Recenzent naukowy: prof. dr hab. in. Korneliusz Miksch prof. dr hab. in. Józef Raczkowski

Transkrypt

1

2 Redaguje Komitet Redakcyjny: Redaktor naczelny: prof. dr hab. in. Józef RACZKOWSKI Redaktorzy działowi: doc. dr in. Andrzej FROSKI prof. dr hab. in. Andrzej KOSTECKI doc. dr Michał KRASODOMSKI Recenzent naukowy: prof. dr hab. in. Korneliusz Miksch prof. dr hab. in. Józef Raczkowski PL ISSN Copyright 2009 INiG Kraków, ul. Lubicz 25A, Poland Wszelkie prawa zastrzeone. adna cz niniejszej publikacji nie moe by, bez uprzedniej pisemnej zgody wydawcy, gromadzona w systemach zbierania informacji, transmitowana lub reprodukowana, włczajc w to fotokopie, fotografie, zapis magnetyczny lub inny. Prenumerat i wysyłk prac naukowo-badawczych oraz materiałów informacyjnych prowadzi redakcja Nafta-Gaz INiG w Krakowie, ul. Lubicz 25A, tel. +48(12) , nafta-gaz@inig.pl

3 W pracy przedstawiono etapowe oczyszczanie odpadów wiertniczych zanieczyszczonych substancjami ropopochodnymi, zdeponowanymi w starych dołach urobkowych. Odpad wiertniczy na podstawie bada fizykochemicznych, analiz chromatograficznych zanieczyszcze ropopochodnych i analiz mineralogicznych oraz przegldu archiwalnych danych z wierce, został zakwalifikowany do grupy odpadów o kodzie ex * gleba i ziemia zanieczyszczona substancjami ropopochodnymi. Umoliwiło to uzyskanie decyzji zezwalajcej na odzysk i unieszkodliwianie zanieczyszcze ropopochodnych metod in-situ na danym dole urobkowym. Odpady wiertnicze charakteryzowały si wysok maksymaln zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych w zakresie od do mg/kg s.m. Z tego wzgldu wprowadzono etapow realizacj kolejnych procesów umoliwiajcych stopniowe obnianie poziomu zanieczyszcze. Pozwala to na sukcesywne wprowadzanie kolejnych metod coraz głbszego oczyszczania skaonego terenu. Przeprowadzenie wstpnej remediacji polegajcej na drenau melioracyjno-odciekowym pozwoliło na obnienie zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych o 59,3 72,8%, czyli do poziomu poniej mg/kg s.m. umoliwiajcego realizowanie dalszych etapów oczyszczania odpadów zgromadzonych w dołach urobkowych. Omówiono wyniki prac optymalizacyjnych prowadzonych w skali półtechnicznej w warunkach ex-situ metod pryzmowania, które obejmowały: modyfikacj struktury odpadu w celu zwikszenia biodostpnoci mikroorganizmów i substancji odywczych do wglowodorów ropopochodnych, bioremediacj podstawow stymulowan poprzez biowentylacj i wzbogacanie rodowiska odpadu w składniki biogenne wspomagajce rozwój mikroflory autochtonicznej oraz bioaugmentacj polegajc na inokulacji wstpnie oczyszczonego odpadu biopreparatami sporzdzonymi na bazie bakterii autochtonicznych, które w kocowej fazie procesu inokulacji wzbogacano o wyizolowane gatunki grzybów. W badaniach mikrobiologicznych majcych na celu opracowanie profesjonalnego biopreparatu na bazie mikroorganizmów autochtonicznych rozszerzono zakres klasycznych bada mikrobiologicznych o analiz sekwencjonowania DNA kodujcego 16S rrna dla bakterii i 18S rrna dla grzybów, co pozwoliło na zidentyfikowanie gatunków bakterii i grzybów wchodzcych w skład biopreparatów. Wprowadzenie w kocowej fazie inokulacji biopreparatu wzbogaconego o wytypowane gatunki grzybów pozwoliło na zwikszenie efektywnoci oddziaływania biopreparatu w stosunku do wglowodorów o dłuszych łacuchach wglowych oraz do ladowych zawartoci BTEX i WWA. Cały cykl procesu oczyszczania odpadu wiertniczego z zanieczyszcze ropopochodnych kontrolowano za pomoc rozbudowanego monitoringu obejmujcego badania fizyko-chemiczne odpadu, badania mikrobiologiczne (oznaczenie ogólnej liczby bakterii i grzybów, liczby bakterii degradujcych wglowodory ropopochodne, aktywnoci dehydrogenazowej i celulazowej) oraz badania toksykologiczne z wykorzystaniem testów nowej generacji (testy Microtox, Ostracodtoxkit F TM, Phytotoxkit F TM, mikropłytkowy test Ames a). Równie istotnym elementem pozwalajcym na szersze spojrzenie na przebieg procesu biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych i okrelenie efektywnoci kolejnych etapów oczyszczania była analiza chromatograficzna pozwalajca na ilociowe i jakociowe oznaczenie poszczególnych wglowodorów wchodzcych w skład zanieczyszcze ropopochodnych. Umoliwiała ona zaobserwowanie zmian zawartoci poszczególnych n-alkanów, BTEX i WWA w trakcie realizowanych etapów oczyszczania. Ponadto wprowadzane wskaniki stopnia biodegradacji n-alkanów w postaci stosunków zawartoci n-c 17 /Pr i n-c 18 /F dobrze obrazuj efektywno realizowanych kolejnych etapów opracowanej technologii oczyszczania odpadów z zanieczyszcze ropopochodnych. W celu opracowania modelu matematycznego biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych w odpadach wiertniczych zastosowano normalizacj stenia analitów za pomoc wprowadzonego biomakera C 30-17α(H),21β(H)-hopanu, który umoliwił pełn ocen stopnia biodegradacji wglowodorów ropopochodnych. Obliczone stałe biodegradacji pierwszego rzdu (k) pozwoliły na przeledzenie i porównanie kinetyki przebiegu biodegradacji poszczególnych grup zanieczyszcze ropopochodnych (TPH, Σ n-c 8 n-c 22, Σ n-c 23 n-c 36, BTEX) w kolejnych etapach oczyszczania odpadów. Ponadto na podstawie przedstawionych stałych bio- 3

4 degradacji mona porówna efektywno działania biopreparatów na bazie bakterii autochtonicznych oraz wzbogaconych o wytypowane gatunki grzybów. Przeniesienie wyników bada laboratoryjnych (ex-situ) na warunki przemysłowe stwarza due trudno- ci, jednake były one podstaw opracowania wytycznych prowadzenia procesu oczyszczania metod in-situ. Ponadto pozwoliły na ustalenie proporcji zmieszania odpadu z czyst ziemi w celu modyfikacji jego struktury, dobór optymalnych dawek substancji biogennych oraz zapoznanie si z efektywnoci opracowanych biopreparatów. Ze wzgldu na sezonowo i zmienno panujcych warunków atmosferycznych, opracowana koncepcja oczyszczania odpadów wiertniczych w warunkach przemysłowych (metoda in-situ) wymaga weryfikacji polegajcej na wydłueniu czasu trwania poszczególnych etapów oczyszczania i zwikszeniu liczby serii inokulacji biopreparatami na bazie bakterii autochtonicznych i grzybów (3 serie inokulacji w cigu 2 lat prowadzenia procesu bioaugmentacji) oraz zastosowaniu dodatkowo dozowania wgłbnego biopreparatu z równoczesnym napowietrzaniem głbszych warstw odpadów zdeponowanych w dołach urobkowych. Przedstawiony tok postpowania w prowadzonym procesie oczyszczania silnie skaonych substancjami ropopochodnymi odpadów ze starych dołów urobkowych, umoliwił po okresie 3 lat uzyskanie obnienia zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych do poziomu nieprzekraczajcego dopuszczalne wartoci okrelonych przez obowizujce standardy jakoci gleby i ziemi. Pozwoliło to na zakoczenie rekultywacji terenów dołów urobkowych i przekazanie ich do zagospodarowania jako uytek leny. W trakcie prowadzonego procesu rekultywacji spełniono obowizujce wymagania administracyjnoprawne w zakresie polskiego ustawodawstwa, co zaowocowało uzyskaniem decyzji o zakoczeniu rekultywacji. Przedstawiona technologia naley do nowych, pewnych i bezpiecznych dla rodowiska oraz uzasadnionych ekonomicznie do zastosowania w warunkach przemysłowych, metod likwidacji zanieczyszcze ropopochodnych na terenach starych dołów urobkowych. Słowa kluczowe: odpady wiertnicze, dół urobkowy, zanieczyszczenia ropopochodne, bioremediacja, mikroorganizmy autochtoniczne, inokulacja, chromatografia GC, ekotoksykologia BIOREMEDIATION OF DRILL WASTES CONTAMINATED WITH PETROLEUM SUBSTANCES FROM WEATHERED WASTE PITS Summary The aim of this work is to discuss the phase technology of drill wastes purification. The wastes, contaminated with petroleum substances and stored in old waste pits, were the subject of physico-chemical research, chromatographical analyses of petroleum pollutants and mineralogical tests. Then, the archival data was revised. As a result, the wastes were qualified as wastes group ex * soil and ground contaminated with petroleum substances. Decision to obtain and neutralise petroleum pollutants (with an in-situ method applied in a waste pit) was the next step. The drill wastes included high content of petroleum hydrocarbons in the range from to mg/kg dry mass. Due to this fact, the phase technology of purification was used. This technology enables effective introduction of consecutive methods of more and more advanced cleaning of the contaminated area. Initial remediation, consisting of drainage, has led to a decrease in pollutants content by 59,3 72,8%, to a level below mg/kg dry mass. Owing to this process, the following steps of waste pits purification were possible. Results of optimisation research, done in a semi-industrial scale with an ex-situ prism method, included: modification in waste structure in order to increase microorganisms and nutrients bioaccess to petroleum hydrocarbons; basic bioremediation stimulated by bioaeration, and waste environment enrichment with biogenic substances aiding the growth of autochthonous microflora and bioaugmentation consisting of inoculation of precleaned waste with biopreparations created on the basis of autochthonous bacteria, enriched with isolated fungi during the last phase of inoculation. 4

