CAMERA SEPARATORIA previously POST PY CHROMATOGRAFII. Volume 3, Number 1 / June 2011, 69-85

Transkrypt

1 CAMERA SEPARATORIA previously POSTPY CHROMATOGRAFII Volume 3, Number 1 / June 2011, Mariusz JASZCZOT, Grzegorz BOCZKAJ, Khrystyna GRYGORYSHYN, Marian KAMISKI * Politechnika Gdaska, Wydzia Chemiczny, Instytut Chemii, Katedra Inynierii Chemicznej i Procesowej, ul. G. Narutowicza 11/12, Gdask mknkj@chem.pg.gda.pl*, mariusz.jaszczot@gmail.com Immunochromatografia: przegld i charakterystyka immunosorbentów oraz metod immobilizacji Immunochromatography: a review and characterization of immunosorbents and methods of immobilization Streszczenie: Chromatografia immunopowinowactwa (ang. ImmunoAffinity Chromatography, IAC) jest technik rozdzielania stosowan do rónorodnych klas zwizków chemicznych, a tak- e jako dodatkowe narzdzie w badaniach z zakresu biochemii. Kluczowym elementem odpowiedzialnym za wysoce selektywne oddziaywania w IAC jest przeciwciao (ang. antibody, Ab) produkowane przez organizmy ywe w wyniku odpowiedzi immunologicznej i wykazujce specyficzno oraz powinowactwo wobec substancji rozpoznawanych, jako obce, okrelanych jako antygeny. W celu przeprowadzenia procesu immunochromatograficznego przeciwciaa immobilizuje si na nonikach, które wczeniej musz zosta zaktywowane. Jako matryce stosuje si naturalne oraz syntetyczne polimery: agaroz, celuloz, dekstran, poliakrylamidy, polimetakrylaty, a take el krzemionkowy oraz szko porowate. Aktywacja zó ma za zadanie przygotowa matryc do immobilizacji poprzez wprowadzenie grup funkcyjnych oddziaujcych z elementami przeciwciaa. W tym celu stosuje si rónorodne aktywatory rozpuszczalne oraz sieciujce czynniki bifunkcyjne. Istnieje take szeroki wachlarz dostpnych metod unieruchamiania przeciwciaa na powierzchni nonika, które ze wzgldu na rodzaj oddziaywa przeciwciao-nonik dzielimy na fizyczne oraz chemiczne, a w zalenoci od orientacji zwizanych immunoglobulin: ukierunkowane i nieukierunkowane (losowe). W trakcie przygotowania immunosorbentu naley uwzgldni waciwoci matrycy, a take warunki prowadzenia procesu aktywacji oraz immobilizacji, co bezporednio wpywa na sprawno kolumny wypenionej tego typu zoem, a w konsekwencji na efektywno procesu chromatograficznego. Sowa kluczowe: chromatografia immunopowinowactwa, przeciwciaa monoklonalne, przeciwciaa poliklonalne, immobilizacja Abstract: Immunoaffinity Chromatography (IAC) is a technique used for separation of different classes of chemical compounds, as well as an additional tool in biochemistry. The key element in the IAC is an antibody (Ab) produced by living organisms as a result of activation of the immune response, which shows the specificity and affinity with the substances recognized as foreign, known as antigens. In order to carry out the immunochromatographic process, antibodies are immobilized on the carrier, which must be firstly activated. There are carriers made of natural and synthetic polymers: agarose, cellulose, dextran, polyacrylamides, polimethacrylates, as well as silica gel and porous glass. The main task of activation is to prepare the carrierx for the immobilization by the introduction of functional groups interacting with the elements of the antibody. For this purpose, the various activators like soluble and bifunctional crosslinking agents are used. There are many methods of immobilization, which, depending on the antibody-matrix

2 70 M. Jaszczot, G. Boczkaj, K. Grygoryshyn, M. Kamiski interactions, are divided into physical and chemical immobilization, and depending on the orientation - random and site-directed. During the preparation of immunosorbent one should take into account the characteristics of the matrix, as well as the conditions of the activation and immobilization, which directly affect the efficiency of the bed, and consequently the performance of the chromatographic process. Key words: Immunoaffinity chromatography, IAC, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, immobilization 1. Wstp (Introduction) Chromatografia immunopowinowactwa (IAC - Immunoaffinity Chromatography) jest technik rozdzielania, w której podstaw procesu separacji skadników rozdzielanej mieszaniny stanowi specyficzno oddziaywa przeciwciao antygen. Moliwo wytwarzania przeciwcia wykazujcych powinowactwo wobec rónorodnych klas zwizków chemicznych, a take selektywno wiza spowodowaa, e chromatografia immunopowinowactwa zostaa uznana za jedn z najbardziej efektywnych technik stosowanych w celach analitycznych oraz preparatywnych. Obecnie metoda ta jest powszechnie wykorzystywana w dziedzinach z zakresu biologii, ochrony rodowiska, analityki ywnoci, jak równie w badaniach klinicznych do rozdzielania oraz oczyszczania peptydów, enzymów, hormonów, receptorów, wirusów, leków, mykotoksyn, pestycydów, innych zwizków organicznych, a take metali [1, 2]. Ponadto, IAC moe suy, jako dodatkowe narzdzie do bada biochemicznych, pozwalajc na ilociow ocen parametrów dotyczcych specyficznych oddziaywa rónorodnych elementów w systemach biologicznych [3]. Pierwsze doniesienia o immobilizacji przeciwcia na podou staym pochodz z roku 1967 [2]. Od tego momentu nastpi ogromny postp w kierunku rozwoju rozmaitych technik unieruchamiania, umoliwiajcych wydajne przeprowadzenie procesu chromatograficznego. Pomimo tego, e ich ilo oraz rónorodno obecnie wydaje si by bardzo dua, wielu naukowców nadal pracuje nad doskonaleniem metod unieruchamiania centrów aktywnych na noniku, uzyskujc wysze wydajnoci oraz polepszajc efektywno procesów immobilizacji. Jednym z gównych problemów napotykanych przez badaczy w trakcie prowadzenia procesu immobilizacji jest zachowanie pierwotnej aktywnoci przeciwcia, która czsto ulega zmianie w wyniku wytwarzanych ze zoem wiza chemicznych, a take odpowiedniej orientacji zapewniajcej efektywne rozdzielanie. 2. Przeciwciaa (Antibodies) Charakterystyka przeciwcia (Characterization of antibody) Przeciwciaa, inaczej immunoglobuliny (Ig), s glikoproteinami nalecymi do grupy biaek cytoplazmatycznych wytwarzanych przez komórki Camera Separatoria Vol. 3, No 1/2011

