Techniki molekularne do identyfikacji pasożytów u ludzi. Danuta Grygierczyk

Transkrypt

1 Techniki molekularne do identyfikacji pasożytów u ludzi Danuta Grygierczyk

2 W laboratoryjnej diagnostyce parazytologicznej stosuje się rutynowo badania: Mikroskopowe Immunologiczne Biochemiczne Hodowle in vitro/ in vivo PCR- badania molekularne ( wybrane laboratoria) przydatność w wykrywaniu pasożytów oprócz materiału klinicznego, w próbach środowiskowych Zastosowanie PCR i innych technik molekularnych ma znaczenie: przy niskiej intensywności zarażenia gdy pasożyty są trudne lub niemożliwe do hodowli są trudności w różnicowaniu gatunków morfologicznie podobnych jeśli badania immunologiczne są niewystarczające

3 Molekularna diagnostyka pierwotniaków Toxoplasma gondii Główną rolę w diagnostyce laboratoryjnej odgrywają badania serologiczne. Przy rozpoznawaniu toksoplazmozy mózgowej i ocznej a także we wczesnym rozpoznawaniu zarażeń wrodzonych hodowla pasożytów z płynów ustrojowych poprzez dootrzewnową inokulację myszy ( kilka tygodni) PCR w toksoplazmozie wykorzystywane do poszukiwania sekwencji genów: B1, P30 i 18S rdna pasożyta Wykrywany materiał genetyczny to zawartość pojedynczych tachyzoitów

4 W inwazji prenatalnej diagnozowanie toksoplazmozy płynu owodniowego techniką PCR uzależnione jest od okresu, w którym doszło do zarażenia. Czułość PCR 92,9% - przy inwazji w II trymestrze ciąży Najwyższe prawdopodobieństwo uzyskania wyników fałszywie ujemnych- zarażenie przed 17 i po 21 tygodniu ciąży. Ujemny wynik badania płynu owodniowego metodą PCR nie może wykluczyć inwazji wrodzonej u płodu.

5 Otrzymanie pozytywnego wyniku amplifikacji nie jest możliwe we wszystkich przypadkach toksoplazmowego zapalenia mózgu. Brak DNA pasożyta w płynie mózgowo- rdzeniowym przy aktywnym procesie inwazji wynika z parenchymalnego umiejscowienia zmian z dala od opon mózgowych i komór mózgu. Toksoplazmoza oczna- amplifikacja genów: B1, P30 i 18S rdna pasożyta w płynie z przedniej komory oka i z wycinków siatkówki i naczyniówki. Wartość diagnostyczna tego badania jest jednak ograniczona ( mała objętość próbki, brak DNA T. gondii w płynie gdy inwazja obejmuje regiony odległe od komory przedniej gałki ocznej)

6 Antygeny rekombinowane pozwolą na określenie stadium choroby Otrzymano antygeny/ markery toksoplazmozy: mikronem (MIC), roptrii (ROP), granul (GRA), powierzchniowe (SAG), cytoplazmatyczny (BAG1) (bradyzoitów) Genotypowanie T. gondii znana sekwencja genów B1,P30, P23, P22, H4, H11 Polimorficzny gen SAG2 wskazuje na istnienie III odmiennych szczepów T. gondii; II najczęściej wywołuje toksoplazmozę wrodzoną bezobjawową przewlekłą. Może prowadzić także do poronień, powikłań ze strony OUN i narządu wzroku u płodu. I typ występuje rzadko u człowieka wywołując wrodzoną toksoplazmozę o ciężkim przebiegu. Typ III typowy u zwierząt.

7 Cryptosporidium spp. W stosunku do tego gatunku metody PCR stały się referencyjne w diagnostyce parazytologicznej ( czułość i swoistość). W odróżnieniu od konwencjonalnych metod pozwalają na wyróżnienie gatunków i/lub genogatunków Cryptosporidium inwazyjnych i patogennych dla człowieka oraz mają zastosowanie do badania prób środowiskowych ( kał, żywność, woda, gleba). Wykonujemy: PCR podstawowy, PCR-RFLP, FISH PCR-fingerprinting i PCR- sekwencjonowanie. Tradycyjne metody mikroskopowe i immunologiczne nie pozwalają na wyróżnienie szczepów. Na podstawie genotypowania różnych gatunków Cryptosporidium zostały wyodrębnione nowe : C. felis, C. wrairi; izolat C. parvum od psów, świń, myszy domowej, torbaczy, małp. W populacji ludzkiej 2 szczepy C.parvum - H( genotyp1)i C( genotyp 2).

