Ocena rozprawy doktorskiej mgr Mariusza Czyżniejewskiego

Transkrypt

1 Dr hab. Paweł Bednarek, prof. IChB PAN Instytut Chemii Bioorganicznej PAN ul. Noskowskiego 12/ Poznań Ocena rozprawy doktorskiej mgr Mariusza Czyżniejewskiego Zmiany profili metabolitów wybranych traw z kompleksu Lolium-Festuca w odpowiedzi na stresy abiotyczne. Oddziaływania roślin uprawnych ze środowiskiem, w tym również odpowiedź na stres abiotyczny mają duży wpływ na produktywność w rolnictwie. Czynniki środowiskowe, takie jak temperatura, wilgotność, czy też stężenie jonów w glebie, mają bezpośrednie przełożenie na wysokość uzyskiwanych plonów. Stres spowodowany suszą, wysokim zasoleniem gleby czy też przymrozkami może prowadzić do znacznych strat w rolnictwie. Ma to szczególne znaczenie w obliczu obecnych, niekorzystnych zmian klimatycznych obserwowanych na świecie. Z tych względów tolerancja roślin na niesprzyjające czynniki środowiskowe posiada duże znaczenie ekonomiczne. W odróżnieniu od zwierząt rośliny nie są w stanie uciec od niekorzystnych dla ich wzrostu warunków, dlatego ich mechanizmy odporności opierają się głównie na tworzeniu zewnętrznych barier częściowo chroniących ich przed wpływem środowiska zewnętrznego oraz modulacji zachodzących procesów biochemicznych. Publikowane do tej pory wyniki wskazują na istotną, jednakże nie do końca poznaną, rolę zmian w akumulacji metabolitów, które indukowane są w odpowiedzi na zaistniały stres abiotyczny. Właśnie tej odpowiedzi na stres abiotyczny wybranych traw z kompleksu Lolium- Festuca dotyczy omawiana praca doktorska mgr Mariusza Czyżniejewskiego. Ocena merytoryczna rozprawy Doktorant wybrał jako obiekt swoich badań trzy gatunki traw pastewnych z kompleksu Lolium-Festuca. Były to kostrzewa trzcinowa Festuca arundinacea (odmiana Kord), życica 1

2 trwała Lolium perenne (odmiana Solen) oraz mieszaniec międzyrodzajowy (Festuca pratensis x Lolium multiflorum) Festulolium (odmiana Felopa). W ramach omawianej pracy zbadano zmiany w metabolizmie wybranych linii wywołane stresem chłodu, zasolenia i suszy. Jednakże mieszaniec międzyrodzajowy badany był jedynie w doświadczeniu dotyczącym wpływu chłodu na metabolizm. Trawy pastewne zajmują w Polsce około 20% gruntów ornych, co powoduje, że prowadzone na nich badania mogą mieć znaczenie ekonomiczne. Wybór gatunków podyktowany był danymi literaturowymi, które wskazywały na wyraźnie większą odporność kostrzewy trzcinowej na chłód i suszę w porównaniu do życicy trwałej. Ta różnica w odporności na stres umożliwia potencjalne wyselekcjonowanie zmian metabolicznych, które mogą być istotne dla odporności na poszczególne czynniki stresowe. Opisane w pierwszym paragrafie wyniki analiz fenotypowych wykazały, iż zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami literaturowymi kostrzewa trzcinowa wykazała większą odporność na stres chłodu i suszy niż życica trwała. Przetestowana w doświadczeniu dotyczącym wpływu chłodu na wzrost roślin mieszaniec międzygatunkowy wykazał pośrednią odporność. Dodatkowa kostrzewa trzcinowa wykazała większą tolerancję na zasolenie gleby niż życica trwała. Wyniki uzyskane przez autora podczas analiz fenotypowych wykazały, że ze względu na kontrastującą tolerancję na użyte w doświadczeniach czynniki stresowe wybrane gatunki stanowią dobry zestaw do badania zmian metabolicznych wywołanych stresem abiotycznym. W kolejnych rozdziałach pracy autor opisuje wyniki wykonanych analiz metabolomicznych. W pierwszej kolejności są to analizy GC/MS metabolitów pierwotnych. Autor skupia się na związkach, które według odpowiednich analiz statystycznych wykazały istotny efekt dla traktowania i/lub odmiany. Wśród omawianych związków znalazły się metabolity reprezentujące różne klasy metabolitów pierwotnych: cukry, aminokwasy, kwasy organiczne czy też poliaminy. Biorąc pod uwagę fakt, że kostrzewa trzcinowa wykazała większą tolerancję na badane stresy szczególna uwaga została poświęcona metabolitom, których akumulacja zmieniała się w odpowiedzi na stres w tym gatunku, ale nie w życicy. Te zmiany metaboliczne zdaniem autora mogły przyczynić się do zwiększonej tolerancji kostrzewy na badane czynniki stresowe. W dalszej części pracy autor skupił się na identyfikacji metabolitów wtórnych obecnych w badanych gatunkach traw. W analizach struktur metabolitów autor wykorzystał metody sprzężenia chromatografi cieczowej ze spektrometrią mas w tym HPLC-ESI-IT oraz UPLC-HESI-Q-ORBITRAP. Druga z wymienionych metod pozwoliła na bardzo dokładny pomiar masy analizowanych związków, co z kolei ułatwiło identyfikację struktur badanych związków. Ta część pracy wyraźnie pokazuje, że autor ma dobrze opanowany warsztat 2

