Ćwiczenie 5. Spektroskopia w podczerwieni w badaniu struktury biomakromolekuł
|
|
- Fabian Białek
- 8 lat temu
- Przeglądów:
Transkrypt
1 Ćwiczenie 5. Spektroskopia w podczerwieni w badaniu struktury biomakromolekuł Metody spektroskopowe polegają na obserwacji oddziaływania promieniowania elektromagnetycznego z materią. Można je podzielić na metody: emisyjne, w których uzyskujemy informacje na temat promieniowania emitowanego przez próbkę; absorpcyjne, gdzie informacje uzyskiwane są na podstawie tej części promieniowania, która została zaabsorbowana oraz metody polegające na analizie promieniowania rozproszonego przez próbkę (spektroskopia Ramana). Spektroskopia w podczerwieni bada absorpcję promieniowania związaną ze wzbudzeniem poziomów oscylacyjnych cząsteczek Spektroskopia w podczerwieni podstawy teoretyczne W widmie promieniowania elektromagnetycznego zakres podczerwieni znajduje się pomiędzy promieniowaniem widzialnym i mikrofalowym. Najbardziej istotny z punktu widzenia spektroskopii biocząsteczek jest zakres podstawowy podczerwieni cm -1, otoczony przez bliską (powyżej 4000 cm -1 ) i daleką podczerwień (poniżej 400 cm -1 ). Energia wewnętrzna cząsteczek występuje w różnych formach, m. in.: (a) energii translacji, związanej z nieuporządkowanym ruchem molekuł; (b) energii rotacyjnej, wynikającej z wirowania cząsteczek wokół własnych osi; (c) energii oscylacyjnej, związanej z oscylacjami wokół położeń równowagi atomów cząsteczek oraz (d) energii elektronowej, w której skład wchodzi energia kinetyczna ruchu elektronów w cząsteczce oraz energia potencjalna oddziaływania elektronów z jądrami oraz sąsiednimi elektronami. Absorpcja promieniowania podczerwonego powoduje zmiany energii oscylacyjnej i rotacyjnej cząsteczki. Kształt widm w tym zakresie promieniowania w przypadku ciał stałych i cieczy zależy głównie od wzbudzeń oscylacyjnych, ponieważ rotacje cząsteczek są w tym przypadku częściowo lub całkowicie hamowane przez oddziaływania międzycząsteczkowe. Widma ciał stałych i cieczy są w związku z tym nazywane widmami oscylacyjnymi, natomiast widma cząsteczek w fazie gazowej noszą nazwę widm oscylacyjno-rotacyjnych ze względu na dużą swobodę zarówno rotacji jak i oscylacji cząsteczek. Drgania molekuł wieloatomowych mają złożony charakter, można je jednakże przedstawić jako superpozycję pewnej liczby drgań prostych, zgodnych w fazie i o jednakowej częstości. Drgania te nazywane są drganiami normalnymi. Wyróżniamy wśród nich drgania rozciągające związane ze zmianą długości wiązań i drgania deformacyjne wynikające ze zmiany kątów płaskich pomiędzy wiązaniami podczas ruchu w płaszczyźnie lub poza płaszczyznę wiązań. Każdy z rodzajów drgań może być dodatkowo symetryczny lub niesymetryczny. H 2 O symetryczne rozciągające (ν s OH) 3652 cm -1 asymetryczne rozciągające (ν as OH) 3756 cm -1 deformacyjne nożycowe (δ s OH) 1596 cm -1 Rys. 1. Drgania normalne izolowanej cząsteczki H 2 O.
2 Liczba stopni swobody cząsteczki jest równa sumie stopni swobody tworzących ją atomów. Każdy atom ma trzy stopnie swobody ruchu, odpowiadające współrzędnym kartezjańskim. Zatem cząsteczka składająca się z n atomów ma 3n stopni swobody. W przypadku cząsteczek nieliniowych trzy stopnie swobody dotyczą translacji, a trzy kolejne ruchu obrotowego. Pozostałe 3n-6 stopnie swobody opisują ruchy oscylacyjne i odpowiadające im drgania normalne. Cząsteczki liniowe mają tylko dwa rotacyjne stopnie swobody, więc ich drganiom odpowiada 3n-5 drgań normalnych. Przykładem nieliniowej drobiny jest cząsteczka wody, która składa się z trzech atomów, ma zatem = 3 stopnie swobody oscylacyjnej. Odpowiadające im trzy drgania normalne przedstawiono na Rys. 1. Do przybliżonego opisu oddziaływania cząsteczki dwuatomowej z promieniowaniem elektromagnetycznych wykorzystuje się model oscylatora harmonicznego. Oscylatorem harmonicznym jest w tym przypadku układ dwóch mas (atomów lub rdzeni atomowych), drgających doskonale sprężyście wokół środka masy układu. Częstość drgań własnych takiego oscylatora (ν osc ) wyraża się wzorem: ν osc 1 f = π, (1) 2 m r gdzie f to stała siłowa, będąca miarą siły wiązania, natomiast m r oznacza masę zredukowaną, równą iloczynowi mas obu atomów podzielonemu przez ich sumę. Energia mikrooscylatora jest kwantowana i dla poszczególnych poziomów energetycznych oscylacji wyraża się wzorem: 1 E osc = hν osc υ +, (2) 2 gdzie υ oscylacyjna liczba kwantowa, która może przyjąć wartości υ = 0, 1, 2, 3, Oddziaływanie promieniowania podczerwonego z oscylującymi cząsteczkami jest możliwe tylko wtedy, gdy spełnione są pewne warunki nazywane regułami wyboru. Zgodnie z pierwszą regułą, energia fotonu promieniowania elektromagnetycznego, która może zostać pochłonięta przez cząsteczkę musi odpowiadać różnicy energii poziomów energetycznych cząsteczki (dla spektroskopii oscylacyjnej E osc = hν). W przypadku oscylatora harmonicznego dozwolone są tylko przejścia absorpcyjne lub emisyjne, dla których oscylacyjna liczba kwantowa zmienia się o υ = ±1. Przedstawiony model oscylatora harmonicznego wyjaśnia występowanie tak zwanych pasm podstawowych, czyli intensywnych pasm absorpcyjnych w widmach cząsteczek heteroatomowych, którym towarzyszy zmiana oscylacyjnej liczby kwantowej υ = 1. W widmach obserwowane są również pasma o niskiej intensywności i o częstościach zbliżonych do wielokrotności częstości pasma podstawowego, są to tzw. nadtony. Ich występowanie wyjaśnia model oscylatora anharmonicznego. Najważniejszą konsekwencją zastosowania tego modelu jest rozszerzenie reguły wyboru dotyczącej zmiany liczby kwantowej oscylacji dozwolone stają się przejścia, dla których oscylacyjna liczba kwantowa zmienia się o kilka jednostek ( υ = ±1, ±2, ±3, ). Warunek ten stanowi drugą regułę wyboru obowiązującą w spektroskopii w podczerwieni. Z trzeciej reguły wyboru wynika natomiast, że w podczerwieni można obserwować tylko te przejścia oscylacyjne, którym towarzyszy zmiana momentu dipolowego cząsteczki. Drgania te nazywa się drganiami aktywnymi w podczerwieni. Rzadko obserwuje się teoretyczną liczbę drgań normalnych tonów podstawowych, ponieważ nadtony i drgania złożone, czyli suma lub różnica kilku drgań, zwiększają liczbę pasm, natomiast inne zjawiska zmniejszają ich liczbę. Gdy dwa oscylujące wiązania mają wspólny atom, pomiędzy utworzonymi oscylatorami istnieje oddziaływanie mechaniczne i z tego względu rzadko zachowują się jak odrębne oscylatory, chyba że częstości ich drgań są
3 bardzo różne. Sprzężenie dwóch drgań normalnych powoduje powstanie dwóch nowych drgań o częstościach wyższej i niższej niż ta, gdy oddziaływania nie zachodzą (rezonans Fermiego). Oddziaływania mogą pojawiać się również pomiędzy drganiami podstawowymi, nadtonami i drganiami złożonymi. W każdym drganiu normalnym biorą udział wszystkie atomy cząsteczek, ale amplitudy ich wychyleń mogą być różne. W wielu drganiach biorą udział przede wszystkim najbliższe atomy tworzące charakterystyczną grupę funkcyjną w cząsteczce, a pozostałe atomy mają tak małą amplitudę wychyleń, że praktycznie nie wpływają na drgania. Z wymienionych powyżej powodów wiele grup funkcyjnych wykonuje drgania o charakterystycznej częstości, zmieniającej się niewiele w różnych cząsteczkach. Kształt krzywej dzwonowej pasm absorpcyjnych jest charakterystyczną cechą oddziaływania substancji z promieniowaniem. Poszerzenie pasma wynika z kilku przyczyn naturalnych, takich jak zasada nieoznaczoności Heisenberga, efekt Dopplera. Pasma w podczerwieni faz skondensowanych są poszerzone ze względu na zatartą strukturę rotacyjną widma oscylacyjnego. Zdarza się również, że sąsiadujące ze sobą pasma w widmie nakrywają się tworząc wspólny kontur. Położenie maksimum pasm w widmie w podczerwieni jest najczęściej określane w skali liczb falowych, czyli liczby drgań przypadających na 1 cm drogi promieniowania (ν = 1/λ, cm -1 ), rzadziej przy pomocy długości fali (λ, nm) lub częstości promieniowania (ν, Hz). Intensywność pasm jest natomiast wyrażona w skali transmitancji (T) lub absorbancji (A). Transmitancja jest to stosunek natężenia światła przepuszczonego przez próbkę do natężenia światła padającego na próbkę. Absorbancja jest logarytmem dziesiętnym odwrotności transmitancji A = log 10 (1/T). Pod pojęciem natężenia pasm rozumiemy pole powierzchni pomiędzy linią określającą kontur pasma a jego linią bazową. W niektórych przypadkach miarą natężenia pasma może być jego wysokość mierzona w maksimum Aparatura pomiarowa Współczesne spektrometry zamiast widm rejestrują bezpośrednio tzw. interferogramy. Promieniowanie obejmujące określony zakres podczerwieni (np cm -1 ) rozdzielane jest na dwie wiązki (Rys. 2). Jedna z nich przebiega drogę o stałej długości, a druga generowana jest przez interferometr z ruchomym zwierciadłem poruszającym się ze stałą prędkością. Zmieniająca się różnica długości dróg obu wiązek powoduje wzajemne interferencje i w wyniku tego powstaje interferogram. Zastosowanie transformacji Fouriera pozwala na przekształcenie takiego interferogramu z domeny czasowej na bardziej użyteczną domenę częstości, czyli widmo. Jedno przejście szerokopasmowego promieniowania przez próbkę pozwala na rejestrację całkowitego widma w podczerwieni, co znacznie skraca czas analizy. Zastąpienie tradycyjnych monochromatorów interferometrami znacznie polepszyło także czułość i rozdzielczość przyrządów. Zwierciadło ruchome Źródło Dzielnik wiązki Próbka Detektor Komputer Przetwornik Zwierciadło stałe Rys. 2. Schemat spektrometru podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR).
