(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (51) T3 Int.Cl. A61K 35/14 ( ) A61K 35/16 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2013/28 EP B1 (54) Tytuł wynalazku: Preparat farmaceutyczny zawierający supernatant z hodowli komórek jednojądrzastych (30) Pierwszeństwo: EP (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2011/43 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2014/01 (73) Uprawniony z patentu: Aposcience AG, Wien, AT PL/EP T3 (72) Twórca(y) wynalazku: HENDRIK JAN ANKERSMIT, Vienna, AT (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Rafał Witek WTS RZECZNICY PATENTOWI WITEK, ŚNIEŻKO I PARTNERZY ul.r. Weigla Wrocław Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 PZ/2085/RW EP B1 Opis [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy preparatu farmaceutycznego do leczenia wewnętrznych stanów zapalnych skóry, korzystnie wewnętrznych stanów chorobowych skóry związanych z niedokrwieniem. [0002] Hipoksja, stan zmniejszenia ilości tlenu, może pojawiać się, gdy płuca są upośledzone lub zmniejszony jest przepływ krwi. Niedokrwienie, zmniejszenie przepływu krwi, może być spowodowane przez niedrożność tętnicy lub żyły przez skrzep (skrzeplinę) lub przez obcą substancję w krążeniu (zator) lub przez chorobę naczyniową, taką jak miażdżyca. Zmniejszenie przepływu krwi może mieć nagły początek i trwać krótko (niedokrwienie ostre) lub może mieć wolny początek i trwać długo lub często nawracać (niedokrwienie przewlekłe). Niedokrwienie ostre związane jest często z miejscową, nieodwracalną martwicą tkanki (zawałem), podczas gdy niedokrwienie przewlekłe związane jest zazwyczaj z przejściowym niedotlenieniowym uszkodzeniem tkanki. Jednakże, jeśli obniżona perfuzja jest wydłużona lub ciężka, niedokrwienie przewlekłe również może wiązać się z zawałem. Zawały powszechnie zdarzają się w śledzionie, nerkach, płucach, mózgu i sercu, dając choroby, takie jak zawał jelit, zawał płuca, udar niedokrwienny i zawał mięśnia sercowego. [0003] Zmiany patologiczne w zaburzeniach niedokrwiennych zależą od trwania i ciężkości niedokrwienia oraz od długości przeżycia pacjenta. Martwicę można zaobserwować w obrębie zawału w pierwszych 24 godz., a ostra odpowiedź zapalna rozwija się w żywej tkance sąsiadującej z zawałem, przy czym leukocyty migrują do obszaru tkanki martwej. W ciągu kolejnych dni następuje stopniowy rozpad i usuwanie komórek w obrębie zawału poprzez fagocytozę i zastępowanie za pomocą blizny kolagenowej lub glejowej. [0004] Hipoperfuzja lub zawał w jednym narządzie wpływają często na inne narządy. Przykładowo, niedokrwienie płuc spowodowane na przykład przez zator płuca, nie tylko wpływa na płuco, ale również poddaje stresowi niedotlenieniowemu serce i inne narządy, takie jak mózg. Zawał mięśnia sercowego, który często obejmuje zablokowanie tętnicy wieńcowej, wynikające z zakrzepicy, skurczów naczyniowych ścian tętniczych lub infekcji wirusowej serca, może prowadzić do zastoinowej niewydolności serca i niedociśnienia układowego. Powikłania wtórne, takie jak globalna encefalopatia niedokrwienna, mogą się rozwinąć, jeśli zatrzymanie akcji serca jest wydłużone z ciągłą hipoperfuzją. Niedokrwienie mózgowe, powodowane najczęściej niedrożnością naczyniową z powodu miażdżycy, może różnić się ciężkością, od przejściowych ataków niedokrwiennych (TIA) do zawału mózgu lub udaru. Chociaż objawy TIA są przejściowe i

3 2 odwracalne, TIA wykazują tendencję do nawracania i często występuje po nich udar. [0005] Choroba zarostowa tętnic obejmuje chorobę tętnic wieńcowych, która może prowadzić do zawału mięśnia sercowego i choroby tętnic obwodowych, która może dotykać aorty brzusznej, jej głównych odgałęzień i tętnic nóg. Choroba tętnic obwodowych obejmuje chorobę Buerger a, chorobę Raynaud a i akrocyjanozę. Chociaż choroba tętnic obwodowych powodowana jest zazwyczaj przez miażdżycę, inne główne przyczyny obejmują np. cukrzycę itp. Powikłania związane z chorobą tętnic obwodowych obejmują ciężkie skurcze nóg, dławicę piersiową, nieprawidłowe rytmy serca, niewydolność serca, atak serca, udar i niewydolność nerek. [0006] Zaburzenia niedokrwienne i niedotlenieniowe są główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności. Choroby sercowo-naczyniowe są odpowiedzialne za 30% śmierci na świecie. Wśród różnych chorób sercowo-naczyniowych, choroba niedokrwienna serca i choroba mózgowo-naczyniowa powodują w przybliżeniu 17% śmierci. [0007] Leczenie zaburzeń niedokrwiennych i niedotlenieniowych skupione jest obecnie na łagodzeniu objawów i leczeniu zaburzeń sprawczych. Przykładowo, terapie dla zawału mięśnia sercowego obejmują nitroglicerynę i analgetyki do kontrolowania bólu i zmniejszania obciążenia serca. Inne leki, włączając digoksynę, diuretyki, amrinon, beta-blokery, środki obniżające lipidy i inhibitory enzymu przekształcającego angiotensynę stosuje się do stabilizowania stanu chorobowego, ale żadna z tych terapii bezpośrednio nie jest skierowana na uszkodzenie tkanki wytwarzane przez niedokrwienie i niedotlenienie. [0008] Ze względu na braki w obecnym leczeniu, utrzymuje się potrzeba dla sposobów, które są skuteczne w leczeniu stanów chorobowych obejmujących niedotlenienie. Istnieje również potrzeba dla sposobów, które są skuteczne w zapobieganiu uszkodzenia tkanek powodowanego niedokrwieniem, które pojawia się ze względu np. na miażdżycę, cukrzycę czy zaburzenia płucne. [0009] Stanom chorobowym związanym z niedokrwieniem i niedotlenieniem towarzyszy zazwyczaj stan zapalny. Z tego względu potrzebne są środki i sposoby, które redukują również stan zapalny. [0010] Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zapewnienie środków, które pozwalają na skuteczne leczenie chorobowych stanów zapalnych, korzystnie stanów zapalnych związanych z niedokrwieniem. [0011] Niniejszy wynalazek dotyczy miejscowego preparatu farmaceutycznego do stosowania w leczeniu chorobowego stanu zapalnego skóry, korzystnie stanu chorobowego skóry związanego z niedokrwieniem, zawierającego supernatant z roztworu fizjologicznego, którego uzyskanie możliwe jest poprzez hodowanie przez co najmniej 1 godz. jednojądrzastych komórek krwi