5 The aim of microbiological research was to create a professional biopreparation on the basis of autochthonous microorganisms. In addition, microbiological tests included sequential analysis of coding DNA 16S rrna for bacteria and 18S rrna for fungi, which enabled identification of bacteria and fungi species include in biopreparations. During the last phase of inoculation, a biopreparation enriched with selected fungi was applied and the effectiveness of the biopreparation increased, concerning long-chain hydrocarbons and BTEX and WWA trace amounts. The entire process of drill wastes purification was controlled with the use of monitoring, which consisted of: physico-chemical research on waste, microbiological tests (determination of bacteria and fungi total amount, bacteria amount degrading petroleum hydrocarbons, dehydrogenaze and cellulase activeness), and toxicological research with the use of new generation tests (Microtox, Ostracodtoxkit F TM, Phytotoxkit TM and microplate Ames tests). One of the most crucial elements, enabling an insight into biodegradation process and determination of purification effectiveness, was a chromatographical analysis. This method leads to quantitative and qualitative determination of hydrocarbons included in petroleum pollutants. Besides, it enables observation of content alternation of n-alkanes, BTEX and WWA during purification phases. Furthermore, introduced indicators of n-alkanes biodegradation degree (as n-c 17 /Pr and n-c 18 /F concentration rate) present the effectiveness of the applied wastes purification technology. In order to create a mathematical model of petroleum pollutants biodegradation in drill wastes, normalization of analyte concentration was applied with the use of a C 30-17α(H),21β(H)-hopane biomarker, which enabled total estimation of petroleum hydrocarbons biodegradation degree. Calculated first-order biodegradation constants (k) led to observation and comparison in kinetics of biodegradation of consecutive groups of petroleum pollutants (TPH, Σ n-c 8 n-c 22, Σ n-c 23 n-c 36, BTEX) in following stages of wastes purification. In addition, owing to the biodegradation constants, comparison in effectiveness of biopreparations, based on autochthonous microorganisms and enriched with fungi, has been possible. Transfer of laboratory research (ex-situ) to industrial conditions causes difficulties. However, they became the main reason to create instructions needed to an in-situ method application. Moreover, proportions of mixing waste with pure soil (leading to modification in waste structure), optimisation of doses of biogenic substances and estimation of biopreparations effectiveness were possible. Due to alternation in weather conditions, the conception of drill wastes purification in industrial conditions (in-situ method) needs verification. Time of purification can be lengthened and the number of inoculation series (with biopreparations based on autochthonous microorganisms and fungi) can be increased to 3 series during 2 years of bioaugmentation. Additional deep-seated dosage of a biopreparation and deeper layers aeration of stored wastes in pits should be taken into account. The above presented purification technology, applied to strongly polluted wastes from weathered pits, enabled a decrease in petroleum pollutants content to a satisfactory level in 3 years. Wastes were on the level of accepted soil and ground standards. Recultivation of waste pits area was completed and the area could be reforested. During recultivation process, all required law and administrative standards concerning Polish law were taken into consideration, that resulted in decision of recultivation completion.the technology can be characterised as new, effective and environmentally friendly. What is more, it is a highly economical method of petroleum hydrocarbons neutralisation in the area of weathered waste pits in industrial conditions. Key words: drill waste, waste pit, petroleum contaminants, bioremediation, autochtonous mikroorganism, inocculation, gas chromatography, ekotoksykology 5

6 1. Wprowadzenie Tezy, cel i zakres pracy Zarys historyczny prowadzonych wierce w aspekcie szkodliwego wpływu na rodowisko Przegld metod likwidacji starych dołów urobkowych Współczesna gospodarka odpadami wiertniczymi Charakterystyka starych dołów urobkowych na kopalni Grabownica Aspekty prawne rekultywacji terenów starych dołów urobkowych skaonych wglowodorami ropopochodnymi Biodegradacja wglowodorów ropopochodnych Charakterystyka zanieczyszcze ropopochodnych Moliwoci stosowania mikroorganizmów w procesach biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych Szlaki metaboliczne rozkładu wglowodorów ropopochodnych Czynniki decydujce o szybkoci biodegradacji substancji ropopochodnych Przegld technik bioremediacyjnych stosowanych do oczyszczania gruntów z zanieczyszcze ropopochodnych Metodyka badawcza Metodyka bada chromatograficznych Badania chromatograficzne Chromatograficzna metodyka oznaczania w glebie/odpadach zanieczyszcze ropopochodnych Chromatograficzna metodyka oznaczania w glebie/odpadzie wglowodorów monoaromatycznych (BTEX) Chromatograficzna metodyka oznaczania w glebie/odpadzie wielopiercieniowych wglowodorów aromatycznych Metodyka chromatograficznego oznaczania zanieczyszcze ropopochodnych w odciekach (ciekach) Chromatograficzna metodyka oznaczania wglowodorów monoaromatycznych (BTEX) w ciekach Chromatograficzna metodyka oznaczania w odciekach (ciekach) wglowodorów aromatycznych Badania mineralogiczne Badania mikrobiologiczne Oznaczanie liczebnoci mikroorganizmów Izolacja i selekcja bakterii i grzybów zdolnych do rozkładu zwizków ropopochodnych Identyfikacja bakterii i grzybów tradycyjnymi technikami mikrobiologicznymi Identyfikacja bakterii i grzybów metodami molekularnymi Sposób przygotowania biopreparatu na bazie bakterii autochtonicznych i grzybów Badania mikroorganizmów patogennych w biopreparatach Badania enzymatyczne Badania respirometryczne Badania ekotoksykologiczne Badania fizyko-chemiczne gleby i odcieków Zakres i metodyka prowadzonych dowiadcze i prac bioremediacyjnych na terenach wytypowanych dołów urobkowych Metodyka prowadzenia dowiadcze w skali półtechnicznej (metoda ex-situ) Sposób prowadzenia bioremediacji zanieczyszcze ropopochodnych w warunkach terenowych metod in-situ Charakterystyka odpadów wiertniczych zanieczyszczonych wglowodorami ropopochodnymi na przykładzie dołów urobkowych Graby-67 i Graby Rozkład zanieczyszcze ropopochodnych na wytypowanych dołach urobkowych Charakterystyka fizyko-chemiczna odpadów z dołów urobkowych Graby-67 i Graby Badania mineralogiczne 140 7

7 6.4. Charakterystyka wybranych parametrów mikrobiologicznych odpadów z dołów urobkowych Graby-67 i Graby Podsumowanie Charakterystyka budowy geologicznej i warunków hydrogeologicznych w miejscu zlokalizowania dołów urobkowych Graby-67 i Graby Omówienie morfologii terenu oraz sieci hydrograficznej w rejonie projektowanej inwestycji Omówienie budowy geologicznej Warunki hydrogeologiczne Charakterystyka parametrów hydrogeologicznych na podstawie bada przeprowadzonych w otworach badawczych Wyznaczenie tła geochemicznego i hydrochemicznego rodowiska gruntowo-wodnego w rejonach dołów urobkowych Graby-67 i Graby Podsumowanie Ocena stopnia obnienia zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych podczas wstpnej remediacji terenów dołów urobkowych Graby-67 i Graby Wstpna remediacja zanieczyszcze ropopochodnych na dole urobkowym Graby Remediacja wstpna zanieczyszcze ropopochodnych na dole urobkowym Graby Unieszkodliwianie zanieczyszcze ropopochodnych w odciekach po zabiegu wstpnej rekultywacji Badania laboratoryjne biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych (metod ex-situ) odpadów wiertniczych z dołów urobkowych Graby-67 i Graby Charakterystyka materiału badawczego Badanie modyfikacji struktury gleby i ziemi z dołów urobkowych Graby-67 i Graby Badania doboru substancji biogennych Badania mikrobiologiczne Izolacja szczepów Ocena zdolnoci szczepów do biodegradacji wglowodorów modelowych i selekcja szczepów Ocena przynalenoci taksonomicznej Skład i badania optymalizacyjne biopreparatu Charakterystyka przebiegu kolejnych etapów biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych w odpadach z dołów urobkowych Graby-67 i Graby Skuteczno rozkładu zanieczyszcze ropopochodnych w odpadach z dołów urobkowych Graby-67 i Graby-12 po kolejnych etapach oczyszczania na podstawie analiz chromatograficznych Opracowanie modelu biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych w odpadach z wytypowanych do bada starych dołów urobkowych Omówienie wyników bada laboratoryjnych (metoda ex-situ) oczyszczania odpadów z terenów starych dołów urobkowych Pierwszorzdowy model biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych w odpadach z terenów wytypowanych dołów urobkowych Analiza toksykologiczna oczyszczanych odpadów wiertniczych z dołów urobkowych w warunkach laboratoryjnych Toksyczno na poziomie producentów Toksyczno na poziomie konsumentów Toksyczno na poziomie reducentów Ocena własnoci mutagennych i rakotwórczych gleb testem Ames a Charakterystyka odcieków z pryzmy Koncepcja technologii etapowego oczyszczania odpadów wiertniczych z zanieczyszcze ropopochodnych Weryfikacja opracowanej technologii oczyszczania terenów dołów urobkowych z zanieczyszcze ropopochodnych w warunkach przemysłowych metod in-situ Analiza efektywnoci poszczególnych etapów oczyszczania terenu dołu urobkowego Graby Ocena toksykologiczna odpadu z dołu urobkowego Graby Badania toksycznoci odpadu z dołu urobkowego Graby-12 z wykorzystaniem testu Ostracodtoxkit FTM 259 8

8 Badania toksycznoci odpadu z dołu urobkowego Graby-12 z wykorzystaniem testu Microtox SPT Badania fitotoksycznoci odpadu z dołu urobkowego Graby Ocena genotoksycznoci odpadu z dołu urobkowego Graby-12 z wykorzystaniem testu Ames a Analiza efektywnoci kolejnych etapów oczyszczania terenu dołu urobkowego Graby Ocena toksykologiczna odpadu z dołu urobkowego Graby Badania toksycznoci odpadu z dołu urobkowego Graby-67 z wykorzystaniem testu Ostracodtoxkit FTM Badania toksycznoci odpadu z dołu urobkowego Graby-67 z wykorzystaniem testu Microtox SPT Badania fitotoksycznoci odpadu z dołu urobkowego Graby Ocena genotoksycznoci odpadu z dołu urobkowego Graby-67 z wykorzystaniem testu Ames a Dyskusja wyników Podsumowanie bada i wnioski 305 Literatura 312 Wykaz stosowanych skrótów i oznacze 326 Spis tabel 328 Spis rysunków 333 Spis fotografii 343 9

