Anty-Borrelia EUROLINE-WB (IgG) Instrukcja do testu

Transkrypt

1 Anty-Borrelia EUROLINE-WB (IgG) Instrukcja do testu NR KATALOGOWY PRZECIWCIAŁA PRZECIW KLASA IG SUBSTRAT FORMAT DY G DY G DY G Borrelia (pełen antygen) plus rekombinant VlsE IgG Opłaszczone antygenem paski membrany 16 x 01 (16) 30 x 01 (30) 240 x 01 (240) Wskazania: Test EUROLINE-WB służy do jakościowego oznaczania in-vitro ludzkich przeciwciał klasy IgG przeciwko antygenom Borrelia w surowicy lub osoczu w diagnostyce boreliozy i powiązanych chorób, takich jak: rumień wędrujący, lymphadenosis cutis benigna, zanikowe zapalenie skóry, zapalenie stawów, zapalenie mięśnia sercowego, limfocytarne zapalenie opon i korzeni nerwowych, neuroborelioza. Zastosowanie: Dzięki połączeniu pełnego ekstraktu antygenowego (B. afzelii) i rekominowanego VlsE, test Anty-Borrelia EUROLINE-WB umożliwia identyfikację reakcji nietypowych oraz oznaczanie swoistych przeciwciał przeciw Borrelia z wysoką czułością. Zasada testu: Zestaw zawiera paski testowe z rozdzielonym elektroforetycznie ekstraktem antygenów Borrelia afzelii. Każdy z pasków membrany zawiera chip membrany z rekombinanowanym antygenem VlsE (variable major protein-like sequence, expressed). Po wstępnym blokowaniu paski membrany inkubuje w pierwszym etapie się z rozcieńczoną próbką pacjenta. W pozytywnych przypadkach specyficzne przeciwciała klasy IgG (również IgA i IgM) wiążą się z odpowiednimi antygenami. Podczas drugiego etapu inkubacji reagują z nimi sprzężone z enzymem przeciwciała skierowane przeciwko ludzkim immunoglobulinom klasy IgG (koniugat enzymatyczny). Enzym katalizuje następnie reakcję barwną z roztworem substratu. Zawartość zestawu testowego: Składnik Format Format Format Symbol 1. Paski testowe pojedyczne paski membrany z rozdzielonym elektroforetycznie antygenami Borrelia plus rekombinant 16 x 1 30 x x 1.STRIPS. VlsE 2. Szablon do oceny wyników pasek membrany zainkubowany z pozytywną surowicą kontrolną 3. Koniugat enzymatyczny znakowana fosfatazą alkaliczną surowica antyludzka IgG (koza), koncentrat 10x 4. Bufor uniwersalny koncentrat 10x 5. Roztwór substratu chlorek nitrobluetetrazolium/5-bromo-4- chloro-3-indolylofosforan (NBT/BCIP), gotowy do użycia 1 wzorzec 1 wzorzec 1 wzorzec dla każdej serii 1 x 3 ml 2 x 3 ml 16 x 3 ml.conjugate 10x. 1 x 50 ml 1 x 100 ml 8 x 100 ml.buffer 10x. 1 x 30 ml 1 x 50 ml 8 x 50 ml.substrate. 6. Rynienki do inkubacji 2 x TRAY. 7. Folia adhezyjna arkuszy Instrukcja wykonania 1 broszura 1 broszura 1 broszura ---.LOT. Numer seryjny Temperatura przechowywania.ivd. Wyrób medyczny do diagnostyki in vitro Data ważności Przechowywanie i trwałość: Test należy przechowywać w temperaturze pomiędzy +2 C i +8 C, nie zamrażać! Nieotwarty zestaw testowy jest trwały do daty ważności podanej na opakowaniu. Usuwanie odpadów: Nierozcieńczone surowice pacjentów oraz zainkubowane paski reakcyjne powinny być traktowane jak odpady zakaźne. Pozostałe odczynniki nie wymagają oddzielnego składowania, jeśli nie jest to uregulowane oddzielnymi przepisami. ---

2 Następujące komponenty nie wchodzą w skład testu, można je zamówić w pod odpowiednim numerem katalogowym. Do przeprowadzenia testów wymagane są rynienki inkubacyjne: ZD Płytka inkubacyjna z 30 rynienkami (czarna) ZD Płytka inkubacyjna z 44 rynienkami (czarna, dla systemu EUROBlotOne i EUROBlotCamera). Do stworzenia protokołu roboczego i do oceny zainkubowanych pasków za pomocą EUROLineScan wymagany jest zielony papier oraz folia adhezyjna: ZD Zielony papier (1 kartka) ZD Folia adhezyjna dla około 16 pasków testowych ZD Folia adhezyjna dla około 30 pasków testowych Jeśli ocena w indywidualnych przypadkach przeprowadzana jest w sposób wizualny, należy posłużyć się szablonem do oceny wzrokowej dostępnym