PL B1. S-mono- i S 2,S 5 -dipodstawione pochodne 2,5-dimerkapto-1,3,4-tiadiazolu, sposób ich wytwarzania oraz ich zastosowanie

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: (51) Int.Cl. C07D 285/125 ( ) A61P 35/00 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (54) S-mono- i S 2,S 5 -dipodstawione pochodne 2,5-dimerkapto-1,3,4-tiadiazolu, sposób ich wytwarzania oraz ich zastosowanie (73) Uprawniony z patentu: POLITECHNIKA WROCŁAWSKA, Wrocław, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 23/07 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 01/12 (72) Twórca(y) wynalazku: JÓZEF OLEKSYSZYN, Siechnice, PL MICHAŁ STOJAK, Lewin Brzeski, PL PAWEŁ SUROWIAK, Wrocław, PL HERMANN LAGE, Berlin, DE MANFRED DIETEL, Berlin, DE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Halina Winohradnik PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku są nowe S-mono i S 2,S 5 -dipodstawione pochodne 2,5-dimerkapto- -1,3,4-tiadiazolu o wzorach 2, 3 i 5 oraz sposób ich wytwarzania. Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie związków o wzorach 1, 2, 3, 4 i 5 jako składnika aktywnego w lekach przeciwnowotworowych. Choroby nowotworowe ciągle stanowią jedną z głównych przyczyn śmierci w krajach rozwiniętych. Stosowane terapie są mało skuteczne. Interwencje chirurgiczne zwykle prowadzą do zezłośliwienia tkanki nowotworowej, co w następnym etapie, prowadzi do przerzutowania ognisk nowotworu do innych tkanek i śmierci pacjenta. Chemioterapii, czasami stosowanej z dużym powodzeniem, towarzyszą bardzo poważne efekty uboczne, generalnie duża toksyczność. Co więcej komórki nowotworowe po pewnym czasie stają się odporne na zastosowane chemoterapeutyki, o czym piszą w swojej publikacji Cheng Q, Evans WE., Cancer pharmacogenomics may require both qualitentive and quantitative approach" Cell Cycle 2005, 4 (11) Stosowane coraz częściej, tak zwane zindywidualizowane podejście do chemoterapii, sprowadza się to do tego, że izoluje się komórki rakowe od pacjenta i traktuje się je in vitro" chemioterapeutykami. Komórki te wykształcają odporność na większość leków przeciwnowotworowych, ale zawsze można znaleźć takie, na które komórki rakowe nie są w stanie się uodpornić. I te właśnie leki stosuje się później w chemoterapii pacjenta, od którego pobrano komórki, o czym piszą między innymi Kohno E., et. al, Transcription factors and drug resistance" Eur. J. Cancer, 2005, 41, 2577; Yale E, Ragz S., Drug resistance in cancer" Br. J. Cancer, 2005, 93, 973. Nowe związki, które nie zostały dotychczas opisane w literaturze, stanowią S-mono i S 2,S 5 - -dipodstawione pochodne 2,5-dimerkapto-1,3,4-tiadiazolu o wzorach 2, 3, i 5, w których atom siarki jest podstawiony rodnikiem 2-metylenobenzimidazolowym, 2-keto-2-(dihydroksyfenylo)etylowym. Sposób wytwarzania S-mono i S 2,S 5 -dipodstawionych pochodnych 2,5-dimerkapto-1,3,4- -tiadiazolu o wzorach 1, 2, 3, 4 i 5 polega na tym, że di-sole potasowe lub sodowe 2,5-dimerkapto- -1,3,4-tiadiazolu traktuje się odpowiednią halogenopochodną, w etanolu lub metanolu. Po 2-8 godzinach mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się wodą, zakwasza kwasem octowym do ph=5 i otrzymuje się żądane związki w postaci osadu, który odsącza się i suszy. Nowe związki wykazują właściwości przeciwnowotworowe, gdyż są zdolne do hamowania wzrostu komórek rakowych w hodowlach in vitro. Uważa się, że takie związki będą aktywne in vivo również. Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie S-mono i S 2,S 5 -dipodstawionych pochodnych 2,5- -dimerkapto-1,3,4-tiadiazolu, jako składników aktywnych w lekach zdolnych zwalczać, oporne na chemioterapię choroby nowotworowe. Właściwości przeciwnowotworowe związków zostały przetestowane na liniach komórek nowotworowych, wywodzących się ze szczególnie opornych klinicznie na chemioterapię guzów - raka trzustki (EPP181/85P), żołądka (EPG257/85P) oraz czerniaka (MeWo). Badania przeprowadzono na parentalnych liniach wymienionych komórek oraz na następujących ich wariantach opornych na cytostatyki: - EPP181/85 RDB - oporne na daunorubicynę - EPP181/85 RNOV - oporne na novantron (1) - EPG257/85RDB - oporne na daunorubicynę - EPG257/85RDB - oporne na novantron (2) - MeWoCis - oporne na cisplatynę - MeWoFote - oporne na fotemustynę - MeWoEto - oporne na etopozyd - MeWoVin - oporne na vindesynę (3) Poniższa tabela zawiera wartości stężeń przy których związki hamują do połowy wzrost niektórych linii komórek nowotworowych in vitro, wyniki są średnią z kilku pomiarów: T a b e l a 1 Nr wzoru, którym nowy związek został zdefiniowany Rak trzustki EPP181/85P Mikromole/litr Rak trzustki (oporne) EPP181/85RDG Oporne na daunorubicynę Mikromole/litr

3 PL B Rak żołądka EPG257/85P cd. tabeli 1 Rak żołądka (oporne) EPG257/85 RDG Oporne na daunorubicynę Przedmiot wynalazku ilustrują następujące przykłady wykonania. P r z y k ł a d 1 W celu wytwarzania 2,5-bis(benzyltio)-1,3,4-tiadiazolu, przedstawionego wzorem 1, w okrągłodennej kolbie o objętości 50 ml umieszcza się 0,67 g (3 mm) soli dipotasowej 2,5-dimerkapto-1,3,4- -tiadiazolu. Rozpuszcza się ją w 10 ml metanolu. Następnie dodaje się 800 μl (6,7 mm w tym 12% nadmiaru) bromku benzylu o gęstości d=1,438 g/cm 3. Po 30 godzinach prowadzenia reakcji dodaje się około 5 ml wody destylowanej. Po 4 dniach wykrystalizowany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem, a następnie suszy. Otrzymuje się 0,53 g produktu w postaci białawego proszku, co daje wydajność reakcji równą 54,6%. Wzór sumaryczny C 16 H 14 N 2 S 3. Masa cząsteczkowa: 330,3 g/mol. Współczynnik Rf=0,78 (eluent CHCl 3 ). Temperatura topnienia 100 C. Widmo 1 HNMR (roztwór w CDCl 3, δ [ppm]: 4.49 (s, 2H, CH 2 ), (m, 5H, aromat.). P r z y k ł a d 2 W celu wytwarzania 2,5-ditio[S-2-keto-2(3,4-dihydroksyfenylo)etylo]-1,3,4-tiadiazolu, przedstawionego wzorem 2, w okrągłodennej kolbie o objętości 50 ml umieszcza się 2,03 g (9 mm) soli dipotasowej 2,5-dimerkapto-1,3,4-tiadiazolu i rozpuszcza się ją w 10 ml metanolu. Następnie dodaje się 3,5 g (19 mm w tym 5% nadmiar) chloro-3,4-dihydroksyacetofenonu. Tworzenie się produktu kontroluje się metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC), używając jako eluentu mieszaniny chloroform : metanol w stosunku objętościowym 9 do 1. Po 48 godzinach prowadzenia reakcji dodaje się około 5 ml wody