4 3 obwodowej (PBMC) lub ich podzbioru w roztworze fizjologicznym pozbawionym substancji powodujących proliferację PBMC i aktywację PBMC. [0012] Okazało się, że podawanie preparatu farmaceutycznego, jaki zdefiniowano powyżej, pacjentowi cierpiącemu z powodu chorobowego stanu zapalnego skóry, korzystnie stanu chorobowego skóry związanego z niedokrwieniem, skutkuje złagodzeniem poszczególnych objawów i procesem gojenia ran. [0013] Preparat farmaceutyczny według niniejszego wynalazku zawiera supernatant hodowanych PBMC lub ich podzbioru. W trakcie hodowli PBMC, komórki te ekspresjonują i wydzielają substancje, takie jak cytokiny, które różnią się od tych ekspresjonowanych i wydzielanych w zaktywowanych PBMC. Oznacza to, że sekretom PBMC według niniejszego wynalazku różni się od sekretomu zaktywowanych PBMC. Komórki według niniejszego wynalazku przechodzą wytwarzanie sekretomu wyzwalane cząsteczką inną niż z powierzchni komórki. Zatem, zaskakujące jest, że supernatant PBMC, których nie kontaktowano z substancjami aktywującymi PBMC, takimi jak PHA czy LPS, można zastosować do leczenia chorobowych stanów zapalnych skóry, co pokazuje, że sekretom tych komórek zawiera substancje wspierające leczenie wspomnianych stanów chorobowych. Supernatant jest szczególnie odpowiedni do leczenia chorobowego stanu niedokrwienia skóry. [0014] Supernatant PBMC według niniejszego wynalazku można uzyskiwać poprzez hodowanie ich w roztworze fizjologicznym, który nie zawiera substancji powodujących proliferację PBMC i aktywację PBMC. Jednakże, PBMC inkubuje się w roztworze fizjologicznym przez co najmniej 1 godz. Ten minimalny czas hodowania wymagany jest, aby umożliwić PBMC wydzielenie cytokin i innych korzystnych substancji. [0015] Część PBMC z preparatu według niniejszego wynalazku można uzyskać z pełnej krwi, stosując sposoby znane w stanie techniki, takie jak gradient Ficoll, lizę hipotoniczną itd. Sposoby te są dobrze znane w stanie techniki. [0016] PBMC z preparatu farmaceutycznego można uzyskiwać od puli donorów lub od tego samego osobnika, do którego preparat zostanie podany. [0017] Roztwór fizjologiczny, z którego uzyskuje się supernatant, zawiera co najmniej 500, korzystnie co najmniej 1000, korzystniej co najmniej 10 5, jeszcze korzystniej co najmniej 10 6, komórek na ml roztworu lub na dawkę jednostkową. [0018] Stosowany niniejszym "roztwór fizjologiczny" dotyczy płynnego roztworu, w którym hodowane są PBMC przed ich zastosowaniem w preparacie farmaceutycznym według niniejszego wynalazku. [0019] "Roztwór fizjologiczny" dotyczy również roztworu, który nie prowadzi do śmierci PBMC w

5 4 ciągu godziny, korzystnie w ciągu 30 min. Jeśli liczba żywotnych PBMC obniża się w roztworze o 75%, korzystniej o 90% w ciągu jednej godziny, korzystnie w ciągu 30 min., roztworu nie uważa się za "roztwór fizjologiczny", jak zdefiniowano niniejszym. "Roztwór fizjologiczny" nie prowadzi do spontanicznej lizy PBMC, gdy zostaną one skontaktowane ze wspomnianym roztworem. [0020] W tym kontekście, etap "uprawiania" lub "hodowania" obejmuje lub składa się z etapu "inkubowania", etapu w którym komórki są kontaktowane z roztworem przez zdefiniowany czas (co najmniej 1 godz., korzystnie co najmniej 4 godz., korzystniej co najmniej 8 godz., jeszcze korzystniej co najmniej 12 godz.) w warunkach, które stosuje się normalnie do hodowania PBMC. [0021] Wyrażenie "stan chorobowy skóry związany z niedokrwieniem" w kontekście niniejszego wynalazku może być stosowany zamiennie z wyrażeniem "niedokrwienne stany chorobowe skóry" i oznacza jakikolwiek stan chorobowy, chorobę lub zaburzenie, w którym obszary ciała człowieka lub zwierzęcia pozbawione są odpowiedniej podaży tlenu, co skutkuje uszkodzeniem lub dysfunkcją tkanki. Patologiczny stan chorobowy może się charakteryzować zmniejszeniem lub zniesieniem dostarczania krwi w obrębie skóry lub jej części, co może być spowodowane ściśnięciem lub niedrożnością naczynia krwionośnego. Takie stany chorobowe określa się niniejszym łącznie za pomocą wyrażenia "niedokrwienie" lub "stany chorobowe skóry związane z niedokrwieniem" lub "stan chorobowy skóry dotyczący niedokrwienia". Przykładowo, w chorobie serca niedokrwienie stosuje się często do opisania mięśnia sercowego, który nie otrzymuje właściwej ilości krwi bogatej w tlen, ze względu na zwężone lub zablokowane tętnice wieńcowe. Objawy niedokrwienia zależą od organu, który jest "niedokrwiony". W przypadku serca, niedokrwienie skutkuje często dusznicą bolesną. Niedokrwienie w mózgu może skutkować udarem. Chorobowym stanom niedokrwiennym towarzyszy stan zapalny. [0022] Nieograniczające przykłady patologicznych stanów chorobowych skóry, które dotyczą stanu zapalnego, w szczególności niedokrwienia, obejmują rany, rany przewlekłe, rany cukrzycowe, wrzody skóry, łuszczycę itp. [0023] Niezależnie jednak od powyższych, patologiczny stan chorobowy w kontekście wynalazku może charakteryzować się uszkodzeniem lub dysfunkcją komórek śródbłonka, tj. raną. Nieograniczającymi przykładami ran, które można leczyć dzięki zastosowaniu preparatu według niniejszego wynalazku, są rany przewlekłe, rany cukrzycowe, wrzody, poparzenia, choroba zapalna skóry i nieswoiste zapalenie jelit. [0024] "Roztwór fizjologiczny", jak stosuje się niniejszym, jest korzystnie roztworem, wykazującym ciśnienie osmotyczne, które nie prowadzi do niszczenia PBMC czy ich podzbioru i