pod numerem katalogowym: ZD Szablon do oceny wizualnej Anty-Treponema pallidum EUROLINE-WB. Przygotowanie i trwałość reagentów Uwaga: Opakowanie zawierające paski testowe jest oznakowane dodatkowym numerem serii, poza numerem seryjnym zestawu. Numer ten odnosi się do serii pasków i jest wydrukowany również na odpowiadającym mu szablonie do oceny. Te dwa numery muszą być zgodne, aby zapewnić prawidłową ocenę testu. Wszystkie reagenty muszą osiągnąć temperaturą pokojową (+18 C do +25 C) około 30 min. przed użyciem. Nieotwarte reagenty są trwałe do daty ważności podanej na opakowaniu, o ile są przechowywane w temperaturze +2 C do +8 C. Po otwarciu reagenty są trwałe 12 miesięcy lub do daty ważności podanej na opakowaniu, pod warunkiem, że w instrukcji nie podano inaczej. Otwarte reagenty należy przechowywać w temperaturze od +2 C do +8 C i chronić przed zanieczyszczeniem. - Paski testowe: Paski są gotowe do użycia. Opakowanie z paskami otworzyć dopiero po osiągnięciu temperatury otoczenia, aby zapobiec zawilgotnieniu. Po wyjęciu potrzebnej ilości pasków opakowanie należy szczelnie zamknąć zaciskając szew zapinający i przechowywać w temperaturze od +2 C do +8 C. Aby zapewnić prawidłową ocenę testu należy sprawdzić, czy numery seryjne na opakowaniu, na paskach membrany i na szablonie do oceny są zgodne. - Koniugat enzymatyczny: Koniugat enzymatyczny jest 10-krotnie skoncentrowany. Do sporządzenia roztworu użytkowego koniugatu należy odmierzyć czystą pipetą potrzebną ilość koncentratu i rozcieńczyć go w stosunku 1:10 gotowym do użycia, rozcieńczonym buforem uniwersalnym. Przykład: Dla jednego paska membrany należy rozcieńczyć 0,15 ml koncentratu koniugatu antyludzkiego-igg w 1,35 ml gotowego do użycia, rozcieńczonego buforu uniwersalnego. Rozcieńczony roztwór koniugatu powinien być zużyty w ciągu jednego dnia. - Bufor uniwersalny: Bufor uniwersalny jest 10-krotnie stężony. Potrzebną ilość buforu należy pobrać z butelki czystą pipetą i rozcieńczyć wodą dejonizowaną lub destylowaną w stosunku 1:10. Przykład: w celu zainkubowania 1 paska należy pobrać 1,5 ml skoncentrowanego buforu i rozcieńczyć w 13,5 ml wody dejonizowanej lub destylowanej. Rozcieńczony roztwór buforu powinien być zużyty w ciągu jednego dnia. - Roztwór substratu: Gotowy do użycia. Butelkę zakręcić zaraz po odpipetowaniu, ponieważ roztwór jest wrażliwy na światło. Ostrzeżenie: Kontrole ludzkiego pochodzenia dały wyniki negatywne pod względem: HBsAg, anty-hcv, anty-hiv-1 i anty-hiv-2. Jednakże wszystkie składniki testu należy traktować jak materiał zakaźny i zachowywać ostrożność. Niektóre z odczynników zawierają azydek sodu w stężeniu niepodlegającym zgłoszeniu. Należy unikać kontaktu ze skórą. 2

3 Rozcieńczanie i trwałość próbek pacjentów Materiał: Ludzka surowica lub osocze pobrane na EDTA, heparynę lub cytrynian. Trwałość: Próbki pacjentów powinny być przechowywane w temperaturze +2 C do +8 C do 14 dni. Rozcieńczone próbki powinny być zainkubowane w ciągu jednego dnia roboczego. Rozcieńczane próbek: Przeznaczone do badania próbki pacjentów należy rozcieńczać w stosunku 1:51 w buforze uniwersalnym. Przykład: dodać 30 µl surowicy do 1,5 ml buforu do rozcieńczania próbek i dobrze wymieszać, np. przez worteksowanie (wymieszanie jedynie końcówką pipety jest niewystarczające). Inkubacja Blokowanie: Inkubacja próbek: (1. krok) Płukanie: Inkubacja koniugatu: (2. krok) Płukanie: Inkubacja substratu: (3. krok) Zatrzymanie reakcji: Napełnić potrzebną ilość rynienek inkubacyjnych rozcieńczonym buforem uniwersalnym, każdą po 1,5 ml. Potrzebną ilość pasków membrany wyjąć z opakowania pęsetą i umieścić pojedynczo w pustych rynienkach inkubacyjnych. Numer paska powinien być widoczny (skierowany do góry). Inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej (+18 C do +25 C) na wytrząsarce o ruchu wahadłowym. Następnie odessać całkowicie roztwór z rynienek. Do każdej rynienki zawierającej pasek membrany odpipetować po 1,5 ml rozcieńczonej próbki krwi. Inkubować w temperaturze pokojowej (+18 C do +25 C) 30 minut na wytrząsarce o ruchu wahadłowym. Całkowicie odessać roztwór z każdej rynienki. Płukać 3 x 5 minut buforem uniwersalnym używając każdorazowo po 1,5 ml. Proces płukania przeprowadzić na wytrząsarce o ruchu wahadłowym. Do każdej rynienki odpipetować 1,5 ml rozcieńczonego koniugatu enzymatycznego (przeciwciała skierowane przeciwko ludzkim IgG sprzężone z fosfatazą zasadową). Inkubować w temperaturze pokojowej (+18 C do +25 C) 30 minut na wytrząsarce o ruchu wahadłowym. Całkowicie odessać roztwór z każdej rynienki. Płukać jak opisano powyżej. Do każdej rynienki odpipetować 1,5 ml substratu. Inkubować 10 minut w temperaturze pokojowej (+18 C do +25 C) na wytrząsarce o ruchu wahadłowym. Całkowicie odessać roztwór substratu z każdej rynienki. Wszystkie paski membrany płukać 3 x 1 minutę wodą destylowaną lub dejonizowaną. W celu przeprowadzenia automatycznej inkubacji przy użyciu EUROBlotMaster, należy wybrać program Euro02 Inf WB30. W celu przeprowadzenia automatycznej inkubacji przy użyciu EUROBlotOne, należy wybrać program Euro 01/02. 3

4 Anty-Borrelia EUROLINE-WB (IgG) Schemat inkubacji Blokowanie Paski membrany ułożyć w rynienkach i dodać 1,5 ml rozcieńczonego buforu uniwersalnego 15 min Kołyska laboratoryjna 1 krok: Inkubacja próbek Roztwór odessać; odpipetować 1,5 ml rozcieńczonej (1:51) próbki surowicy do rynienki z paskiem membrany 30 min Kołyska laboratoryjna Płukanie Roztwór odessać; płukać 3 x 5 min. stosując każdorazowo 1,5 ml rozcieńczonego buforu uniwersalnego 2 krok: Inkubacja koniugatu Roztwór odessać; odpipetować 1,5 ml roztworu koniugatu (1:10) do rynienki z paskiem membrany 30 min Kołyska laboratoryjna Płukanie Roztwór odessać; płukać 3 x 5 min. stosując każdorazowo 1,5 ml rozcieńczonego buforu uniwersalnego 3 krok: Inkubacja substratu Roztwór odessać; odpipetować 1,5 ml roztworu substratu do rynienki z paskiem membrany 10 min Kołyska laboratoryjna Zatrzymanie reakcji Roztwór odessać; przemywać 3 x 1 min. wodą dejonizowaną lub destylowaną Ocena Elektroniczna (EUROLineScan) 4

5 Anty-Borrelia EUROLINE-WB (IgG) Ocena i interpretacja wyników Wykonanie: Zalecamy elektroniczną ocenę zainkubowanych pasków testowych z wykorzystaniem programu EUROLineScan. Po zatrzymaniu reakcji za pomocą wody dejonizowanej bądź destylowanej, wilgotne paski membrany po inkubacji należy ułożyć za pomocą pęsety na folii adhezyjnej znajdującej się na protokole do oceny w kolorze zielonym. Pozycję pasków można skorygować, dopóki są one jeszcze wilgotne. Od momentu umieszczenia ostatniego paska na protokole do oceny, paski należy docisnąć papierem absorbcyjnym i pozostawić do wyschnięcia. Suche paski przykleją się do folii adhezyjnej. Suche paski należy zeskanować używając skanera płaskiego ( ) i oceniać za pomocą EUROLineScan. Alternatywnie obrazowanie i ocena możliwe są bezpośrednio ze studzienek rekacyjnych (EUROBlotCamera i EUROBlotOne). W celu uzyskania bliższych informacji na temat programu EUROLineScan proszę odwołać się do instrukcji obsługi EUROLineScan ( ). Kod do wprowadzenia testu do programu EUROLineScan: Borr_EL-WB_IgG. Jeżeli ocena wykonywana jest w sposób wizualny, szablon do oceny należy tak przyłożyć do zainkubowanego paska, aby czarne linie znajdujące się powyżej numerów wywołanego paska i szablonu znalazły się na tej samej wysokości. Numery seryjne na szablonie do oceny i wywołanym pasku membrany muszą być zgodne. Wyraźnie rozpoznawalne pasma na wywołanym pasku membrany, które odpowiadają oznaczeniom na