4 5.3. Spektroskopia w podczerwieni w badaniach struktury i stabilności białek Spektroskopia w podczerwieni jest jedną z najbardziej wszechstronnych technik badawczych, pozwalających na obserwowanie struktury drugorzędowej białek oraz jej zmian wywołanych różnymi czynnikami zewnętrznymi. Jej niewątpliwą zaletą jest możliwość dostosowania warunków pomiarowych do konkretnego problemu. Dostępnych jest wiele odmian tej techniki (np. tradycyjna spektroskopia transmisyjna, spektroskopia ATR lub spektroskopia odbiciowa), umożliwiających pomiary roztworów białek o różnym stężeniu, żeli, cienkich filmów lub stałych preparatów. Popularnym problemem biochemicznym do którego wykorzystuje się spektroskopię FTIR jest analiza struktury drugorzędowej białek. Rozwój tej techniki eksperymentalnej w badaniach biochemicznych spowodowany jest wzrostem zainteresowania strukturą białek oraz ograniczeniami bardziej bezpośrednich technik, takich jak NMR i krystalografia rentgenowska. Wprawdzie za pomocą spektroskopii w podczerwieni nie można uzyskać informacji o absolutnej strukturze białka, to jednak, w przeciwieństwie do wymienionych wyżej technik, pozwala ona na analizę struktury białek trudno rozpuszczalnych, nie tworzących kryształu lub białek o masach cząsteczkowych powyżej kilkudziesięciu kda. Spektroskopia w podczerwieni jest także wykorzystywana w badaniach nad stabilnością białek, nad mechanizmem ich denaturacji oraz do badania molekularnych podstaw ich funkcjonowania. Na Rys. 3 przedstawiono przykładową serię widm FTIR lizozymu z białka jaja kurzego zmierzonych w różnych temperaturach (rozpuszczalnikiem była woda ciężka). Zmiany w kształcie pasm można powiązać ze zmianami w strukturze drugorzędowej białka, pojawiającymi się wraz ze wzrostem temperatury. Na podstawie zależności wartości absorbancji przy liczbie falowej 1640 cm -1 od temperatury możliwe jest wykreślenie krzywej denaturacji (we wstawce), która może posłużyć do określenie temperatury denaturacji lub pomóc w określeniu mechanizmu denaturacji białka. Absorbancja cm Temperatura ( o C) 0.5 pasmo amidowe I' pasmo amidowe II Liczba falowa (cm -1 ) Rys. 3. Seria widm lizozymu z białka jaja kurzego zmierzonych w zakresie temperatur 30,4 o C 83,5 o C. Strzałkami oznaczono kierunek najważniejszych zmian w natężeniu i położeniu pasm amidowych I oraz II, towarzyszących wzrostowi temperatury. Widma zmierzono w kuwecie transmisyjnej wyposażonej w okienka z CaF 2 rozdzielone przekładkami teflonowymi o grubości 56 µm. Temperatura była regulowana za pomocą zewnętrznego kontrolera. We wstawce przedstawiono krzywą denaturacji, wyznaczoną dla liczby falowej 1640 cm -1. Wykorzystanie spektroskopii różnicowej lub czasowo rozdzielczej spektrofotometrii (ang. time-resolved) z wykorzystaniem techniki zatrzymanego przepływu pozwala
5 przykładowo na obserwowanie zmian w centrum katalitycznym enzymu. Często wykorzystuje się w tym zakresie technikę znakowania białek ciężkimi izotopami ( 15 N) lub mutagenezę ukierunkowaną. Pozwala to na precyzyjne przypisanie określonych pasm widocznych w widmie białka konkretnym resztom aminokwasowym Określanie struktury drugorzędowej białek Białka posiadają dziewięć charakterystycznych pasm, z których największe znaczenie w analizie struktury drugorzędowej mają przedstawione na Rys.4: pasmo amidowe I (odpowiadające głównie drganiom rozciągającym wiązania C=O, ok cm -1 ), pasmo amidowe II (odpowiadające sprzężonym drganiom zginającym wiązania N-H i rozciągającym wiązania C-N, ok cm -1 ) oraz w mniejszym stopniu pasmo amidowe III (odpowiadające głównie drganiom rozciągającym wiązania C-N i drganiom zginającym wiązania N-H, ok cm -1 ) pasmo amidowe I Absorbancja pasmo amidowe II pasmo amidowe III Liczba falowa (cm -1 ) Rys. 4. Charakterystyczne widmo czystego białka (lizozym z białka jaja kurzego) rozpuszczonego w wodzie wraz z zaznaczonymi najważniejszymi pasmami amidowymi, służącymi do analizy zmian w jego strukturze. Widmo jest wynikiem odjęcia zmierzonego widma ATR czystej wody od widma ATR roztworu białka. Wskaźnikiem prawidłowego odjęcia widm było uzyskanie płaskiego przebiegu linii bazowej widma wynikowego powyżej 1800 cm -1. Ograniczenia steryczne, hydrofobowy/hydrofilowy charakter reszt bocznych aminokwasów jak i samego szkieletu polipeptydowego, a także otaczający białko rozpuszczalnik powodują, że białka przyjmują w roztworach wodnych ściśle określone konformacje geometryczne, zwane strukturami drugorzędowymi. Istotnym elementem każdej z nich jest charakterystyczna sieć wiązań wodorowych między atomami tlenu karbonylowego łańcucha polipeptydowego a atomem wodoru grupy aminowej, które spinają fragmenty łańcucha polipeptydowego, często znacznie oddalone od siebie. Każda ze struktur drugorzędowych białek posiada charakterystyczną geometrię sieci wiązań wodorowych, a co za tym idzie, także charakterystyczne zakresy częstości drgań wiązań zaangażowanych w ich tworzenie. Na Rys. 5 przedstawiono zakresy częstości drgań wiązań w zakresie pasma amidowego I, najczęściej wykorzystywanego do określania zawartości poszczególnych struktur drugorzędowych, przypisane poszczególnym strukturom drugorzędowym. Wartości te opierają się głównie na danych eksperymentalnych oraz obliczeniach teoretycznych.