6 5 może być bezpośrednio podawany osobnikowi. [0025] Wyrażenie "wolny od substancji powodujących proliferację PBMC i aktywację PBMC" dotyczy roztworu fizjologicznego, który nie zawiera substancji, które aktywują PBMC i indukują proliferację PBMC lub ich podzbioru. Substancje te obejmują PHA, LPS itd. [0026] Według korzystnego przykładu wykonania niniejszego wynalazku, chorobę zapalną skóry wybiera się z grupy składającej się ze stanu zapalnego, stanu zapalnego wywołanego hipoksją i choroby autoimmunologicznej, korzystnie łuszczycy, trądziku, trądziku różowatego, piodermii zgorzelinowej, zapalenia skóry, choroby atopowej skóry, alergicznego kontaktowego zapalenia skóry, łojotokowego zapalenia skóry, rumienia guzowatego, infekcyjnej choroby skóry, spowodowanej przez zakażenie bakteryjne, wirusowe, grzybowe, pasożytnicze, użądlenia, ugryzienia i pokrzywki oraz stanów chorobowych skóry związanych z niedokrwieniem. Szczególnie korzystnymi stanami chorobowymi skóry są stany chorobowe skóry związane z niedokrwieniem. [0027] Według szczególnie korzystnego przykładu wykonania niniejszego wynalazku, stan chorobowy skóry związany z niedokrwieniem wybiera z grupy składającej się z ran, niedokrwienia tkanki, ran przewlekłych, ran cukrzycowych, wrzodu skóry, poparzeń skóry, płatów skóry w chirurgii plastycznej i regeneracji tkanki po przeszczepie dentystycznym. [0028] Podzbiorem jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) są korzystnie komórki T, komórki B lub komórki NK. Oczywiście, możliwe jest również zastosowanie kombinacji tych komórek: komórek T i komórek B; komórek T i komórek NK; komórek B i komórek NK; komórek T, komórek B i komórek NK. Sposoby zapewniania i izolowania wspomnianych komórek są znane. [0029] W sposób zaskakujący okazało się, że PBMC według niniejszego wynalazku można hodować w dowolnym rodzaju roztworu pod warunkiem, że wspomniany roztwór nie zawiera substancji, które nie są farmaceutycznie dopuszczalne, nie prowadzą do natychmiastowej śmierci PBMC (jak zdefiniowano powyżej), nie aktywują PBMC i nie stymulują proliferacji PBMC. Zatem roztwór do stosowania wykazuje przynajmniej właściwości osmotyczne, które nie prowadzą do lizy PBMC. Roztwór fizjologiczny jest korzystnie roztworem fizjologicznym soli, korzystnie roztworem fizjologicznym NaCl, pełnej krwi, frakcji krwi, korzystnie surowicy lub pożywką do hodowli komórkowej. [0030] Pożywkę do hodowli komórkowej wybiera się korzystnie z grupy składającej się z RPMI, DMEM, X-vivo i Ultraculture. [0031] Według szczególnie korzystnego przykładu wykonania niniejszego wynalazku, komórki według niniejszego wynalazku hoduje się w warunkach wywołujących stres.

7 6 [0032] Stosowane niniejszym wyrażenie "w warunkach wywołujących stres" dotyczy warunków hodowlanych, prowadzących do zestresowania komórek. Warunki powodujące stres dla komórek obejmują, między innymi, ciepło, substancje chemiczne, promieniowanie, niedotlenienie, ciśnienie osmotyczne itd. [0033] Dodatkowy stres dla komórek według niniejszego wynalazku prowadzi do dalszego wzrostu ekspresji i wydzielania substancji korzystnych dla leczenia chorobowego stanu zapalnego skóry, w szczególności stanów chorobowych skóry związanych z niedokrwieniem. [0034] Według korzystnego przykładu wykonania niniejszego wynalazku warunki wywołujące stres obejmują niedotlenienie, ozon, ciepło (np. więcej niż 2 C, korzystnie więcej niż 5 C, korzystniej więcej niż 10 C powyżej optymalnej temperatury hodowlanej PBMC, tj. 37 C ), promieniowanie (np. promieniowanie UV, promieniowanie gamma), substancje chemiczne, ciśnienie osmotyczne (tj. warunki osmotyczne, które są podniesione o co najmniej 10% w porównaniu do warunków osmotycznych występujących normalnie w płynie ciała, w szczególności w krwi) lub ich kombinacje. [0035] Jeżeli do stresowania PBMC według niniejszego wynalazku stosuje się promieniowanie, komórki napromieniowuje się korzystnie za pomocą co najmniej 10 Gy, korzystnie co najmniej 20 Gy, korzystniej co najmniej 40 Gy, przy czym stosuje się korzystnie źródło w postaci cezu Cs [0036] Według korzystnego przykładu wykonania niniejszego wynalazku, niezaktywowane PBMC lub ich podzbiór hoduje się w pożywce przez co najmniej 4 godz., korzystnie przez co najmniej 6 godz., korzystniej przez co najmniej 12 godz. [0037] Preparat farmaceutyczny według niniejszego wynalazku podaje się miejscowo. Z tego względu, wspomniany preparat zapewnia się korzystnie jako żel, korzystnie hydrożel, jako maść, jako plaster skórny, jako farmaceutycznie dopuszczalną matrycę, korzystnie matrycę kolagenowo/elastynową (patrz np. Haslik W et al. J PlastReconstAesthSurg (2008): "Management of fullthickness skin defects in the hand and wrist region: first longterm experiences with the dermal matrix Matriderm"), jako pastę, jako krem, jako proszek, jako płyn do nacierania lub jako lotion. [0038] Preparat farmaceutyczny według niniejszego wynalazku może zawierać farmaceutycznie dopuszczalne rozczynniki, takie jak rozcieńczalniki, stabilizatory, nośniki itp. W zależności od postaci dawkowania, preparat według niniejszego wynalazku zawiera odpowiednie składniki. Sposoby ich otrzymywania są dobrze znane specjaliście w dziedzinie. [0039] W celu wydłużenia okresu trwałości preparatu według niniejszego wynalazku, roztwór a) lub supernatant b) liofilizuje się. Sposoby liofilizowania takich preparatów są dobrze znane

8 7 specjaliście w dziedzinie. [0040] Przed zastosowaniem, liofilizowany preparat można kontaktować z wodą lub roztworem wodnym, zawierającym bufory, stabilizatory, sole itd. [0041] Inny przykład wykonania niniejszego wynalazku dotyczy zastosowania preparatu jak zdefiniowano powyżej, do wytwarzania leku do leczenia chorobowego stanu zapalnego skóry, w szczególności stanu chorobowego skóry związanego z niedokrwieniem. [0042] Jeszcze inny przykład wykonania niniejszego wynalazku dotyczy sposobu otrzymywania miejscowego preparatu farmaceutycznego, jak ujawniono niniejszym, obejmującego etapy a) zapewniania jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) lub ich podzbioru, b) hodowania komórek z etapu a) w roztworze fizjologicznym wolnym od substancji powodujących proliferację PBMC i aktywację PBMC przez co najmniej 1 godz., c) izolowania supernatantu z etapu b) id) otrzymywania preparatu farmaceutycznego z zastosowaniem supernatantu z etapu c). [0043] Preparat według niniejszego wynalazku można uzyskiwać przez inkubowanie lub hodowanie PBMC w roztworze fizjologicznym przez co najmniej 1 godz., korzystnie co najmniej 4 godz., korzystniej co najmniej 8 godz., jeszcze korzystniej co najmniej 12 godz. W trakcie tego etapu PBMC zaczynają syntezować i wydzielać substancje, które są użyteczne w leczeniu chorobowych stanów zapalnych. Przed, po i w trakcie trwania etapu hodowania komórki nie są aktywowane poprzez dodawanie substancji aktywujących PBMC, jak PHA czy LPS. Po etapie hodowania komórki i/lub supernatant z hodowli izoluje się do dalszego zastosowania w otrzymywaniu końcowego preparatu farmaceutycznego. Jak omówiono powyżej, preparat farmaceutyczny może zawierać hodowane PBMC, supernatant z hodowli, w którym inkubowano wspomniane komórki lub zarówno hodowane PBMC, jak i pożywką hodowlaną. [0044] Według korzystnego przykładu wykonania niniejszego wynalazku, komórki poddaje się warunkom wywołującym stres przed lub w trakcie etapu b), przy czym wspomniane warunki wywołujące stres obejmują niedotlenienie, ozon, ciepło, promieniowanie, substancje chemiczne, ciśnienie osmotyczne (np. wywoływane przez dodatek soli, w szczególności NaCl, w celu uzyskania ciśnienia osmotycznego wyższego niż to we krwi), przesunięcie ph (tj. zmianę ph poprzez dodanie kwasów lub wodorotlenków, dla uzyskania wartości ph wynoszącej od 6,5 do 7,2 lub od 7,5 do 8,0) lub ich kombinacji. [0045] Według korzystnego przykładu wykonania niniejszego wynalazku, komórki napromieniowuje się przed lub w trakcie etapu b) za pomocą co najmniej 10 Gy, korzystnie co