szablonie należy wpisać do protokołu ocen. Antygeny: Źródłem antygenów w teście Anty-Borrelia EUROLINE-WB jest szczególnie odpowiedni szczep Borrelia afzelii. Białka z ekstraktu Borrelia zostały rozdzielone elektroforetycznie na żelu poliakrylamidowym według ciężarów molekularnych i przeniesione na membranę nitrocelulozową. Na każdym pasku umieszczony jest dodatkowy chip membranowy z rekombinantem VlsE (Variable major protein-like sequence, expressed) pochodzący z Borrelia burgdorferi sensu stricto. VlsE jest lipoproteiną, do ekspresji której dochodzi tylko in vivo. VlsE posiada wysoko immunogenne regiony konserwatywne. Przeciwciała klasy IgG przeciwko temu białku są wysoce czułym i swoistym markerem zakażeń Borrelia. Z każdej membrany nitrocelulozowej wybrano paski kontrolne i zainkubowano z dodatnią surowicą referencyjną. Jeden z wywołanych pasków znajduje się w zestawie testowym na szablonie do oceny, drugi pozostaje w w celu dokumentacji. Istotne diagnostycznie antygeny zostały scharakteryzowane za pomocą referencyjnych surowic monoklonalnych pochodzących z niemieckiego laboratorium referencyjnego (National Reference Laboratory for Borreliae). Swoistość antygenów na pasku testowym: Pasmo Antygen Swoistość VlsE Variable major protein-like sequence, Swoisty expressed 83 kda Membrane-vesical protein, p83 Swoisty 41 kda Flagellina, p41 Nieswoisty, reakcje krzyżowe z innymi Spirochaetaceae i bakteriami z wicią 39 kda BmpA, p39 Swoisty 31 kda OspA, p31 Białko powierzchniowe A, swoisty 30 kda p30 Swoisty 25 kda OspC, p25 Białko powierzchniowe C, swoisty, marker świeżej infekcji 21 kda p21 Swoisty 19 kda p19 Swoisty 17 kda p17 Swoisty W dolnej części paska testowego znajduje się chip membrany będący kontrolą koniugatu (IgA, IgG oraz IgM). Poniżej kontroli koniugatu znajduje się chip membrany będący pasmem kontronym (Kontrola). Uwaga: Potwierdzeniem prawidłowego wykonania oznaczenia przeciwciał klasy IgG przeciwko antygenom opisanym powyżej jest pozytywna reakcja pasma kontrolnego i pozytywna reakcja pasma IgG. 5

6 Jeśli któreś z tych pasm kontrolnych wykazuje słabą reakcję lub jej brak, wynik należy uznać za nieważny. Przeciwciała klasy IgG przeciwko Borrelia burgdorferi sensu lato Zastosowanie wysoko swoistego i czułego rekombinantu VlsE pozawala na szybką cenę testu Anty-Borrelia EUROLINE-WB. Szybka ocena IgG: Pasmo antygenowe VlsE poz. Przeciwciała IgG pozytywne Przeciwciała IgG przeciwko VlsE mogą być negatywne we wczesnych stadiach zakażenia Borrelia i czasami w stadiach późnych. W tych przypadkach ocena testu powinna być przeprowadzona zgodnie z poniższym schematem: Ocena IgG: Swoiste pasma antygenowe z pełnego ekstraktu: p83, p39, p31, p30,ospc (p25), p21, p19 oraz p17 WYNIK 2 lub więcej pasm 1 pasmo Brak pasma pozytywnych pozytywne Pasmo pozytywne pozytywny pozytywny pozytywny VlsE Pasmo słabo wybarwione pozytywny pozytywny negatywny Pasmo negatywne pozytywny negatywny negatywny Przeciwciała klasy IgM przeciwko Borrelia burgdorferi sensu lato Przeciwciała klasy IgM są wytwarzane we wczesnej fazie zakażenia Borrelia i typowo skierowane przeciwko OspC (p25). Przeciwciała IgM przeciwko innym swoistym gatunkowo antygenom niekoniecznie są wskaźnikiem świeżej infekcji. Szybka ocena IgM: Pasmo antygenowe OspC poz. Przeciwciała IgM pozytywne Jeśli pasmo OspC nie wykazuje wyraźnego pozytywnego sygnału przy podejrzeniu boreliozy, ocena testu powinna być przeprowadzona zgodnie z poniższym schematem: Ocena IgM: WYNIK Swoiste pasma antygenowe z pełnego ekstraktu: p83, p39, p31, p30, p21, p19 oraz p17 1 pasmo pozytywne Brak pasma Pasmo pozytywne pozytywny pozytywny OspC Pasmo słabo wybarwione pozytywny graniczny Pasmo negatywne pozytywny negatywny Nietypowy układ pasm w świeżym zakażeniu Borrelia Przeciwciała klasy IgM przeciwko swoistym antygenom Borrelia, innym niż OspC, nie są uważane za definitywny wykładnik świeżej infekcji. W diagnostyce serologicznej zakażeń Borrelia ocena przeciwciał klasy IgM często daje niejasne wyniki. Czasem IgM wykrywane są w surowicy po latach od przebycia infekcji lub po zastosowaniu leczenia antybiotykami. Dlatego wykrycie przeciwciał IgM nie zawsze wskazuje na świeżą infekcję. 6