3 Immunochromatografia: przegld i charakterystyka immunosorbentów 71 w wyniku aktywacji odpowiedzi immunologicznej. Szacuje si, e ukad odpornociowy ssaków (w tym czowieka) produkuje od 10 6 do 10 8 rónorodnych przeciwcia, które swoicie wi si z ciaami obcymi lub ich czciami zwanymi antygenami [4]. Typowe przeciwciao (rys.1) o masie czsteczkowej okoo 150 kda zoone jest z czterech acuchów polipeptydowych: dwóch lekkich L, od ang. light (o ciarze ok. 25 kda kady) oraz dwóch cikich H, od ang. heavy (o ciarze ok. 50 kda kady). Dwa identyczne acuchy H s dusze i powizane midzy sob wizaniami disiarczkowymi. acuchy lekkie równie s identyczne i wi si wizaniami disiarczkowymi z acuchami cikimi. Czsto wystpuj w dwóch formach i. W wyniku trawienia enzymatycznego papain przeciwciaa otrzymuje si trzy fragmenty o masie 50 kda kady. Dwa z nich to fragment F ab (z ang. antigen binding fragment) znajdujcy si na N-kocu i zawierajcy region o zmiennej zawartoci aminokwasów zwany paratopem, który odpowiada za wizanie antygenu, a take element F c (z ang. crystallization fragment) na C-kocu, który nie wie antygenu, natomiast wykazuje funkcje efektorowe. W nienaruszonej czsteczce immunoglobuliny fragment F c jest poczony w sposób ruchomy z dwoma jednostkami F ab,, co umoliwia zmian kta F c - F ab, tym samym uatwia tworzenie kompleksów przeciwciao-antygen [5]. Rys. 1. Schemat budowy przeciwciaa Fig. 1. Scheme of antibody structure Vol. 3, No 1/2011 Camera Separatoria

4 72 M. Jaszczot, G. Boczkaj, K. Grygoryshyn, M. Kamiski Istnieje 5 klas immunoglobulin: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, które zawieraj taki sam acuch lekki, ale róni si sekwencj aminokwasow acucha cikiego, adunkiem, zawartoci wglowodanów, iloci jednostek Y, miejscem wystpowania, a take steniem w organizmie, co w konsekwencji daje inne funkcje biologiczne. W chromatografii immunopowinowactwa najczciej wykorzystywan klas jest immunoglobulina G (IgG), wystpujca w surowicy w najwikszej iloci. W jej obrbie wyrónia si cztery podklasy: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Wystpuj one w rónych proporcjach: 66%, 23%, 7% oraz 4%. Cech wspóln jest posiadanie acucha cikiego, który w zalenoci od podklasy nieco róni si sekwencj aminokwasow, a take regionem zawiasowym, szczególnie lokalizacj mostków disiarczkowych. Zalet tej klasy przeciwcia jest stabilno w trakcie oczyszczania, a take najmniejsza masa czsteczkowa sporód wszystkich klas immunoglobulin [5, 6]. Otrzymywanie przeciwcia (Receiving of antibodies) Dwa typy przeciwcia poliklonalne oraz monoklonalne - s wykorzystywane jako elementy aktywne fazy stacjonarnej w chromatografii immunopowinowactwa. Przeciwciaa poliklonalne s produkowane przez rónorodne linie komórkowe, mog wiza róne epitopy z rónicym si powinowactwem. Z kolei przeciwciaa monoklonalne s wytwarzane z jednego klonu limfocytów B, s swoiste wobec tego samego epitopu oraz wi si z nim w przyblieniu z tak sam si [6]. W pocztkowym okresie rozwoju technik chromatografii immunopowinowactwa gównym ródem przeciwcia poliklonalnych bya surowica immunizowanych (cho nie zawsze) zwierzt laboratoryjnych. Po wprowadzeniu antygenu do organizmu zwierzcia (zazwyczaj myszy lub królika) zostaje zaktywowany cay szereg limfocytów B, które zaczynaj produkowa przeciwciaa przeciw antygenom zawierajcym róne epitopy. W ten sposób powstaje mieszanina przeciwcia o zrónicowanym powinowactwie i swoistoci. Gdy stenie immunoglobulin osignie podan warto, przeprowadza si procedur izolacji. W celu immobilizacji, wczeniej wykorzystywano albo nieoczyszczon frakcj Ig lub te oczyszczon metodami powinowactwa na specyficznych zoach [2]. Dziki rozwojowi technik hybrydyzacji komórek w poowie lat 70. pojawia si te moliwo wykorzystania przeciwcia monoklonalnych. Procedura ich otrzymywania jest analogiczna do procedury otrzymywania przeciwcia poliklonalnych. Limfocyty B s izolowane ze ledziony zwierzt immunizowanych antygenami, specyficznymi do interesujcych nas przeciwcia, a nastpnie poddawane fuzji z komórkami szpiczaka wykazujcymi zdolno do nieograniczonej liczby podziaów. Tak otrzymana hybryda o swoistoci limfocytu B jest w stanie produkowa specyficzne przeciwciaa przez dugi okres czasu. Kolejnym etapem jest dokonanie selekcji (skriningu) i izolacji hybrydy produkujcej charakterystyczne przeciwciao. Po dokonaniu wyboru, odpowiednie komórki izoluje si, a nastpnie reklonuje. Na tym etapie ocenia si te waciwoci wice przeciwcia. Jeli wybrana linia prze- Camera Separatoria Vol. 3, No 1/2011

5 Immunochromatografia: przegld i charakterystyka immunosorbentów 73 ciwcia monoklonalnych spenia wszystkie stawiane wymagania, mona rozpocz produkcj na wiksz skal [2]. Dokonanie wyboru pomidzy przeciwciaami poli- czy monoklonalnymi, które maj suy jako elementy zoa do oczyszczania interesujcych skadników mieszaniny, czasami nastrcza trudnoci, poniewa kady typ posiada swoje zalety i wady. Z praktycznego punktu widzenia produkcja przeciwcia poliklonalnych jest atwiejsza i szybsza. Jednak ródo, z którego izolowane s tego typu imunoglobuliny, jakim s zwierzta hodowlane (konie), jest ograniczone. Dodatkowo potrzeba pobierania krwi wczeniej zaszczepionych zwierzt, a take przeprowadzenie procesu immunizacji za kadym razem od nowa, czsto powoduje problemy z uzyskaniem odpowiedniej iloci oraz jakoci podanych przeciwcia. W tym przypadku dobrym rozwizaniem moe by wykorzystanie przeciwcia monoklonalnych. Komórki hybrydowe mona przechowywa w ciekym azocie i teoretycznie zachowuj one zdolno do wytwarzania przeciwcia monoklonalnych nawet przez kilka lat. Pomimo e ich produkcja jest nieco bardziej skomplikowana i kosztowna, stosowanie przeciwcia monoklonalnych na wiksz skal oraz przez duszy okres czasu jest bardziej opacalne [3]. Nie ma uniwersalnych zasad wyboru typów przeciwcia. W badaniach naukowych szerokie zastosowanie posiadaj oba typy immunoglobin. Z kolei w przemyle, zwaszcza farmaceutycznym, do oczyszczania stosuje si gównie przeciwciaa monoklonalne. Oprócz aspektów ekonomicznych, zwizane to te jest z koniecznoci standaryzacji metod oraz technik, która wymaga zapewnienia staego oraz bezpiecznego róda surowca [2]. 3. Noniki: ogólna charakterystyka (Carriers: general characterization) Wanym elementem planowania procesu chromatograficznego rozdzielania jest dokonanie wyboru odpowiedniego nonika. Dla efektywnego wykorzystania w chromatografii immunopowinowactwa, idealna matryca powinna posiada nastpujce waciwoci [7]: nierozpuszczalno; odpowiednia przepuszczalno i dua powierzchnia waciwa; sztywno oraz odpowiedni rozmiar ziaren; zerowa pojemno adsorpcyjna (w przypadku chemicznych metod immobilizacji); odpowiednia reaktywno chemiczna, pozwalajca na wprowadzenie przeciwcia; stabilno chemiczna w warunkach prowadzenia procesu immobilizacji, adsorpcji, desorpcji oraz regeneracji; odporno na dziaanie mikroorganizmów i enzymów; charakter hydrofilowy. Vol. 3, No 1/2011 Camera Separatoria

6 74 M. Jaszczot, G. Boczkaj, K. Grygoryshyn, M. Kamiski Cakowita nierozpuszczalno jest wana nie tylko z powodu moliwych strat czci nonika, ale te dla zapobiegania zanieczyszczenia substancji przeznaczonej do rozdzielania. Odpowiednia przepuszczalno matrycy jest konieczna, w celu umoliwienia tworzenia si kompleksów pomidzy przeciwciaem, a substancj rozdzielan [7]. Sorbent musi te wykazywa minimaln niespecyficzn sorpcj. Jest to istotny warunek w przypadku chemicznych metod immobilizacji. W trakcie przygotowania zoa wane jest, aby ligand przycza si gównie wizaniami kowalencyjnymi, a przeciwciaa niezwizane mogy by usunite z kolumny. Natomiast w przypadku fizycznej adsorpcji warunek ten nie jest konieczny [7]. Matryca powinna zawiera odpowiedni ilo grup funkcyjnych, które po aktywacji lub modyfikacji maj naby zdolno do wizania przeciwciaa. Aktywacja oraz modyfikacja musz zachodzi w warunkach niepowodujcych zmian struktury nonika. Szczególnie wan jest wytrzymao mechaniczna w trakcie doczania liganda (przeciwciaa) oraz stabilno chemiczna w szerokim zakresie ph, temperatury, siy jonowej, jak równie w obecnoci czynników denaturujcych. Fizyczna oraz chemiczna stabilno wie si z moliwoci wielokrotnego wykorzystania zó [7]. Sorbenty nie mog by te atakowane przez drobnoustroje lub enzymy. Takie wymagania lepiej speniaj noniki nieorganiczne, takie jak szko, czy te syntetyczne polimery. Hydrofilowe waciwoci s podane nie tylko w celu zniesienia niespecyficznych oddziaywa, ale take w celu niedopuszczenia do obnienia stabilnoci liganda w wyniku oddziaywa hydrofobowych, które mog mie podobny efekt, co rozpuszczalniki organiczne i powodowa denaturacj biaka, jakim jest przeciwciao [7]. Stosowane w chromatografii immunopowinowactwa zoa to gownie pochodne wglowodanowe (np. agaroza, celuloza), czy te syntetyczne, organiczne noniki (akrylamidy, ich pochodne oraz kopolimery, polimetakrylany, matryce polieterosulfonowe). Istnieje te wiele zó komercyjnych: Affinica Agarose/Polymeric Supports (Schleicher i Schuell), AvidGel (BioProbe), Bio-Gel/Affi-Gel (BioRad), Fractogel (EM Separations), HEMA-AFC (Alltech), Reacti-Gel (Pierce), Sepharose/Superose/Sephacryl (Pharmacia), Trisacryl / Ultrogel (IBF) oraz TSK Gel Toyopearl (TosoHaas) [4]. Niskie opory przepywu tych zó powoduj, i proces moe by przeprowadzony w warunkach przepywu pod wpywem siy grawitacji czy te podcinienia. To powoduje, e ele te s stosunkowo proste i tanie. Gówn wad tego typu materiau jest niekorzystna dynamika wymiany masy, ograniczona stabilno przy wysokich nateniach przepywu oraz zwikszonym cinieniu. W tabeli 1 przedstawiono informacj dotyczce niektórych zó komercyjnych stosowanych w procesach rozdzielania skadników mieszanin z zastosowaniem IAC. Chromatografia immunopowinowactwa moe by stosowana, w wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), pod warunkiem, e zostan wykorzystane materiay o wikszej wytrzymaoci mechanicznej. Zoa, które Camera Separatoria Vol. 3, No 1/2011

7 Immunochromatografia: przegld i charakterystyka immunosorbentów 75 zostay wytworzone do tych celów obejmuj modyfikowany el krzemionkowy, szko, organiczne polimery syntetyczne, takie jak zoa azalaktonowe i polistyrenowe [4]. 4. Przegld najpopularniejszych noników (Review of the most common carriers) Celuloza (Cellulose) Celuloza jest liniowym polimerem nalecym do polisacharydów. Skada si z czsteczek zawierajcych od kilkunastu do kilkuset tysicy jednostek D-glukozy, które s poczone wizaniami -1,4-glikozydowymi, rzadko te -1,6-glikozydowymi. Preparaty komercyjne, produkowane na bazie celulozy s zazwyczaj sieciowane czynnikami bifunkcyjnymi takimi jak epichlorohydryn (1-chloro- 2,3-epoksypropan) i wykazuj wysok stabilno chemiczn. Wizania glikozydowe celulozy s podatne na hydroliz kwan, a w warunkach ekstremalnych obserwuje si prawie ilociowe rozczepienie do wolnej krystalicznej D-glukozy. Z kolei oddziaywanie z czynnikami utleniajcymi jak na przykad nadjodan sodu (jodan (VII) sodu) powoduje tworzenie si grup aldehydowych bd te karboksylowych. Celuloza ulega dziaaniu celulaz obecnych midzy innymi w mikroorganizmach. Agaroza (Agarose) Agaroza jest liniowym polisacharydem zbudowanym z naprzemian uoonych jednostek D-galaktozy oraz 3,6-anhydro-L-galaktozy. Obecnie jest najbardziej rozpowszechnionym nonikiem w chromatografii powinowactwa. Jak wykazay badania, odpowiada ona prawie wszystkim wymaganiom idealnej matrycy. Sepharose jest elem agarozy o sferycznych ziarnach. W handlowej postaci wystpuje jako biaa zawiesina w wodzie, która zawiera 0,02% azydek sodu jako czynnik bakteriostatyczny. Pierwsze w sprzeday pojawiy si trzy typy sefarozy: Sepharose 6B, 4B oraz 2B. Najczciej stosowan jest Sepharose 4B. Wraz ze wzrostem stenia agarozy zmniejsza si jej porowato, co z kolei powoduje zwikszenie sztywnoci. Sepharose rozpuszcza si po podgrzewaniu do 40 C, a take moe zosta zniszczona pod wpywem zamraania. Sepharose jest stabilna w wodnych (w tym o wysokim steniu soli) roztworach w zakresie ph od 4 do 9. Nie zaleca si te stosowania jako medium odszczepiajcego chlorowodorku guanidyny, mocznika, soli chaotropowych, rodanku potasu czy te czynników utleniajcych. Substancje te mog powodowa niszczenie wiza wodorowych, które stabilizuj nonik. Dziki obecnoci 3,6-anhydro-L-galaktozy matryca jest odporna na biodegradacj. Sepharose mona równie poddawa sterylizacji chemicznej (np. dietylopirowglanem - DEPC ) [7]. Vol. 3, No 1/2011 Camera Separatoria

8 76 M. Jaszczot, G. Boczkaj, K. Grygoryshyn, M. Kamiski W roku 1975 w celach praktycznych zaczto wykorzystywa Sepharose CL (2B, 4B, 6B), wytwarzan w wyniku reakcji z 2,3-dibromopropanolem w silnie zasadowym rodowisku. Po przeprowadzeniu procesu sieciowania, el jest poddawany hydrolizie zasadowej w warunkach redukujcych. Zwizane acuchy polisacharydowe zawieraj mao grup ulegajcych jonizacji, a take lepsz chemiczna i fizyczn wytrzymao w porównaniu z Sepharose. Z kolei porowato obu rodzajów noników jest podobna. Sepharose CL jest stabilna w rodowisku wodnym w ph 3-14 oraz w rozpuszczalnikach organicznych. Mona stosowa sole chaotropowe, natomiast naley unika warunków utleniajcych w celu zachowania identycznoci wchodzcych w skad reszt cukrowych. Sepharose CL moe by wielokrotnie autoklawowana w temperaturze 120 o C oraz przy ph 7. Matryca jest równie odporna na biologiczn degradacj [8]. Firma BioRad produkuje kilka typów noników znanych, jako Biogel A o zrónicowanej zawartoci agarozy. W chromatografii immunopowinowactwa najczciej s wykorzystywane formy zaktywowane tych matryc wystpujcych w sprzeday pod nazw handlow Affi-Gel 10. Zoe to stanowi sieciowan agaroz z aktywn grup karboksylow w postaci estru z N-hydroksysukcynimidem [7, 9]. Affi-Gel 10 zawiera obojtne 10-atomowe rami cznikowe, w zwizku z czym jest czsto wykorzystywany w rónych technikach chromatografii powinowactwa. Biako, w tym przeciwciaa, wi si wizaniem amidowym poprzez terminaln grup karboksylow. Wielko ziaren wynosi m. Pojemno chemiczna 15 mol/ml elu, pojemno biakowa 35 mg/ml. Zoe jest stabilne do temperatury -70 C, a take w obecnoci rozpuszczalników organicznych: alkoholi, dimetylosulfotlenku, formamidu oraz dioksanu. Wród zalet mona wymieni atwo w wykorzystaniu, szybkie wizanie liganda (w cigu 4 godzin) w stosunku do innych sorbentów, wysoka stabilno w szerokim zakresie ph (2 11) oraz w obecnoci czynników chaotropowych [9]. ele poliakrylamidowe (Poliacrylamides gels) ele poliakrylamidowe s zbudowane z acucha wglowego, do którego przyczone s grupy amidowe. Te zupenie syntetyczne matryce otrzymuje si poprzez kopolimeryzacj akrylamidu CH 2 =CH-CO-NH 2 oraz N,N -metylenobisakrylamidu CH 2 =CH-CO-NH-CH 2 -NH-CO-CH=CH 2, który jest czynnikiem sieciujcym [10]. ele poliakrylamidowe do celów chromatograficznych otrzymuje si metod polimeryzacji emulsyjnej. S produkowane przez firm Bio-Rad, która oferuje je w postaci suchych proszków o nazwie handlowej Bio-Gel. Bioel, to kseroel (ciao stae), które powstaje poprzez powolne suszenie elu (bez zmiany mikrostruktury), który po dodaniu wody pcznieje formujc ziarna przydatne do celów chromatograficznych [10]. ele poliakrylamidowe s stabilne w zakresie ph 1 10 i odporne na wikszo rozpuszczalników. Nie posiadaj naadowanych grup, dlatego wymiana jonami z substancjami Camera Separatoria Vol. 3, No 1/2011

9 Immunochromatografia: przegld i charakterystyka immunosorbentów 77 poddanymi rozdzielaniu chromatograficznemu odgrywa marginalne znaczenie. ele poliakrylamidowe s biologicznie obojtne i nie s atakowane przez drobnoustroje. W zwizku z tym, e ich czsteczki silnie przylegaj do szklanych powierzchni, zaleca si stosowanie naczy ze szka silanizowanego lub polietylenu [7, 11]. ele krzemionkowe (Silica gels) el krzemionkowy (silica gel, silica) - jest amorficznym ciaem staym o ogólnym wzorze chemicznym SiO 2 H 2 O. Zakwaszajc roztwór krzemianu sodu otrzymuje si zol kwasu ortokrzemowego (SiO 2 2H 2 O), a nastpnie przeprowadza si proces dojrzewania, przemywanie oraz suszenie. W trakcie dojrzewania zolu zachodzi jego polikondensacja w mikroczstki, które nastpnie tworz konglomeraty wypenione kapilarami (porami) o rednich wymiarach liniowych w zakresie 3-30 nm. Powierzchnia waciwa elu krzemionkowego moe osiga nawet 600 m 2 /g. W zalenoci od techniki przygotowania mona otrzyma czstki o zrónicowanych wymiarach oraz wielkociach porów. Od techniki wytwarzania zale take waciwoci powierzchniowe materiau, co jest bardzo istotnie wpywa na charakterystyk noników chromatograficznych. Struktura ta wyrónia si wysok stabilnoci wynikajc z do mocnych wiza krzemu za porednictwem mostków tlenowych. Ponadto, na powierzchni mikroczstek, a w konsekwencji wewntrz porów oraz na powierzchni ziaren znajduj si grupy hydroksylowe, co powoduje, i el krzemionkowy wykazuje silne waciwoci hydrofilowe. Nieco wilgotny el krzemionkowy regeneruj oraz aktywuj w temperaturze C. Wynik procesu zaley od wybranej temperatury. Dla otrzymania standardowych waciwoci adsorpcyjnych po cakowitym wysuszeniu el czciowo dezaktywuje si poprzez dozowanie kontrolowanej iloci wody (20-30 ml na 100 m 2 ogólnej powierzchni). Tak otrzymany el zachowuje waciwoci hydrofilowe oraz due zdolnoci adsorpcyjne. W zalenoci od stosowanej techniki chromatograficznej ele krzemionkowe poddaje si rónym modyfikacjom chemicznym. Jednak w przypadku IAC wprowadza si gównie grupy hydroksylowe -OH oraz typu DIOL. Tak otrzymane noniki s nastpnie aktywowane grupami aldehydowymi (metoda Schiffa), imidazolowymi (metoda CDI), a take hydrazydowymi (metoda hydrazydowa) [11]. 5. Metody immobilizacji (Methods of immobilization) Ze wzgldu na rodzaj oddziaywa przeciwciao antygen metody immobilizacji dzieli si na fizyczne oraz chemiczne, a w zalenoci od orientacji immunoglobulin ukierunkowane i nieukierunkowane (losowe). Vol. 3, No 1/2011 Camera Separatoria

10 78 M. Jaszczot, G. Boczkaj, K. Grygoryshyn, M. Kamiski Fizyczne metody immobilizacji (Physical methods of immobilization) Metody fizyczne immobilizacji przeciwcia opieraj si na rónego typu niespecyficznych oddziaywaniach pomidzy przeciwciaem a nonikiem. Takie oddziaywania obejmuj zrónicowane wizania niekowalencyjne: jonowe, wodorowe, siy van der Waalsa oraz oddziaywania hydrofobowe, których liczba oraz zasig zaley od waciwoci chemicznych fazy staej oraz charakterystyki powierzchniowej przeciwciaa. Ten sposób immobilizacji nie zapewnia odpowiedniej orientacji fragmentów przeciwciaa wicych antygen wzgldem fazy ruchomej. Zatem w praktyce nie da si z góry okreli frakcji przeciwcia, która bdzie wykazywa funkcjonalno po tego typu immobilizacji. Dodatkowo, powanym ograniczeniem immobilizacji fizycznej jest fakt, e w trakcie procesu elucji zwizane z faz sta przeciwciaa mog ulega wymywaniu. Niemniej jednak, immobilizacja poprzez fizyczn adsorpcj jest nadal, cho rzadko, wykorzystywana w chromatografii immunopowinowactwa. Adsorpcja jest czsto spotykana w zastosowaniach, gdzie elucja zwizanych przeciwcia jest albo podana albo nie jest wykonywana [3]. Chemiczne metody immobilizacji (Chemical methods of immobilization) Wizanie kowalencyjne nieukierunkowane (Indirect covalent binding) W celu zwizania przeciwciaa do nonika staego uywane s róne odczynniki, reagujce z grupami funkcyjnymi zoa i przeciwcia tzw. aktywatory. Te reagenty zostay podzielone na kilka grup: aktywatory rozpuszczalne, rozpuszczalne bifunkcyjne czynniki sieciujce oraz aktywatory zwizane z faz sta. W tabeli 1 zostaa wymieniona cz z nich, która znalaza swoje zastosowanie w chromatografii immunopowinowactwa. Tabela 1. Aktywatory stosowane do immobilizacji [3] Table 1. Activators used for immobilization [3] Rodzaj odczynnika (Type of the reagent) Aktywatory rozpuszczalne Rozpuszczalne bifunkcyjne czynniki Aktywatory zwizane z faz sta Nazwa odczynnika (Reagent name) chlorowodorek N -(3- dimetyloaminopropylo) karbodiimidu chlorowodorek N-etylo-N -(dimetyloaminopropylo) karbodiimidu N-hydroksysukcynoimid sulfo-n-hydroksysukcynoimid bromocyjan dialdehyd glutarowy bezwodnik maleinowy zwizki oksiranu (pochodne epoksydowe) grupy estrowe n-hydroksysukcynoimidu bezwodnik maleinowy Camera Separatoria Vol. 3, No 1/2011

11 Immunochromatografia: przegld i charakterystyka immunosorbentów 79 W praktyce jednym z najczciej stosowanych aktywatorów rozpuszczalnych jest bromocyjan, który oddziauje z grupami funkcyjnymi zoa przygotowujc go do przyczenia przeciwciaa. Rys. 2. Schemat aktywacji zoa bromocyjanem [7] Fig. 2. Scheme of activation by bromo-cyanide [7] Na rys. 2 przedstawiono schemat aktywacji bromocyjanem sefarozy. Nie protonowane grupy aminowe przeciwciaa reaguj z zaktywowanym no- nikiem wytwarzajc N-podstawiony izomocznik. Pomimo swojej popularno- ci, metoda ta ma posiada pewne wady. Powstae w trakcie immobilizacji struktury nie s cakowicie stabilne. W wyniku reakcji w rodowisku obojtnym bd zasadowym powstaj grupy, które mog zosta sprotonowane i w konskwencji dziaa jako jonowymieniacze. Kolejne dodanie czsteczek zawierajcych grupy aminowe prowadzi do powstania N-monopodstawione i N,N-dipodstawione pochodne guanidyny. W poczeniu z hydrofobowymi acuchami alkiloamin wytwarzaj si adunki dodatnie, wykazujce waciwoci powierzchniowe czynne. To powoduje wzrost niespecyficznej sorpcji, co moe by rozpatrywane, jako odwrotna denaturacja biaek - jakimi s przeciwciaa [7]. W przeciwiestwie do tego reakcja grup aminowych ze zo- em zaktywowanym N-hydroksysukcynoimidem czy te 1,1 -karbonylodiimidazolem (CDI) umoliwia uzyskanie stabilnych N-alkilokarbaminianów (uretany) pozbawione dodatkowych naadowanych grup w szerokim zakresie ph. Rozpuszczalnie bifunkcyjne czynniki wice dziaaj, jako mostki pomidzy grupami funkcyjnymi. Cz z nich, do których naley na przykad dialdehyd glutarowy czy bezwodnik maleinowy, tworz mostki pomidzy identycznymi grupami funkcyjnymi, np. midzy dwoma grupami aminowymi. Z kolei heterogenne bifunkcyjne czynniki takie jak ester N-hydroksysukcynoimidolowy kwasu 4-maleimidomasowego wi grupy tiolowe nonika z aminowymi grupami przeciwciaa. Inna grup zwizków nalecych do tej rodziny s fotoaktywne agenty, takiej jak benzofenony czy diazyryny. Po zwizaniu z faz staa przeprowadza si fotoaktywacj umoliwiajc tworzenie wiza kowalencyjnych z przeciwciaem [2]. Pomimo tego, e opisane metody s bardzo czsto wykorzystywane do unieruchamiania, istnieje te kilka nieuniknionych problemów zwizanych z budow samych przeciwcia. Jak ju zostao wczeniej zaznaczone, chemiczne nieukierunkowane metody immobilizacji dla zwizania przeciwciaa wykorzystuj gównie aminowe reszty lizyny wystpujce w obrbie caej czsteczki (60-80 z 1350 reszt w czsteczce). Skutkiem tego jest wielokrotne wizanie oraz wielokierunkowa orientacja, co w konsekwencji powoduje spadek aktywnoci przeciwcia. Ponadto przeciwciaa zawieraj cztery ter- Vol. 3, No 1/2011 Camera Separatoria

12 80 M. Jaszczot, G. Boczkaj, K. Grygoryshyn, M. Kamiski minalne grupy aminowe, które z powodu niszego pk a s nawet bardziej reaktywne w porównaniu z -aminowymi grupami lizyn. Negatywny efekt polegajcy na przyczaniu poprzez te grupy, które znajduj si w miejscu wizania antygenu, bdzie o wiele wikszy nawet w porównaniu ze znacznym nadmiarem reszt lizynowych [12]. Podsumowujc, niespecyficzna natura tworzcych si wiza uniemoliwia przewidywanie orientacji immobilizowanych przeciwcia, ani te stopnia ich funkcjonalnoci. Potencjalnie moliwe sposoby orientacji zwizanych przeciwcia s przedstawione na rys. 3. Rys. 3. Orientacja losowo zwizanych przeciwcia [3] Fig. 3. Orientation of random bonded antibodies [3] Wizanie ukierunkowane (Direct binding) Metoda wizania ukierunkowanego ma na celu unieruchomi przeciwciao tak, aby jak najwiksza liczba regionów odpowiedzialnych za czenie si z antygenem zostaa wyeksponowana w kierunku fazy ruchomej [3]. Jedna z technik, naleca do tej grupy, opiera si na tworzeniu mostków biakowych pomidzy faz stacjonarn a przeciwciaem. Najczciej w tym celu wykorzystuje si dwa typy biaek: biako A (PrA) oraz G (PrG). Biako A wyizolowane z bakterii Staphylococcus aureus naley do bia- ek powierzchniowych i posiada wyjtkow zdolno do wizania immunoglobulin ssaków, szczególnie immunoglobulin G. To biako, zwizane ze zo- em typu Sepharose, jako pierwsze zostao wykorzystane do konstrukcji biospecyficznych kompleksów, majcych na celu ukierunkowan immobilizacj przeciwcia. Unieruchamianie poprzez mostek biakowy okazao si szczególnie przydatne w wysokosprawnych procesach rozdzielczych (HPIAC lub HPIC), pozwalajcych na efektywn jednoetapow izolacj odpowiednich antygenów nawet z tak zoonych próbek jak ekstrakty bony komórkowej (plasma membrane extracts) [13]. Uniwersalnym nonikiem w technice HPIAC jest szko porowate. Schemat przygotowania zoa jest przedstawiony na rys. 4. Camera Separatoria Vol. 3, No 1/2011

13 Immunochromatografia: przegld i charakterystyka immunosorbentów 81 Rys. 4. (A) Chemizm procesu wizania biaka A ze zoem szklanym modyfikowanym 1,1 -karbonylodiimidazolem. (B) Schemat wizania Immunoglobuliny G z unieruchomionym biakiem A Fig. 4. (A) Chemistry of binding protein A to glass sorbent modified with 1,1 -carbonyldiimidazole. (B) Scheme of binding immunoglobulin G to immobilized protein A Biako A posiadajce waciwo wizania fragmentów F c immunoglobulin jest zoone z piciu podjednostek, z których kada posiada wasny receptor dla F c. Jednak w trakcie immobilizacji trzy z nich s dezaktywowane, natomiast dwie pozostae stanowi punkt uchwytu dla przeciwcia, które nastpnie tworz wizania kowalencyjne z biakiem A potraktowanym uprzednio karbodiimidem. Takie z kolei przyczanie uatwia odpowiedni orientacj receptorów antygenowych przeciwciaa wzgldem fazy ruchomej. Na dodatek biako A stanowi ruchome rami dla unieruchomionych przeciwcia, zmniejszajc wpyw zawady sterycznej [13]. W celu zwikszenia specyficznoci wizania IgG przez biako A zosta- a skonstruowana technika wykorzystujca aktywne fragmenty PrA (FB). Uzyskuje si je poprzez trawienie trypsyn biaka A. Otrzymane fragmenty FB immobilizuje si nastpnie poprzez aldehyd glutarowy na zou Eupergit CB6200 zmodyfikowanym dihydrazydem kwasu adypinowego. Tak powstae Vol. 3, No 1/2011 Camera Separatoria