3 spektrometrii mas i jest w stanie samodzielnie interpretować widma masowe. Łącznie w badanych gatunkach traw autor zidentyfikował 60 metabolitów wtórnych (Załącznik Tabela). Wśród zidentyfikowanych związków znajdują się pochodna kwasu benzoesowego oraz pochodne kwasów hydroksycynamonowych i flawonoidów. W tej ostatniej grupie związków autor zidentyfikował pochodne cukrowe, w tym mono-, di-, tri-, a nawet jeden tetra-glikozyd. Scharakteryzowanie takiej liczby metabolitów wtórnych stanowi na pewno jeden z istotniejszych aspektów poznawczych omawianej rozprawy doktorskiej. Niektóre z zidentyfikowanych glikozydów były dodatkowo modyfikowane kwasem malonowym lub kawowym. Pewien niedosyt może budzić fakt, że autor skupił się wyłącznie na związkach fenolowych (pochodnych fenyloalaniny). Uczucie niedosytu może być zrekompensowane przez ilość zidentyfikowanych związków. Jednakże biorąc uwagę różnorodność strukturalną metabolitów wtórnych należy zwrócić też uwagę na fakt, że autor nie podaje jednoznacznie przyczyn, dla których skupił się wyłącznie na tej klasie związków. Stwierdza on jedynie (strona 146), Wśród metabolitów wtórnych szczególną uwagę zwrócono na związki fenolowe, bez obiektywnego uzasadnienia tego wyboru (np. czy zadecydowały tu względy analityczne, czy dane literaturowe na temat funkcji poszczególnych klas metabolitów wtórnych w odpowiedzi na stres abiotyczny). W kolejnych rozdziałach autor opisuje zmiany w akumulacji zidentyfikowanych metabolitów wtórnych w odpowiedzi na badane czynniki stresowe. Podobnie jak w przypadku analiz metabolitów pierwotnych autor skupia się na związkach, które według odpowiednich analiz statystycznych wykazały istotny efekt dla traktowania i/lub odmiany. Ponownie biorąc pod uwagę fakt, że kostrzewa trzcinowa wykazała większą odporność na badane stresy szczególna uwaga została poświęcona metabolitom, których akumulacja zmieniała się w odpowiedzi na stres w tym gatunku. Autor stawia hipotezę, że te związki związane są z odpornością na stres abiotyczny. Podsumowując część eksperymentalną, zakres zaprojektowanych doświadczeń i dobór badanych obiektów jest poprawny do tego, aby zbadać zmiany metabolizmu traw podczas odpowiedzi na różne rodzaje strasu abiotycznego. W moim odczuciu opisane eksperymenty zostały przeprowadzone z zachowaniem odpowiedniej staranności badawczej. Należy jednak zwrócić uwagę na brak niezależnych powtórzeń biologicznych w przypadku doświadczeń dotyczących suszy i zasolenia gleby. Z jednej strony może być to zrozumiałe biorąc pod uwagę ilość analiz wykonanych dla pojedynczych eksperymentów. Z drugiej strony, brak powtórzeń biologicznych może znacznie utrudniać opublikowanie 3

4 uzyskanych wyników. Większość dobrych czasopism wymaga, aby uzyskane wyniki były weryfikowane w niezależnych eksperymentach. Wybór gatunków o zróżnicowanej tolerancji na badane czynniki stresowe umożliwił na wytypowanie metabolitów, które mogą być istotne dla mechanizmów odporności. Należałoby jednak w dyskusji zwrócić też uwagę na fakt, że odporność na przetestowane przez autora pracy czynniki stresowe może być zależna od wielu mechanizmów, nie tylko od obserwowanej zwiększonej biosyntezy metabolitów pierwotnych i wtórnych. Dlatego też nie można wykluczyć, że w przypadku kostrzewy odporność na suszę zależy od innych mechanizmów, a obserwowane zmiany w metabolizmie mają charakter wtórny. Taki scenariusz powinien zostać uwzględniony w dyskusji. Omawiając aspekty związane z prezentacją wyników oraz dyskusją należy zwrócić uwagę, że wsparcie tekstu rozprawy rycinami wydaje się niepełne. Na rycinach autor zamieszcza jedynie podsumowanie analiz fenotypowych dotyczących wpływu badanych stresów abiotycznych na rozwój roślin (Ryc. 6-10), wykresy przedstawiające zmiany akumulacji metabolitów pierwotnych (Ryc ) i wtórnych (Ryc ), oraz wykres prądu jonowego i widma masowe zidentyfikowanych związków (Ryc ). Brakuje rycin lub tabeli, które porównywałyby zmiany poszczególnych klas metabolitów lub indywidulanych związków pomiędzy stosowanymi rodzajami stresu i/lub testowanymi gatunkami traw. Takie zestawienia wsparłyby dyskusję dotyczącą zmian w profilach metabolicznych, które mogą być istotne w odpowiedzi na stres. Dodatkowo ułatwiłyby one czytelnikowi lepszą ocenę wniosków autora. Brak jest też schematu, który podsumowywałby zmiany metaboliczne istotne zdaniem autora dla odporności na suszę. Pewien niedosyt budzi również fakt, że autor nie umieścił w swojej pracy ryciny przedstawiającej podstawowe struktury zidentyfikowanych kwasów hydroksycynamonowych oraz aglikonów flawonoidów (apigenina, izoramnetyna, kempferol, kwercetyna etc.). Praca jest chyba dedykowana osobom zainteresowanym odpowiedzią roślin na stres abiotyczny, a nie jedynie wąskiej grupie specjalistów metabolizmu wtórnego roślin, którzy dobrze znają wzory strukturalne dyskutowanych związków. Dodatkowo w pracy brakuje tabeli lub ryciny (np. diagramy Venna), która podsumowywałaby ilość konstytutywnie obecnych pochodnych kwasów hydroksycynamonowych, oraz flawonoidów wspólnych i unikalnych dla badanych gatunków. Ocena formalna rozprawy Pod względem formalnym rozprawa doktorska mgr Mariusza Czyżniejewskiego nie budzi poważnych zastrzeżeń. Obejmuje ona łącznie 177 tekstu (dodatkowo 30 stron 4

5 załączników) i zawiera 75 rycin (dodatkowo 7 zestawów rycin w załączniku) oraz 11 tabel (dodatkowo 1 w załączniku). Lista cytowanej literatury zawiera około 140 pozycji. Odnośniki literaturowe dobrze odzwierciedlają obecny stan wiedzy na temat odpowiedzi na stresy abiotyczne, funkcji metabolitów pierwotnych i wtórnych w tolerancji na dany stres oraz zastosowania technik spektrometrii mass w analizie metabolitów fenolowych. W pracy pojawiły się jednak pewne niedociągnięcia: Z tekstu pracy (włączając opisy rycin) dosyć trudno jest wywnioskować liczbę niezależnych prób/pomiarów, które użyte były do obliczenia średnich wyników prezentowanych na poszczególnych rycinach. Opisując doświadczenia autor podaje ilość roślin/klonów, które hodowane były do poszczególnych doświadczeń. Nie jest jednak jasne jak te ilości korespondują do ilości próbek użytych do pomiaru RWC, bądź też do ilościowych analiz metabolomicznych. Z reguły liczba analizowanych prób (n) powinna być jasno podana w materiałach i metodach lub w opisach poszczególnych rycin. Na wykresach nie zaznaczono, które różnice są istotne statystycznie. W przypadku wszystkich wykresów opisujących akumulację metabolitów skala osi y opisana jest jako Skala lograytmiczna (log 2 ). Niestety autor nie podaje jaka wielkość jest wyrażona w tej skali. Można się domyśleć, że chodzi tu o wyniki integracji chromatogramów prądów jonowych odniesione prawdopodobnie do standardu wewnętrznego. Jednakże powinno to zostać wyraźnie sprecyzowane. Autor stosuje w swojej pracy trzy rodzaje wykresów do pokazania obserwowanych zmian metabolitów podczas odpowiedzi na stres solny i suszy: liniowy (np. Ryc. 17), słupkowy (np. Ryc. 18) lub słupkowy 3D (Ryc. 63). Trudno znaleźć uzasadnienie dlaczego dla przedstawienia tego samego rodzaju danych dla różnych związków wybrano w sposób raczej losowy różne rodzaje wykresów. Dla wyników prezentowanych, jako wykresy liniowe i słupkowe 3D nie podano odchyleń standardowych. Autor używa wielokrotnie zwrotu traktowane stresem, co jest raczej niepoprawne. Nazwa trycyna, którą autor używa w stosunku do flawonoidu (ang. tricin) jest używana w języku polskim również dla N-tris(hydroksymetylo)metylo glicyny (ang. tricine). Dlatego użycie tej nazwy nie jest do końca jednoznaczne, szczególnie uwzględniając brak ryciny przedstawiającej wzór strukturalny tego związku. 5

6 Podsumowanie Zat6wno zawartosd memoryczna, jak i forma omawianej rozpnv,ry doktorskiej Swiadczq o tym, 2e mgr Mariusz Czy2niejewski posiadl duzy zas6b wiedzy i opanowal odpowiedni warsztat eksperymentalny, co umozliwilo zrealizowanie interesuiqcego projektu badawczego. oceniana rozprawa zawiera wiele ciekawych wynik6w, kt6re stanowiq podstawq do dalszych bada6 nad funkcia metabolit6w pierwotnych im6rnych w odpornosci roslin na stresy abiotyczne. Dodatkowo uzyskane wyniki stanowie istotny wklad w poznanie metabolizmu wt6rnego traw. wymienione przeze mnie powyzej uchylenia nie wplywaiq na pozytywnq oceng pracy, kt6ra moim zdaniem spelnia wszystkie wymagania stawiane rozprawom doktorskim. Na tej podstawie wnioskujg do Rady Naukowej Instytutu Genetyki Roslin Polskiej Akademii Nauk w poznaniu o dopuszczenie mgr Mariusz czyzniejewskiego do dalszych etap6w pzewodu doktorskiego. Pawel Bednarek i?u{wj'-'*^-- 6