9 8 najmniej 20 Gy, korzystniej co najmniej 40 Gy za pomocą ozonu, za pomocą podniesionej temperatury lub za pomocą promieniowania UV. [0046] Inny przykład wykonania niniejszego wynalazku dotyczy preparatu możliwego do uzyskania za pomocą sposobu, jaki opisano powyżej. [0047] Inny przykład wykonania niniejszego wynalazku dotyczy sposobu leczenia chorobowych stanów zapalnych skóry, szczególnie stanów chorobowych skóry związanych z niedokrwieniem, poprzez podawanie osobnikowi, który tego potrzebuje, odpowiedniej ilości preparatu farmaceutycznego według niniejszego wynalazku. [0048] Niniejszy wynalazek zilustrowano dodatkowo za pomocą następujących figur i przykładów, jednakże bez jego ograniczania do nich. [0049] Na Fig. 1 przedstawiono wpływ supernatantów (SN) uzyskanych z hodowli jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) na migrację komórek w przypadku ludzkich pierwotnych keratynocytów (KC) i fibroblastów skóry (FB). [0050] KC i FB hodowano w pożywce wzrostowej odpowiednio dla KC i DMEM (uzupełnionej 10% FBS). Po osiągnięciu konfluentności, monowarstwę komórek zadrapywano za pomocą końcówki pipety i hodowano dalej z SN pochodzącym z PBMC przez 16 godz. Mogliśmy wykryć jedynie niewielki wpływ SN od żyjących PBMC (LL) na KC, podczas gdy SN od apoptotycznych PBMC (APO) silnie indukował migrację KC. Tymczasem, oba SN (LL i APO) silnie indukowały migrację komórek w przypadku skórnych FB. [0051] Na Fig. 2 przedstawiono wpływ SN pochodzącego od PBMC na progresję cyklu komórkowego KC i FB. [0052] Proliferujące KC i FB hodowano w SN pochodzącym od PBMC. Po 24 godz. komórki inkubowano z BrdU przez 2 godz. i dodatkowo traktowano jak wskazano w instrukcji użytkownika (zestaw [do analizy] cyklu komórkowego BrdU-FACS, BD Biosciences). Jak przedstawiono na Fig. 2, stymulowanie FB za pomocą SN pochodzącego od PBMC doprowadziło do zmniejszenia populacji komórek proliferujących, czemu towarzyszył wzrost [liczby] komórek w fazie G2/M. W przeciwieństwie do tego, stwierdzono znaczący wzrost proliferujących KC przy pomocy zarówno LL-, jak i APO-SN. Jednakże, wpływ SN pochodzącego od komórek apoptotycznych był bardziej wyraźny w przypadku KC. [0053] Fig. 3 przedstawia silne wzmocnienie gojenia ran in vivo przez SN pochodzący od PBMC. [0054] Kremy zawierające SN-PBMC LL (Fig. 3a, b) albo APO (Fig. 3b) nanoszono na 6 mm ranę po biopsji sztancowej na plecach myszy B6/129 natychmiast po powstaniu rany. 8 dni po powstaniu rany myszy uśmiercano, a rany analizowano za pomocą barwienia H&E. Jak

10 9 przedstawiono na Fig. 3a i 3b, oba SN silnie wzmacniały gojenie się ran, zarówno w części skóry w postaci skóry właściwej, jak i nabłonka. [0055] Na Fig. 4 przedstawiono silne wzmocnienie gojenia ran in vivo przez SN pochodzący od PBMC. [0056] Rozmiar rany mierzono podczas pierwszych 5 dni po powstaniu rany do utworzenia strupa. Jak przedstawiono na Fig. 4, stwierdzono, że podczas całych 5 dni zamykanie się ran po leczeniu za pomocą kremów zawierających supernatanty pochodzące od PBMC było dużo szybsze w porównaniu z użyciem samego kremu. Podczas gdy rozmiar ran w pewien sposób zwiększył się podczas pierwszych 2 dni przy samym kremie, rany leczone supernatantami pochodzącymi od PBMC zaczynały się zamykać podczas pierwszych 24 godz. po powstaniu rany i aplikacji kremów. [0057] Na Fig. 5 przedstawiono zwiększoną angiogenezę w mysich ranach in vivo po leczeniu za pomocą SN pochodzącego od PBMC. [0058] Poprzez immunohistochemię pod kątem czynnika VIII (Fig. 5a) i CD31 (Fig. 5b), przy czym oba są markerami naczyń krwionośnych, stwierdzono znaczny wzrost [liczby] komórek pozytywnych pod względem CD31 w przypadku ran leczonych SN w porównaniu do kontroli, co wskazuje na zwiększenie angiogenezy, która mogła przyczynić się do zwiększonego gojenia ran. W przeciwieństwie do tego, nie można było wykryć zwiększonej liczby komórek proliferujących w tym punkcie czasowym, jak przeanalizowano poprzez barwienie Ki67 (Fig. 5a). [0059] Na Fig. 6a pokazano, że ani niestymulowane, żywotne PBMC, ani IA-PBMC nie wydzielają prozapalnej cytokiny TNF-α, pochodzącej głównie z monocytów. (Poziomy istotności oznaczono następująco: * p=0,05, ** p=0,001; n=8) [0060] Na Fig. 6b przedstawiono silną indukcję wydzielania prozapalnego interferonu-γ po aktywacji w porównaniu z niestymulowanymi PBMC. (Poziomy istotności oznaczono następująco: * p=0,05, ** p=0,001; n=8) [0061] Na Fig. 7a przedstawiono zebrane wyniki analizy cytometrii przepływowej. PBMC bramkowano pod kątem komórek T i oceniano ekspresję markerów aktywacji, CD69 i CD25. (Poziomy istotności oznaczono następująco: * p=0,05, ** p=0,001; n=4) [0062] Na Fig. 7b przedstawiono analizę reprezentatywnego FACS dla komórek PBMC, także aktywowanych (PHA, CD3 mab). Bramkowanie przedstawia % komórek pozytywnych. [0063] Na Fig. 8 przedstawiono wysokie prędkości proliferacji stymulowanych PBMC, jak zmierzono za pomocą inkorporacji 3[H]-tymidyny, w porównaniu z żywotnymi PBMC, hodowanymi w RPMI bez stymulacji. [0064] Na Fig. 9 przedstawiono hamowanie odpowiedzi komórek T z sekretomu PBMC w teście