destylowanej. Po 4 dniach wykrystalizowany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem a następnie suszy. Otrzymuje się 3,32 g produktu w postaci białego proszku co daje wydajność reakcji równą 81,9%. Wzór sumaryczny C 18 H 14 N 2 O 6 S 3. Masa cząsteczkowa: 450,5 g/mol. Współczynnik Rf=0,26 (eluent CHCl 3 :CH 3 OH 9:1). Temperatura topnienia 211 C. Widmo 1 HNMR (roztwór w DMSO-d 6, δ [ppm]: 4.91 (s, 2H, CH 2 ), (m, 3H, aromat), 9.42 (s, 1H, OH), 9.99 (s, 1H, OH). P r z y k ł a d 3 W celu wytwarzania 2,5-bis(benzimidazylo-2-metylenotio)-1,3,4-tiadiazolu przedstawionego wzorem 3, w okrągłodennej kolbie o objętości 50 ml umieszcza się 0,45 g (2 mm) soli dipotasowej 2,5- -dimerkapto-1,3,4-tiodiazolu i rozpuszcza się ją w 10 ml metanolu. Następnie dodaje się 0,73 g (4 mm w tym 10% nadmiar) 2-chlorometylobenzimidazolu. Tworzenie się produktu kontroluje się metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC), używając jako eluentu mieszaniny chloroform : metanol w stosunku objętościowym 9 do 1. Po 48 godzinach prowadzenia reakcji dodaje się około 5 ml wody destylowanej. Po 4 dniach wykrystalizowany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem a następnie suszy. Otrzymuje się 0,77 g produktu w postaci beżowego proszku, co daje wydajność reakcji równą 95%. Wzór sumaryczny C 18 H 14 N 6 S 3. Masa cząsteczkowa: 410,4 g/mol. Współczynnik Rf=0,44 (eluent CHCl 3 :CH 3 OH 9:1). Temperatura topnienia 208 C. Widmo 1 HNMR (roztwór w DMSO-d 6, δ [ppm]: 4.72 (s, 2H, CH 2 ), (m, 4H, aromat.), 11.9 (s, 1H, NH). P r z y k ł a d 4 W celu wytwarzania 2,5-bis(pirydylo-2-metylenotio)-1,3,4-tiadiazolu przedstawionego wzorem 4, w okrągłodennej kolbie o objętości 50 ml umieszcza się 0,45 g (2 mm) soli dipotasowej 2,5- -dimerkapto-1,3,4-tiadiazolu. Rozpuszcza się ją w 10 ml metanolu. Następnie dodaje się 0,32 g (8 mm) wodorotlenku sodu. Po jego rozpuszczeniu dodaje się 1 g (4 mm) bromowodorku 2-bromometylpirydyny. Tworzenie się produktu kontroluje się metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC), używając jako eluentu mieszaniny chloroform : metanol w stosunku objętościowym 9 do 1. Po 48 godzinach prowadzenia reakcji dodaje się około 1 ml wody destylowanej. Po 5 dniach wykrysta

4 4 PL B1 lizowany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem a następnie suszy. Otrzymuje się 0,3 g produktu w postaci jasnobrązowego proszku co daje wydajność reakcji równą 45,4%. Wzór sumaryczny C 14 H 12 N 4 S 3. Masa cząsteczkowa: 332,3 g/mol. Współczynnik Rf=0,61 (eluent CHCl 3 :CH 3 OH 9:1). Temperatura topnienia 83 C. Widmo 1 HNMR (roztwór w DMSO-d 6, δ [ppm]: 4.60 (s, 2H, CH 2 ), (m, 4H, aromat.). P r z y k ł a d 5 Sposób wytwarzania 2-merkapto-5-S-tiometyleno(2-benzimidiazolo)-1,3,4-tiadiazolu przedstawionego wzorem 5, w okrągłodennej kolbie o objętości 50 ml umieszcza się 0,54 g (2,3 mm) soli dipotasowej 2,5-dimerkapto-1,3,4-tiadiazolu i rozpuszcza się ją w 10 ml metanolu. Następnie w przeciągu 24 godzin bardzo małymi porcjami (0,05 g) dodaje się 0,2 g (1,2 mm) 2-chlorometylobenzimidazolu. Tworzenie się produktu kontroluje się metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC), używając jako