7 Negatywny wynik badania IgM nie wyklucza świeżej infekcji. W przypadku reinfekcji nie są wytwarzane przeciwciała IgM a jedynie przeciwciała klasy IgG. W późnym stadium boreliozy pozytywny wynik IgM jest efektem przetrwania przeciwciał i nie wnosi żadnych dodatkowych informacji. Przyczyna takich fałszywie pozytywnych wyników IgM często pozostaje nieznana. Są one obserwowane w np. w mononukleozie, zakażeniach wirusami Herpes i chorobach autoagresyjnych. W diagnostyce świeżego zakażenia Borrelia pozytywny wynik przeciwciał klasy IgM powinien być potwierdzony pozytywnym wynikiem IgG w kolejnej próbce pobranej po 3 do 6 tygodniach. W diagnostyce wyniki testów serologicznych zawsze powinny być brane pod uwagę wraz z obrazem klinicznym pacjenta. Charakterystyka testu Zakres pomiaru: EUROLINE-WB jest testem jakościowym. Bez zakresu pomiaru. Odtwarzalność i powtarzalność: W celu kontroli odtwarzalności i powtarzalności wykonano pomiary scharakteryzowanych próbek w ciągu kilku dni. W każdym przypadku intensywność pasm pozostała w określonym zakresie. Test EUROLINE-WB wykazuje bardzo dobrą odtwarzalność i powtarzalność. Interferencje: Hemolityczne, lipemiczne oraz surowice z hiperbilirubinemią do stężenia hemoglobiny 5 mg/ml, trójglicerydów 20 mg/ml, bilirubiny 0,4 mg/ml nie wpływały w żaden sposób na wyniki analityczne testu EUROLINE. Czułość: Przebadano próbki 115 pacjentów scharakteryzowanych klinicznie i 200 zdrowych dawców krwi za pomocą Anty-Borrelia EUROLINE-WB. Czułość Surowice scharakteryzowane klinicznie n IgG IgM IgG/IgM Rumień wędrujący 47 51% 57% 83% Neurobolrelioza 27 78% 33% 81% Zapalenie stawów 33 94% 6% 94% Acrodermatitis 8 100% 13% 100% Częstość występowania przeciwciał przeciwko Borrelia w późnym stadium choroby koreluje z danymi literaturowymi [11]. Za pomocą opisywanego testu wykrywa się znacząco więcej przeciwciał klasy IgG u pacjentów we wczesnym stadium choroby (stadium I i II) w porównaniu do testu Westernblot z pełnym ekstraktem antygenów ale bez VlsE. Wzrost czułości przy niezmienionej swoistości został osiągnięty dzięki zastosowaniu VlsE, dodatkowego antygenu w teście Anty-Borrelia EUROLINE-WB. Częstość występowania Próbki surowic n IgG IgM Zdrowi dawcy krwi * % 2,5% * Uniwersytet Medyczny w Lubece Częstość występowania przeciwciał przeciw Borrelia u zdrowych dawców krwi (pochodzenie: Medical University of Lübeck, Niemcy, grupa wiekowa: 20 do 70 lat) odpowiada danym literaturowym [14]. 7

8 Reakcje krzyżowe: Wysoka swoistość analiztyczna zestawu testowego jest zagwarantowana dzięki jakości zastosowanych zubstratów antygenów (antygenów i ich źródeł). Reaktywność krzyżowa antygenów użytych w teście Anty-Borrelia EUROLINE-WB została określona poprzez porównanie wyników otrzymanych z panelu próbek pobranych od pacjentów z chorobami reumatycznymi. Choroba n Anty-Borrelia pozytywne Reumatoidalne zapalenie stawów (RF seropoz.) 17 0 (0%) 0 (0%) Reumatoidalne zapalenie stawów (RF seroneg.) 