11 10 proliferacji komórek T. [0065] Na Fig. 10 przedstawiono eksperymenty stymulacji anty-cd3 i PHA, wykonane z użyciem PBMC. [0066] Na Fig. 11 przedstawiono proliferację PBMC pod wpływem stymulacji za pomocą anty- CD3, PHA i mieszanych limfocytów. [0067] Na Fig. 12 przedstawiono poziom aneksyny V i odpowiedzi pozytywnej pod kątem PI z supernatantu komórek CD4+ inkubowanych z supernatantami PBMC. [0068] Na Fig. 13 przedstawiono hamowanie przez supernatant PBMC regulacji wzmacniającej CD25 i CD69 w komórkach CD4+. [0069] Na Fig. 14 pokazano, że wycofanie IL-10 i TGF-β nie zwiększa sprędkości proliferacji komórek CD4+. PRZYKŁADY: Przykład 1: Supernatanty z hodowli jednojądrzastych komórek krwi obwodowej silnie wzmacniają gojenie ran. [0070] Niegojące się wrzody skóry są często odporne na większość popularnych sposobów leczenia. We wcześniejszym badaniu pokazano, że zastosowanie jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) razem z podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów wydaje się być użyteczne do leczenia zgorzeli cukrzycowej. W niniejszym przykładzie badano, czy supernatanty z hodowli PBMC (nienapromieniowane lub napromieniowane) są wystarczające do wywołania zwiększonego gojenia ran w modelu mysim. Ponadto, analizowano wpływ tych supernatantów na ludzkie, pierwotne fibroblasty (FB), keratynocyty (KC) i komórki śródbłonka (EC). [0071] Poprzez inkubację FB i KC z supernatantami pochodzącymi od PBMC stwierdzono, że supernatanty z komórek, zarówno nienapromieniowanych, jak i napromieniowanych, silnie indukowały migrację FB, podczas gdy nie wpływały na proliferację FB. W przeciwieństwie do tego pokazano, że oba supernatanty były skuteczne wobec KC w odniesieniu do ich zdolności do migracji i proliferacji. Jednakże, wpływ supernatantów pochodzących od komórek napromieniowanych był bardziej wyraźny. Ponieważ supernatanty pochodzące od PBMC indukowały mechanizmy migracyjne i proliferacyjne in vitro, zbadano dodatkowo, czy supernatanty te są również zdolne indukować gojenie się ran in vivo. Z tego względu, otrzymano kremy zawierające supernatant PBMC i zastosowano je na 6 mm rany po biopsji sztancowej na plecach myszy B6/129 natychmiast po powstaniu ran. Wielkość ran mierzono podczas

12 11 następnych 4-5 dni, do czasu utworzenia strupa. W sposób zaskakujący stwierdzono, że podczas całych 5 dni zamykanie się ran po leczeniu za pomocą kremów zawierających supernatanty pochodzące od PBMC było dużo szybsze w porównaniu ze stosowaniem samego kremu. Co interesujące, podczas gdy wielkość ran nieco zwiększyła się podczas pierwszych 2 dni przy samym kremie, rany leczone supernatantami pochodzącymi od PBMC zaczynały się zamykać podczas pierwszych 24 godz. po powstaniu rany i aplikacji kremów dni po powstaniu rany myszy uśmiercano, a rany analizowano za pomocą barwienia H&E i poprzez immunohistochemię pod kątem CD31, markera naczyń krwionośnych. Barwienie H&E ujawniło, że gojenie się ran, zarówno w częściach skóry w postaci skóry właściwej, jak i naskórka, było bardziej zaawansowane w obecności kremów z supernatantów pochodzących od PBMC. Ponadto, odnotowano ogromny wzrost ilości komórek pozytywnych pod względem CD31 w takich ranach, co wskazuje na zwiększoną angiogenezę, która mogła się przyczynić do zwiększonego gojenia ran. [0072] Podsumowując, pokazano, że supernatanty pochodzące od PBMC prowadziły do zwiększenia gojenia się ran u myszy oraz, że supernatanty te indukowały również proliferację i migrację w ludzkich komórkach in vitro. Formulacja kremów zawierających supernatanty PBMC może stanowić dużą korzyść dla leczenia niegojących się wrzodów skóry (patrz Fig. 1 do 5). Przykład 2: Spoczynkowe jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) wskazują na niskie wytwarzanie markera aktywacji i zmniejszone [wytwarzanie] cytokiny zapalnej [0073] Przypuszcza się, że aktywowane jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) i ich supernatanty (SN) są korzystne w regeneracji ran (Holzinger C et al. Eur J Vasc Surg Maj; 8(3): 351-6). W przykładach 1 i 2 można pokazać, że nieaktywowane PBMC i pochodzący z nich SN ma korzystne działania w eksperymentalnym, ostrym zawale mięśnia sercowego (AMI) i modelu powstawania ran. Ze względu na to, że brak aktywacji PBMC musiał być zweryfikowany eksperymentalnie, zbadano, czy hodowla PBMC prowadzi do zwiększonego wydzielania markerów aktywacji komórek T (CD69, CD25) lub zwiększonego [wydzielania] cytokin zapalnych (aktywacja monocytów=tnfα, aktywacja komórek T=INF-γ). W eksperymencie kontrolnym hodowane komórki T wyzwalano poprzez stymulację CD3 mab lub fitohemaglutyniną (PHA). Sposoby i wyniki [0074] Krew żylną od zdrowych ochotników zbierano w probówkach z EDTA. Po rozdzieleniu w