eluentu mieszaniny chloroform : metanol w stosunku objętościowym 9 do 1. Po 48 godzinach prowadzenia reakcji dodaje się około 5 ml wody destylowanej. Wykrystalizowany produkt po 6 dniach od rozpoczęcia reakcji odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i tą część odrzuca. Do otrzymanego przesączu bardzo powoli wkrapla się 2 ml kwasu octowego, czego wynikiem jest wykrystalizowanie końcowego produktu, który następnie odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy. W ten sposób otrzymuje się 0,26 g produktu w postaci żółtego proszku co daje wydajność reakcji równą 35,6%. Wzór sumaryczny C 10 H 7 KN 4 S 3. Masa cząsteczkowa: 318,4 g/mol. Współczynnik Rf=0,38 (eluent CHCl 3 :CH 3 OH 9:1). Temperatura topnienia 185 C. Widmo 1 HNMR (roztwór w DMS0-d 6, δ [ppm]: 4.58 (s, 2H, CH 2 ), (m, 4H, aromat.), 9.16 (s, 1H, NH). W celu sprawdzenia właściwości przeciwnowotworowych związków zostały wykonane testy cytotoksyczności, na wyhodowanych komórkach: Komórki były hodowane w standardowych warunkach w medium L-15, zawierającym 10% FCS, 1 mm L-glutaminy, 6.25 mg/l fetuiny, 80 le/l insuliny, 2.5 mg/l transferyny, 1 g/l glukozy, 1.1 g/l NaHCO 3, 1% podstawowych witamin i kie/l trazylolu w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO 2 w temperaturze 37 C. Testy cytotoksyczności: Komórki z badanych linii były nakładane w ilości 800 sztuk do dołków płytek 96-dołkowych. Następnie były hodowane przez dwa dni w medium. Po dwóch dniach do poszczególnych dołków zostały dodane badane związki w różnych stężeniach (1 do 100 mikromoli) w celu określenia wartości IC 50 dla każdego ze związków. Po trzech dniach inkubacji komórki zostaną utrwalone za pomocą lodowatego 10% kwasu trójchlorooctowego przez 1 godzinę w temperaturze 40 C. Następnie płytki były 5 razy płukane w wodzie, a potem barwione przez dodanie 100 μl do każdego dołka 0.4% roztworu SRB (Sigma, St. Louis, MO, USA) w 1% kwasie octowym w temperaturze pokojowej. Nadmiar barwnika został usunięty przez pięciokrotne płukanie w 1% kwasie octowym. Po suszeniu w temperaturze pokojowej i dodaniu do każdego dołka 300 μl 10 mm Tris-HCl (ph=8.0) odczytano absorbancję przy długości fal 562 nm w czytniku Elisa-Reader (EL 340 Microplate Bio Kinetics Reader, BIO-TEK Instruments, Winooski, VT, USA) (4). Zastrzeżenia patentowe 1. Nowe S-mono i S 2,S 5 -dipodstawione pochodne 2,5-dimerkapto-1,3,4-tiadiazolu o wzorach 2, 3 i Sposób wytwarzania S-mono i S 2,S 5 -dipodstawionych pochodnych 2,5-dimerkapto-1,3,4- -tiadiazolu o wzorze ogólnym 2, 3 5, znamienny tym, że di-sole potasowe lub sodowe 2,5-dimerkapto-1,3,4-tiadiazolu traktuje się odpowiednią halogenopochodną, w etanolu lub metanolu, a po 2-8 godzinach mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się wodą, zakwasza kwasem octowym do ph=5 i otrzymuje się żądane związki w postaci osadu, który odsącza się i suszy. 3. S-mono i S 2,S 5 -dipodstawione pochodne 2,5-dimerkapto-1,3,4-tiadiazolu o wzorach 1, 2, 3, 4 i 5, do zastosowania jako składniki aktywne w lekach zdolnych zwalczać odporne na chemioterapię choroby nowotworowe.

5 PL B1 5 Rysunki

6 6 PL B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)