Tok badania bakteriologicznego. Klasyczne metody stosowane w diagnostyce bakteriologicznej (identyfikacja bakterii i oznaczanie lekowrażliwo

Transkrypt

1 Tok badania bakteriologicznego. Klasyczne metody stosowane w diagnostyce bakteriologicznej (identyfikacja bakterii i oznaczanie lekowrażliwo liwości). Mgr Kornelia Dobrzaniecka

2 Stwierdzenie obecności drobnoustrojów i ich identyfikacja w badanym materiale pobranym od zakażonego człowieka lub zwierzęcia lub też w próbce pobranej ze środowiska stanowi cel badania mikrobiologicznego.

3 Diagnostyka mikrobiologiczna to zespół postępowań przedlaboratoryjnych i laboratoryjnych, mających na celu identyfikację drobnoustrojów oraz oznaczenie ich lekowrażliwości.

4 Procedury przedlaboratoryjne obejmują: Wyznaczenie rodzaju materiału podlegającego analizie, Sposób pobrania materiału klinicznego, Warunki przechowywania i transportu.

5 Pobieranie materiału: Badany materiał powinien być pobrany z miejsca, gdzie toczy się proces chorobowy, Ilość materiału powinna być wystarczająca do przeprowadzenia analizy mikrobiologicznej, Próbka powinna być dostarczona do laboratorium w jak najszybszym czasie, Materiał powinno się dobrze oznakować i dołączyć kompletną dokumentację, Próbka materiału klinicznego powinna zostać pobrana przed zastosowaniem leczenia, a w przypadku gdy jest to niemożliwe należy podać informację o lekach podawanych pacjentowi.

6 Postępowania laboratoryjne Badanie mikroskopowe preparatu bezpośredniego, Posiew materiału na odpowiednie podłoże, celem otrzymania czystych hodowli, Obserwacje morfologiczne makro i mikroskopowe otrzymanych hodowli, Badanie właściwości fizjologicznych czystych hodowli, Badania immunologiczne, Określenie wrażliwości na substancje przeciwdrobnoustrojowe, w tym leki.

7 Tok izolacji i identyfikacji nieznanego drobnoustroju: 1. Badanie mikroskopowe Preparat wykonany bezpośrednio z materiału klinicznego pobranego od pacjenta (PREPARAT BEZPOŚREDNI) Przykład: plwocina- w przypadku gruźlicy, wymaz z pochwy- ocena stopnia czystości płyn mózgowo-rdzeniowy Preparat wykonany z wyhodowanych na podłożach sztucznych kolonii bakterii

8 PREPARAT BEZPOŚRENI WYKONUJEMY OBOWIĄZKOWO Z NASTĘPUJĄCYCH MATERIAŁÓW KLINICZNYCH skóra i tkanka podskórna wydzielina z kanału szyjki macicy, pochwy, cewki moczowej płyn mózgowo-rdzeniowy plwocina, BAL, aspiraty z oskrzeli i płuc wymazy z oka płyn z opłucnej, otrzewnej

9 PREPARAT BEZPOŚREDNI NIE WYKONUJEMY Z NASTĘPUJĄCYCH MATERIAŁÓW KLINICZNYCH wymaz z gardła WYJĄTKI: podejrzenie zakażenia błonicą anginy Plauta-Vincenta podejrzenie zakażenia grzybiczego kał WYJĄTKI: kał od noworodków podejrzenie zakażenia kampylobakteriozą podejrzenie zakażenia cholerą

10 2. Posiew materiału na odpowiednie podłoże, celem otrzymania pojedynczych kolonii potrzebnych do uzyskania czystych hodowli: Posiew redukcyjny na odpowiednie podłoże stałe. Seryjne rozcieńczenie badanego materiału.

11 3. Obserwacja makro i mikroskopowa morfologii otrzymanych hodowli.

12 Morfologia kolonii na płytce: Kształt (okrągły, spiralny, nieregularny), Brzeg (regularny, nieregularny, strzępiasty), Przekrój (wypukły, płaski, wyniosły, brodawkowaty, wrastający w podłoże), Wielkość, Barwa, Przejrzystość, Struktura, Konsystencja, Zapach, Zawieszalność Barwienie: 1. Proste Pozytywne, Negatywne, 2. Złożone Met. Grama, Met. Ziehl-Nieelsena.

13 4. Badanie właściwości fizjologicznych czystych hodowli: Próby hodowlane, Próby biochemiczne.

14 Metody biochemiczne polegają na określeniu zdolności mikroorganizmów do asymilacji, fermentacji lub rozkładu określonych związków chemicznych.