13 12 gradiencie gęstości Ficoll-Hypaque, PBMC zbierano i rozdzielano na żywotne i napromieniowane komórki apoptotyczne (IA-PBMC). Dla otrzymania komórek apoptotycznych, PBMC napromieniowywano za pomocą 60 Gy (Cez-137). Do analizy w ramach cytometrii przepływowej PBMC hodowano w 200ml pożywki bez surowicy. Komórki stymulowano za pomocą PHA (7µg/ml) lub CD3-mAb (10µg/ml) albo pozostawiano je niestymulowanymi. Po 24 godz. inkubacji komórki przemywano, wybarwiano pod kątem CD3, CD69 i CD25 (R&D System) i oceniano pod względem powierzchniowych markerów aktywacji na FC500 (Coulter). Do testu ELISA, PBMC hodowano przez noc przy gęstości wynoszącej 2,5x10 6 komórek/ml, z lub bez stymulacji PHA lub CD3. Po 24 godz. supernatanty zbierano i zamrażano w -20 C. Zakupiono dostępne handlowo zestawy ELISA dla TNF-α (R&D) i INF-γ (Bender). W skrócie, płytki MaxiSorp pokrywano przeciwciałami skierowanymi przeciwko TNF-α oraz INF-γ i przechowywano przez noc. Po 24 godz., płytki przemywano i w dwóch powtórzeniach do każdej studzienki dodawano próbki. Po inkubacji i dodaniu przeciwciała do detekcji oraz streptawidyny- HRP, do każdej studzienki dodawano substrat TMB. Po uzyskaniu zabarwienia, reakcję enzymatyczną zatrzymywano poprzez dodanie kwasu siarkowego. Wartości gęstości optycznej odczytywano na czytniku płytek Wallac Victor3. Wyniki: [0075] Analiza FACS: Komórki T stymulowane CD3 i PHA wykazały regulację wzmacniającą markerów aktywacji CD69 i CD25 po 24 godz. inkubacji. Niestymulowane i apoptotyczne komórki ekspresjonowały jedynie niskie ilości CD69 i CD25 (Fig. 6a (próba reprezentatywna, Fig. 6b, histogram, n=4). Istotność statystyczną wskazano za pomocą gwiazdki (xx p<0,001, x p<0,05). Analiza ELISA: Podczas gdy w niestymulowanych supernatantach pochodzących od PBMC nie wykryto ani TNF-α, ani INF-γ, supernatanty od PBMC stymulowanych PHA lub CD3 wykazały wysokie wartości dla tych cytokin, jak wskazano za pomocą analizy ELISA (gwiazdka ** p<0,001, * p<0,05, n=8). Wyniki pokazują wyraźnie różny wzór wydzielania cytokin zapalnych w porównaniu z niestymulowanymi PBMC. Wniosek: [0076] Dane te wskazują, że "niestymulowane PBMC" świadczą o wyraźnie innym fenotypie (marker aktywacji, wydzielanie cytokiny) w porównaniu ze stymulowanymi PBMC (PHA i CD3 mab).

14 13 [0077] Na Fig. 6a wskazano, że ani niestymulowane, żywotne PBMC, ani IA-PBMC nie wydzielają prozapalnej cytokiny TNF-α, pochodzącej głównie z monocytów. (Poziomy istotności oznaczono następująco: * p=0,05, ** p=0,001; n=8) [0078] Na Fig. 6b przedstawiono silną indukcję wydzielania prozapalnego interferonu-γ po aktywacji, w porównaniu z niestymulowanymi PBMC. (Poziomy istotności oznaczono następująco: * p=0,05, ** p=0,001; n=8) [0079] Na Fig. 7a przedstawiono zebrane wyniki analizy cytometrii przepływowej. PBMC bramkowano pod kątem komórek T i oceniano ekspresję markerów aktywacji, CD69 i CD25. (Poziomy istotności oznaczono następująco: * p=0,05, ** p=0,001; n=4) [0080] Na Fig. 7b przedstawiono analizę reprezentatywnego FACS dla komórek PBMC, także aktywowanych (PHA, CD3 mab). Bramkowanie przedstawia % komórek pozytywnych. Przykład 3: Proliferatywna aktywność PBMC hodowanych w roztworze fizjologicznym [0081] Celem tego przykładu jest udowodnienie, że PBMC nie mają aktywności proliferatywnej w porównaniu z testami immunologicznymi, które wykorzystują specyficzne (CD3), niespecyficzne (lecytyna, PHA) i allogeniczne wyzwalanie komórek T (reakcja mieszanych limfocytów, P9LR) w dniu 2 (CD3, PHA) i dniu 5 (MLR) testu stymulacji. Materiały i sposoby [0082] PBMC od młodych, zdrowych osobników oddzielano za pomocą wirowania w gradiencie gęstości Ficoll i ponownie zawieszano w RPMI (Gibco, USA), zawierającym 0,2% siarczan gentamycyny (Sigma Chemical Co, USA), 1% L- glutaminę (Sigma, USA) przy 1*105 komórek na 200pl. Komórki odpowiadające stymulowano albo za pomocą MoAb względem CD3 (10µg/ml, BD, NJ, USA), PHA (7ml/ml, Sigma Chemical Co, USA), albo za pomocą napromieniowanych, allogenicznych PBMC w stosunku 1: 1 (dla MLR). Płytki inkubowano przez 48 godz. lub 5 dni, a następnie pulsowano przez 18 godz. za pomocą 3[H]-tymidyny (3,7*101 Bq/studzienkę; Amersham Pharmacia Biotech, Szwecja). Komórki zbierano, a inkorporację 3[H]- tymidyny mierzono w cieczowym liczniku scyntylacyjnym. Wyniki: [0083] Stymulowane PBMC wykazały wysoką prędkość proliferacji, jak zmierzono za pomocą

15 14 inkorporacji 3[H]-tymidyny, w porównaniu z żywotnymi PBMC, hodowanymi w RPMI bez stymulacji (Fig. 8). Efekt ten zaobserwowano poprzez dodawanie specyficznych bodźców dla komórek T (PHA, CD3), jak również w testach, w których proliferację uruchamiano za pomocą komórek prezentujących antygen (MLR). Wniosek: [0084] Ten zestaw eksperymentów wskazuje, że żywotne PBMC utrzymywane w hodowli przez do 5 dni nie ulegały proliferacji, podczas gdy PBMC stymulowane na różne sposoby wykazały znaczącą odpowiedź w postaci proliferacji. Można wysnuć wniosek, że hodowla PBMC bez stymulacji nie prowadzi do uzyskania odpowiedzi w postaci proliferacji. Przykład 4: Sekretom oddzielonych PEMC trzymanych w warunkach sterylnej hodowli ma zdolności neoangiogenne. [0085] Ponieważ neoangiogeneza i stan zapalny są mocno powiązane in vivo, zbadano czy te sekretomy PBMC wykazują również wpływ przeciwproliferacyjny na komórki T i z tego względu zakłócają zapalną odpowiedź immunologiczną. Materiały i sposoby [0086] Sekretom uzyskano inkubując PBMC (2,5*106/ml) od młodych, zdrowych ochotników, oddzielone za pomocą wirowania w gradiencie gęstości Ficoll, przez 24 godz. w RPMI (Gibco, CA, USA), zawierającym 0,2% siarczan gentamycyny (Sigma Chemical Co, USA), 1% L-glutaminę (Sigma, USA). Supernatanty oddzielano od frakcji komórkowej i przechowywano w - 80 C. Do badania proliferacji allogeniczne PBMC pon ownie zawieszano przy 1*105 komórek na 200ml RPMI po oddzieleniu. Komórki odpowiadające stymulowano albo za pomocą MoAb względem CD3 (10µg/ml, BD, USA), albo PHA (7µl/ml, Sigma Chemical Co, USA). Dodawano różne rozcieńczenia supernatantów. Płytki inkubowano przez 48 godz., a następnie pulsowano przez 18 godz. za pomocą 3[H]-tymidyny (3,7*104 Bq/studzienkę; Amersham Pharmacia Biotech, Szwecja). Komórki zbierano, a inkorporację 3[H]-tymidyny mierzono w cieczowym liczniku scyntylacyjnym. Wyniki:

16 15 [0087] Substancje wydzielone (sekretom) przez allogeniczne PBMC wykazały znaczące zmniejszenie prędkości proliferacji, mierzonych za pomocą inkorporacji 3[H]-tymidyny, w porównaniu z kontrolami pozytywnymi (Fig. 9). Efekt ten był zależny od dawki i można go było zaobserwować pod wpływem stymulacji anty-cd3, jak również pod wpływem PHA. Implikacja: [0088] Ten zestaw eksperymentów wskazuje, że sekretom uzyskany z żywotnych PBMC, utrzymywanych w hodowli przez 24 godz. wykazuje znaczące działanie przeciwproliferacyjne in vitro. Dane te wskazują, że supernatant uzyskany z PBMC lub jego postać liofilizowana może służyć jako potencjalny preparat terapeutyczny do leczenia chorób człowieka, które związane są ze stanem zapalnym wywołanym niedotlenieniem lub innymi chorobami hiperzapalnymi (np. choroby autoimmunologiczne, choroby zapalne skóry). Przykład 5: Czynniki parakrynne wydzielane przez jednojądrzaste komórki krwi obwodowej mają cechy immunosupresyjne [0089] W Przykładzie 1 wykazano działanie przeciwzapalne sekretomu PBMC w modelu zwierzęcym ostrego zawału mięśnia sercowego (AMI). W przykładzie tym pokazano, że zastosowanie sekretomu PBMC po wywołaniu AMI hamuje uszkodzenie zapalne mięśnia sercowego poprzez mocną regulację osłabiającą odpowiedź immunologiczną. [0090] Opierając się na tym stwierdzeniu, badano możliwe działania immunosupresyjne sekretomu w eksperymentach in vitro. Komórki CD4+ odgrywają kluczową rolę w instrumentacji odpowiedź immunologicznej, ze względu na to, że są one zasadniczymi do pomocy innym leukocytom (np. makrofagom, komórkom B, komórkom T cytotoksycznym) w procesach immunologicznych. Materiały i sposoby Otrzymywanie sekretomu PBMC [0091] PBMC od zdrowych ochotników oddzielano za pomocą wirowania w [gradiencie] gęstości

17 16 Ficoll. Komórki zawieszano ponownie w Ultra Culture Medium (Lonza, Bazylea, Szwajcaria) przy stężeniu wynoszącym 1*10 6 komórek/ml (sup liv). Dla otrzymywania sekretomu z apoptotycznych PBMC, indukowano apoptozę poprzez napromieniowywanie za pomocą 60Gy (sup APA). Komórki inkubowano przez 24 godz. w nawilżanej atmosferze (5% CO 2, 37 C, wilgotność względna 95%). Supernatanty usuwano i dializowano przy punkcie odcięcia 3,5 kda (Spectrum laboratories, Breda, Holandia) względem 50mM octanu amonu przez noc w 4 C. Następnie, supernatanty filtrowano sterylnie i liofilizowano. Liofilizowany sekretom przechowywano w -80 C i ponownie zawieszano świeży do każdego eksperymentu. Z sekretomu pobierano losowe próbki pod kątem ich wartości ph. Oddzielanie komórek CD4 [0092] Komórki CD4+ oddzielano poprzez zmniejszanie ilości komórek innych niż T CD4+, stosując system kuleczek MACS (Miltenyi, BergischGladbach, Niemcy). Przygotowywano świeże komórki i bezpośrednio stosowano do poszczególnych eksperymentów. Pomiar apoptozy [0093] Apoptozę wykrywano za pomocą cytometrii przepływowej, stosując dostępny handlowo zestaw Aneksyna V/PI (BD, New Jersey, USA). Apoptozę definiowano za pomocą pozytywnego barwienia aneksyny, późną apoptozę za pomocą pozytywnego PI. Eksperymenty proliferacji [0094] PBMC lub oczyszczone komórki CD4+ rozcieńczano w Ultra Culture suplementowanym za pomocą 0,2% siarczanu gentamycyny (Sigma, St. Louis, MO, USA), 0,5% R- merkaptoetanolu (Sigma, St Louis, MO, USA) i 1% GlutaMAX-I (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) do stężenia wynoszącego 1*105/studzienkę w 96-studzienkowej płytce o okrągłych dnach. Komórki stymulowano albo za pomocą PHA (7µg/ml, Sigma, USA), CD3 (10µg/ml, BD, New Jersey, USA), IL-2 (10U/ml, BD, USA) albo allogenicznymi, napromieniowanymi PBMC w stosunku 1:1 (60 Gy) dla MLR. Komórki inkubowano przez 48 godz. lub 5 dni (MLR) z różnymi stężeniami sekretomu PBMC, IL-10 lub TGF-β. Następnie, komórki pulsowano przez 18 godz. za pomocą 3 [H]-tymidyny (3,7 x 10 4 Bq/studzienkę; Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Szwecja). Komórki zbierano, a inkorporację 3[H]-tymidyny mierzono w cieczowym liczniku

18 17 scyntylacyjnym. Markery aktywacji [0095] Oczyszczone komórki CD4+ stymulowano za pomocą anty-cd3 (10µg/ml) i inkubowano razem z różnymi stężeniami sekretomu PBMC. Komórki wybarwiano pod kątem CD69 i CD25, postępując zgodnie ze standardowym protokołem barwienia dla cytometrii przepływowej i analizowano w cytometrze przepływowym FC500 (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA). Wyniki [0096] We wstępnych eksperymentach testowano przeciwproliferacyjne właściwości supernatantów PBMC od żywotnych komórek (sup liv). W eksperymentach stymulowania anty- CD3 i PHA, prędkość proliferacji była znacząco obniżona poprzez dodawanie sekretomu (n=10). [0097] Opierając się na tych wynikach oceniano wpływ sekretomu PBMC na część komórek T pomocniczych, ponieważ komórki te odgrywają kluczową rolę w zapoczątkowywaniu i utrwalaniu odpowiedzi immunologicznej. Analogicznie do Fig. 10, wysoce oczyszczone komórki CD4+ utraciły swoją zdolność proliferacyjną przez dodatek sekretomu. Zjawisko to obserwowano dla supernatantu z żywych, jak również apoptotycznych, napromieniowanych PBMC (Fig. 11, n=5). [0098] Następnym etapem było określenie możliwych wpływów sekretomu na żywotność komórek. Z tego względu, spoczynkowe komórki CD4+ inkubowano z supernatantem i oceniano odpowiedź pozytywną pod kątem aneksyny V i PI. Supernatanty z obu, żywotnych i apoptotycznych PBMC, wykazały wyraźne wpływy proapoptotyczne (Fig. 12, n=5). [0099] Dla przetestowania, czy sekretom PBMC mógł hamować aktywację komórek CD4+, oceniano markery aktywacji komórek T, CD25 i CD69, po stymulacji komórek CD4+ przez anty- CD3. Regulacja wzmacniająca obu markerów była znacząco i sposób zależny od dawki hamowana przez sekretom PBMC (Fig. 13, n=5). [0100] W ostatnim zestawie eksperymentów badano wpływ cytokin immunosupresyjnych, IL-10 i TGF-β, poprzez dodawanie w tych eksperymentach przeciwciał neutralizujących. Nie stwierdzono, żeby IL-10 czy TGF-β były odpowiedzialne za anty-proliferacyjne działanie naszego sekretomu PBMC, ponieważ wycofanie tych cytokin nie zwiększało prędkości proliferacji (Fig. 14, n=5). Wniosek

19 18 [0101] Eksperymenty te dowodzą po raz pierwszy, że (sekretom) substancje wydzielone z PBMC wykazują cechy immunosupresyjne in vitro. Pokazano, że supernatant a) zmniejsza prędkość proliferacji w eksperymentach stymulacji przez anty-cd3, PHA i MLR, b) ma moc indukowania apoptozy i hamuje aktywację komórek CD4+ pod wpływem wyzwalania komórek T.