9 1. Introduction Arguments, aims, and subjects of a study History of drilling pits and their harmful influence on environment Methods of old weathered pits neutralisation Contemporary management of drilling waste Characteristics of weathered pits in the Grabownica oil plant Recultivation of weathered pits areas contaminated with petroleum hydrocarbons law aspects Petroleum hydrocarbons biodegradation Characteristics of petroleum hydrocarbons Use of microorganisms in petroleum pollutants biodegradation Metabolic traces of petroleum hydrocarbon decomposition Parameters determining the rate of petroleum hydrocarbons biodegradation Bioremediation techniques applied for soil purification from petroleum pollutants Research methodology Methodology of chromatographic research Chromatographic analyses Chromatographic method of petroleum pollutants determination in soil/waste Chromatographic method of monoaromatic hydrocarbons (BTEX) determination in soil/waste Chromatographic method of policyclic aromatic hydrocarbons (PAH) determination in soil/waste Chromatographic method of petroleum pollutants determination in waste water (effluent) Chromatographic method of monoaromatic hydrocarbons (BTEX) determination in waste water (effluent) Chromatographic method of policyclic aromatic hydrocarbons (PAH) determination in waste water (effluent) Mineralogical research Microbiological research Quantity determination of microorganisms Isolation and selection of bacteria and fungi able to petroleum compounds decomposition Identification of bacteria and fungi with the use of traditional microbiological techniques Identification of bacteria and fungi with the use of molecular methods Creation of a biopreparation based on autochthonous bacteria and fungi Research on pathogenic organisms in biopreparations Enzymatic research Respirometric research Ecotoxicological research Physico-chemical research on soil and effluents Scope and methodology of experiments and bioremediation works led in selected waste pits Methodology of experiments in a semi-industrial scale (ex-situ method) Petroleum pollutants bioremediation in industrial conditions (in-situ method) Characteristics of drilling wastes contaminated with petroleum hydrocarbons on the example of Graby-67 and Graby-12 waste pits Distribution of petroleum hydrocarbons in selected waste pits Physico-chemical characteristics of wastes from Graby-67 and Graby-12 waste pits Mineralogical research Characteristics of microbiological parameters of wastes from Graby-67 and Graby-12 waste pits Summary

10 7. Characteristics of geological structure and hydrogeological conditions in Graby-67 and Graby-12 waste pits location Morphology and hydrographical net of an expected project area Geological structure Hydrogeological conditions Characteristics of hydrogeological parametres on the basis of research led in test bore-holes Determination of geochemical and hydrochemical background of soil-water environment in Graby-67 and Graby-12 waste pits Summary Estimation of decrease in petroleum hydrocarbons content degree during initial remediation of Graby-67 and Graby-12 waste pits Initial remediation of petroleum hydrocarbons in Graby-67 waste pit Initial remediation of petroleum hydrocarbons in Graby-12 waste pit Neutralisation of petroleum hydrocarbons from waste water after initial remediation Laboratory research on drilling wastes from Graby-67 and Graby-12 waste pits petroleum hydrocarbons biodegradation (ex-situ method) Characteristics of a research material Research on modification of soil and ground structure from Graby-67 and Graby-12 waste pits Research on selection of biogenic substances Microbiological research Strain isolation Estimation of strains ability to model hydrocarbons biodegradation and selection of strains Estimation of taxonomic belonging Content and optimisation research on a biopreparation Characteristics of consecutive stages of petroleum hydrocarbon biodegradation in wastes from Graby-67 and Graby-12 waste pits Effectiveness estimation of petroleum pollutants degradation in wastes from Graby-67 and Graby-12 waste pits after consecutive stages of purification on the basis of chromatographic analyses Creation of a model of petroleum hydrocarbons biodegradation in wastes from selected weathered waste pits Results of laboratory research (ex-situ method) of wastes from the area of weathered pits First-order model of petroleum hydrocarbons biodegradation Toxicological analysis of drilling wastes from waste pits during purification in laboratory conditions Toxicity on a producers level Toxicity on a consumers level Toxicity on a reducents level Soil mutagenes and cancer properties estimation with the Ames test Characteristics of effluent from a prism Technology of phase purification of drilling wastes from petroleum hydrocarbons Verification of phase purification technology applied in the areas of waste pits in industrial conditions with an in-situ method Analyses of effectiveness of consecutive purification stages of Graby-12 waste pit area Toxicological estimation of the waste from Graby-12 waste pit Research on soil and ground toxicity from Graby-12 waste pit with the use of Ostracodtoxkit F Test Research on soil and ground toxicity from Graby-12 waste pit with the use of Microtox SPT Test Research on soil and ground phytotoxicity from Graby-12 waste pit Genotoxicity estimation of soil and ground from Graby-12 waste pit with the use of Ames Test Effectiveness analyses of consecutive purification phases in the area of Graby-67 waste pit Ecotoxicological estimation of the waste from Graby-67 waste pit

11 Research on soil and ground toxicity from Graby-67 waste pit with the use of Ostracodtoxkit F Test Research on soil and ground toxicity from Graby-67 waste pit with the use of Microtox SPT Test Research on soil and ground phytotoxicity from Graby-67 waste pit Genotoxicity estimation of soil and ground from Graby-67 waste pit with the use of Ames Test Discussion Conclusions 304 Bibliography 311 Abbreviations and notations 325 Table list 327 Figure list 332 Picture list

12 Działalno człowieka od wieków powoduje zmiany w rodowisku, zmniejsza jego zasoby, modyfikuje naturalne cechy i powoduje wprowadzenie do rodowiska obcych, niewystpujcych naturalnie substancji. Zmiany te, pocztkowo niewielkie, w miar rozwoju techniki i przemysłu coraz bardziej widoczne i dotkliwie, wywołały w latach siedemdziesitych ubiegłego wieku niepokój wród przedstawicieli nauki. W roku 1989 w raporcie opracowanym przez Komisj rodowiska i Rozwoju wyartykułowane zostały obawy o bezpieczestwo ekologiczne wiata i o los przyszłych pokole. Zawarto w nim równie rekomendacj dla drogi zrównowa- onego rozwoju, której wyznacznikiem jest dbało o człowieka i cał planet. Na stray bezpieczestwa ekologicznego sta musz zobowizania i umowy prawne, uwzgldniajce zapobieganie globalnym, regionalnym, krajowym i lokalnym zagroeniom [Steczko, 2008]. Górnictwo naftowe eksploatuje cenne, nieodnawialne zasoby gazu ziemnego i ropy naftowej, zuywa due iloci rónorodnych materiałów i energii, a take wytwarza odpady powodujce trudno odwracalne zmiany w rodowisku naturalnym. Równoczenie przemysł ten jest w kraju wanym podmiotem gospodarczym, dlatego te jego działania i plany musz by zintegrowane z polityk zrównowaonego rozwoju Polski zarówno w ramach Wspólnoty Europejskiej jak i całego wiata, a wic musi posiada priorytety wynikajce zarówno z lokalnych, krajowych, jak i globalnych potrzeb i zagroe. Pracom prowadzonym w górnictwie naftowym towarzyszy nieuchronna konieczno gromadzenia i zagospodarowywania duych iloci odpadów wiertniczych i eksploatacyjnych, które w pocztkowym okresie prowadzenia wierce były składowane w dołach urobkowych. Odpady wiertnicze pochodzce ze starych dołów urobkowych w swym składzie zawierały przede wszystkim zwierciny, zuyte płuczki bentonitowe oraz zanieczyszczenia ropopochodne, pochodzce z nawierconych warstw ropononych. Odpady te czciowo zostały zmieszane z ziemi, torfem itp., gdy w pocztkowym okresie rozwoju górnictwa nafty i gazu wiedza ekologiczna była na niskim poziomie, a co za tym idzie, wiadomo zagroe stwarzanych przez gromadzone odpady zarówno wród pracowników brany, jak i zwykłych ludzi była 15

13 niedostateczna. Dopiero w drugiej połowie XX wieku zaczto dostrzega ekologiczn rang problemu. Obecnie rekultywacja terenów starych dołów urobkowych zdegradowanych przez skaenie substancjami ropopochodnymi naley do kluczowych problemów ekologicznych, które naley rozwiza w najbliszej przyszłoci. Substancje ropopochodne stanowi jedno z głównych ródeł skaenia gleby/odpadów zdeponowanych w starych dołach urobkowych, powodujc degradacj ycia biologicznego na terenie składowania i nieprzydatno uytkow, take ze wzgldu na niekorzystne zmiany parametrów wytrzymałociowych gruntu na obszarze składowiska. Odpady ropopochodne wpływaj niekorzystnie na produkcj rolinn, a take stwarzaj zagroenie dla ludzi i zwierzt. Wikszo z substancji wchodzcych w skład zanieczyszcze działa toksycznie na organizmy ywe. Poszczególne ekosystemy ldowe, stanowice jednostk ekologiczn, w skład której wchodz zespoły organizmów ywych, tworz pewn cało dostosowan do warunków panujcych w biotopie. Wprowadzenie do ekosystemów zanieczyszcze ropopochodnych wywołuje zaburzenia przebiegu naturalnych cykli obiegu materii i energii. Obserwuje si stymulacj rozwoju niektórych grup mikroorganizmów oraz hamowanie aktywnoci pozostałych. Ponadto zanieczyszczenia ropopochodne powoduj zniekształcenia gleb, idce w kierunku zmniejszenia pojemnoci wodnej wskutek czciowego lub całkowitego zapełnienia porów glebowych, utrudniaj bd uniemoliwiaj wymian powietrza pomidzy gleb a atmosfer. Bardzo dua przewaga wgla organicznego nad zawartoci azotu i fosforu powoduje ostry niedobór tych składników dla mikroorganizmów i rolin, degradacj fizyko-chemicznych właciwoci koloidów glebowych (pojemnoci sorpcyjnej, wymiany jonowej) oraz wywołuje widoczne i niekorzystne zmiany odczynu rodowiska. Wielorako i specyficzne własnoci składników zanieczyszcze ropopochodnych oraz produktów ich biologicznych i fizykochemicznych przekształce w rodowisku przyrodniczym powoduj due trudnoci w rozpoznaniu ekologicznych nastpstw zanieczyszczenia rodowiska, wyborze technologii oczyszczania, a take metod diagnozowania i monitorowania postpu oczyszczania rodowiska [Siuta, 2003]. Rekultywacja terenów starych dołów urobkowych zdegradowanych przez skaenie substancjami wymaga opracowania nowych, prostych i uzasadnionych ekonomicznie do zastosowania w warunkach kopalnianych technologii w celu usunicia lub ograniczenia ich ujemnego wpływu na rodowisko. Obecnie stosowane technologie rekultywacyjne opieraj si przede wszystkim na procesach natury fizyko-chemicznej. Wikszo z nich przeprowa- 16