14 82 M. Jaszczot, G. Boczkaj, K. Grygoryshyn, M. Kamiski zoe wykazuje lepsz zdolno wizania przeciwciaa, ni zoe z nietrawionym biakiem A w takich samych warunkach. Do tworzenia zó z immobilizowanymi przeciwciaami s równie stosowane techniki IMAC (ang. Immobilized Metal Affinity Chromatography), czyli chromatografii metalopowinowactwa. Oryginalne podejcie zaproponowane przez Hale a polegao na przygotowaniu wypenienia zawierajcego, jako grupy aktywne reszty kwasu iminodioctowego, kompleksujce jony kobaltu, na którym zostay unieruchomione w sposób odwracalny przeciwciaa. Pierwszym etapem tego procesu bya chelatacja jonów kobaltu, którego ródem jest CoCl 2. Nastpnie do kolumny dozuje si bufor z przeciwciaami, które wi si ze zoem IDA-Co 2+ w sposób odwracalny. Po zwizaniu kobalt jest utleniany do Co 3+ rozcieczonym roztworem H 2 O 2 w PBS. W ten sposób tworzy si nieodwracalny kompleks z przeciwciaami. Ostatnim etapem jest przemywanie zoa roztworem EDTA i imidazolu w celu usunicia niezwizanych przeciwcia Zwizane immunoglobuliny nie mog by wymyte przez reagenty chelatujce, wysokie stenie soli, detergenty ani czynniki chaotropowe. Jedynie odczynniki o waciwociach redukcyjnych s zdolne do usuwania przeciwcia. Poniewa histydyny wice metale koncentruj si na C-kocu acucha cikiego, przeciwciaa cz si ze zoem w sposób ukierunkowany, a ich receptory rozpoznajce antygen s skierowane do fazy ruchomej. Wan zalet tego typu zó jest fakt, e umoliwiaj one immobilizacj przeciwcia rónych typów oraz podklas. Ilustruje to dowiadczenie przeprowadzone przez Hale a. Cztery podtypy przeciwcia (oczyszczone mysie IgG 1, mysie IgG 2a (z pynu puchlinowego), mysie IgG 3 (z pynu puchlinowego), oczyszczone ludzkie IgG 4 ) zostay unieruchomione wcze- niej opisan metod w identycznych warunkach (kolumna IDA 7,5 x 75 mm zrównowaona Na 2 HPO 4, NaCl). Przeciwciaa byy wymywane poprzez elucj gradientow imidazolem w steniu od 0 do 250 mm w cigu 20 min [8]. Wszystkie przeciwciaa w tym przypadku byy zwizane przy takiej samej wartoci ph 7,5 oraz zostay wymyte z kolumny przy niskim steniu imidazolu (50 mm). Na chromatogramie testowym, piki pochodzce od rónych przeciwcia wykazyway prawie ten sam czas retencji, co oznacza, e wizanie przeciwcia nie jest specyficzne wzgldem rónych typów oraz podklas [8]. Technika wykorzystujca jony metali przejciowych, w tym przypadku kobalt, jest prostym i szybkim sposobem umoliwiajcym immobilizacje rónorodnych przeciwcia. Czas przygotowania kolumny wynosi 2-3 godziny. Przeciwciaa poddaje si dziaaniu czynników utleniajcych w niskich steniach, co nie powoduje ich denaturacji, ani utraty aktywnoci. Tworzenie nieodwracalnych wiza z jonami Co 3+ nie wymaga przeprowadzenia procesu blokowania grup funkcyjnych, jak ma to miejsce w innych technikach. Kolejna zalet tych zó jest odwracalno immobilizacji. Po traktowaniu kolumny czynnikami redukujcymi oraz chelatujcymi jony metali, zoe moe by nastpnie wykorzystane do konstrukcji innych kolumn w chromatografii powinowactwa [8]. Camera Separatoria Vol. 3, No 1/2011

15 Immunochromatografia: przegld i charakterystyka immunosorbentów 83 Najnowsze publikacje z dziedziny immobilizacji donosz o opracowaniu nowej metody za udziaem metali. Wykorzystujc akrylamid (AM) jako monomer, dimetakrylan glikolu etylenowego (EGDMA) jako czynnik sieciujcy, 2,2-azoizonitryl kwasu masowego (AIBN) (inicjator) oraz metod syntetyczn polegajc na skonstruowaniu polimeru z wbudowanymi jonami miedzi (II) tzw. bulk polimerization. Kolumna jest nastpnie przygotowywana przez unieruchomienie przeciwcia poliklonalnych specyficznych do klenbuterolu - leku z grupy leków -adrenergicznych, odpowiedzialnego za rozszerzanie oskrzela. Testujc kolumn okazao si, e nawet po 30 powtórzeniach procesu rozdzielania, nie stwierdzono znaczcych zmian w specyficznym rozpoznawaniu antygenów. Najbardziej efektywnymi metodami immobilizacji s takie, które wi przeciwciao poprzez ich unikalne fragmenty [3]. Jedno z takich podej polega na wykorzystaniu wglowodanowych reszt regionu F c przeciwcia. Reszty cukrowe znajduj si w domenie przeciwciaa przestrzennie oddzielonej od miejsc wizania antygenu. W zwizku z powyszym metoda ta pozwala na otrzymanie immunosorbentu o wysokiej specyficznej aktywnoci. Immobilizacj przeprowadza si poprzez utlenienie nadjodanem acuchów wglowodanowych znajdujcych si na F c przeciwciaa do grup aldehydowych, które nastpnie mog kondensowa z nonikiem zawierajcym grup aminow tworzc zasad Schiffa. Zasada Schiffa jest nastpnie stabilizowana borowodorkiem sodu. Metod alternatywn jest wykorzystanie zaktywowanych hydrazydem noników, takich jak: agaroza, celuloza, el krzemionkowy oraz kopolimery akrylowe, które po reakcji z aldehydami tworz hydrazony. Biorc pod uwag fakt, e przeciwciaa posiadaj grupy cukrowe tylko w obrbie domeny CH 2 acuchów cikich, fragmenty F ab rozpoznajce i wice antygen bd cakowicie wolne i mog oddziaywa z faz ruchom. Róne badania nad warunkami utleniania przeciwcia poliklonalnych udowodniy, e immobilizacja t technik zaley od stenia nadjodanu, odczynu ph, czasu oraz temperatury. Efektywn kombinacj tych czynników mona przewidzie matematycznie [3, 12]. 6. Podsumowanie Dziki wysokiej specyficznoci, przeciwciaa immobilizowane na pod- oach staych s dzisiaj powszechnie stosowane do oczyszczania rónorodnych klas zwizków chemicznych. Przed rozpoczciem procesu unieruchamiania naley dokona wyboru odpowiednich przeciwcia. Przeciwciaa poliklonalne s tasze, a ich produkcja atwiejsza w porównaniu z monoklonalnymi. Natomiast wad jest niepewne ródo pozyskiwania (zwierzta hodowlane) oraz problem ze standaryzacj. Zalet przeciwcia monoklonalnych jest natomiast moliwo dugotrwaego przechowywania oraz jednorodno waciwoci (specyficznoci i powinowactwa). Obecnie wci stosowane s obie grupy. Vol. 3, No 1/2011 Camera Separatoria