6 Granice różnych zakresów są często dosyć szerokie, dlatego należy ostrożnie analizować uzyskane wyniki. W strukturze przestrzennej białek można najczęściej wyróżnić wiele różnych struktur drugorzędowych, dlatego też ich widma w podczerwieni mają złożony charakter. Pasma amidowe składają się w wielu różnych, zachodzących na siebie pasm składowych, charakterystycznych dla poszczególnych struktur. Znacząco komplikuje to analizę widm. Jednak stosując techniki zwiększania rozdzielczości widm można jednak uzyskać informacje o ich położeniu i natężeniu, a czasem także o ich procentowym udziale w stosunku do wszystkich struktur drugorzędowych danego białka α-helisa 8 7 Agr Zakręty i pętle Pętle Agregat βs β β-kartki βs Reszty AA Reszty AA Liczba falowa / cm -1 Rys. 5. Zakresy absorpcji poszczególnych struktur drugorzędowych występujących powszechnie w białkach. Skróty i objaśnienia: β β-kartki, βs β- spinki (β-kartki zbudowane tylko z dwóch łańcuchów), reszty AA grupy boczne reszt aminokwasowych, Agr. agregaty, 3 10 helisa 3 10, Pętle rozumiane jako długie pętle, lub struktura nieuporządkowanego polipeptydu (charakterystyczna dla białek zdenaturowanych); struktury, których pasma absorpcji przesuwają się pod wpływem wymiany protonowej oznaczone zostały strzałką, prostokątami przerywanymi oznaczono zakresy absorpcji tych struktur w wodzie ciężkiej Izolacja i analiza widm biocząseczek w roztworach wodnych Widma biocząsteczek najczęściej mierzone są w roztworach wodnych i rzadko możliwa jest bezpośrednia analiza charakterystycznych pasm absorpcji. Ogólny schemat postępowania w takich sytuacjach przedstawia się następująco: a. Usunięcie udziału widmowego pary wodnej Pierwszym problemem we wstępnej obróbce danych widmowych jest usunięcie pasm absorpcji pary wodnej w zakresie pasma amidowego I i II. W dużym stopniu problem ten jest zmniejszany przez intensywne płukanie aparatu suchym azotem lub osuszonym powietrzem. Jednak nie zawsze jest to wystarczające rozwiązanie. Korekcja atmosfery opiera się najczęściej na takim dobraniu współczynnika odejmowania zmierzonego widma pary wodnej, aby uzyskać widmo w najwyższym stopniu pozbawione udziału tej pary. Procedura odbywa się metodą "prób i błędów", a kryterium jest ocena wizualna widma. b. Odejmowanie udziału widmowego wody Największym problemem w przygotowaniu widm do dalszej obróbki jest prawidłowe odjęcie widma wody (lub buforu), ponieważ nawet w bardzo stężonych próbkach natężenie pasma wody w zakresie amidu I jest od 5 do 10 razy większe, niż samego pasma amidowego I. Powszechnie stosowanym sposobem odejmowania widma wody od zmierzonego widma
7 roztworu białka (zarówno uzyskanego metodą transmisyjną jak i ATR) jest wizualne odjęcie wcześniej zmierzonego widma wody aż do uzyskania na widmie wynikowym płaskiej linii w okolicy cm -1. Alternatywnym rozpuszczalnikiem białek może być woda ciężka, D 2 O. Jej zaletą jest to, iż nie posiada silnych pasm absorpcji w zakresie pasma amidowego I. Zastąpienie atomów wodoru deuterem nie powoduje drastycznych zmian w kształcie pasma amidowego I (znak prim oznacza, że widmo zostało zmierzone w wodzie ciężkiej), zmiany te jednak pozwalają na rozróżnienie pasm absorpcji struktur α od struktur pętlowych, co w wodzie zwykłej (H 2 O) nie byłoby łatwe. Niewielkiemu przesunięciu w stronę niższych liczb falowych ulegają też wartości absorpcji pozostałych struktur drugorzędowych (Rys. 5). Drastycznej zmianie ulega natomiast położenie pasma amidowego II. Wymiana protonowa powoduje przesunięcie maksimum tego pasma od ok cm -1 do ok cm -1 (to nowe pasmo nazywane jest pasmem amidowym II ). Tak duża zmiana jest podstawą dla eksperymentów mających na celu np. określenie stabilności hydrofobowego rdzenia białek. c. Zwiększanie rozdzielczości widm - uzyskiwanie informacji o pasmach składowych Stosuje się powszechnie kilka technik pozwalających określić liczbę i położenie pasm składowych, które można następnie przypisać konkretnym strukturom drugorzędowym. Wszystkie te techniki mają jednak poważną wadę uzyskane wyniki są w dużym stopniu zależne od subiektywnych decyzji dokonywanych na kolejnych etapach obróbki widm i powinny być stosowane z ostrożnością. i) Druga pochodna widm. Minima na drugiej pochodnej widm biocząsteczek określają w przybliżeniu liczbę i położenie pasm składowych. Kształt drugiej pochodnej, w szczególności informacja o liczbie pasm składowych, zależy od jakości danych pierwotnych. Druga pochodna widm jest bardzo wrażliwa na wszelkie zakłócenia (np. szumy aparaturowe, nieskorygowane pasma absorpcji pary wodnej, itp), dlatego należy ostrożnie analizować jej kształt. Na Rys. 6 przedstawiono serię drugich pochodnych widm lizozymu z białka jaja kurzego zmierzonych w zakresie temperatury 35 o C 56 o C. Minima drugich pochodnych wskazują prawdopodobne położenie pasm składowych, które można przypisać poszczególnym strukturom drugorzędowym Druga pochodna zakręty β α+pętle Liczba falowa (cm -1 ) Rys. 6. Seria drugich pochodnych widm lizozymu z białka jaja kurzego, zmierzonych w zakresie temperatury 35 o C 56 o C. Strzałką oznaczono kierunek zmian towarzyszących wzrostowi temperatury. Oznaczono także najważniejsze struktury drugorzędowe: α α - helisy, β β - kartki.
8 ii) Rozkład pasma na składowe. Kształt złożonego pasma na widmie w podczerwieni przybliża się sumą sztucznie wygenerowanych pasm składowych, będących najczęściej funkcjami Gaussa i Lorentza, ich sumą lub iloczynem. Absorbancja % % % % % % Liczba falowa (cm -1 ) Rys. 7. Przykład rozkładu pasma amidowego I białka bogatego w β-kartki (świadczy o tym silne pasmo przy 1633 cm -1 ). Każdemu pasmu składowemu przypisano maksimum oraz procentowy udział zajmowanej powierzchni całego pasma. iii) Dekonwolucja z wykorzystaniem odwrotnej transformacji Fourier a. Metoda ta służy przede wszystkim do zwiększenia rozdzielczości widma, a nie do samego określania liczby i położenia składowych, chociaż i w takim celu może być wykorzystana Technika tłumionego całkowitego odbicia Technika tłumionego całkowitego odbicia (ang. Attenuated Total Reflectance ATR) jest obecnie coraz szerzej stosowaną odmianą spektroskopii odbiciowej, posiadającą wiele wspomnianych wcześniej zalet w stosunku do tradycyjnej techniki transmisyjnej pomiaru widm. fala zanikająca promień padający θ próbka kryształ ATR promień odbity Rys. 8. Przebieg promieni w krysztale ATR. Promień padający pod kątem θ, większym od kąta granicznego, na powierzchnię kryształu ATR ulega całkowitemu odbiciu (Rys. 8). Materiały z którego wykonane są kryształy ATR charakteryzują się wysokim współczynnikiem załamania światła i są wykonane najczęściej z germanu, selnku cynku lub diamentu. Jeśli do powierzchni kryształu
9 zostanie przyłożona próbka materiału absorbującego promieniowanie, to wiązka promieniowania wnika w głąb próbki (fala zanikająca) na bardzo małą głębokość, zależną od kąta padania wiązki i współczynników załamania światła kryształu ATR i samej próbki. Część promieniowania może zostać zaabsorbowana przez próbkę, a mierząc intensywność promieniowania wiązki odbitej od powierzchni kryształu można uzyskać widmo charakterystyczne dla materiału próbki, tzw. widmo ATR. Widma ATR są złożeniem widma refleksyjnego (odbiciowego) oraz absorpcyjnego. Korekcja ATR umożliwia wyodrębnienie części absorpcyjnej widma ATR. Korygowane są także efekty widmowe związane z niektórymi zjawiskami optycznymi, jak normalna lub anomalna dyspersja optyczna. W ich wyniku fale o różnych częstotliwościach penetrują warstwy próbki o różnej grubości, a co za tym idzie, są różnie przez nią absorbowane. Zjawisko to jest silnie zależne od współczynnika załamania światła próbki, dlatego też nie można dokonywać operacji odejmowania lub dodawania widm ATR próbek o różnych współczynnikach załamania światła. W spektroskopii biocząsteczek najważniejszą zaletą techniki tłumionego wewnętrznego odbicia jest możliwość uzyskania widm roztworów, których składniki (przede wszystkim woda) posiadają bardzo silne pasma własne, uniemożliwiające uzyskanie widma samego białka metodą transmisyjną. Wadą tej techniki jest jednak konieczność stosowania dość wysokich stężeń biocząsteczek oraz konieczność korekcji tych widm, jeżeli mają one zostać poddane dalszej analizie Eksperymenty Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest obserwacja zmian zachodzących w strukturze drugorzędowej lizozymu z białka jaja kurzego, spowodowanych obecnością w roztworze substancji denaturującej: soli metalu ciężkiego lub kwasu nieorganicznego. Przebieg ćwiczenia Przygotowanie roztworów Roztwory substancji denaturującej 1. Za pomocą biurety przygotować 12 roztworów substancji denaturującej o wzrastającym stężeniu. Rodzaj substancji oraz jej stężenia wskazuje osoba prowadząca zajęcia. Wszystkie rzeczywiste objętości roztworów wyjściowych oraz końcowych zapisać w tabeli wyników. Roztwory lizozymu 1. Do ponumerowanych probówek 1,5 ml odważyć na wadze analitycznej po ok. 50 mg wcześniej oczyszczonego i liofilizowanego białka. Masę białka w każdej z probówek zapisać w tabeli. 2. Do kolejnych probówek dodać odpowiedni roztwór denaturanta tak, aby końcowe stężenie białka wynosiło mg/ml roztworu denaturanta (dokładne stężenie końcowe białka podaje osoba prowadząca). Wszystkie objętości zapisać w tabeli wyników. 3. Każdą próbkę zworteksować i odwirować przez ok. 30 sekund przy 6 tys. obrotów/min. 4. Próbki pozostawić na 30 minut w temperaturze pokojowej.