14 dza si metod ex-situ, charakteryzuj si one jednak głbok i gwałtown ingerencj w struktur gleby, zmieniajc jej właciwoci i utrudniajc póniejsze wykorzystanie. Coraz czciej prowadzone s badania nad przyspieszeniem procesu biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych na drodze procesów biologicznych przy wykorzystaniu aktywnych kultur bakteryjnych, wyizolowanych uprzednio z silnie skaonych rodowisk naturalnych. Alternatyw dla metod standardowych jest wykorzystywanie mikroorganizmów autochtonicznych do usuwania zanieczyszcze ropopochodnych z odpadów wiertniczych. Wdroenie metod biologicznych stwarza moliwo przekształcenia zanieczyszcze ropopochodnych w produkty nietoksyczne i bezpieczne dla rodowiska. Umoliwia prowadzenie procesu oczyszczania metod in-situ, która zapewnia szybkie przywrócenie równowagi ekologicznej na skaonym terenie, poniewa zmiany spowodowane prowadzonymi procesami nie s głbokie i nie maj destrukcyjnego wpływu na zasiedlajce oczyszczany obszar organizmy ywe. Likwidacja polegajca na biodegradacji wglowodorów ropopochodnych metod insitu wydaje si by w tym przypadku najkorzystniejszym rozwizaniem, poniewa zmniejsza do minimum zagroenia zwizane ze skaeniem rodowiska rop naftow. Polskie Górnictwo Naftowe i Gazownictwo S.A. wychodzi naprzeciw yczeniom władz wojewódzkich, które chciałyby usun zagroenia zwizane z obecnoci odpadów wiertniczych zdeponowanych w starych dołach urobkowych, finansujc badania majce na celu opracowanie technologii i prace zmierzajce do likwidacji starych dołów urobkowych na terenie m.in. kopalni Grabownica i Bóbrka. 17

15 Obecna polityka rozwoju gospodarczego uwzgldnia, w wikszym ni dotychczas stopniu, zadania z zakresu ekologii, preferuje technologie bezpieczne z punktu widzenia ochrony rodowiska i kładzie nacisk na zapobieganie zagroeniom dla ekosystemów. Gospodarka odpadami wiertniczymi stanowi jeden z kluczowych problemów ekologicznych, jakie staj przed bran górnictwa nafty i gazu. Doły urobkowe, w których zgromadzono odpady wiertnicze pochodzce z dawno zakoczonych wierce, prowadzonych w celu pozyskania ropy naftowej na terenie obecnego województwa podkarpackiego, na kopalniach Grabownica i Bóbrka, stanowi uciliw pozostało działa przemysłu sprzed wielu (ponad 50-60) lat. Likwidacja tych dołów jest jednym z priorytetów poprawy rodowiska w podkarpackich lasach, gdy przykładowo na kopalni Grabownica wystpuje ponad 100 starych dołów urobkowych. Odpady wiertnicze powstałe przy wierceniu płytkich otworów (poniej 1000 m ppt) na kopalniach terenu Podkarpacia, które prowadzono za pomoc prostych technik wiercenia, metod udarow, za przy pogłbianiu otworów stosowano metod obrotowo-płuczkow, oprócz urobku skalnego, zawieraj składniki płuczki i rop z nawierconych warstw wodono- nych. W wierceniach tych stosowano tylko płuczki iłowe niemodyfikowane rodkami chemicznymi (utworzone z wody i minerału ilastego, najczciej bentonitu). Odpady te zdeponowane w starych dołach urobkowych charakteryzuj si wysok zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych w zakresie: mg/kg s.m., co uniemoliwia prowadzenie biologicznego oczyszczania. W zwizku z tym postawiono nastepujace nastpujce tezy pracy: Po dokonaniu przegldu dokumentów archiwalnych wierce oraz na podstawie studium dotyczcego sposobów likwidacji odpadów wiertniczych pochodzcych z rónych czasowo okresów wierce i po przeprowadzeniu bada fizyko-chemicznych i mineralogicznych odpadu oraz analiz chromatograficznych zanieczyszcze ropopochodnych, mona bdzie uzyska argumenty, które bd stanowiły podstaw do zakwalifikowania odpadu wiertni- 18

16 czego zdeponowanego w starych dołach urobkowych, do grupy odpadów o kodzie ex * gleba i ziemia zanieczyszczona substancjami ropopochodnymi, który zgodnie z rozporzdzeniem Ministra rodowiska z dnia 21 marca 2006 r. Dz.U. 49, poz. 356 moe by poddany obróbce biologicznej i unieszkodliwianiu metod in-situ (Zał. Nr 3 do powyszego rozporzdzenia). Zastosowanie etapowej technologii oczyszczania odpadów wiertniczych ze starych dołów urobkowych powinno umoliwi stopniowe obnianie poziomu zanieczyszcze ropopochodnych w silnie skaonych odpadach, co z kolei pozwoli na wprowadzanie kolejnych etapów oczyszczania opartych na metodach biologicznych. Głbsze doczyszczenie odpadów ze starych dołów urobkowych, mona bdzie osign poprzez wprowadzenie inokulacji biopreparatem opracowanycm na bazie bakterii autochtonicznych, który w kocowej fazie inokulacji powinien zosta wzbogacony o wytypowane gatunki grzybów, w celu biodegradacji zanieczyszcze trudno ulegajcych rozkładowi biologicznemu. Opracowane biopreparaty powinny by bezpieczne dla rodowiska i ludzi. Przeprowadzone badania labolatoryjne metod pryzmowania ex-situ kolejnych etapów oczyszczania powinny, unoliwi opracowanie wytycznych prowadzenia etapowego oczyszczania odpadów wierniczych zdeponowanych w starych dołach urobkowych, w warunkach przemysłowych metod in-situ. Weryfikacja opracowanej koncepcji etapowego oczyszczania odpadów ze starych dołów urobkowych z zanieszyszcze ropopochodnych w warunkach przemysłowych powinna, potwierdzi jej uyteczno i przydatno oraz skuteczno bioremediacji zanieczyszcze ropopochodnych wystpujcych w odpadach w wysokich steniach. Cel pracy Cel naukowy: Identyfikacja i analiza kluczowych parametrów pozwalajcych na kompleksow ocen przebiegu bioremediacji zastarzałych zanieczyszcze ropopochodnych i okrelenie jej dynamiki. Cel utylitarny: Opracowanie w oparciu o badania laboratoryjne (metoda pryzmowania ex-situ) koncepcji etapowej technologii oczyszczania silnie skaonych substancjami ropopochodnymi odpadów wiertniczych ze starych dołów urobkowych i jej weryfikacja w warunkach przemy- 19

17 słowych na podstawie przyjtego schematu oceny efektywnoci i skutecznoci poszczególnych etapów oczyszczania. Ogólny zakres bada przedstawiono schematycznie na rys. 2.1, natomiast na rys. 2.2 zilustrowano opracowany schemat efektywnoci i skutecznoci biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych w kolejnych etapach oczyszczania, wystpujcych w wysokich steniach w odpadach wiertniczych zdeponowanych w starych dołach urobkowych. Podczas prowadzonych prac oczyszczania terenów dołów urobkowych w warunkach przemysłowych realizowanych metod in-situ naley spełni wymagania formalno-prawne w zakresie prowadzenia prac bioremediacyjnych na terenach górniczych. Zrekultywowane tereny dołów urobkowych na podstawie decyzji o zakoczeniu rekultywacji powinny zosta przekazane na uytek leny lub rolny. W tym celu opracowano schemat postpowania administracyjnego przy rekultywacji terenu starego dołu urobkowego (rozdział 3, rys. 3.4). Przeprowadzone działania na rzecz ochrony rodowiska, poparte studium literaturowym oraz badaniami w skali laboratoryjnej i przemysłowej na kopalniach ropy i gazu ziemnego, powinny przynie minimalizacj zagroenia zanieczyszczeniami ropopochodnymi dla otaczajcego rodowiska. 20

18 Przeprowadzenie bada i analiz umoliwiajcych zakwalifikowanie zastarzałego odpadu wiertniczego do grupy odpadów o kodzie ex * gleba i ziemia zanieczyszczone substancjami ropopochodnymi Rozpoznanie rozmieszczenia zanieczyszcze ropopochodnych w odpadach i wykonanie analiz w celu przeprowadzenia efektywnej remediacji wstpnej (drena melioracyjno-odciekowy) Przeprowadzenie bada laboratoryjnych (metod pryzmowania ex-situ) obejmujcych optymalizacj parametrów technologicznych dla poszczególnych etapów oczyszczania Modyfikacja struktury odpadu na podstawie: dyfraktogramów rentgenowskich pomiarów aktywnoci dehydrogenazowej Cel: zwikszenie biodostpnoci mikroorganizmów do substancji biogennych i zanieczyszcze ropopochodnych Bioremediacja podstawowa: dobór dawki substancji biogennych korekta odczynu, wilgotnoci i temperatury Cel: uaktywnienie mikroorganizmów autochtonicznych (obnienie zawartoci zanieczyszcze do poziomu umoliwiajcego realizacj kolejnych etapów oczyszczania) Inokulacja biopreparatem: opracowanie składu biopreparatu na bazie bakterii autochtonicznych modyfikacja składu biopreparatu o wytypowane gatunki grzybów wykluczenie ze składu biopreparatu mikroorganizmów patogennych (badania molekularne). Cel: przyspieszenie biodegradacji wglowodorów w celu głbszego doczyszczenia odpadu Ocena efektywnoci i skutecznoci biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych w poszczególnych etapach oczyszczania: Opracowanie koncepcji etapowej technologii oczyszczania zastarzałych odpadów wiertniczych z dołów urobkowych na podstawie bada laboratoryjnych Weryfikacja opracowanej etapowej technologii oczyszczania odpadów z zanieczyszcze ropopochodnych w warunkach przemysłowych w oparciu o schemat oceny efektywnoci i skutecznoci poszczególnych etapów oczyszczania Zakoczenie procesu rekultywacji terenu dołu urobkowego w oparciu o administracyjn decyzj o zakoczeniu rekultywacji Rys Zakres prowadzonych prac badawczych Fig Range of research 21