16 84 M. Jaszczot, G. Boczkaj, K. Grygoryshyn, M. Kamiski Wybierajc odpowiedni nonik naley bra pod uwag cel rozdzielania, a w konsekwencji koszty. Noniki do HPLC s drosze, cechuj si jednak lepsz wytrzymaoci mechaniczn, kinetyk. Najistotniejsze znaczenie w caym procesie immobilizacji ma metoda aktywacji zoa oraz koncepcja unieruchamiania. Zoa mona przygotowa stosujc cay szereg zwizków chemicznych, nalecych do aktywatorów rozpuszczalnych, oraz bifunkcyjnych czynników sieciujcych. Czsto wykorzystuje si take komercyjne, uprzednio zaktywowane zoa. Wikszo technik immobilizacji opiera si na nieukierunkowanym (losowym) wizaniu przeciwcia, wykorzystujc przy tym wolne aminowe reszty lizyn rozproszone w obrbie caego przeciwciaa. Jest to czsto przyczyn spadku zdolnoci wicych przeciwcia i nisk efektywnoci immobilizacji niekiedy jedynie na poziomie 1-30% teoretycznej wydajnoci. Std obecne trendy zmierzaj do wykorzystywania jedynie metody ukierunkowanej immobilizacji. Unieruchamianie poprze biako A lub G daje odpowiedni efekt orientacji oraz aktywnoci przeciwcia, ale wad jest wysoki koszt oraz fakt, e nie wszystkie immunoglobuliny wykazuj zdolno do czenia si z tymi ligandami. Jednym z ciekawych kierunków rozwoju metod unieruchamiania jest wykorzystanie jonów metali. Techniki te s powszechnie stosowane do immobilizacji biaek i by moe wkrótce bd te wykorzystywane w przypadku przeciwcia. Przygotowujc immunosorbent uwzgldni naley waciwoci zoa, warunki procesu aktywacji oraz unieruchamiania. Odpowiedni dobór przeciwcia oraz ukierunkowana immobilizacja chemiczna stanowi o sukcesie uzyskania unikatowej fazy stacjonarnej pozwalajcej na selektywne rozdzielenie wielu skomplikowanych mieszanin. Conclusions Because of high specificity immobilized antibodies are widely applied in purification of various chemical compounds. First step in immobilization process is selection of the most suitable antibodies. In comparison to polyclonal antibodies are less expensive and their production process is less complicated than monoclonal antibodies. However an uncertain source (breeding animals) and problem with standardization are main disadvantages of monoclonal antibodies. The advantages of that kind of antibodies are possibility of long-term storage and homogeneity properties: specificity and affinity. Currently both kinds of antibodies are used. A method of bed activation and method of immobilization are the most important factors in separation process by immunochromatography. To preparation of beds many chemical compound are applicated, e.g. soluble activators and bifunctional cross linkers. Most of the immobilization techniques are based on indirect binding to antibodies, using free lysine residues distributed through antibody but low efficiency implicates that monoclonal antibodies are more frequently used. Immobilization of antibodies by protein A and protein G is well oriented, but method os high cost and unspecificity to some ligands. Camera Separatoria Vol. 3, No 1/2011

17 Immunochromatografia: przegld i charakterystyka immunosorbentów 85 Suitable selection of antibodies and direct chemical immobilization are main cause of success of application of antibodies. Literatura (Literature) 1. S. Zhang, J. Wang, D. Li, J. Huang, H. Yang, A. Deng, A novel antibody immobilization and its application in immunoaffinity chromatography, Talanta, 82(2010) M. Nisnevitch, M.A. Firer, The solid phase in affinity chromatography: strategies for antibody attachment, J. Biochem. Biophys. Methods, 49(2001) E. Heftmann, Journal of Chromatography Library, Chromatography: Fundamentals, and applications of chcromatography and related differential migration methods, Elsevier Amsterdam, S.D. Hage, Survey of recent advances in analytical applications of immunoaffinity chromatography, J. Chromatogr. B, 715(1998)3. 5. J.M. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, Wydawnictwo Naukowe PWN SA, Biochemia, 2007, P.A. Millner, High resolution chromatography. A practical approach, Oxford University Press 2002, J. Turkova, Journal of Chromatography Library, Bioaffinity chromatography, Elsevier Amsterdam, 1978, J. Turkova, Oriented immobilization of biologically active proteins as a tool for revealing protein interactions and function, J. Chromatogr. B, 722(1999) Katalog Sigma-Aldrich, Katalog BioRad, O. Mikes, Mir, Laboratory handbook of chromatographic and allied methods, 1982, L. Osterman, Chromatografia biaek i kwasów nukleinowych, Chromatography of proteins and nucleic acids, Nauka 1985, R.L. Wimalasena. G.S. Wilson, Factors affecting the specific activity of immobilized antibodies and their biologically active fragments, J. Chromatog. B, 572(1991) J.E. Hale, Irreversible, Oriented immobilization of antibodies to cobaltiminodiacetate resin for use as immunoaffinity, Media Anal. Biochem., 231(1995)46. Vol. 3, No 1/2011 Camera Separatoria