8 Badania polimorfizmu w obrębie C. parvum pozwoliły na określenie pokrewieństwa pomiędzy gatunkami i szczepami pasożyta. Najbardziej filogenetycznie spokrewnione są szczepy H i C, izolat od małp i od myszy domowej; oddzielne gałęzie to izolaty od psów, świń torbaczy i C. felis. Najbardziej odległe filogenetycznie od specyficznie ludzkiego szczepu H są gatunki: C. muris, C. andersoni, C. serpentis i C. nasorum. Szczep H (genotyp1)- odpowiedzialny za epidemie miejskie, z dobrym układem odpornościowym Szczep C wspólny dla ludzi i zwierząt ( epidemie wodnopochodne na terenach rolniczych) oraz połowę zarażeń u nosicieli wirusa HIV

9 Entamoeba histolytica i E. dispar E. histolytica s.s. patogeniczny, w obrębie tego gatunku są szczepy patogeniczne i niepatogeniczne (badania izoenzymatyczne i genetyczne) Diamond i Clark dokonali w 1993r redeskrypcji gatunku E. histolytica, przywracając nazwę E. dispar niepatogeniczny Badania obu gatunków metodami izoenzymatycznymi, wykrywającymi swoiste antygeny i PCR( z cyst w kale i treści ropnia wątroby).

10 Plasmodium spp. Rutynowo cienki rozmaz krwi pasozytów/ μl krwi Gruba kropla 10-20pasożytów/μl krwi Trudności są przy niskiej parazytemii, mieszanej, po przyjęciu nieskutecznej dawki leku PCR- pełna krew na EDTA, startery komplementarne do genów r RNA małej podjednostki rybosomu, białko powierzchniowe circumsporozoite czy BRK1 PCR standardowy, nested PCR

11 Molekularna diagnostyka robaków Trichinella spp. W rutynowej diagnostyce stosowane są nadal mikroskopowe wykrywanie larw w bioptatach oraz metody serologiczne, (test ELISA). PCR: RAPD-PCR, multiplex PCR, RFLP-PCR Identyfikacja 7 gatunków przy zastosowaniu 11 enzymów restrykcyjnych- 3 różne produkty PCR: 2800pz( b. sekrecyjne), 1250pz (startery SB147A), 372pz (startery SB372A) Potwierdzono występowanie w obrębie rodzaju Trichinella 2 nowych gatunków: T. murrelli oraz T. papue

12 Echinococcus multilocularis Głównie badania immunologiczne, skreeningowe (odczyn hemaglutynacji pośredniej, ELISA) potwierdzenie -ELISA z antygenem EM2+, immunoblotting z antygenem EM18 i EM 16, badania histopatologiczne materiału z zabiegu lub biopsja cienkoigłowa. PCR mitochondrialny 12S rrna, sekwencjonowanie produktów PCR

13 Genetyczne zróżnicowanie pasożytniczych pierwotniaków Giardia Obecnie istnieje 5 odmiennych gatunków (grup) w rodzaju Giardia: G. agilis,g. muris i G. intestinalis (G. duodenalis),g. psittaci, G. ardeae. Genetyczna analiza 200 aksenicznych izolatów Giardia ujawniła, że należą do 2 dużych grup- polskie (A)(1i 2) i belgijskie (B)(3 i 4). W obrębie 1 izolaty od ludzi i zwierząt, 2- tylko od ludzi, 3 i 4 bardziej zróżnicowane. Dodatkowe grupy C i D ( od psów) Różnią się kariotypami, sekwencją nukleotydów małej podjednostki rrna i obrazem długości fragmentów restrykcyjnych rdna. Zastosowanie technik molekularnych umożliwia identyfikacje gatunków Giardia w próbach środowiskowych. Samo wykrycie cyst w wodzie nie pozwala oszacować ryzyka zarażenia ludzi. Izolaty B odpowiedzialne są za łagodny lub bezobjawowy przebieg choroby.

14 Cryptosporidium Obecnie wyróżnia się 8 gatunków, obserwuje się różnorodność objawów klinicznych kryptosporydiozy oraz zmienną inwazyjność i wirulencję populacji tego pasożyta. Wynik RAPD PCR wykazał istnienie 4 genetycznie odmiennych grup wśród kilkudziesięciu izolatów Cryptosporidium uzyskanych od ssaków i węży (C. serpentis). Od ludzi są mało zróżnicowane ale różnią się swoją potencją zoonotyczną. Molekularna analiza genetycznych różnic w locus genu białka TRAP-C2 od ludzi z różnych regionów geograficznych wykazała istnienie 2 genotypów( od ludzi i zwierząt). Analiza filogenetyczna opiera się na sekwencji 18rDNA i genu syntetazy acetylo-koenzymu A.