19 Ocena efektywnoci i skutecznoci biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych w poszczególnych etapach oczyszczania Analiza parametrów fizykochemicznych: przewodno ChZT (Cr) wilgotno odczyn OWO zawarto: chlorków, siarczanów, azotu (NO 3, NO 2, NH 4 + ), azotu ogólnego, fosforu ogólnego, wapnia, magnezu, elaza, glinu, metali cikich Badania toksykologiczne: zastosowanie testów nowej generacji: Phytotoxkit F, Ostracodtoxkit, Microtox, test Ames a przeprowadzenie bada dla wszystkich poziomów troficznych pozwalajce na kompleksow ocen oczyszczanego rodowiska glebowego moliwo wykrycia powstajcych w trakcie procesu biodegradacji toksycznych metabolitów porednich moliwo oceny przydatnoci uytkowej oczyszczonego terenu Analizy chromatograficzne umoliwiaj: ilociowe i jakociowe oznaczenie zawartoci TPH, BTEX i WWA w badanym odpadzie na poszczególnych etapach oczyszczania, pozwalajce na okrelenie efektywnoci procesu, okrelenie stopnia biodegradacji wglowodorów ropopochodnych w postaci zmian wartoci wskaników oceny stopnia biodegradacji n-alkanów (n-c 17 /Pr i n-c 18 /F), obliczenie stałych szybkoci biodegradacji poszczególnych grup zanieczyszcze w kolejnych etapach procesu oczyszczania na podstawie opracowanego modelu matematycznego. Analizy mikrobiologiczne pozwalaj na: oznaczenie ogólnej liczby mikroorganizmów, liczebnoci mikroorganizmów degradujcych wglowodory, liczebnoci grzybów, oznaczenie aktywnoci dehydrogenazowej i celulazowej, identyfikacj rodzajow i gatunkow bakterii i grzybów z wykorzystaniem technik klasycznych i biologii molekularnej (PCR, analiza sekwencyjna DNA kodujcego 16S rrna dla bakterii i 18S rrna dla grzybów). Połczenie danych z analiz chromatograficznych i mikrobiologicznych stanowi podstaw przy doborze swoistych mikroorganizmów i grzybów pozwalajcych na skomponowanie składu profesjonalnego biopreparatu ukierunkowanego na biodegradacj zidentyfikowanych zwizków oraz zapewniajcego szerokie spektrum działania. Rys Schemat oceny efektywnoci i skutecznoci biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych Fig Scheme of effectiveness estimation and biodegradation effectiveness of petroleum contaminants 22

20 Podkarpacie jest kolebk przemysłu naftowego. Prowadzona działalno górnicza od samego pocztku niosła ze sob niekorzystne oddziaływanie na rodowisko. Pierwsza na wiecie kopalnia ropy naftowej powstała w Bóbrce 155 lat temu, tj. w roku Rop naftow wydobywano z tzw. kopanek, które wykonywano rcznie. Miały one przekrój kwadratowy o wymiarach 1,2 x 1,2 m. ciany zabezpieczano przed obsypaniem si cembrowinami drewnianymi z grubych desek. W celu ułatwienia drenia kopanki stosowano kołowrót i kubeł, nastpnie trójnóg. Opierajc si na danych archiwalnych szacuje si, e na złou ropy naftowej Bóbrka wykonano 82 szyby kopane [Gonet, et al., 2005]. W miar rozwoju zastosowa produktów destylacji ropy naftowej rosło zainteresowanie jej wydobyciem. W celu zaspokojenia wzrastajcego popytu signito po złoa ropy poło- one na wikszych głbokociach, co wymusiło rozwój technik wiertniczych. W roku 1862 Henryk Wolter na kopalni ropy naftowej w Bóbrce zastosował po raz pierwszy technik wiercenia udarowego rcznego, przy uyciu noyc wolnospadajcych Fabiana. Technika ta polegała na kruszeniu skały na dnie otworu wiertniczego za pomoc uderze (udarów) widra. Urobek usuwano z otworu specjaln łyk, zapuszczan na dno za pomoc kołowrotu. Przewód wiertniczy w tym okresie składał si z drewnianych erdzi, wolnospadajcych noyc i widra z obcinikiem. Konstrukcja noyc umoliwiała podniesienie widra na wysoko od 0,5 do 1,2 m ponad dno otworu, a nastpnie zrzucenie go z zaczepu. Stanowice przeszkod w głbieniu otworów samorodne płuczki iłowe, tworzce si w wyniku napływu wód, usuwane były czerpakami. Z biegiem lat i rozwoju techniki wiertniczej stosowano kolejne ulepszenia w postaci erdzi elaznych, parowego napdu, a wreszcie przewodów linowych oraz gwintowanych, hermetycznych rur okładzinowych, słucych do zamykania wód wgłbnych. W pocztkach XX wieku głboko otworów sigała ju kilkuset metrów. Wikszo wierce udarowych prowadzono bezpłuczkowo, a wic zwierciny (okruchy skalne) usuwano z odwiertu za pomoc odpowiedniego urzdzenia czerpicego i gromadzono 23

21 je w dołach ziemnych (dołach urobkowych). Nie prowadzono adnych prac likwidacyjnych wydobytego urobku skalnego, ani zanieczyszcze ropopochodnych, poniewa w ówczesnych czasach była to zwykła praktyka, nieregulowana adnymi przepisami i niebudzca sprzeciwu władz odpowiedzialnych za ochron rodowiska. Po zakoczeniu II wojny wiatowej rozpoczł si intensywny rozwój działalnoci wydobywczej i wiercenia udarowe stopniowo zastpowano wierceniami obrotowymi. Wiercenie obrotowe polega na skrawaniu lub kruszeniu skały na dnie otworu wiertniczego, przy uyciu rónego rodzaju widrów lub koronek wiertniczych, wprawianych w ruch obrotowy. W celu wykonania wiercenia zapuszcza si do otworu wiertniczego odpowiedni wider, przykrcony do dolnego koca przewodu wiertniczego, złoonego z rur płuczkowych. Obrót widra w otworze uzyskuje si za pomoc przewodu wiertniczego, który przenosi napd z silnika za porednictwem przekładni i stołu wiertniczego [Czstka, 1975]. Podczas wiercenia przez rurowy przewód płuczkowy tłoczona jest płuczka wiertnicza, spełniajca wiele zada [Raczkowski, 1981]: oczyszczanie dna otworu i powierzchni widra ze zwiercin poprzez ich wymywanie i wynoszenie na powierzchni, wywieranie na ciany otworu przeciwcinienia, uniemoliwiajcego przepływ wód złoowych, utrzymywanie zwiercin w zawieszeniu w objtoci płuczki oraz tworzenie na ciankach otworu cienkiej nieprzepuszczalnej warstwy osadu, która zapobiega migracji komponentów płuczki do strefy przyodwiertowej, stworzenie właciwych warunków pracy urzdze przez przekazywanie widrowi mocy hydraulicznej, chłodzenie i smarowanie widra i przewodu wiertniczego, zmniejszenie ciaru przewodu wiertniczego i rur okładzinowych oraz zapobieganie ich korozji, zapobieganie przechwytywaniu przewodu wiertniczego. W miar zwikszania głbokoci otworu oraz w zalenoci od rodzaju przewiercanych formacji konieczne jest zmienianie składu płuczki tak, aby charakteryzowała j odpowiednia do warunków panujcych w odwiercie: gsto, lepko, stabilno i filtracja. Do płuczki dodaje si rónorodne rodki chemiczne uzyskujc skomplikowane mieszaniny, w skład których wchodz zarówno minerały i zwizki chemiczne wystpujce w przyrodzie, jak i syntetyczne chemikalia. 24

22 Podstaw klasyfikacji płuczek wiertniczych s: rodzaj orodka dyspersyjnego, rodzaj fazy koloidalnej, stopie i charakter mineralizacji, rodzaj wypełnienia, obróbka chemiczna, wielko ph, sposób sporzdzania płuczki, zakres zastosowania. Podział płuczek wiertniczych przedstawiono na rys Rys Klasyfikacja płuczek wiertniczych [wg Raczkowski, 1981; Raczkowski et al., 1998] Fig Drilling fluids classification [Raczkowski, 1981; Raczkowski et al., 1998] Zwikszajcy si z biegiem lat zakres prac wiertniczych, dua rónorodno warunków geologiczno-technicznych, w jakich były prowadzone poszukiwania ropy naftowej i gazu ziemnego oraz denie do podwyszenia ich efektywnoci techniczno-ekonomicznej, sprzyjały wdroeniu szerokiego asortymentu materiałów i rodków chemicznych, stosowanych do sporzdzania i obróbki chemicznej płuczek. 25