10 5. Po tym czasie rozpocząć pomiary spektroskopowe oraz równolegle zmierzyć współczynnik załamania światła wszystkich próbek i roztworów substancji denaturującej, n D 25. Wszelkie zmiany w wyglądzie próbek zanotować w tabeli wyników. Wykonanie pomiarów 1. Na godzinę przed planowanym rozpoczęciem pomiarów spektroskopowych rozpocząć płukanie aparatu suchym azotem. 2. Uruchomić program OMNIC i w zakładce Parametry pomiaru ustalić następujące parametry: liczba skanów 128, rozdzielczość widm 4 cm -1, zakres liczb falowych cm Rozpocząć pomiary od pomiaru widma tła klikając przycisk Pomiar tła. Widmo tła należy mierzyć przed każdą próbką, chyba że prowadzący wskaże inaczej. 4. Pomiary próbek rozpocząć od próbki o najniższym stężeniu substancji denaturującej. Próbki nanosić na kryształ przystawki ATR i rozpocząć pomiar poprzez kliknięcie przycisku Pomiar próbki. Zacząć od serii roztworów substancji denaturującej, a następnie zmierzyć serię roztworów lizozymu. 5. Po każdym pomiarze próbki kryształ przetrzeć 10% roztworem SDS i wodą. 6. Po zakończeniu wszystkich pomiarów zmierzyć widmo atmosfery i zapisać wszystkie widma w formacie *.SPA. Opracowanie wyników 1. Skorygować wszystkie widma próbek ze względu na obecność atmosfery. 2. Na każdym widmie dokonać korekcji ATR, uwzględniając zmierzony współczynnik załamania światła, n D Odjąć od każdego widma widmo czystego rozpuszczalnika. 4. Uzyskane wyizolowane widma białka sprowadzić do wspólnej linii bazowej oraz wyznaczyć ich drugie pochodne w zakresie pasma amidowego I. Wszystkie widma i ich drugie pochodne zapisać w postaci plików *.CSV. 5. Uzupełnić wszystkie dane w tabeli wyników. 6. Wszystkie widma (w zakresie cm -1 ) przedstawić na zbiorczym wykresie oraz omówić zmiany w kształcie widm lizozymu, towarzyszące zwiększającemu się stężeniu substancji denaturującej. 7. Na podstawie drugich pochodnych widm dla roztworów o skrajnych stężeniach substancji denaturującej określić precyzyjnie które struktury drugorzędowe są najbardziej wrażliwe na obecność substancji denaturującej. 8. Dla wskazanej przez osobę prowadzącą liczby falowej wykonać wykres natężenia pasma od stężenia substancji denaturującej oraz omówić uzyskaną zależność. Wielkości niezbędne do wyznaczenia danych w tabeli wyników Stężenie roztworu wyjściowego denaturanta, C r.wyj. mol dm -3 Objętość końcowa przygotowywanych roztworów denaturanta, V k.r.den. ml Cząstkowa objętość właściwa lizozymu, υ 0,703-1 cm 3 g Masa molowa lizozymu z białka jaja kurzego g mol -1 Końcowe stężenie białka w roztworze denaturanta mg (ml roztw. denaturanta) -1 Końcowe stężenie białka w roztworze denaturanta mol dm -3
11 Tabela wyników Roztwory substancji denaturującej Roztwory lizozymu Nr V r.wyj V wody C den. 25 n D r. den. m białka V r.den. C k.den. 25 n D r. białka Uwagi [ml] [ml] [mol dm -3 ] [mg] [µl] [mol dm -3 ] V r.wyj V wody C den. 25 n D r. den. m białka V r.den. C k.den. 25 n D r. białka objętość roztworu wyjściowego substancji denaturującej objętość wody stężenie substancji denaturującej w przygotowanych roztworach współczynnik załamania światła roztworów substancji denaturującej masa białka odważona do probówki 1,5 ml objętość roztworu substancji denaturującej konieczna do uzyskania założonego stężenia końcowego białka stężenie końcowe substancji denaturującej w roztworze białka współczynnik załamania światła roztworów białka
Podczerwień bliska: cm -1 (0,7-2,5 µm) Podczerwień właściwa: cm -1 (2,5-14,3 µm) Podczerwień daleka: cm -1 (14,3-50 µm)
SPEKTROSKOPIA W PODCZERWIENI Podczerwień bliska: 14300-4000 cm -1 (0,7-2,5 µm) Podczerwień właściwa: 4000-700 cm -1 (2,5-14,3 µm) Podczerwień daleka: 700-200 cm -1 (14,3-50 µm) WIELKOŚCI CHARAKTERYZUJĄCE
Bardziej szczegółowoOptyczna spektroskopia oscylacyjna. w badaniach powierzchni
Optyczna spektroskopia oscylacyjna w badaniach powierzchni Zalety oscylacyjnej spektroskopii optycznej uŝycie fotonów jako cząsteczek wzbudzających i rejestrowanych nie wymaga uŝycia próŝni (moŝliwość
Bardziej szczegółowoSpektroskopia molekularna. Spektroskopia w podczerwieni
Spektroskopia molekularna Ćwiczenie nr 4 Spektroskopia w podczerwieni Spektroskopia w podczerwieni (IR) jest spektroskopią absorpcyjną, która polega na pomiarach promieniowania elektromagnetycznego pochłanianego
Bardziej szczegółowoSPEKTROSKOPIA IR I SPEKTROSKOPIA RAMANA JAKO METODY KOMPLEMENTARNE
SPEKTROSKOPIA IR I SPEKTROSKOPIA RAMANA JAKO METODY KOMPLEMENTARNE Promieniowanie o długości fali 2-50 μm nazywamy promieniowaniem podczerwonym. Absorpcja lub emisja promieniowania z tego zakresu jest
Bardziej szczegółowoPRODUKTY CHEMICZNE Ćwiczenie nr 3 Oznaczanie zawartości oksygenatów w paliwach metodą FTIR
PRODUKTY CHEMICZNE Ćwiczenie nr 3 Oznaczanie zawartości oksygenatów w paliwach metodą FTIR WSTĘP Metody spektroskopowe Spektroskopia bada i teoretycznie wyjaśnia oddziaływania pomiędzy materią będącą zbiorowiskiem
Bardziej szczegółowoWykład 5 Widmo rotacyjne dwuatomowego rotatora sztywnego
Wykład 5 Widmo rotacyjne dwuatomowego rotatora sztywnego W5. Energia molekuł Przemieszczanie się całych molekuł w przestrzeni - Ruch translacyjny - Odbywa się w fazie gazowej i ciekłej, w fazie stałej
Bardziej szczegółowoSPEKTROSKOPIA IR I SPEKTROSKOPIA RAMANA JAKO METODY KOMPLEMENTARNE
1 SPEKTROSKOPIA IR I SPEKTROSKOPIA RAMANA JAKO METODY KOMPLEMENTARNE 2 Promieniowanie o długości fali 2-50 μm nazywamy promieniowaniem podczerwonym. Absorpcja lub emisja promieniowania z tego zakresu jest
Bardziej szczegółowoPODSTAWY METODY SPEKTROSKOPI W PODCZERWIENI ABSORPCJA, EMISJA
PODSTAWY METODY SPEKTROSKOPI W PODCZERWIENI ABSORPCJA, EMISJA Materia może oddziaływać z promieniowaniem poprzez absorpcję i emisję. Procesy te polegają na pochłonięciu lub wyemitowaniu fotonu przez cząstkę
Bardziej szczegółowoZASADY ZALICZENIA PRZEDMIOTU MBS
ZASADY ZALICZENIA PRZEDMIOTU MBS LABORATORIUM - MBS 1. ROZWIĄZYWANIE WIDM kolokwium NMR 25 kwietnia 2016 IR 30 maja 2016 złożone 13 czerwca 2016 wtorek 6.04 13.04 20.04 11.05 18.05 1.06 8.06 coll coll
Bardziej szczegółowoWYKŁAD 2 Podstawy spektroskopii wibracyjnej, model oscylatora harmonicznego i anharmonicznego. Częstość oscylacji a struktura molekuły Prof. dr hab.