15 Leishmania spp. Wyróżnia się kilkanaście gatunków Leishmania inwazyjnych dla człowieka. Do celów taksonomicznych przydatna jest metoda fingerprintów DNA. Do różnicowania izolatów L. donovani wykorzystuje się 2 sondy molekularne odpowiadające sekwencjom genów białka szoku termicznego (hsp70)

16 Trypanosoma Populacja T.cruzi wykazuje dużą heterogeniczność podobną do Giardia. Wykazano korelacje miedzy filogenetyczną różnorodnością i biomedycznymi właściwościami, T.cruzi jest przykładem klonalnej ewolucji co wykazała analiza różnych markerów molekularnych- wyróżniono 2 filogenetyczne linie rozwojowe. Rozróżniono podgatunki w obrębie T. brucei dzięki zastosowaniu RFLP PCR, hybrydyzacji z sondami DNA, analizie izoenzymów oraz oceny wrażliwości metacyklicznych trypomastigota na lityczne działanie ludzkiej surowicy odpornościowej. Izolaty T.b.gambiense, T.b.rhodesiense różnią się od T.b. brucei

17 Toxoplasma Genetyczny polimorfizm T. gondii warunkuje niezwykłą zdolność adaptacyjną do licznych gatunków żywicieli pośrednich. Do oceny stopnia heterogeniczności genomu zastosowano: RFLP (starter dla genu P30), RAPD i sekwencjonowanie. Wykazano zmienność wewnątrzgatunkową i wewnątrzszczepową tego pasożyta. 3 linie klonalne wyróżniono; genotyp 2 związany z ciężkim przebiegiem toksoplazmozy u ludzi.

18 Lekooporność pasożytów Lekooporność wynika z: Długotrwałego i powszechnego stosowania tego samego leku Przerwania terapii (uboczne działanie leków) Nie przestrzegania przyjmowania odpowiednich dawek leku Niepodatność na leczenie może być wynikiem genetycznych, immmunologicznych lub fizjologicznych czynników zarażonego żywiciela

19 Lekooporność jest genetycznie przekazywaną utratą wrażliwości populacji pasożyta na lek, który wcześniej był skuteczny. Tolerancja lub naturalna oporność to niepodatność populacji, która wcześniej nie była wystawiona na działanie danego leku. W obu przypadkach dotyczy to pojedynczej lub licznych mutacji różnicujących populacje pod względem wrażliwości na działanie leku. W lekooporności mutacja jest indukowana selekcyjnym działaniem leku ( lek mutagenem). Tolerancja ujawnia się w rozprzestrzenieniu różnych populacji, poddanych naturalnej selekcji.

20 Oporność na leki wynikać może z nabycia nowej aktywności przez pasożyty( degradowanie lub inaktywowanie leku) bądź z utraty wcześniej istniejącej aktywności. Stwierdza się heterogeniczność różnych gatunków pasożytów pod względem wrażliwości na działanie leków. U różnych pasożytów istnieją odmienne molekularna mechanizmy lekooporności

21 Schistosoma mansoni Stwierdzono zmienność międzypopulacyjną S. mansoni we wrażliwości na hykanton i oksamnikwin(afrykańskie są bardziej oporne niż południowoamerykańskie) (genetycznie przekazywana cechaautosomalnie, recesywnie; utrata pojedynczej aktywności przywr- pojedyncza mutacja punktowa). Aktywacja leku polega na enzymatycznej estryfikacji, spontanicznej dysocjacji powstałego estru. Utworzone aktywne reszty są zdolne do alkilacji DNA lub innych cząsteczek przywr. Przywry z opornym fenotypem wykazują mniejszą żywotność. O wysokiej skuteczności nadal jest lek prazykwantel.

22 Leishmania Amplifikacja niektórych genów i ich nadekspresja wiąże się z brakiem wrażliwości na działanie leków pierwotniakobójczych. Tlenki związków stosowane jako leki są induktorami amplifikacji danego genu u Leishmania. Gatunki te często amplifikują swoistą część genomu po selekcyjnym działaniu leku. Genomowy region zawierający locus H jest amplifikowany jako pozachromosomowy, kolisty DNA 2 klasy genów pgp (P- glikoproteina) oporne na leki hydrofilne (1) i hydrofobowe (2) Uzyskano szczep L. tropika z fenotypem MDR (multidrug resistant), u którego stwierdzono nadekspresje genu ltpgpe

23 Plasmodium spp. Izolaty Plasmodium spp. uzyskane z przypadków klinicznych jak i drogą selekcji w warunkach laboratoryjnych wykazują oporność na liczne leki w szczególności na chlorochinę. Lekooporność wynika ze zmniejszonej akumulacji leku w wodniczkach pokarmowych pasożyta. Przywrócenie wrażliwości na leki jest możliwe po podaniu inhibitorów kanału wapniowego. PCR i hybrydyzacja z sondami molekularnymi geny pfmdr1 i pfmdr2; amplifikacja i nadekspresja genu 1 występowała u P. falciparum opornych na chininę, meflochinę i halofantrin przy braku amplifikacji genu 2

24 Entamoeba histolytica W genomie zidentyfikowano geny pgp (4g+2pg) Wykazano oporność na emetynę, podanie inhibitorów kanału wapniowego- przywrócenie wrażliwości na leki. Trichomonas vaginalis Oporność na metronidazol, wrażliwe na tinidazol. Oporność jest związana ze spadkiem reduktazy flawiny i tioredoksyny ( zaburzenia przemiany tlenu) oraz dehydrogenazy alkoholowej1 (ADH1)