23 Najwikszy udział w płuczkach wiertniczych stanowi materiały obciajce i materiały ilaste. Materiały ilaste (bentonity, iły bentonitowe, attapulgity, pałygorskit, sepiolit) spełniaj rol czynnika strukturotwórczego, zagstnika zwikszajcego parametry reologiczne, rodka obniajcego filtracj i tworzcego na cianie odwiertu osad filtracyjny, chronicy przewiercane warstwy przed migracj fazy wodnej z płuczki. Najczciej stosowanym materiałem obciajcym jest baryt (BaSO 4 ), który w najwikszym stopniu odpowiada wymaganiom technologii płuczkowej. W zalenoci od gstoci materiału płuczkowego, w roli obcinika stosowane s take inne materiały: wapie, kreda, margiel, ilmenit, koncentraty rud elaza o zawartoci elaza 45-55% oraz koncentraty rud ołowiu (magnetyt, hematyt, syderyt oraz galena). rodki chemiczne, zarówno nieorganiczne, jak i organiczne, stanowi obecnie główny element obróbki chemicznej płuczki wiertniczej, umoliwiajcy racjonalne regulowanie ich właciwoci technologicznych w zalenoci od geologicznych warunków wiercenia. Zastosowanie rodków chemicznych zostało zapocztkowane w latach 40-tych i od tego okresu widoczna jest szybko postpujca chemizacja technologii płuczkowej. Jako obciniki płuczek solno-polimerowych stosuje si sole metali (NaCl, KCl, KBr, NaBr). Nowoci w zakresie cikich solanek jest stosowanie soli organicznych mrówczanów (NaCOOH, KCOOH, CsCOOH). Du rol w technologii płuczkowej odgrywaj rodki nieorganiczne rozpuszczalne w wodzie (NaOH, NaCO 3, NaHCO 2, NaBr, KOH, K 2 CO 3, KCl, KBr, Ca(OH) 2, CaSO 4, CaCl 2, CaBr 2, ZnBr 2 ), które dziki dysocjacji elektrolitycznej w roztworze wodnym na naładowane jony (dodatnie kationy i ujemne aniony) spełniaj szereg funkcji w płuczce wiertniczej. Do najwaniejszych naley zaliczy: regulowanie składu kompleksu wymiennych jonów w iłach, regulowanie alkalicznoci płuczki, inhibitowanie płuczki wiertniczej w celu uodpornienia jej na szkodliwe działanie niektórych rodzajów przewiercanych skał, tworzenie struktury wewntrznej w płuczkach iłowych, regulowanie procesów osmotycznych w układzie płuczka wiertniczaskała, zwikszenie gstoci i odpornoci termicznej płuczek [Raczkowski et. al., 1998]. Najwiksze jednak znaczenie w technologii płuczkowej maj organiczne rodki chemiczne uywane do: zwikszenia lepkoci płuczek: biopolimery, ywice naturalne, rolinne ywice guarowe, hydroksyetyloceluloza (HEC), polianionowa celuloza (PAC), polichlorek wodorotlenku magnezowo-glinowego (MMH), 26

24 obnienia parametrów reologicznych: taniny rolinne, taniny modyfikowane, taniny syntetyczne, lignosulfoniany (wapniowe, elazowo-chromowe, potasowe, chromowe, bezchromowe), lignity (naturalne, potasowe, chromowe, cynkowe), polimery syntetyczne (np. kopolimer bezwodnika maleinowego i styrenu), zmniejszenia filtracji płuczek wiertniczych: preparaty skrobiowe (Rotoksol, Polgel, Rotocal, Rotomag), karboksymetyloskrobia (KMS), karboksymetyloceluloza (KMC), polianionowa celuloza (PAC), karboksymetylohydroksyetyloceluloza (KMHEC), metyloceluloza, polimery syntetyczne (poliakrylan sodowy, hydrolizowany poliakryloamid, modyfikowane polimery naturalne, półsyntetyczne i syntetyczne). Ponadto w technologii płuczkowej stosowano pomocnicze materiały i rodki chemiczne: inhibitory hydratacji skał ilastych (wapniowe zwizki nieorganiczne, chlorek amonowy, siarczan glinu, krzemian sodowy, kationowy poliakryloamid, poliglikole i pochodne gliceryny), rodki asfaltowe (asfalty naturalne, asfalty neutralizowane wodorotlenkami metali alkalicznych oraz sole sodowe lub potasowe asfaltu aulfonowanego), flokulanty zwiercin (flokulanty selektywne Gigtar, Rokrysol, Magnafloc), rodki powierzchniowo-czynne (niejonowe, anionowe i kationowe), rodki chemiczne likwidujce pienienie: stearynian glinowy, alkohole wysokowrzce (oktanal), modyfikowane oleje rolinne, zwizki krzemoorganiczne (silikony), rodki przeciwfermentacyjne: formalina, fenol, krezol, ksylenom. inhibitory korozji. Rozwój technologii płuczkowej miał wpływ na wzrost iloci krajowych i zagranicznych materiałów i rodków chemicznych stosowanych w polskim wiertnictwie. W tabeli 3.1 przedstawiono przykładowo zestawienie iloci i rodzajów rodków zuytych podczas prac wiertniczych w 1988 r. Zaostrzenie przepisów w latach 80-tych XX wieku w zakresie ochrony rodowiska przyczyniły si do zrezygnowania ze szkodliwych materiałów wiertniczych, takich jak: galena, fenol, krezol, formaldehyd, chromal, chromian sodu. Ponadto dla przeciwdziałania pcznieniu iłów i stabilizacji cian odwiertu zamiast soli zaczto wprowadza odpowiednie polimery. Płuczki olejowe stosuje si tylko w niezbdnych przypadkach, zastpujc powszechnie stosowany olej napdowy olejem mineralnym o znacznie mniejszej zawartoci składników aromatycznych [Molenda et al., 2000, Goc, 1998]. 27

25 Tabela 3.1. Całkowite zuycie materiałów płuczkowych wykorzystanych do wierce w 1988 r. [Steczko et al., 1991] Table 3.1. Total use of fluid materials applied to drilling in 1988 [Steczko et al., 1991] Rodzaj materiału Ilo materiału [t] Rodzaj materiału Ilo materiału [t] Minerały ilaste 4000 Chlorki (NaCl, KCl, CaCl 2 ) 1600 Baryt Chromiany i dwuchromiany 11 Ruda magnetytowa 3000 Fenole i pochodne 70 Kreda 200 Formalina 15 Ługi (NaOH, KOH) 200 Lignosulfoniany Al-Fe 200 Wapno {CaO, Ca(OH) 2 } 300 Lignosulfoniany Fe-Cr 30 Gips 14 Polifenole 20 Wglan sodu {NaHCO 3, Na 2 CO 3 } 150 Lignity 800 Koloidy celulozowe 1200 rodki powierzchniowo-czynne 6 Koloidy skrobiowe rodki przeciwpienne (oktanol) 120 Polimery 15 rodki smarne 44 Materiały uywane do sporzdzania płuczek i regulacji ich właciwoci powinny by dobrane w ten sposób, by spełniały swoje funkcje technologiczne i jednoczenie były mniej szkodliwe dla rodowiska. Prawidłowy z ekologicznego punktu widzenia dobór materiałów wiertniczych jest moliwy tylko wtedy, gdy znana jest potencjalna szkodliwo materiału dla rodowiska [Raczkowski et al., 1997; Raczkowski et al., 2001]. Punkt zwrotny w ekologicznym spojrzeniu na płuczki stosowane w procesach wiercenia otworów nastpił w latach 90-tych XX wieku, kiedy to w Instytucie Nafty i Gazu w Krakowie podjto próby okrelenia szkodliwoci stosowanych materiałów płuczkowych. Prowadzone badania bazowały na wytypowanych parametrach chemicznych, do których zaliczono: zawarto metali cikich: Cr, Pb, Cd, Zn Cu, Hg, As oraz manganu i elaza, zawarto anionów chlorkowych, zawarto fenoli, zawarto substancji ropopochodnych zawarto substancji rozpuszczalnych bd tworzcych drobno zdyspergowan, trudno sedymentujc zawiesin, zawarto substancji o własnociach redukcyjnych, mierzon wskanikiem CHZT Cr, czyli tych czynników, które mog wywiera: niekorzystny wpływ na funkcjonowanie organizmów ywych (denaturyzacja białka, usuwanie naturalnych wydzielin, zatykanie porów), 28

26 zmiany siły jonowej roztworów, impregnacj gleby, zanieczyszczenia wód, nadmierne zuboenie rodowiska w tlen. Metody okrelania szkodliwego wpływu płuczek na rodowisko nie róni si w sposób zasadniczy od metod stosowanych do ekologicznej oceny materiałów stosowanych w wiertnictwie. Naley jednake zaznaczy, e szkodliwo płuczek wiertniczych nie zaley wprost od wkładów zwizanych ze szkodliwoci wszystkich komponentów ze wzgldu na ich wzajemne, czy to synergetyczne, czy te antagonistyczne oddziaływanie. Dlatego wanym elementem prewencji ekologicznej jest dowiadczalne okrelenie szkodliwoci płuczek wiertniczych dla rodowiska i uwzgldnienie jej przy modyfikacji składu [Steczko et al., 1994; Steczko et al., 1995]. Globalny, potencjalnie szkodliwy wpływ materiałów wiertniczych, płuczek oraz odpadów wiertniczych oceniano obliczajc stopie szkodliwoci (St), równy sumie iloczynów ste czynników szkodliwych C i [kg/kg] i odpowiadajcych im współczynników szkodliwo- ci Wt (przypisane zostały czynnikom szkodliwym na podstawie wysokoci kar pieninych, jakie naley uici zgodnie z obowizujcym prawem przy, zrzucie 1 kg czynnika szkodliwego do rodowiska): St = n i= 1 Wt i C i Wyliczone stopnie szkodliwoci stanowi liczbow miar ich potencjalnie szkodliwego wpływu na rodowisko [Krasiska, et al., 1995; Steczko, et. al., 1995; Raczkowski et al., 1997]. Na rysunku 3.2, dla przykładowo wybranych płuczek wiertniczych, przedstawiono porównanie potencjalnie szkodliwego ich wpływu na rodowisko. Obliczone stopnie szkodliwoci wybranych modelowych płuczek wiertniczych w oparciu o badania wskazuj na due zrónicowanie ich potencjalnie szkodliwego wpływu na rodowisko. W przypadku płuczki bentonitowej o szkodliwoci dla rodowiska (St = 361) decyduje wysoka zawarto substancji rozpuszczalnych i trudno sedymentujcej zawiesiny. Wysoki stopie szkodliwoci płuczki solno-skrobiowej (St = 606) i glikolowo-solnej (St = 998) zwizany jest głównie z wysok zawartoci jonów chlorkowych, substancji rozpuszczonych oraz metali cikich wprowadzonych wraz ze rodkami obciajcymi i minerałami. 29