23 1 (4%) 0 (0%) Finger polyarthrosis 18 1 (6%) 0 (0%) Fibromialgia 14 0 (0%) 0 (0%) Kolagenoza 25 4 (16%) 0 (0%) Spondyloartropatie/łuszczycowe zapalenie stawów (seroneg.) IgG IgM 22 1 (5%) 0 (0%) Całkowita (6%) 0 (0%) Znaczenie kliniczne Na przykładzie historii choroby z Lyme, zakaźnego schorzenia wywoływanego przez Borrelia burgdorferi, przenoszonego na ludzi przez kleszcze, można zaobserwować jak szybko dokonuje się postęp w medycynie. Opis kliniczny rozpoczęto formułować w Europie na przełomie XIX/XX wieku Pick opisał jednostkę chorobową nazywaną później zanikowym zapaleniem skóry obwodowych części kończyn. Pięćdziesiąt lat później Hauser zauważył, że choroba jest przenoszona przez kleszcze. Afzelius i Lipschutz, niezależnie od siebie, opisali rumień wędrujący (erythema migrans) i jego związek z ukłuciem przez kleszcza. Towarzyszące objawy neurologiczne zostały również powiązane ze zmianami skórnymi. Te wczesne opisy dermatologiczne znalazły się w centrum zainteresowania w 1975 roku, kiedy to wybuchła epidemia zapalenia stawów u dzieci w Lyme, Connecticut, USA. Wiele dotkniętych nią dzieci miało rumień wędrujący. Opierając się na tych obserwacjach oraz analizie epidemiologicznej, Steele i współpracownicy zdefiniowali chorobę z Lyme jako zaburzenie reumatoidalne powszechnie związane z rumieniem wędrującym, a czasem również z zajęciem wielu narządów. W 1982 roku Burgdorfer zasugerował, że Spirochaeta są przenoszone przy ukłuciu przez kleszcza. Zidentyfikowany później czynnik wywołujący boreliozę został nazwany Borrelia burgdorferi. Borrelia burgdorferi jest gatunkiem bakterii zaliczanym do rodziny Spirochaetaceae. Rodzina ta obejmuje pięć rodzajów: Borrelia, Spirochaeata, Cristispira, Treponema i Leptospira. Z pośród 30 gatunków kleszczy, których żywicielem jest człowiek, Ixodes ricinus jest najczęściej spotykany w Europie. Jest on wektorem Borrelia burgdorferi wywołującej chorobę z Lyme (boreliozę), anaplazmozę i wirusowe zapalenie mózgu przenoszone przez kleszcze. Ixodes ricinus przechodzi trzy stadia rozwojowe: larwa, nimfa i postać dorosła (samice i samce). Zagęszczenie tego gatunku kleszcza może być bardzo wysokie. W niektórych miejscach osiąga ponad 300 kleszczy/100 m 2. Borelioza jest naczęściej występującą chorobą przenoszoną przez kleszcze na północnej półkuli. W Europie, zwłaszcza w Środkowej Europie i Skandynawii, stwierdza się do 155 przypadków na osób spowodowane przez gatunki B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii i B. garini (w rzadkich przypadkach także B. spielmanii i B. bavariensis). Wskaźniki występowania przeciwciał przeciwko Borrelia burgdorferi w populacji Niemiec i innych krajów Środkowej Europy są na poziomie 8%, a w rejonach endemicznych nawet od 18% do 52%. We Wschodniej Azji, np. w rejonach endemicznych w Chinach, średnio wynoszą 26%. Osoby pracujące w lasach mają przeciwciała anty-borrelia w 40% przypadków, a myśliwi w ponad 50% przypadków. Zakażenie krętkami Borrelia burgdorferi może wywoływać objawy dermatologiczne, neurologiczne, okulistyczne, reumatologiczne i internistyczne. Obraz kliniczny boreliozy dzieli się na trzy stadia: 8

9 Stadium I: Typową pierwotną manifestacją zakażenia Borrelia burgdorferi jest erythema migrans (80%). Zaczerwienienie skóry, które pojawia się kilka dni do kilku tygodni po ukąszeniu przez kleszcza i rozszerza się pierścieniowato wokół miejsca ukąszenia. Rumieniowi towarzyszą grypopodobne objawy ogólne takie jak gorączka, dreszcze, bóle głowy, wymioty. W niektórych przypadkach dochodzi do limfadenopatii (Lymphadenosis cutis benigna). W obrazie klinicznym boreliozy przebiegającej bez rumienia (20%) jako wiodące występują objawy neurologiczne, bóle stawowo-mięśniowe, grypopodobne, sercowo-naczyniowe, zapalenie wątroby, węzłów chłonnych oraz mieszane. Stadium I może ulec spontanicznemu wyleczeniu bądź przejść w uogólnioną boreliozę. Faza przejściowa jest zwykle bezobjawowa. Serologicznie u 50% do 90% pacjentów w stadium I stwierdza się przeciwciała klasy IgM przeciwko Borrelia burgdorferi. Ludzie wytwarzają wysoce swoiste przeciwciała przeciw OspC (ang. outer surface