15 Spektrometria masowa MALDI-TOF Narzędziem najnowszej generacji wykorzystywanym w mikrobiologii klinicznej do identyfikacji mikroorganizmów jest spektrometria mas, tzw. MALDI- TOF MS (ang. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry). System dokonuje klasyfikacji i identyfikacji mikroorganizmów przez automatyczną analizę ich profilu białkowego (molekularny białkowy odcisk palca ) i porównanie ze spektrofotometrycznymi wzorami referencyjnymi zgromadzonymi w bazie danych.

16 Przykłady testów w toku diagnostycznym: Test na katalazę. Katalaza jest enzymem, który rozkłada toksyczny dla komórki H 2 O 2 do H 2 O i tlenu. Na szkiełko podstawowe należy nanieść kroplę 3% roztworu H 2 O 2 i zawiesić w niej pobraną kolonię; pęcherzyki gazu wskazująna obecnośćkatalazy.

17 Katalazo-dodatnie Micrococcus, Staphylococcus, Corynebacterium, Listeria, Enterobacteriaceae Katalazo-ujemne Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Peptostreptococcus, Peptococcus

18 Test na koagulazę. Koagulaza ścina osocze krwi króliczej w obecności aktywatora koagulazy, który zostaje przekształcony w związek podobny do trombiny. Związek ten działając na fibrynogen przemienia go w fibrynę. Oznaczenie wykonuję się metodą probówkową. Do badania używa się 24godzinnej hodowli bakterii. Osocze królicze miesza się w probówce z hodowlą i inkubuje w temp.37 C przez 1-4godzin. Jako wynik dodatni przyjmuje siępowstanie wyraźnego skrzepu plazmy. Jeżeli po 4 godzinach nie stwierdza się wyniku dodatniego próbę należy pozostawić w temperaturze pokojowej do następnego dnia. Wykonuje się też oznaczanie koagulazy związanej tzw. CF-clumping factor, tj. ścinania fibrynogenu bez udziału aktywatora koagulazy. Test przeprowadza się metodą szkiełkową poprzez zmieszanie drobnoustrojów zawieszonych w kropli jałowej wody z kroplą króliczego osocza. Wynik odczytuje się po 30 sekundach. Wystąpienie aglutynacji to wynik dodatni.

19 Koagulazododatnie S. aureus, S. intermedius, S. hyicus ssp. hyicus, S. schleiferi ssp. coagulans Koagulazo-ujemne S. saprophyticus, S. xylosus, S. gallinarum, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. capitis, S. warneri, S. simulans, S. caprae, S. hominis

20 5. Badania immunologiczne

21 Odczyny, w których zachodzi bezpośrednie łączenie się antygenu z przeciwciałem (immunofluorescencja, odczyny immunoenzymatyczne, radioimmunologiczne), Odczyny, w których zachodzą różne reakcje fizykochemiczne lub uczestniczą dodatkowe elementy (immunoprecypitacja, immunoelektroforeza, odczyn wiązania dopełniacza)

22 METODY SEROLOGICZNE Metody niehodowlane Metody bezpośrednie (do wykrywania antygenów) Metody pośrednie (do wykrywania przeciwciał) Odczyny immunologiczne: precypitacji aglutynacji immunofluorescencji immunoenzymatyczne (ELISA)

23 AGLUTYNACJA LATEKSOWA Mikrocząsteczki lateksu opłaszczone są znanymi przeciwciałami, które wiążą się ze specyficznymi antygenami. Powstaje widoczna gołym okiem AGLUTYNACJA. brak aglutynacji wynik negatywny aglutynacja wynik dodatni

24 Paciorkowce Grupy serologiczne wg schematu Lancefield Rebeca Lancefield w 1933r. opracowała schemat klasyfikacji serologicznej dla paciorkowców β-hemolizujących. Oznaczenie opiera się na wykryciu grupowo-swoistych antygenów ściany komórkowej. W większości są to wielocukry. Antygeny te posiadają w większości paciorkowce dające β- hemolizę, część α-hemolizujących i paciorkowce niehemolizujące.

25 A - S. pyogenes, nieliczne szczepy S. anginosus i S. constelatus B -S. agalactiae, C -S. dysgalactiae subsp. equisimilis, S. equi subsp. equi, S. equi subsp. zooepidemicus D -S. bovis (=equinus), Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Streptococcus avium F - niektóre paciorkowce grupy S. millieri G - m.in. zwierzęce paciorkowce ropotwórcze (S. canis)

26 Klasyfikacja i nazewnictwo bakterii Salmonella Rodzaj Salmonella podzielony jest na dwa gatunki: 1. Salmonella enterica, w obrębie którego wyróżniono sześć podgatunków (subspecies): S. enterica subsp. enterica (serowary Typhimurium, London, Paratyphi B, Typhi, Enteritidis, Hadar, Mbandaka, Newport) S. enterica subsp. salamae S. enterica subsp. arizonae S. enterica subsp. diarizonae S. enterica subsp. houtenae S. enterica subsp. indica 2. Salmonella bongori. Serowary pięciu pozostałych podgatunków Salmonella enterica i serowary gatunku Salmonella bongori opisuje się wzorami antygenowymi. Przynależność serowarów do tych podgatunków określono następującymi symbolami: II - serowary S. enterica subsp. salamae IIIa - S. enterica subsp. arizonae IIIb - S. enterica subsp. diarizonae IV - S. enterica subsp. houtenae VI - S. enterica subsp. Indica V- S. bongori

27 Źródło: _01.pdf

28 Ilość aktualnie znanych wariantów serologicznych (serowarów) w poszczególnych gatunkach i podgatunkach Salmonella, wynosi: 1. Salmonella enterica subspecies enterica 1531 salamae 505 arizonae 99 diarizonae336 houtenae 73 indica Salmonella bongori 22 Razem: 2557 Podstawądo podziału jest zróżnicowanie antygenów somatycznych (antygen O) i rzęskowych (antygen H).

29 Metoda immunoenzymatyczna- ELISA Oparta na znakowaniu, czyli związaniu antygenu lub przeciwciała z enzymem. Powstający kompleks antygen-przeciwciało-enzym jest wykrywany po dodaniu bezbarwnego substratu, który trawiony enzymem daje barwny produkt. Reakcja barwna jest odczytywana wizualnie lub w spektrofotometrze. Przykłady: - Wykrywanie antygenów HBV - Oznaczanie przeciwciał swoistych przeciwko HIV, HBV, HCV, diagnostyka kleszczowego zapalenia mózgu - Oznaczanie miana przeciwciał swoistych przeciwko Legionella pneumophila, Borrelia burgdorferii

30 METODY MOLEKULARNE Poszukiwanie kwasów nukleinowych w materiale klinicznym lub hodowli drobnoustrojów. metoda łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) hybrydyzacja kwasów nukleinowych przy użyciu sond molekularnych

31 6. Określenie wrażliwości na substancje przeciwdrobnoustrojowe, w tym leki.

32 Lekowrażliwość Antybiotyki (z greki anti - przeciw, bios - życie) - naturalne związki organiczne wytwarzane przez drobnoustroje; także syntetyczne lub półsyntetyczne, stosowane jako leki przeciwdziałające infekcjom wywoływanym przez drobnoustroje chorobotwórcze (najczęściej bakterie, ale także grzyby i pierwotniaki). Chemioterapeutyki- są to związki stworzone w sposób czysto chemiczny, brak ich odpowiedników w naturze.

33 Działanie Działanie antybiotyków polega na powodowaniu śmierci komórki bakteryjnej (działanie bakteriobójcze) lub wpływaniu w taki sposób na jej metabolizm, aby ograniczyć jej możliwości rozmnażania się (działanie bakteriostatyczne).

34 Mechanizmy oporności bakterii na antybiotyki 1. Błona zewnętrzna bakterii Gram-ujemnych mutacje poryn 2. Enzymatyczna inaktywacja antybiotyków 3. Aktywne wypompowywanie antybiotyków z cytoplazmy- EFLUKS 4. Modyfikacja celów działania antybiotyków 5. Regulacja ekspresji genów oporności 6. Transfer genów oporności Mutacje istniejących genów Nabycie nowych genów (w obrębie jednego gatunku) - tansdukcja (bakteriofagi) - transformacja (np. S. pneumoniae - oporność na pencylinę) Międzygatunkowy i międzyrodzajowy transfer genów oporności - plazmidy - koniugacyjne transpozony

35 Główne grupy antybiotyków i chemioterapeutyków 1 B-laktamy penicyliny, penicyliny z inhibitorem, cefalosporyny/cefamycyny, monobaktamy, trójbaktamy, karbapenemy, penemy 2 Aminoglikozydy streptomycyna, neomycyna, kanamycyna, gentamycyna, tobramycyna, netylmycyna, isepamycyna, amikacyna 3 Tetracykliny doksycyklina, tetracyklina, minocyklina 4 Makrolidy/ketolidy erytromycyna, spiramycyna, josamycyna cykliczny węglan erytromycyny (Dawercin), roksytromycyna, klarytromycyna, azytromycyna, dirytromycyna, trolitromycyna 5 Linkozamidy linkomycyna, klindamycyna 6 Streptograminy pristinamycyna, chinupristina, dalfopristina 7 Oksazolidynony linezolid 8 Glikopeptydy wankomycyna, teikoplanina

36 9 Chloramfenikol detreomycyna 10 Polimiksyny kolistyna 11 Rifamycyny rifampicyna 12 Sulfonamidy kotrimoksazol 13 Nitroimidazole metronidazol, ornidazol 14 Nitrofurany nitrofurantoina, furagin, nifuroksazyd 15 Chinolony kwas pipemidynowy, norfloksacyna, pefloksacyna, ciprofloksacyna, ofloksacyna, lewofloksacyna, sparfloksacyna, moksifloksacyna, gemifloksacyna 16 Kwas fusydowy 17 Leki przeciwgrzybicze polieny: nystatyna, amfoterycyna B azole: flukonazot, itrakonazol, ketokonazol, ekonazol, worikonazol antymetabolity: 5-fluorocytozyna 18 Leki przeciwwirusowe acyklowir, didanozyna, famcyklowir, gancyklowir, indinawir, lamiwudyna, nalfinawir, ritonawir, sakwinawir, stawudyna, zalcytabina, zydowudyna

37 Spektrum działania ZAKRES DZIAŁANIA WĄSKIE SREKTRUM -OGRANICZONE NP. DO ZIARENKOWCÓW SZEROKIE SPEKTRUM -GRAM(+) I GRAM(-) (+/-BEZTLENOWCE) PENICYLINA BENZYLOWA WANKOMYCYNA PENICYLINY PÓŁSYNTETYCZNE CEFALOSPORYNY KARBAPENEMY

38 OZNACZENIE LEKOWRAŻLIWO LIWOŚCI Wybór leku o najwęższym zakresie działania i największej skuteczności przeciwko wyizolowanemu drobnoustrojowi.

39 Lekowrażliwość: 1. Metoda półilościowa- ATB, 2. Metoda dyfuzyjno-krążkowa- nasączone antybiotykiem krążki bibuły, 3. Metoda ilościowa- E-testy, 4. Systemy automatyczne

40 E-test- metoda służąca do ustalenia najmniejszego stężenia antybiotyku (MIC) hamującego wzrost drobnoustroju. Wykorzystuje się paski nasycone antybiotykiem w gradiencie stężeń. ATB- pasek pozwala na określenie wrażliwości badanych bakterii na antybiotyki w półpłynnym podłożu. Metoda dyfuzyjno-krążkowa- najczęściej używana metoda, oparta jest na dyfuzji antybiotyku zawartego w krążku do podłoża. Antybiotyk dyfunduje promieniście, tworząc gradient stężeń.

41 Szczepy alarmowe W trakcie pobytu pacjenta w szpitalu może dojść do rozwinięcia zakażenia, które jest bezpośrednim wynikiem hospitalizacji. Może się ono ujawnić po opuszczeniu szpitala oraz dotyczyć personelu medycznego bądź osób odwiedzających. Czynnikami etiologicznymi zakażeń szpitalnych mogą być zarówno bakterie, jak i wirusy, a także grzyby i pasożyty.

42 Lista czynników alarmowych stanowiąca załącznik nr 1 do Rozporządzenia Ministra Zdrowia z dn. 23 grudnia 2011r. w sprawie listy czynników alarmowych, rejestrów zakażeń szpitalnych i czynników alarmowych oraz raportów o bieżącej sytuacji epidemiologicznej szpitala (Dz. U nr 294 poz. 1741) 1. Gronkowiec złocisty (Staphylococcus aureus) oporny na metycylinę (MRSA) lub glikopeptydy (VISA lub VRSA) lub oksazolidynony. 2. Enterokoki (Enterococcus spp.) oporne na glikopeptydy (VRE) lub oksazolidynony. 3. Pałeczki Gram-ujemne Enterobacteriaceae spp. wytwarzające beta-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym (np. ESBL,AMPc,KPC) lub oporne na karbapenemy lub inne dwie grupy leków lub polimyksyny. 4. Pałeczka ropy błękitnej (Pseudomonas aeruginosa) oporna na karbapenemy lub inne dwie grupy leków lub polimyksyny. 5. Pałeczki niefermentujące z rodzaju Acinetobacter spp. oporne na karbapenemy lub inne dwie grupy leków lub polimyksyny. 6. Szczepy chorobotwórcze laseczki beztlenowej Clostridium difficile oraz wytwarzane przez nie toksyny A i B.

43 7. Laseczka beztlenowa Clostridium perfringens. 8. Dwoinka zapalenie płuc (Streptococcus pneumoniae) oporna na cefalosporyny III generacji lub penicylinę. 9. Grzyby Candida oporne na flukonazol lub inne leki z grupy azoli lub kandyn. 10. Grzyby Aspergillus.

44 11. Rotawirus (rotavirus). 12. Norowirus (norovirus). 13. Wirus syncytialny (RSV) 14. Wirus zapalenia wątroby typu B 15. Wirus zapalenia wątroby typu C. 16. Wirus nabytego niedoboru odporności u ludzi (HIV). 17. Biologiczne czynniki chorobotwórcze izolowane z krwi lub płynu mózgowo-rdzeniowego, odpowiedzialne za uogólnione lub inwazyjne zakażenia.