27 ! " #! " # $! " % '" %& (! " Rys Wpływ czynników szkodliwych na stopieĕ szkodliwoğci przykładowych płuczek wiertniczych Fig Influence of harmful factors to noxiousness degree of exemplary drilling fluids W przypadku wierceĕ na obszarach morskich, impulsem do prowadzenia badaĕ nad toksycznoğcią płuczek i materiałów wiertniczych było zagroīenie Īycia biologicznego w morzach. Miarą szkodliwoğci materiałów oraz płuczek dla Ğrodowiska jest wartoğü LD50 lub stċīenie EC50 odpowiadające stċīeniu, które powoduje Ğmierü 50% organizmów testowanej populacji (LD50) lub okreğlony 50% efekt biologiczny (EC50). Są one wyznaczane podczas testów biologicznych, w których jako biowskaĩniki stosuje siċ Īywe organizmy alg i skorupiaków morskich, ryb, szczurów, królików [Petersen et al., 1991; Reis, 1996; Pathak et al., 2001]. W praktyce Ğwiatowej natomiast, dla wierceĕ prowadzonych na lądzie, wydawanie werdyktów o stopniu szkodliwoğci dla Ğrodowiska materiałów wiertniczych opiera siċ na podstawie badaĕ chemicznych [Conklin et al., 1983; Addy et al., 1984; Leuterman et al., 1988; Tsvetnenko et al., 2000]. 30

28 Gospodarka odpadami wiertniczymi stanowi jeden z naczelnych problemów ekologicznych, jakie staj przed bran górnictwa nafty i gazu. Odpady wiertnicze gromadzone były sukcesywnie w dołach urobkowych usytuowanych w bezporednim ssiedztwie wiertni. W skład odpadu wchodzi powinny tylko zwierciny i zuyta płuczka wiertnicza, ale moe si zdarzy, e do składowiska odpadu s zrzucane wody technologiczne, nadmiary zaczynów płuczek itp. Podstawowym krokiem w celu zabezpieczenia rodowiska przed szkodliwym oddziaływaniem odpadów jest właciwa konstrukcja dołu urobkowego, tj.: odpowiednia pojemno dołu, która jest zalena od głbokoci wiercenia i powinna pomieci cało odpadów wytworzonych w trakcie pracy oraz posiada rezerw objto- ciow, któr mona wykorzysta w przypadku awarii, konstrukcja dołu i wałów oraz kt nachylenia obszaru dołu powinny by zalene od wła- ciwoci mechanicznych i ukształtowania terenu, dno dołu urobkowego powinno znajdowa si w odpowiedniej odległoci od poziomu wód podziemnych (wynoszcej co najmniej 0,5 m), obwałowanie dołu powinno by nieprzepuszczalne i musi posiada odpowiedni wytrzymało mechaniczn, stworzenie nieprzepuszczalnej i stabilnej w czasie warstwy uszczelniajcej, tak aby nie dopuci do przenikania do podłoa gleby i wód podziemnych zanieczyszcze mobilnych i odcieków z dołu urobkowego. Rodzaj uszczelnienia dołu urobkowego naley wybra po rozpoznaniu budowy geologicznej i hydrogeologicznej terenu, na którym dół ten ma by zlokalizowany oraz na podstawie prognozy dotyczcej szkodliwoci gromadzonych odpadów. Rozpoznanie złó minerałów odbywa si w ramach geologicznej dokumentacji złoowej lub bada geologiczno-inynierskich. Jako zasad naley stosowa wykorzystanie warstw ilastych o miszoci wikszej od 0,5 m. W przypadku uszczelnie mineralnych najlepsze własnoci maj grunty montmorylonitowe, smektytowe, gorsze illitowe, a najgorsze kaolinowe. Zwizane jest to z pojemnoci kompleksu sorpcyjnego i wymian jonow tych gruntów (im wiksza pojemno wymiany jonowej, tym lepsze właciwoci sorpcyjne i izolacyjne). Bardzo niekorzystnym czynnikiem jest kurczliwo, wiksza dla iłów z grupy montmorylonitu ni dla kaolinitu [Rosik-Dulewska, 2008]. 31

29 Najprostsza izolacja starego dołu urobkowego polegała na iłowaniu dna zbiornika (dołu urobkowego), cementowaniu lub zastosowaniu mieszaniny gleby, bentonitu i polimeryzujcych ywic syntetycznych, ewentualnie w póniejszym okresie wyłoeniu foli. W chwili obecnej problemy natury ekologicznej mona wyeliminowa poprzez zastosowanie materiałów uszczelniajcych, gwarantujcych długotrwało i bezpieczestwo magazynowanych odpadów. Do najczciej stosowanych rodzajów z grupy nieprzepuszczalnych geosyntetyków nowej generacji mona zaliczy: geopianki, geomembrany, geokompozyty [Rosik-Dulewska, 2008; Stryczek et al., 2004]. Na uwag zasługuj geomembrany z polietylenu o duej gstoci (HPDE-MDPE), charakteryzujce si bardzo nisk przepuszczalnoci, korzystnymi parametrami wytrzymałociowymi, elastycznoci i odpornoci na zmiany temperatury i czynniki chemiczne. Jednake mona stwierdzi, e kada technologia jest wskazana do zastosowania, o ile pozwala na zatrzymanie procesów skaenia rodowiska. W pocztkowym okresie rozwoju górnictwa nafty i gazu, wiedza ekologiczna stała na niskim poziomie. Nie rozumiano w pełni zagroe, jakie mog stwarza odpady powstajce podczas prowadzenia prac wiertniczych i składowane w dołach urobkowych. Ponadto nie znano efektywnych metod unieszkodliwiania, a zarazem nie obowizywały przepisy administracyjne, dotyczce prowadzenia działa naprawczych i zapobiegajcych zanieczyszczaniu rodowiska naturalnego. W latach na terenie Polski wykonano 4000 odwiertów badawczych, o łcznej głbokoci 6 mln m, co dowodzi, e iloci zgromadzonych odpadów wiertniczych były znaczne, a szacunkowa ilo zlikwidowanych w tym okresie (do 1972 r.) dołów urobkowych wynosi około Naley zaznaczy, e czsto stan techniczny wielu dołów urobkowych stanowił zagroenie dla otaczajcego terenu oraz pobliskich zabudowa. Due niebezpieczestwo stanowiły doły urobkowe wykonywane na stokach wzgórz, gdy obwałowania w niektórych przypadkach ulegały czciowo obsuniciu [Gero et al., 1978]. Odpady wiertnicze w formie skoncentrowanej mog stanowi istotne zagroenie dla czystoci wód. Wie si to z zawartymi w odpadach ładunkami zanieczyszcze chemicznych, takich jak: jony metali cikich (Pb, Cr, Cd, Cu, Zn, Mn, Fe) pochodzce z minerałów lub dodatków chemicznych stosowanych do sporzdzania płuczek (np. ołów z galeny, chrom z lignosulfonianów elazowo-chromowych i chromianu potasowego) oraz z materiałów stosowanych do cementowania, z elementów orurowania otworów lub zwierconych materiałów skalnych, 32

30 bentonity, których sedymentacja nastpuje dopiero po rozkładzie koloidów ochronnych i obnieniu ph, sole pochodzce z przewiercanych interwałów oraz dodawane do płuczek w postaci chlorków, oleje, smary (czsto w postaci emulsji), które s stosowane w procesie wiercenia dla zapewnienia prawidłowej pracy urzdzenia, fenole wprowadzane do płuczki z polifenolami (rotanina) lub rodkami antyfermentacyjnymi, silne alkalia, zwizki organiczne o wysokim potencjale redukcyjnym, rodki powierzchniowo-czynne, trudne do zidentyfikowania produkty rozpadu licznych składników płuczek wiertniczych. Znaczc rol w dokonaniu prawidłowej oceny szkodliwoci odpadu wiertniczego dla rodowiska ma prawidłowy pobór prób. Odpady tworzce si w poszczególnych fazach wiercenia i gromadzone sukcesywnie w miar postpu wiercenia w dole urobkowym powinny by najmniej skaone w najgłbszej partii dołu. W dole urobkowym wraz z upływem lat zachodziły róne reakcje chemiczne oraz procesy fizykochemiczne w tym rozdział faz, ale przebiegały one bardzo wolno i z reguły nie dochodziło do wyrównania ste. Liczne badania wykazały, e rozkład zanieczyszcze w odpadzie jest nierównomierny, a czsto wystpowanie miejsc o najwyszej koncentracji metali cikich jest zupełnie przypadkowe. Stwierdzono, e najlepsza głboko poboru próbek wynosi 0,4 0,7 m ppt, gdy wówczas gsto próbki odpowiada redniej gstoci zgromadzonej w dole urobkowym zawiesiny [Wojtanowicz et al., 1989]. Prawidłowy pobór reprezentatywnej próbki do bada ma znaczcy wpływ na okrelenie stopnia szkodliwoci odpadu i wybór efektywnej metody unieszkodliwiania. Szkodliwo odpadów wiertniczych okrela si na podstawie identycznych parametrów chemicznych jak w przypadku materiałów wiertniczych i płuczek. Prowadzone w latach 90-tych XX wieku badania szkodliwoci odpadów wiertniczych wskazuj, e w porównaniu do płuczek, odpad zawiera znacznie mniejsze iloci substancji o własnociach redukcyjnych, substancji ulegajcych rozpuszczeniu oraz tworzcych trudno opadajce zawiesiny. Odpad w odrónieniu od płuczki zawiera wicej toksycznych metali cikich (z materiałów obciajcych, zwiercin, zaczynów cementowych) oraz substancji ropopochodnych z nawierconych warstw ropononych, smarów i olejów [Steczko et al., 1998]. Praktyka wykazuje, e negatywne skutki deponowania w rodowisku silnie zanieczyszczonych odpadów wiertniczych mog pojawi si dopiero wiele lat po utworzeniu dołu 33