protein C) krótko po zakażeniu. Główny antygen VlsE, który ulega ekspresji jedynie in vivo, jest naczulszym antygenem do wykrywania przeciwciał klasy IgG, natomiast OspC do wykrywania przeciwciał klasy IgM. Stadium II: Kilka tygodni lub miesięcy po ukąszeniu przez kleszcza mogą pojawić się różnorodne objawy. Na pierwszym planie znajdują się objawy neurologiczne: zapalenie opon mózgowych, zapalenie mózgu, asymetryczne zapalenie wielonerwowe, porażenia nerwów czaszkowych, limfocytarne zapalenie opon i korzeni nerwowych Bannwartha. Jednym z najczęściej występujących neurologicznych symptomów boreliozy u dzieci jest porażenie nerwów obwodowych twarzy. Zwykle niedowład nerwów twarzowych pojawia się po jednej stronie, a po kilku tygodniach po drugiej stronie twarzy. Często występuje również zapalenie stawów, szczególnie kolanowych, a także nie zlokalizowane bóle kości, mięśni i stawów. Rzadsze są manifestacje kardiologiczne takie jak: zapalenie mięśnia sercowego lub zapalenie osierdzia. Przeciwciała przeciw Borrelia burgdorferi wykrywa się u 50% do 90% pacjentów w II stadiu. We wczesnej fazie tego stadium przeciwciała klasy IgM przeważnie są jeszcze pozytywne, w późnej fazie występują często już tylko przeciwciała IgG. Przeciwciała klasy IgM mogą jednak także przetrwać dłużej. Oznaczając dodatkowo przeciwciała przeciwko VlsE procent trafień wzrasta o 20% do 30%. VlsE prezentuje najwyższą czułość ze wszytkich testowanych w kierunku IgG antygenów. Stadium III: Typowymi objawami zakażenia Borrelia burgdorferi w stadium III są przewlekle nawracające nadżerkowe zapalenia stawów, zanikowe zapalenie skóry obwodowych części kończyn, postępujące zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego o przebiegu podobnym do stwardnienia rozsianego. Bez leczenia stadium III może rozwijać się przez lata i dziesiątki lat po ukąszeniu. W tym stadium przeciwciała klasy IgG są wyraźnie podwyższone u 90% do100% pacjentów, podczas gdy przeciwciała klasy IgM wykrywane są bardzo rzadko. W diagnostyce neuroboreliozy decydujące znaczenie ma oznaczenie przeciwciał w płynie mózgowrdzeniowym. Indeks przeciwciał (AI, Antibody Index) różnicuje frakcje przeciwciał pochodzących z krwi od frakcji specyficznych, patologicznych przeciwciał w płynie mózgowo-rdzeniowym, a tym samym dostarcza informacji o zaburzeniach funkcjonowania bariery krew/mózg. Przeciwciała przeciw Borrelia burgdorferi można wykrywać za pomocą różnych technik: ELISA, immunofluorescencja pośrednia, aglutynacja bierna i immunoblot. Do wstępnej diagnostyki próbek używa się zazwyczaj testu ELISA lub immunofluorescencji pośredniej. Według wytycznych obowiązujących w USA i w Niemczech, serologiczna diagnostyka boreliozy powinna być dwustopniowa: w pierwszym etapie należy przeprowadzić test ELISA lub immunofluorescencji pośredniej IIFT, wyniki pozytywne należy potwierdzić następnie testem immunoblot. W przypadku świeżych infekcji zaleca się równoległe przeprowadzenie testów ELISA/IIFT oraz immunoblot, ponieważ część słabych reakcji może być wykryta wczesniej za pomocą Westernblot niż testów skrynigowych. VlsE, najczulszy antygen do detekcji przeciwciał klasy IgG oraz OspC, do detekcji IgM, powinny być włączone do badania. Dodatkowe oznaczenie przeciwciał przeciwko VlsE zwiększa procent trafień o 20% w porównaniu do Westernblot z kompletnego ekstraktu. Ze wszystkich badanych rekombinantów, VlsE posiada najwyższą czułość pozwalającą na detekcję infekcji wywołanych przez Borrelia. 9