WYKŁAD 2 Podstawy spektroskopii wibracyjnej, model oscylatora harmonicznego i anharmonicznego. Częstość oscylacji a struktura molekuły Prof. dr hab. Halina Abramczyk POLITECHNIKA ŁÓDZKA Wydział Chemiczny
Bardziej szczegółowoZastosowanie spektroskopii w podczerwieni w jakościowej i ilościowej analizie organicznej
Zastosowanie spektroskopii w podczerwieni w jakościowej i ilościowej analizie organicznej dr Alina Dubis Zakład Chemii Produktów Naturalnych Instytut Chemii UwB Tematyka Spektroskopia - podział i zastosowanie
Bardziej szczegółowoIR II. 12. Oznaczanie chloroformu w tetrachloroetylenie metodą spektrofotometrii w podczerwieni
IR II 12. Oznaczanie chloroformu w tetrachloroetylenie metodą spektrofotometrii w podczerwieni Promieniowanie podczerwone ma naturę elektromagnetyczną i jego absorpcja przez materię podlega tym samym prawom,
Bardziej szczegółowoĆwiczenie 3 Pomiar równowagi keto-enolowej metodą spektroskopii IR i NMR
Ćwiczenie 3 Pomiar równowagi keto-enolowej metodą spektroskopii IR i NMR 1. Wstęp Związki karbonylowe zawierające w położeniu co najmniej jeden atom wodoru mogą ulegać enolizacji przez przesunięcie protonu
Bardziej szczegółowoĆwiczenie 2 Przejawy wiązań wodorowych w spektroskopii IR i NMR
Ćwiczenie 2 Przejawy wiązań wodorowych w spektroskopii IR i NMR Szczególnym i bardzo charakterystycznym rodzajem oddziaływań międzycząsteczkowych jest wiązanie wodorowe. Powstaje ono między molekułami,
Bardziej szczegółowoSpektrometria w bliskiej podczerwieni - zastosowanie w cukrownictwie. Radosław Gruska Politechnika Łódzka Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności
Spektrometria w bliskiej podczerwieni - zastosowanie w cukrownictwie Radosław Gruska Politechnika Łódzka Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności Spektroskopia, a spektrometria Spektroskopia nauka o powstawaniu
Bardziej szczegółowospektroskopia IR i Ramana
spektroskopia IR i Ramana oscylacje (wibracje) 3N-6 lub 3N-5 drgań normalnych nie wszystkie drgania obserwuje się w IR - nieaktywne w IR gdy nie zmienia się moment dipolowy - pasma niektórych drgań mają
Bardziej szczegółowoSpektroskopia molekularna. Ćwiczenie nr 1. Widma absorpcyjne błękitu tymolowego
Spektroskopia molekularna Ćwiczenie nr 1 Widma absorpcyjne błękitu tymolowego Doświadczenie to ma na celu zaznajomienie uczestników ćwiczeń ze sposobem wykonywania pomiarów metodą spektrofotometryczną
Bardziej szczegółowoAkademia Górniczo-Hutnicza Wydział Inżynierii Materiałowej i Ceramiki Katedra Chemii Krzemianów i Związków Wielkocząsteczkowych
Akademia Górniczo-Hutnicza Wydział nżynierii Materiałowej i Ceramiki Katedra Chemii Krzemianów i Związków Wielkocząsteczkowych nstrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych Kierunek studiów: Technologia chemiczna
Bardziej szczegółowoOZNACZANIE ŻELAZA METODĄ SPEKTROFOTOMETRII UV/VIS
OZNACZANIE ŻELAZA METODĄ SPEKTROFOTOMETRII UV/VIS Zagadnienia teoretyczne. Spektrofotometria jest techniką instrumentalną, w której do celów analitycznych wykorzystuje się przejścia energetyczne zachodzące
Bardziej szczegółowoFizykochemiczne metody w kryminalistyce. Wykład 7
Fizykochemiczne metody w kryminalistyce Wykład 7 Stosowane metody badawcze: 1. Klasyczna metoda analityczna jakościowa i ilościowa 2. badania rentgenostrukturalne 3. Badania spektroskopowe 4. Metody chromatograficzne
Bardziej szczegółowoSpektroskopowe metody identyfikacji związków organicznych
Spektroskopowe metody identyfikacji związków organicznych Wstęp Spektroskopia jest metodą analityczną zajmującą się analizą widm powstających w wyniku oddziaływania promieniowania elektromagnetycznego
Bardziej szczegółowoSpektroskopia w podczerwieni
Spektroskopia w podczerwieni Metody badań strukturalnych ciała stałego dr inż. Magdalena Król Co to jest spektroskopia? Spektroskopia jest to nauka zajmująca się oddziaływaniem fali elektromagnetycznej
Bardziej szczegółowoSPEKTROSKOPIA RAMANA. Laboratorium Laserowej Spektroskopii Molekularnej PŁ
SPEKTROSKOPIA RAMANA Laboratorium Laserowej Spektroskopii Molekularnej PŁ WIDMO OSCYLACYJNE Zręby atomowe w molekule wykonują oscylacje wokół położenia równowagi. Ruch ten można rozłożyć na 3n-6 w przypadku
Bardziej szczegółowoĆwiczenie 3 ANALIZA JAKOŚCIOWA PALIW ZA POMOCĄ SPEKTROFOTOMETRII FTIR (Fourier Transform Infrared Spectroscopy)
POLITECHNIKA ŁÓDZKA WYDZIAŁ INśYNIERII PROCESOWEJ I OCHRONY ŚRODOWISKA KATEDRA TERMODYNAMIKI PROCESOWEJ K-106 LABORATORIUM KONWENCJONALNYCH ŹRÓDEŁ ENERGII I PROCESÓW SPALANIA Ćwiczenie 3 ANALIZA JAKOŚCIOWA
Bardziej szczegółowoSpektroskopia charakterystycznych strat energii elektronów EELS (Electron Energy-Loss Spectroscopy)
Spektroskopia charakterystycznych strat energii elektronów EELS (Electron Energy-Loss Spectroscopy) Oddziaływanie elektronów ze stałą, krystaliczną próbką wstecznie rozproszone elektrony elektrony pierwotne
Bardziej szczegółowoMetody spektroskopowe:
Katedra Chemii Analitycznej Metody spektroskopowe: Absorpcyjna Spektrometria Atomowa Fotometria Płomieniowa Gdańsk, 2010 Opracowała: mgr inż. Monika Kosikowska 1 1. Wprowadzenie Spektroskopia to dziedzina
Bardziej szczegółowoZastosowanie spektroskopii w podczerwieni w analizie jakościowej i ilościowej. dr Alina Dubis Zakład Chemii Produktów Naturalnych Instytut Chemii UwB
Zastosowanie spektroskopii w podczerwieni w analizie jakościowej i ilościowej dr Alina Dubis Zakład Chemii Produktów Naturalnych Instytut Chemii UwB Tematyka Spektroskopia - podział i zastosowanie Promieniowanie
Bardziej szczegółowom 1, m 2 - masy atomów tworzących wiązanie. Im
Dr inż. Grażyna Żukowska Wykorzystanie metod spektroskopii oscylacyjnej do analizy materiałów organicznych i nieorganicznych 1. Informacje podstawowe Spektroskopia Ramana i spektroskopia w podczerwieni
Bardziej szczegółowoSpektroskopia modulacyjna
Spektroskopia modulacyjna pozwala na otrzymanie energii przejść optycznych w strukturze z bardzo dużą dokładnością. Charakteryzuje się również wysoką czułością, co pozwala na obserwację słabych przejść,
Bardziej szczegółowoWYKŁAD NR 3 OPIS DRGAŃ NORMALNYCH UJĘCIE KLASYCZNE I KWANTOWE.
1 WYKŁAD NR 3 OPIS DRGAŃ NORMALNYCH UJĘCIE KLASYCZNE I KWANTOWE. Współrzędne wewnętrzne 2 F=-fq q ξ i F i =-f ij x j U = 1 2 fq2 U = 1 2 ij f ij ξ i ξ j 3 Najczęściej stosowaną metodą obliczania drgań
Bardziej szczegółowoJak analizować widmo IR?