20 19 Zastrzeżenia patentowe 1. Miejscowy preparat farmaceutyczny do stosowania w leczeniu chorobowego stanu zapalnego skóry, korzystnie stanu chorobowego związanego z niedokrwieniem, zawierający supernatant w postaci roztworu fizjologicznego, którego uzyskanie możliwe jest poprzez hodowanie przez co najmniej 1 godz. jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) lub ich podzbioru w roztworze fizjologicznym pozbawionym substancji powodujących proliferację PBMC i aktywację PBMC. 2. Preparat do stosowania w leczeniu chorobowego stanu zapalnego skóry według zastrz. 1, znamienny tym, że wspomniany stan chorobowy wybiera z grupy składającej się z ran, niedokrwienia tkanki, ran przewlekłych, ran cukrzycowych, wrzodu skóry, poparzeń skóry, płatów skóry w chirurgii plastycznej i regeneracji tkanki po przeszczepie dentystycznym. 3. Preparat do stosowania w leczeniu chorobowego stanu zapalnego skóry według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że podzbiorem jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) są komórki T, komórki B albo komórki NK. 4. Preparat do stosowania w leczeniu chorobowego stanu zapalnego skóry według dowolnego z zastrz. od 1 do 3, znamienny tym, że roztwór fizjologiczny jest roztworem fizjologicznym soli, korzystnie roztworem fizjologicznym NaCI, pełnej krwi, frakcji krwi, korzystnie surowicy albo pożywką do hodowli komórkowej. 5. Preparat do stosowania w leczeniu chorobowego stanu zapalnego skóry według zastrz. 4, znamienny tym, że pożywkę do hodowli komórkowej wybiera się z grupy składającej się z RPMI, DMEM, X-vivo i Ultraculture. 6. Preparat do stosowania w leczeniu chorobowego stanu zapalnego skóry według dowolnego z zastrz. od 1 do 5, znamienny tym, że komórki hoduje się w warunkach wywołujących stres.

21 20 7. Preparat do stosowania w leczeniu chorobowego stanu zapalnego skóry według zastrz. 6, znamienny tym, że warunki wywołujące stres obejmują niedotlenienie, ozon, ciepło, promieniowanie, substancje chemiczne, ciśnienie osmotyczne, przesunięcie ph albo ich kombinacje. 8. Preparat do stosowania w leczeniu chorobowego stanu zapalnego skóry według dowolnego z zastrz. od 1 do 7, znamienny tym, że PBMC lub ich podzbiór podczas hodowania poddawany jest stresowi poprzez co najmniej 10 Gy, korzystnie co najmniej 20 Gy, korzystniej co najmniej 40 Gy, za pomocą ozonu, za pomocą podniesionej temperatury albo za pomocą promieniowania UV. 9. Preparat do stosowania w leczeniu chorobowego stanu zapalnego skóry według dowolnego z zastrz. od 1 do 8, znamienny tym, że wspomniany preparat zapewnia się jako żel, korzystnie hydrożel, jako maść, jako plaster skórny, jako farmaceutycznie dopuszczalną matrycę, korzystnie matrycę kolagenowo/elastynową, jako pastę, jako krem, jako proszek, jako płyn do nacierania albo jako lotion. 10. Preparat do stosowania w leczeniu chorobowego stanu zapalnego skóry według dowolnego z zastrz. od 1 do 9, znamienny tym, że supernatant jest liofilizowany. 11. Preparat do stosowania w leczeniu chorobowego stanu zapalnego skóry według dowolnego z zastrz. od 1 do 10, znamienny tym, że PBMC lub ich podzbiór hoduje się we wspomnianym roztworze przez co najmniej 4 godz., korzystnie przez co najmniej 6 godz., korzystniej przez co najmniej 12 godz. 12. Zastosowanie preparatu jak zdefiniowano w dowolnym z zastrz. od 1 do 11 do wytwarzania leku do leczenie chorobowego stanu zapalnego skóry, korzystnie stanu chorobowego związanego z niedokrwieniem. 13. Sposób otrzymywania miejscowego preparatu farmaceutycznego określonego w dowolnym z zastrz. od 1 do 11, obejmujący etapy a) zapewniania jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) albo ich podzbioru,

22 21 b) hodowania komórek z etapu a) w roztworze fizjologicznym wolnym od substancji powodujących proliferację PBMC i aktywację PBMC przez co najmniej 1 godz., c) izolowania supernatantu z etapu b) i d) otrzymywania preparatu farmaceutycznego z zastosowaniem supernatantu z etapu c). 14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że komórki poddaje się warunkom wywołującym stres przed lub w trakcie etapu b), przy czym wspomniane warunki wywołujące stres obejmują niedotlenienie, ozon, ciepło, promieniowanie, substancje chemiczne, ciśnienie osmotyczne, przesunięcie ph lub ich kombinacje. 15. Sposób według zastrz. 13 albo 14, znamienny tym, że komórki napromieniowuje się przed lub w trakcie etapu b) za pomocą co najmniej 10 Gy, korzystnie co najmniej 20 Gy, korzystniej co najmniej 40 Gy za pomocą ozonu, za pomocą podniesionej temperatury lub za pomocą promieniowania UV. 16. Preparat farmaceutyczny możliwy do uzyskania za pomocą sposobu określonego w dowolnym z zastrz. 13 albo 15.

23 22

24 23

25 24

26 25

27 26

28 27

29 28

30 29

31 30

32 31

33 32

34 33

35 34

36 35

37 36

38 37

39 38

40 39

41 40

42 41

43 42 DOKUMENTY WYMIENIONE W OPISIE Poniższa lista wymienionych przez zgłaszającego dokumentów została dołączona wyłącznie dla informacji czytającego. Nie stanowi ona części europejskiego dokumentu patentowego. Została zestawiona z największą starannością, Europejski Urząd Patentowy nie bierze jednak żadnej odpowiedzialności za ewentualne błędy lub braki. Literatura niepatentowa cytowana w niniejszym opisie: HASLIK W et al. Management of fullthickness skin defects in the hand and wrist region: first longterm experiences with the dermal matrix Matriderm. J Plast Reconst Aesth Surg, 2008 [0037] HOLZINGER C et al. Eur J Vasc Surg., May 1994, t. 8 (3), [0073]