10 Piśmiennictwo 1. Burgdorfer W, Barbour, Hayes SF, Benach JL, Grunwaldt E, Davis JP. Lyme disease a tickborne Spirochetosis? Science 216 (1982) Christova I. Enzyme-linked immunosorbent assay, immunofluorescent assay, and recombinant immunoblotting in the serodiagnosis of early Lyme borreliosis. Int J Immuno-pathol Pharmacol 16 (2003) Komorowski L, Janssen A, Stöcker W, Probst C. Dimerisation of recombinant OspC leads to an antigen with enhanced potential for active vaccination. 12. International Conference on Lyme Borreliosis and other Tick-Borne Diseases, Ljubljana, Slowenien (2010). 4.. Komorowski L, Probst C, Janssen A, Stöcker W. Polypeptide und Verfahren zur spezifischen Detektion von Antikörpern bei Patienten mit einer Borrelieninfektion. Europäische Patentanmeldung EP (2008). 5.. Meyer W, Janssen A, Scheper T, Schlumberger W, Stöcker W. Lyme borreliosis: Prevalence of antibodies against non-proteinic (lipid) antigens. Int J Med Microbiol 298S2 (Suppl. 45) (2008) Probst C, Ott A, Scheper T, Meyer W, Stöcker W, Komorowski L. N-Terminal disulfide-bridging of Borrelia outer surface protein C increases its diagnostic and vaccine potentials. Ticks and Tick-Borne Diseases 3 (2012) Meyer W, Scheper T, Schlumberger W, Stöcker W. Antibodies Against the Newly Identified Major Antigen VlsE: A milestone in the Serological Diagnosis of Lyme Borreliosis. Poster zum EUREGIO. Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, Aachen (2003). 8.. Steinhagen K, Schlumberger W, Stöcker W. Nachweis einer spezifischen intrathekalen Antikörpersynthese mit modernen ELISA-Testsystemen: Hohe Trefferquote bei Multipler Sklerose und Neuroborreliose. J Lab Med 25 (2001) Meyer W, Janssen A, Kühn B, Scheper T, Suer W, Komorowski L, Probst C, Schlumberger W, Stöcker W. EUROLINE Borrelia RN-AT: Marriage of authentic recombinant and native borrelia antigens in a line immunoassay format. International Journal of Medical Microbiology 298S2 (Suppl. 45): (2008). 10. Goettner G, Schulte-Spechtel U, Hillermann R, Liegl G, Wilske B, Fingerle V. Improvement of Lyme borreliosis serodiagnosis by a newly developed recombinant immunoglobulin G (IgG) and IgM line immunoblot assay and addition of VlsE and DbpA homologues. J Clin Microbiol 43 (2005) Hauser U, Lehnert G, Lobentanzer R, Wilske B. Interpretation Criteria for Standardized WesternBlots for Three European Species of Borrelia burgdorferi Sensu Lato. J Clin Microbiol 35 (1997) Johnson R, Schmid GP, Hyde FW, Steigerwalt, Brenner DJ. Borrelia burgdorferi sp. Nov.: Etiologic agent of lyme disease. Int J Syst Bacteriol 34 (1984) Oehme R, Hartelt K, Backe H, Brockmann S, Kimmig P. Foci of tick-borne diseases in southwest Germany. Int J Med Microbiol 291 (2002) Robert-Koch-Institut. Surveillance der Lyme-Borreliose am Beispiel des Bundeslandes Brandenburg. Epidemiologisches Bulletin 14 (1998) Schulte-Spechtel U, Lehnert G, Liegl G, Fingerle V, Heimerl C, Johnson BJ, Wilske B. Significant improvement of the recombinant Borrelia-specific immunoglobulin G immunoblot test by addition of VlsE and a DbpA homologue derived from Borrelia garinii for diagnosis of early neuroborreliosis. J Clin Microbiol 41 (2003) Tilton RC, Ryan RW. The laboratory diagnosis of Lyme disease. J Clin Immunoassay 16 (1993)

11 17. Wilske B, Fingerle V, Schulte-Spechtel U. Microbiological and serological diagnosis of Lyme borreliosis. FEMS Immunol Med Microbiol 49 (2007) Wilske B. Epidemiology and diagnosis of Lyme borreliosis. Ann Med 37 (2005) Wilske B, Zöller L, Brade V, Eiffert H, Göbel UB, Stanek G, Pfister HW. MiQ 12/2000 Qualitätsstandards in der mikrobiologisch-infektiologischen Diagnostik: Lyme-Borreliose. Urban & Fischer Verlag München Jena (2000). 20. Zhang JR, Hardham JM, Barbour, Norris SJ. Antigenic Variation in Lyme Disease Borreliae by Promiscuous Recombination of VMP-like Sequence Cassettes. Cell 89 (1997)

12 WYTWÓRCA: Seekamp 31, D Luebeck Tel: , fax: Dystrybutor w Polsce: Polska Sp. z o.o. Ul. Widna 2a, Wrocław Tel: , fax: DY_2131-1G_A_PL_C12.doc Wersja: