Ocena Zmiany w proteomie i związkach fenolowych liści oraz korzeni winorośli ( Vitis vinifera L.) pod wpływem stresu chłodu i suszy

Transkrypt

1 prof. dr hab. Krystyna Żółtowska Olsztyn, r. Katedra Biochemii emerytowany profesor Wydział Biologii i Biotechnologii Uniwersytet Warmińsko-Mazurski Ocena rozprawy doktorskiej mgr Angeliki Krół pt. Zmiany w proteomie i związkach fenolowych liści oraz korzeni winorośli (Vitis vinifera L.) pod wpływem stresu chłodu i suszy, wykonanej w Katedrze Biochemii UWM w Olsztynie pod kierunkiem prof. dr hab. Stanisława Weidnera, prof. zw. OCENA FORMALNA ROZPRAWY Praca doktorska ma postać manuskryptu obejmującego łącznie 243 strony maszynopisu. Napisana została w układzie typowym dla prac doktorskich z zakresu nauk biologicznych. Składa się ze Wstępu (2 str.), poprzedzonego wykazem skrótów (3 str.), Przeglądu Literatury (22 str.), Celu pracy (1 str.), Materiału i Metod (20 str.), Wyników (100 str.), Dyskusji (35 str.), Podsumowania i Wniosków (4 str.), Streszczenia w języku polskim i angielskim (po 2 str.), wykazu Literatury liczącego 372 pozycje oraz wykazu stron internetowych (4 pozycie). Krótki, przystępnie napisany, Wstęp sprawnie wprowadza czytelnika w zagadnienia będące przedmiotem rozprawy. Po nim następuje obszerny Przegląd Literatury, dotyczący charakterystyki i warunków upraw winorośli, ze zwróceniem szczególnej uwagi na odmiany winorośli właściwej będące materiałem badawczym pracy doktorskiej. Przedstawia szczególne wymogi środowiskowe upraw winorośli oraz wiążące się z ich zmianami stresy środowiskowe dla rośli. Rozdział napisany został w sposób interesujący i wyczerpujący zagadnienia. Moim zdaniem uatrakcyjniłoby pracę wprowadzenie fotografii badanych odmian winorośli oraz zamieszczenie schematu szlaków syntezy i wzorów głównych związków fenolowych, o których autorka wspomina w tytule podrozdziału 1.6. Stało by się wtedy jasne, co ma na myśli pisząc związki o schemacie budowy C 6 -C 1 (str. 28, 29). Celem pracy, nakreślonym na tle aktualnych zmian środowiskowych i prognoz demograficznych, było poszerzenie, wiedzy o naturalnych mechanizmach regulacji odporności roślin (na przykładzie winorośli) na stres chłodu i suszy. Sformułowano też 4 zadania badawcze, pozwalające na realizację zamierzonego celu. Opis Materiału badawczego i zaprojektowanych eksperymentów jest zrozumiały i w wykonaniu prawidłowy. Występują w nim też określenia nieprecyzyjne np. str. 33 Po adaptacji roślin do warunków szklarniowych i osiągnięciu odpowiednich rozmiarów 1

2 sadzonki winorośli poddano dalszym badaniom tzn. kiedy i jakich rozmiarów? W opisie zastosowanych Metod stwierdzono, nieliczne przy tak rozległej części metodycznej, braki lub błędy, jak: na str. 34 i Tabeli 3.1. intensywność naświetlania sadzonek wyrażana w μmol x m 2 x s -1, na str terminem sucha masa określono materiał nie do końca pozbawiony wody. Metoda izolacji białek do analizy proteomicznej (str. 46) opisano niedokładnie, tak że niewtajemniczony badacz nie byłby w stanie jej zastosować. Nie wiadomo też, w jaki sposób wycinano spoty do identyfikacji białek (str. 50). Jak przypuszczam program Microsoft Office 2010 służył do opracowania i graficznego przedstawienia wyników, natomiast statystycznie analizowano je stosując oprogramowanie Statistica 10.0 (tu jednak nie podano rodzajów testów użytych do analiz (str.52). Wyniki zostały przedstawione starannie, ich dokumentacja jest czytelna i estetyczna. Jako zbędne uważam podawanie dokładnie tych samych danych liczbowych w tekście i na rysunkach 4.3, 4.4 (dotyczących względnej zawartości wody), Ryc. 4.9 i 4.10 (zmiana siły redukcyjnej ekstraktów) oraz w Tabelach 4.1 i 4.2, dotyczących związków fenolowych. Dyskusja została napisana w sposób wyczerpujący, poruszone zostało w niej wiele istotnych aspektów związanych z wynikami i ich odniesieniem do literatury przedmiotu. Ale zawiera też wiele niepotrzebnych powtórzeń, nawiązujących do założeń eksperymentu oraz prawie identyczne zdania kończące akapity, dotyczące potencjalnego wpływu i znaczenia omawianego wskaźnika badawczego, nakreślonego w sposób szablonowy i bardzo ogólny. Bardzo pomocna w typowaniu białek markerowych Tabela 4.11 mogłaby być jeszcze lepsza, gdyby poza kierunkiem strzałek, obrazujących wzrost lub obniżenie zawartości danego białka, za pomocą rozmiaru strzałek przestawiała względną wielkość tej zmiany. Pozwoliłoby to czytelnikowi na uszeregowanie markerów stresowych pod względem ich potencjalnej istotności. Moim zdaniem punkty 8 i 9 rozdziału Podsumowanie i Wnioski z powodzeniem można połączyć ze sobą, gdyż dotyczą tego samego zagadnienia. Stronę redakcyjną pracy oceniam pozytywnie, niewiele jest w niej drobnych pomyłek, literówek oraz błędów w cytacjach i w spisie piśmiennictwa. Niemniej muszę podkreślić, że objętość papieru, którą praca zajmuje, byłaby o co najmniej 1/3 mniejsza, gdyby rozkład materiału był bardziej przemyślany, bez pozostawiania 23 stron od 1/4 do 4/5 niezapisanych w rozdziale Wyniki (str. 55, 61, 63, 65, 67, 70, 71, 72, 76, 77, 78, 86, 96, 102, 107, 113, 118, 124, 129, 135, 140, 146, 158) oraz zbędnych powtórzeń tych samych danych w tabelach na rysunkach i w tekście rozdziału Wyniki oraz fragmentów tekstu w Dyskusji. 2

3 OCENA MERYTORYCZNA ROZPRAWY W ostatnich kilkunastu latach obserwuje się w Polsce wyraźny wzrost zainteresowania uprawą winorośli i winiarstwem. Trudne warunki klimatyczne stanowią najpoważniejszą przeszkodę w rozwoju komercyjnych upraw winorośli w Polsce. Pomimo obserwowanego stopniowego ocieplanie się klimatu, nadal ryzyko wystąpienia niekorzystnych zjawisk pogodowych jest największym zagrożeniem dla rentowności plantacji winorośli. Konieczne jest wprowadzanie do upraw nowych odmian bardziej przystosowanych do warunków polskiego klimatu. Zespół kierowany przez Pana prof. Stanisława Weidnera od lat zajmuje się badaniami molekularnych postaw odpowiedzi roślin uprawnych na abiotyczne stresy środowiskowe. Temu zagadnieniu poświęcona jest też oceniana praca, której celem było poznanie biochemicznych podstaw warunkujących odporność na stresy chłodu i suszy odmian winorośli, które są propagowane do upraw komercyjnych i działkowych w Polsce. Badania tego typu mogą mieć znaczenie nie tylko poznawcze, ale też aplikacyjne, z myślą o uzyskiwaniu naturalnych lub też genetycznie modyfikowanych odmian winorośli, których areał upraw mógł by się poszerzyć o regiony o trudniejszych warunkach klimatycznych, takich chociażby jak teren Warmii i Mazur. Dlatego uważam problematykę podjętą w pracy doktorskiej mgr Angeliki Król za ważną. W pracy zastosowano wielostronne podejście do zagadnienia, którego podstawą była analiza porównawcza tych samych wyznaczników stresu u roślin dwóch odmian odpornych z dwoma wrażliwymi na stres chłodu. Co interesujące i cenne, jedną odmianę - Kiszmisz Łuczistyj (wrażliwą na stres chłodu) w równoległym eksperymencie poddawano stresowi suszy, co pozwalało na porównanie odpowiedzi zachodzących u tej samej odmiany winorośli na oba rodzaje stresu. Oceniam, że praca została dobrze zaplanowana, a Pani mgr Angelika Król była bardzo dobrze przygotowana do podjętych badań. Znakomicie opanowała bardzo szeroki wachlarza metod analitycznych, poczynając od najprostszych jak oznaczenie suchej masy, bardziej skomplikowanych jak oznaczenie potencjału antyoksydacyjnego, po przez wysokosprawną chromatografię cieczową, do skomplikowanych procedur proteomicznych. Autorka osiągnęła wyznaczony cel pracy. Najwartościowsze jej wyniki, zdaniem recenzenta, to; 1. Wykazanie, że obraz zmian badanych wskaźników po ekspozycji na oba stresy w liściach winorośli był podobny, co potwierdza uniwersalny, co do zasady, charakter odpowiedzi roślin na warunki stresowe. Obserwowano obniżenie względnej zawartości wody i wzrost suchej masy, niższą ogólną zdolność zmiatania wolnych rodników, wiążącą się 3

4 prawdopodobnie m.in. z obniżenie zawartości związków fenolowych, w tym poszczególnych kwasów fenolowych w liściach roślin. 2. Natomiast, nasilenie powyższych zmian i ich kierunek były zróżnicowane i są cechą indywidualną danej odmiany winorośli i jej odporności na chłód. Stwierdzono, że powyższe wskaźniki były silniej zmienione u odmian wrażliwych na ten stresor. 3. Długotrwały stres suszy mocniej zmieniał ww. wskaźniki w liściach niż w korzeniach sadzonek odmiany Kiszmisz Łuczystyj, co wydaje się z uwagi na morfologię i histologię tych organów oczywiste. Ważnym było spostrzeżenie, że kwas kawowy, jest jednym z ważniejszych metabolitów wtórnych, warunkujących prawdopodobnie w dużym stopniu odporność winorośli na stresy abiotyczne, gdyż najobficiej występujący w profilu kwasów fenolowych liści i korzeni badanych odmian winorośli. Co ciekawe w odpowiedzi na stres chłodu obserwowano duże (ok. 3-krotne) zmniejszenie zawartości form estrowo związanych tego kwasu w liściach Kiszmisz Łuczistyj, natomiast w warunkach stresu suszy obniżenie to było znacznie niższe (ok. 30%). Co może prawdopodobnie wynikać z lepszego dostosowania, tej pochodzącej z Mołdawii rośliny, do stresu suszy niż stresu chłodu? 4. W toku badań proteomicznych obserwowano duże (1,8 razy) zmiany zawartości 40 białek (spośród ogółu ok. 620 białek obecnych w każdej próbie), które później zidentyfikowano i przypisano do siedmiu grup pod względem ich funkcji biologicznej. Stwierdzono, że długotrwałe warunki stresowe najmocniej dotykają białek związanych z pozyskiwaniem energii, w tym z metabolizmem węglowodanów oraz stresowych, słabiej białek z grup odpowiadających za metabolizm wtórny oraz białek strukturalnych. 5. Na podstawie analizy proteomicznej wskazano 15 białek, które można uznać za potencjalne markery stresu abiotycznego u winorośli oraz wytypowanie białek, które można powiązać z określoną formą stresu. Nowatorskie było stwierdzenie po raz pierwszy wzrostu zawartości białka enzymu arylformanidazy [EC ], zwanej też formamidazą kinureninową, u winorośli w odpowiedzi na stresy abiotyczne. Na tle danych z piśmiennictwa mgr Angelika Król przeprowadza w rozdziale Dyskusja analizę własnych rezultatów, dyskutując po kolei wyniki każdego zadania badawczego. Najobszerniej, krok po kroku, omawia kolejno rolę i znaczenie 40 zidentyfikowanych białek, indukowanych w czasie obu stresów. Na jej podstawie Doktorantka sformułowała 11 punktów, z których większość nie jest w ścisłym tego słowa rozumieniu wnioskami. Znajduje 4

5 to odzwierciedlenie w tytule rozdziału, który brzmi - Podsumowanie i Wnioski. W większości jest to podsumowanie najważniejszych wyników i sugestie odnośnie ich znaczenia. Podczas czytania pracy nasunęły mi się pytania. Proszę Doktorantkę o ustosunkowanie się do nich: 1. Co Autorka rozumie pod pojęciem wtórny stres oksydacyjny? 2. Czy obniżone zdolności do zmiatania wolnych rodników w stresie chłodu mogły wynikać również z niższego zapotrzebowaniem na związki antyoksydacyjne, wiążące się ze słabszą generacji RFT w skutek niższego tempem metabolizmu w warunkach chłodu? 3. Dlaczego wybrano różny czas trwania stresu chłodu (7 dni) i suszy (14 dni)? Czy 14 dniowy stres chłodu byłby za długi? Czy wilgotność gleby była w kontrolnych hodowlach przy obu stresach podobna? Ujednolicenie warunków obu eksperymentów, a więc wieku sadzonek, pozwoliłoby pewniejszą ocenę odpowiedzi odmiany Kiszmisz Łuczistyj na oba stresy. 4. Interesujące było to, że zawartość kwasów fenolowych była niższa w korzeniach winorośli odmiany Kiszmisz Łuczistyj niż w jej liściach. Zawartość, uważanego za jeden z główny antyoksydantów, kwasu kawowego była aż o rząd wartości, a pozostałych o połowę niższa niż w liściach. Czym Pani Magister wytłumaczy zatem znacznie wyższe zdolności zmiatania wolnych rodników przez ekstrakty korzeni niż liści, które wykazała w swoich badaniach? 5. W pierwszym punkcie rozdziału Podsumowanie i Wnioski znalazłam zdanie rozpoczynające się od słów: Wspomniane niekorzystne warunki oddziaływały na wzrost i rozwój sadzonek, co pewnie jest prawdziwe, ale nie znajduje żadnego materialnego potwierdzenia w wynikach pracy. 6. Autorka wykonała setki analiz, w tym pomiary zdolności redukcyjne ekstraktów aż trzema metodami, proszę wyjaśnić istotę różnice między tymi metodami i co nowego z ich pomocą można było ustalić? 7. Dlaczego do markerów suszy przypisuje Pani magister tylko białka, których poziom różni się istotnie od występujących w stresie chłodu u wszystkich odmian? Nie wiem czy słusznie, ale porównując dane dla odmiany Kiszmisz Łuczystyj, jedynej poddanej obu stresom, poszerzyłabym tę listę o 5 kolejnych białek, różniących się odpowiedzią na stres chłodu i suszy stresy.. W pracy znalazłam też kilka niedociągnięć i zbyt daleko idących skrótów myślowych, które przytaczam poniżej: 5

6 6