Jak analizować widmo IR? Literatura: W. Zieliński, A. Rajca, Metody spektroskopowe i ich zastosowanie do identyfikacji związków organicznych. WNT. R. M. Silverstein, F. X. Webster, D. J. Kiemle, Spektroskopowe
Bardziej szczegółowoPromieniowanie rentgenowskie. Podstawowe pojęcia krystalograficzne
Promieniowanie rentgenowskie Podstawowe pojęcia krystalograficzne Krystalografia - podstawowe pojęcia Komórka elementarna (zasadnicza): najmniejszy, charakterystyczny fragment sieci przestrzennej (lub
Bardziej szczegółowoMetoda osłabionego całkowitego wewnętrznego odbicia ATR (Attenuated Total Reflection)
Metoda osłabionego całkowitego wewnętrznego odbicia ATR (Attenuated Total Reflection) Całkowite wewnętrzne odbicie n 2 θ θ n 1 n > n 1 2 Kiedy promień pada na granicę ośrodków pod kątem większym od kąta
Bardziej szczegółowo2. Metody, których podstawą są widma atomowe 32
Spis treści 5 Spis treści Przedmowa do wydania czwartego 11 Przedmowa do wydania trzeciego 13 1. Wiadomości ogólne z metod spektroskopowych 15 1.1. Podstawowe wielkości metod spektroskopowych 15 1.2. Rola
Bardziej szczegółowoSpektroskopia. Spotkanie pierwsze. Prowadzący: Dr Barbara Gil
Spektroskopia Spotkanie pierwsze Prowadzący: Dr Barbara Gil Temat rozwaŝań Spektroskopia nauka o powstawaniu i interpretacji widm powstających w wyniku oddziaływań wszelkich rodzajów promieniowania na
Bardziej szczegółowoTechniki analityczne. Podział technik analitycznych. Metody spektroskopowe. Spektroskopia elektronowa
Podział technik analitycznych Techniki analityczne Techniki elektrochemiczne: pehametria, selektywne elektrody membranowe, polarografia i metody pokrewne (woltamperometria, chronowoltamperometria inwersyjna
Bardziej szczegółowoPromieniowanie podczerwone (ang. infrared IR) obejmuje zakres promieniowania elektromagnetycznego pomiędzy promieniowaniem widzialnym a mikrofalowym.
Próby identyfikacji białego cukru buraczanego i trzcinowego dr inż. Maciej Wojtczak Promieniowanie podczerwone Promieniowanie podczerwone (ang. infrared IR) obejmuje zakres promieniowania elektromagnetycznego
Bardziej szczegółowoRozmycie pasma spektralnego
Rozmycie pasma spektralnego Rozmycie pasma spektralnego Z doświadczenia wiemy, że absorpcja lub emisja promieniowania przez badaną substancję występuje nie tylko przy częstości rezonansowej, tj. częstości
Bardziej szczegółowoWidma w podczerwieni (IR)
Spektroskopowe metody identyfikacji związków organicznych Widma w podczerwieni (IR) dr 2 Widmo w podczerwieni Liczba drgań zależy od liczby atomów w cząsteczce: cząsteczka nieliniowa o n atomach ma 3n-6
Bardziej szczegółowoRepetytorium z wybranych zagadnień z chemii
Repetytorium z wybranych zagadnień z chemii Mol jest to liczebność materii występująca, gdy liczba cząstek (elementów) układu jest równa liczbie atomów zawartych w masie 12 g węgla 12 C (równa liczbie
Bardziej szczegółowoĆw. 10 Techniki spektroskopii w podczerwieni w analizie ciał stałych
Ćw. 10 Techniki spektroskopii w podczerwieni w analizie ciał stałych Podstawy Analizy nstrumentalnej dla studentów roku Ochrony Środowiska na Wydziale Chemii UJ prowadzący dr hab. Joanna Łojewska (pok.
Bardziej szczegółowoDiagnostyka plazmy - spektroskopia molekularna. Ewa Pawelec wykład dla pracowni specjalistycznej
Diagnostyka plazmy - spektroskopia molekularna Ewa Pawelec wykład dla pracowni specjalistycznej Plazma Różne rodzaje plazmy: http://www.ipp.cas.cz/mi/index.html http://www.pro-fusiononline.com/welding/plasma.htm
Bardziej szczegółowoSpektroskopia ramanowska w badaniach powierzchni
Spektroskopia ramanowska w badaniach powierzchni z Efekt Ramana (1922, CV Raman) I, ν próbka y Chandra Shekhara Venketa Raman x I 0, ν 0 Monochromatyczne promieniowanie o częstości ν 0 ulega rozproszeniu
Bardziej szczegółowoKwantowe własności promieniowania, ciało doskonale czarne, zjawisko fotoelektryczne zewnętrzne.
Kwantowe własności promieniowania, ciało doskonale czarne, zjawisko fotoelektryczne zewnętrzne. DUALIZM ŚWIATŁA fala interferencja, dyfrakcja, polaryzacja,... kwant, foton promieniowanie ciała doskonale
Bardziej szczegółowoFala jest zaburzeniem, rozchodzącym się w ośrodku, przy czym żadna część ośrodka nie wykonuje zbyt dużego ruchu
Ruch falowy Fala jest zaburzeniem, rozchodzącym się w ośrodku, przy czym żadna część ośrodka nie wykonuje zbyt dużego ruchu Fala rozchodzi się w przestrzeni niosąc ze sobą energię, ale niekoniecznie musi
Bardziej szczegółowoĆwiczenie 1. Zagadnienia: spektroskopia absorpcyjna, prawa absorpcji, budowa i działanie. Wstęp. Część teoretyczna.
Ćwiczenie 1 Metodyka poprawnych i dokładnych pomiarów absorbancji, wyznaczenie małych wartości absorbancji. Czynniki wpływające na mierzone widma absorpcji i wartości absorbancji dla wybranych długości
Bardziej szczegółowoStałe siłowe. Spektroskopia w podczerwieni. Spektrofotometria w podczerwieni otrzymywanie widm
Spektroskopia w podczerwieni Spektrofotometria w podczerwieni otrzymywanie widm absorpcyjnych substancji o różnych stanach skupienia. Powiązanie widm ze strukturą pozwala na identyfikację związku. Widmo
Bardziej szczegółowoReflekcyjno-absorpcyjna spektroskopia w podczerwieni RAIRS (IRRAS) Reflection-Absorption InfraRed Spectroscopy
Reflekcyjno-absorpcyjna spektroskopia w podczerwieni RAIRS (IRRAS) Reflection-Absorption InfraRed Spectroscopy Odbicie promienia od powierzchni metalu E n 1 Równania Fresnela E θ 1 θ 1 r E = E odb, 0,
Bardziej szczegółowoJan Drzymała ANALIZA INSTRUMENTALNA SPEKTROSKOPIA W ŚWIETLE WIDZIALNYM I PODCZERWONYM
Jan Drzymała ANALIZA INSTRUMENTALNA SPEKTROSKOPIA W ŚWIETLE WIDZIALNYM I PODCZERWONYM Światło słoneczne jest mieszaniną fal o różnej długości i różnego natężenia. Tylko część promieniowania elektromagnetycznego
Bardziej szczegółowoPRACOWNIA PODSTAW SPEKTROSKOPII MOLEKULARNEJ
PRACOWNIA PODSTAW SPEKTROSKOPII MOLEKULARNEJ Kierowniczka pracowni: dr hab. Magdalena Pecul-Kudelska, (pok. 417), e-mail mpecul@chem.uw.edu.pl, tel 0228220211 wew 501; Spis ćwiczeń i osoby prowadzące 1.
Bardziej szczegółowoSPEKTROSKOPIA MOLEKULARNA 2015/16 nazwa przedmiotu SYLABUS A. Informacje ogólne
SPEKTROSKOPIA MOLEKULARNA 2015/16 nazwa SYLABUS A. Informacje ogólne Elementy składowe sylabusu Nazwa jednostki prowadzącej kierunek Nazwa kierunku studiów Poziom kształcenia Profil studiów Forma studiów
Bardziej szczegółowoOptyka. Optyka geometryczna Optyka falowa (fizyczna) Interferencja i dyfrakcja Koherencja światła Optyka nieliniowa
Optyka Optyka geometryczna Optyka falowa (fizyczna) Interferencja i dyfrakcja Koherencja światła Optyka nieliniowa 1 Optyka falowa Opis i zastosowania fal elektromagnetycznych w zakresie widzialnym i bliskim
Bardziej szczegółowoWidmo promieniowania
Widmo promieniowania Spektroskopia Każde ciało wysyła promieniowanie. Promieniowanie to jest składa się z wiązek o różnych długościach fal. Jeśli wiązka światła pada na pryzmat, ulega ono rozszczepieniu,
Bardziej szczegółowoPomiar drogi koherencji wybranych źródeł światła
Politechnika Gdańska WYDZIAŁ ELEKTRONIKI TELEKOMUNIKACJI I INFORMATYKI Katedra Optoelektroniki i Systemów Elektronicznych Pomiar drogi koherencji wybranych źródeł światła Instrukcja do ćwiczenia laboratoryjnego
Bardziej szczegółowoMonochromatyzacja promieniowania molibdenowej lampy rentgenowskiej
Uniwersytet Śląski Instytut Chemii Zakładu Krystalografii ul. Bankowa 14, pok. 133, 40 006 Katowice tel. (032)359 1503, e-mail: izajen@wp.pl, opracowanie: dr Izabela Jendrzejewska Laboratorium z Krystalografii
Bardziej szczegółowoSpektroskopia w podczerwieni
Spektroskopia w podczerwieni Podstawy teoretyczne spektroskopii w podczerwieni Podstawowe pojęcia związane ze spektroskopią oscylacyjną Interpretacja widm Budowa spektrometru FTIR Podstawowe techniki pomiarowe
Bardziej szczegółowoMetody badań spektroskopowych
Metody badań spektroskopowych Program wykładu Wstęp A. Spektroskopia optyczna 1. Podstawy spektroskopii optycznej 1.1 Promieniowanie elektromagnetyczne 1.2 Kwantowanie energii 1.3 Emisja i absorpcja promieniowania
Bardziej szczegółowoKARTA PRACY DO ZADANIA 1. Pomiar widma aminokwasu na spektrometrze FTIR, model 6700.
KARTA PRACY D ZADANIA 1 Pomiar widma aminokwasu na spektrometrze FTIR, model 6700. Wykonaj zadanie zgodnie z instrukcją nr 1 i wypełnij tabelę (w odpowiednich komórkach wstaw "X"). ZAKRES SPEKTRALNY ZMIERZNEG
Bardziej szczegółowoModel wiązania kowalencyjnego cząsteczka H 2
Model wiązania kowalencyjnego cząsteczka H 2 + Współrzędne elektronu i protonów Orbitale wiążący i antywiążący otrzymane jako kombinacje orbitali atomowych Orbital wiążący duża gęstość ładunku między jądrami
Bardziej szczegółowoOpracował dr inż. Tadeusz Janiak
Opracował dr inż. Tadeusz Janiak 1 Uwagi dla wykonujących ilościowe oznaczanie metodami spektrofotometrycznymi 3. 3.1. Ilościowe oznaczanie w metodach spektrofotometrycznych Ilościowe określenie zawartości
Bardziej szczegółowoĆWICZENIE Nr 4 LABORATORIUM FIZYKI KRYSZTAŁÓW STAŁYCH. Badanie krawędzi absorpcji podstawowej w kryształach półprzewodników POLITECHNIKA ŁÓDZKA
POLITECHNIKA ŁÓDZKA INSTYTUT FIZYKI LABORATORIUM FIZYKI KRYSZTAŁÓW STAŁYCH ĆWICZENIE Nr 4 Badanie krawędzi absorpcji podstawowej w kryształach półprzewodników I. Cześć doświadczalna. 1. Uruchomić Spekol
Bardziej szczegółowoĆwiczenie 363. Polaryzacja światła sprawdzanie prawa Malusa. Początkowa wartość kąta 0..
Nazwisko... Data... Nr na liście... Imię... Wydział... Dzień tyg.... Godzina... Polaryzacja światła sprawdzanie prawa Malusa Początkowa wartość kąta 0.. 1 25 49 2 26 50 3 27 51 4 28 52 5 29 53 6 30 54
Bardziej szczegółowoWzajemne relacje pomiędzy promieniowaniem a materią wynikają ze zjawisk związanych z oddziaływaniem promieniowania z materią. Do podstawowych zjawisk
Wzajemne relacje pomiędzy promieniowaniem a materią wynikają ze zjawisk związanych z oddziaływaniem promieniowania z materią. Do podstawowych zjawisk fizycznych tego rodzaju należą zjawiska odbicia i załamania
Bardziej szczegółowoSKUTECZNOŚĆ IZOLACJI JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI? JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI?
SKUTECZNOŚĆ IZOLACJI Wydajność izolacji- ilość otrzymanego kwasu nukleinowego Efektywność izolacji- jakość otrzymanego kwasu nukleinowego w stosunku do ilości Powtarzalność izolacji- zoptymalizowanie procedury
Bardziej szczegółowoZad Sprawdzić, czy dana funkcja jest funkcją własną danego operatora. Jeśli tak, znaleźć wartość własną funkcji.
Zad. 1.1. Sprawdzić, czy dana funkcja jest funkcją własną danego operatora. Jeśli tak, znaleźć wartość własną funkcji. Zad. 1.1.a. Funkcja: ϕ = sin2x Zad. 1.1.b. Funkcja: ϕ = e x 2 2 Operator: f = d2 dx
Bardziej szczegółowoE (2) nazywa się absorbancją.
1/6 Celem ćwiczenia jest poznanie zjawiska absorpcji światła przez roztwory, pomiar widma absorpcji przy pomocy spektrofotometru oraz wyliczenie stężenia badanego roztworu. Promieniowanie elektromagnetyczne,
Bardziej szczegółowo1. Od czego i w jaki sposób zależy szybkość reakcji chemicznej?
Tematy opisowe 1. Od czego i w jaki sposób zależy szybkość reakcji chemicznej? 2. Omów pomiar potencjału na granicy faz elektroda/roztwór elektrolitu. Podaj przykład, omów skale potencjału i elektrody
Bardziej szczegółowoSPEKTROSKOPIA W PODCZERWIENI - MOŻLIWOŚCI I ZASTOSOWANIA
SPEKTROSKOPIA W PODCZERWIENI - MOŻLIWOŚCI I ZASTOSOWANIA Beata Rozum Seminarium Analityczne MS Spektrum 2013 Porównania laboratoryjne, akredytacja, typowe problemy w laboratoriach SPEKTROSKOPIA Oddziaływanie
Bardziej szczegółowoJAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI? JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI?
Podstawowe miary masy i objętości stosowane przy oznaczaniu ilości kwasów nukleinowych : 1g (1) 1l (1) 1mg (1g x 10-3 ) 1ml (1l x 10-3 ) 1μg (1g x 10-6 ) 1μl (1l x 10-6 ) 1ng (1g x 10-9 ) 1pg (1g x 10-12
Bardziej szczegółowoIM21 SPEKTROSKOPIA ODBICIOWA ŚWIATŁA BIAŁEGO
IM21 SPEKTROSKOPIA ODBICIOWA ŚWIATŁA BIAŁEGO Cel ćwiczenia: Zapoznanie się z metodą pomiaru grubości cienkich warstw za pomocą interferometrii odbiciowej światła białego, zbadanie zjawiska pęcznienia warstw
Bardziej szczegółowoSpektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego - wprowadzenie
Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego - wprowadzenie Streszczenie Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego jest jedną z technik spektroskopii absorpcyjnej mającej zastosowanie w chemii,
Bardziej szczegółowoI. PROMIENIOWANIE CIEPLNE
I. PROMIENIOWANIE CIEPLNE - lata '90 XIX wieku WSTĘP Widmo promieniowania elektromagnetycznego zakres "pokrycia" różnymi rodzajami fal elektromagnetycznych promieniowania zawartego w danej wiązce. rys.i.1.
Bardziej szczegółoworelacje ilościowe ( masowe,objętościowe i molowe ) dotyczące połączeń 1. pierwiastków w związkach chemicznych 2. związków chemicznych w reakcjach
1 STECHIOMETRIA INTERPRETACJA ILOŚCIOWA ZJAWISK CHEMICZNYCH relacje ilościowe ( masowe,objętościowe i molowe ) dotyczące połączeń 1. pierwiastków w związkach chemicznych 2. związków chemicznych w reakcjach
Bardziej szczegółowoAtomowa spektrometria absorpcyjna i emisyjna
Nowoczesne techniki analityczne w analizie żywności Zajęcia laboratoryjne Atomowa spektrometria absorpcyjna i emisyjna Cel ćwiczenia: Celem ćwiczenia jest oznaczenie zawartości sodu, potasu i magnezu w
Bardziej szczegółowoPrzejścia optyczne w strukturach niskowymiarowych
Współczynnik absorpcji w układzie dwuwymiarowym można opisać wyrażeniem: E E gdzie i oraz f są energiami stanu początkowego i końcowego elektronu, zapełnienie tych stanów opisane jest funkcją rozkładu
Bardziej szczegółowoĆwiczenie nr 2 : Badanie licznika proporcjonalnego fotonów X
Ćwiczenie nr 2 : Badanie licznika proporcjonalnego fotonów X Oskar Gawlik, Jacek Grela 16 lutego 2009 1 Podstawy teoretyczne 1.1 Liczniki proporcjonalne Wydajność detekcji promieniowania elektromagnetycznego
Bardziej szczegółowoSpektroskopia Analiza rotacyjna widma cząsteczki N 2. Cel ćwiczenia: Wyznaczenie stałych rotacyjnych i odległości między atomami w cząsteczce N 2
Spektroskopia Analiza rotacyjna widma cząsteczki N 2 Cel ćwiczenia: Wyznaczenie stałych rotacyjnych i odległości między atomami w cząsteczce N 2 w stanach B 2 v=0 oraz X 2 v=0. System B 2 u - X 2 g cząsteczki
Bardziej szczegółowoSPEKTROFOTOMETRIA UV-Vis. - długość fali [nm, m], - częstość drgań [Hz; 1 Hz = 1 cykl/s]
SPEKTROFOTOMETRIA UV-Vis Instrukcja do ćwiczeń opracowana w Katedrze Chemii Środowiska Uniwersytetu Łódzkiego. Spektrofotometria w zakresie nadfioletu (UV) i promieniowania widzialnego (Vis) jest jedną
Bardziej szczegółowoĆwiczenie 31. Zagadnienia: spektroskopia absorpcyjna, prawa absorpcji, budowa i działanie. Wstęp
Ćwiczenie 31 Metodyka poprawnych i dokładnych pomiarów widm absorbancji w zakresie UV-VIS. Wpływ monochromatyczności promieniowania i innych parametrów pomiarowych na kształt widm absorpcji i wartości
Bardziej szczegółowoWYKŁAD 5 Zastosowanie teorii grup w analizie widm oscylacyjnych
WYKŁAD 5 Zastosowanie teorii grup w analizie widm oscylacyjnych Prof. dr hab. Halina Abramczyk Dr inż. Beata Brożek-Płuska POLITECHNIKA ŁÓDZKA Wydział Chemiczny, Instytut Techniki Radiacyjnej Laboratorium
Bardziej szczegółowoMetody badania kosmosu
Metody badania kosmosu Zakres widzialny Fale radiowe i mikrofale Promieniowanie wysokoenergetyczne Detektory cząstek Pomiar sił grawitacyjnych Obserwacje prehistoryczne Obserwatorium słoneczne w Goseck
Bardziej szczegółowoCiało doskonale czarne absorbuje całkowicie padające promieniowanie. Parametry promieniowania ciała doskonale czarnego zależą tylko jego temperatury.
1 Ciało doskonale czarne absorbuje całkowicie padające promieniowanie. Parametry promieniowania ciała doskonale czarnego zależą tylko jego temperatury. natężenie natężenie teoria klasyczna wynik eksperymentu
Bardziej szczegółowoDźwięk. Cechy dźwięku, natura światła
Dźwięk. Cechy dźwięku, natura światła Fale dźwiękowe (akustyczne) - podłużne fale mechaniczne rozchodzące się w ciałach stałych, cieczach i gazach. Zakres słyszalnej częstotliwości f: 20 Hz < f < 20 000
Bardziej szczegółowoANALIZA SPEKTRALNA I POMIARY SPEKTROFOTOMETRYCZNE. Instrukcja wykonawcza
ĆWICZENIE 72A ANALIZA SPEKTRALNA I POMIARY SPEKTROFOTOMETRYCZNE 1. Wykaz przyrządów Spektroskop Lampy spektralne Spektrofotometr SPEKOL Filtry optyczne Suwmiarka Instrukcja wykonawcza 2. Cel ćwiczenia
Bardziej szczegółowoLABORATORIUM POMIARY W AKUSTYCE. ĆWICZENIE NR 4 Pomiar współczynników pochłaniania i odbicia dźwięku oraz impedancji akustycznej metodą fali stojącej
LABORATORIUM POMIARY W AKUSTYCE ĆWICZENIE NR 4 Pomiar współczynników pochłaniania i odbicia dźwięku oraz impedancji akustycznej metodą fali stojącej 1. Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest poznanie metody
Bardziej szczegółowo5.1. Powstawanie i rozchodzenie się fal mechanicznych.
5. Fale mechaniczne 5.1. Powstawanie i rozchodzenie się fal mechanicznych. Ruch falowy jest zjawiskiem bardzo rozpowszechnionym w przyrodzie. Spotkałeś się z pewnością w życiu codziennym z takimi pojęciami
Bardziej szczegółowoPodstawy fizyki wykład 7
Podstawy fizyki wykład 7 Dr Piotr Sitarek Katedra Fizyki Doświadczalnej, W11, PWr Drgania Drgania i fale Drgania harmoniczne Siła sprężysta Energia drgań Składanie drgań Drgania tłumione i wymuszone Fale
Bardziej szczegółowoĆwiczenie 30. Zagadnienia: spektroskopia absorpcyjna w zakresie UV-VIS, prawa absorpcji, budowa i. Wstęp
Ćwiczenie 30 Metodyka poprawnych i dokładnych pomiarów absorbancji w zakresie UV- VS, wyznaczenie małych wartości absorbancji. Czynniki wpływające na mierzone widma absorpcji i wartości absorbancji dla
Bardziej szczegółowoOptyka. Optyka falowa (fizyczna) Optyka geometryczna Optyka nieliniowa Koherencja światła
Optyka Optyka falowa (fizyczna) Optyka geometryczna Optyka nieliniowa Koherencja światła 1 Optyka falowa Opis i zastosowania fal elektromagnetycznych w zakresie widzialnym i bliskim widzialnemu Podstawowe
Bardziej szczegółowoMETODY SPEKTRALNE. dr hab. Włodzimierz Gałęzowski Wydział Chemii UAM Zakład Chemii Ogólnej (61)
METODY SPEKTRALNE dr hab. Włodzimierz Gałęzowski Wydział Chemii UAM Zakład Chemii Ogólnej (61) 829 1484 wlodgal@amu.edu.pl materiał wymagany na egzaminie: wykłady ćwiczenia wiadomości z kursu Analizy Instrumentalnej
Bardziej szczegółowoCelem ćwiczenia jest badanie zjawiska Dopplera dla fal dźwiękowych oraz wykorzystanie tego zjawiska do wyznaczania prędkości dźwięku w powietrzu.
Efekt Dopplera Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest badanie zjawiska Dopplera dla fal dźwiękowych oraz wykorzystanie tego zjawiska do wyznaczania prędkości dźwięku w powietrzu. Wstęp Fale dźwiękowe Na czym
Bardziej szczegółowoANALIZA INSTRUMENTALNA
ANALIZA INSTRUMENTALNA TECHNOLOGIA CHEMICZNA STUDIA NIESTACJONARNE Sala 522 ul. Piotrowo 3 Studenci podzieleni są na cztery zespoły laboratoryjne. Zjazd 5 przeznaczony jest na ewentualne poprawy! Możliwe
Bardziej szczegółowoPracownia analizy instrumentalnej i spektroskopii molekularnej
Pracownia analizy instrumentalnej i spektroskopii molekularnej Makrokierunek Inżynierii Nanostruktur Uniwersytetu Warszawskiego. Semestr zimowy 2012/2013 Zastosowanie spektroskopii FT-IR oraz techniki
Bardziej szczegółowoEKSTRAHOWANIE KWASÓW NUKLEINOWYCH JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI? JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI?
EKSTRAHOWANIE KWASÓW NUKLEINOWYCH Wytrącanie etanolem Rozpuszczenie kwasu nukleinowego w fazie wodnej (met. fenol/chloroform) Wiązanie ze złożem krzemionkowym za pomocą substancji chaotropowych: jodek
Bardziej szczegółowoOPTYKA. Leszek Błaszkieiwcz
OPTYKA Leszek Błaszkieiwcz Ojcem optyki jest Witelon (1230-1314) Zjawisko odbicia fal promień odbity normalna promień padający Leszek Błaszkieiwcz Rys. Zjawisko załamania fal normalna promień padający
Bardziej szczegółowoPOLITECHNIKA BIAŁOSTOCKA
POLITECHNIKA BIAŁOSTOCKA KATEDRA ZARZĄDZANIA PRODUKCJĄ Instrukcja do zajęć laboratoryjnych z przedmiotu: Towaroznawstwo Kod przedmiotu: LS03282; LN03282 Ćwiczenie 4 POMIARY REFRAKTOMETRYCZNE Autorzy: dr
Bardziej szczegółowodr hab. inż. Józef Haponiuk Katedra Technologii Polimerów Wydział Chemiczny PG
2. METODY WYZNACZANIA MASY MOLOWEJ POLIMERÓW dr hab. inż. Józef Haponiuk Katedra Technologii Polimerów Wydział Chemiczny PG Politechnika Gdaoska, 2011 r. Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej
Bardziej szczegółowoWyznaczanie zależności współczynnika załamania światła od długości fali światła
Ćwiczenie O3 Wyznaczanie zależności współczynnika załamania światła od długości fali światła O3.1. Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest zbadanie zależności współczynnika załamania światła od długości fali
Bardziej szczegółowoABSORPCYJNA SPEKTROMETRIA ATOMOWA
ABSORPCYJNA SPEKTROMETRIA ATOMOWA Ćwiczenie 1. Badanie wpływu warunków pomiaru na absorbancję oznaczanego pierwiastka Ustalenie składu gazów płomienia i położenia palnika Do dwóch kolbek miarowych o pojemności
Bardziej szczegółowoPonadto, jeśli fala charakteryzuje się sferycznym czołem falowym, powyższy wzór można zapisać w następujący sposób:
Zastosowanie laserów w Obrazowaniu Medycznym Spis treści 1 Powtórka z fizyki Zjawisko Interferencji 1.1 Koherencja czasowa i przestrzenna 1.2 Droga i czas koherencji 2 Lasery 2.1 Emisja Spontaniczna 2.2
Bardziej szczegółowo