31 urobkowego, w wyniku uszkodzenia izolacji lub zmiany stosunków wodnych w otaczajcym terenie. Odpad zgromadzony w dole urobkowym ulega z reguły samorzutnemu rozwarstwieniu na faz półstał, zalegajc dno dołu urobkowego i faz ciekł, zwan wod nasadow (cieki wiertnicze), która stanowi do 70% objtoci zdeponowanych odpadów. Podczas przewiercania skał górotworu do układu hydrozolu płuczki zostaj włczone wysoko zdyspergowane oraz okruchowe składniki skalne. Składnikami zdyspergowanymi s najczciej minerały ilaste o strukturze pczniejcej (smektyty i minerały mieszano-pakietowe smektyt-illit), pochodzce z macierzystej płuczki oraz ze zwiercin, które ulegaj kompleksacji z hydrofilowymi makroelementami, tworzc dezorientowane asocjaty micelarne hydroelu. W dołach urobkowych warstwa hydroelu spoczywa na dnie zbiornika [Fijał et al., 2004; Czekaj et al., 2005]. Proces likwidacji dołu urobkowego mona podzieli na dwa etapy: oczyszczanie i odprowadzenie wody, unieszkodliwienie i likwidacja szlamu i zwiercin. Schemat przebiegu oczyszczania odpadów płuczkowych przedstawiono na rys Metody oczyszczania cieków wiertniczych przed odprowadzeniem do wód powierzchniowych były na ogół bardzo proste. Polegały one na podaniu in-situ lub do zbiorników czynników koagulujcych (CaO, FeSO 4, lub Al 2 (SO 4 ) 3 ) i flokulujcych (Rokrysol WF, Gigtar) w przypadku cieków zawierajcych opadajc zawiesin. Rodzaje rodków i ich dawki były zrónicowane i dobierane na podstawie bada dowiadczalnych wykonywanych indywidualnie dla układu koagulant-flokulant. Zanieczyszczone wody (cieki), w których stwierdzono obecno jonów Cr 6+, unieszkodliwianie przeprowadzano dwuetapowo: w pierwszym etapie redukowano stopie utlenienia chromu do Cr 3+ za pomoc kwanego siarczynu sodu oraz pirosiarczynu sodu, a nastpnie w II etapie nastpowała ich neutralizacja za pomoc Ca(OH) 2, w czasie której wytrcał si osad wodorotlenku chromu [Czerwiska et al., 1985]. Fenole stanowi najbardziej szkodliw grup zanieczyszcze oddziaływujcych na flor i faun ekosystemów wodnych. Stosowana chemiczna metoda oczyszczania polegała na neutralizacji fenolu podchlorynem sodu lub perhydrolem, co wizało si z powstawaniem szeregu produktów ubocznych, które usuwano poprzez filtr z wgla aktywnego. Warto zaznaczy, e pod koniec lat 80-tych ubiegłego wieku podjto prekursorskie próby biodegradacji 34

32 fenoli w dołach urobkowych, według metody opracowanej w INiG z zastosowaniem szczepionki bakteryjnej, opracowanej na bazie wyodrbnionych z zanieczyszczonych wód szczepów bakteryjnych z rodzaju Pseudomonas, któr z pozytywnym wynikiem wdroono na kilku obiektach (dołach urobkowych) PGNiG Jasło [Karaskiewicz, 1980]. Do dodatkowych metod oczyszczania naley zaliczy napowietrzanie oczyszczanych cieków oraz ich doczyszczanie na filtrach wirowo-piaskowych. Odpad płuczkowy Łapacz oleju Zestalanie Oddzielanie fazy stałej od fazy cie- Wirowanie bez lub z flokulantem Odolejanie odpadów emulsyjnych; separator: flotacja powietrzem w obecnoci rodków chemicznych Olej Urednianie odpadu Dodatek chemicznych substancji zestalajcych Ciecz Odpuszczenie do zbiornika wodnego Odpad Wywóz do zbiornicy Materiał stały Odpad stały Pozostawienie na miejscu Wypełnianie gruntu Magazynowanie Wywóz na nieuytki Rys Sposoby unieszkodliwiania odpadów płuczkowych [Raczkowski, 1981] Fig Methods of drill waste disposal [Raczkowski, 1981] 35

33 Zanieczyszczenia ropopochodne pochodzce ze ródeł naturalnych (np. ropa naftowa z nawierconego kolektora skalnego) lub technologicznych, takich jak faza ropno-olejowa z płuczki wiertniczej, olej napdowy, wycieki ropy naftowej, stanowiły powany problem w procesach unieszkodliwiania cieków wiertniczych. Do oczyszczania cieków z zanieczyszcze ropopochodnych stosowano: metody mechaniczne (wyłapywanie oleju), adsorpcyjne (adsorpcja na bentonicie, specjalnych tworzywach lub rozdrobnionej piance poliuretanowej), filtry koalescencyjne, dyspergatory, deemulgatory, elektrochemiczne destabilizatory emulsji i inne [Gero et al., 1978]. Po odpuszczeniu warstwy wodnej z dołu urobkowego, do likwidacji pozostaje szlam składajcy si ze zwiercin, fazy stałej płuczki wraz z zaadsorbowanymi chemikaliami i nieodseparowanej wody. Wprawdzie istniały dwa sposoby likwidacji dołów urobkowych, ale preferowano metod polegajc na zestaleniu odpadu i pozostawieniu na miejscu składowania. Szlam wymagał obróbki rodkami neutralizujcymi oraz zagszczajcymi. W wyniku przeprowadzonych bada wytypowano nastpujce rodki do zestalania: wapno palone, gips budowlany i suchy torf. Ilo zuytych rodków była uzaleniona od składu chemicznego i mineralogicznego szlamu oraz stopnia jego uwodnienia. Szlam wymieszany z zadozowanymi w odpowiedniej iloci rodkami przykrywano warstw gleby. Naley zauway, e nie doprowadzano do całkowitego zestalenia szlamu, gdy warstwa taka byłaby nieprzepuszczalna dla wód gruntowych, jak równie utrudniałaby w powanym stopniu rozpoczcie procesów biologicznego rozkładu zwizków chemicznych zawartych w szlamie. Metoda likwidacji szlamu została przedyskutowana w Instytucie Gleboznawstwa, Chemii Rolnej i Mikrobiologii Akademii Rolniczej w Krakowie oraz ze specjalistami Wydziału Rolnictwa Urzdu Wojewódzkiego w Krakowie i uzyskała akceptacj z zastrzeeniem, e dokładne skutki jej stosowania bd musiały by poznane dopiero po kilku latach. Zastrzeenie to było słuszne, gdy obecnie mona stwierdzi, e stosowanie tej metody w latach 70-tych XX wieku nie doprowadziło do pełnej likwidacji dołów urobkowych, o czym wiadcz zanieczyszczenia wystpujce na terenach po zlikwidowanych dołach urobkowych w podkarpackich lasach (np. kopalnia Grabownica, Bóbrka). Odpady (szlamy) charakteryzujce si zwikszon zawartoci metali cikich, zanieczyszcze ropopochodnych, wykazujce du tendencj do tworzenia si dobrze zdyspergowanej i trudno opadajcej zawiesiny, przed zdeponowaniem w glebie poddawano procesowi zestalania (solidyfikacji). Proces ten został wprowadzony do praktyki krajowej przez Zakład 36

34 Poszukiwa Nafty i Gazu [Szyszkowski et al., 1991]. Jako czynnik solidyfikujcy stosowano szkło wodne oraz aktywatory procesu, charakteryzujce si zdolnoci wizania wody (gips, cement). Stosowane rodki zestalajce dodawano w iloci 1-5% w stosunku do masy odpadu. Badania przeprowadzone w INiG w latach wykazały, e zestalenie dawało dobre efekty w niszczeniu struktury koloidalnej zdyspergowanych substancji ilastych (bentonit). Ponadto zestalone odpady zatrzymywały znaczne iloci substancji ekstrahujcych si eterem naftowym/chloroformem (40 80%), kationy metali cikich dwu i trójwartociowe zostały zatrzymywane całkowicie w utwardzanej strukturze bentonitowej. W zestalonych próbkach okrelono wysoki stopie zatrzymywania (50 92%) substancji o własnociach redukcyjnych, co przejawia si znacznym zmniejszeniem ChZT Cr ekstraktów wodnych. Aniony chlorkowe były zatrzymywane w zestalonym odpadzie w niewielkim stopniu (około 20%) [Hajdus et al., 1994]. Jednake soildyfikacja nie stanowi rozwizania, które umoliwiałoby deponowanie w gruncie odpadów o wysokiej zawartoci wglowodorów ropopochodnych oraz odpadów o duym zasoleniu. W tabeli 3.1 przedstawiono zestawienie sposobów likwidacji odpadów wiertniczych w zalenoci od stopnia szkodliwoci (St) poszczególnych czynników szkodliwych, wchodzcych w skład odpadu wiertniczego [Steczko et. al., 1994]. Tabela 3.2. Wybór sposobu likwidacji odpadów wiertniczych w zalenoci od składu zanieczyszcze Table 3.2. Application of drill wastes removal type according to their content Sposób likwidacji Zawarto metali cikich Zawarto olejów i smarów Zawarto jonów chlorkowych Stopie szkodliwoci [St] Zawarto substancji redukcyjnych Zawarto substancji rozpuszczalnych i dyspergujcych Odwodnienie i rozprowadzenie w rodowisku Odwodnienie (rowy rozprowadzajce), wymieszanie z gleb, składowanie pod wierzchni warstw gleby Solidyfikacja, wymieszanie z gleb, składowanie pod wierzchni warstw gleby Odwodnienie i składowanie w warunkach pełnej izolacji od rodowiska > > > > > ( )

35 Górnictwo nafty i gazu naley do tych dziedzin przemysłu, które ingeruj głboko w litosfer i generuj odpady obcione duymi ładunkami chemicznymi. Rosnca wiadomo ekologiczna i troska o stan rodowiska naturalnego stymulowana zarówno przez wymogi prawa krajowego, jak i midzynarodowego powoduje podejmowanie szeregu działa majcych na celu skuteczniejsze rozwizywanie problemów w zakresie prowadzenia działalnoci gospodarczej, w wyniku której powstaj odpady. Dyrektywa 2006/21/WE z dnia 15 marca 2006 r. w sprawie gospodarowania odpadami pochodzcymi z przemysłu wydobywczego wprowadziła wspóln dla wszystkich pastw członkowskich UE normy, majce na celu zapobieganie lub zredukowanie negatywnych skutków wynikajcych z gospodarki odpadami. Ustawa z dnia 10 lipca 2008 r. o odpadach wydobywczych jest transpozycj ww. dyrektywy do prawodawstwa polskiego. Przy opracowaniu tej ustawy starano si wkomponowa nowe przepisy do obowizujcego ju systemu prawnego w dziedzinie ochrony rodowiska (ustawa z dnia 27 kwietnia 2001 r. Prawo ochrony rodowiska, ustawa z dnia 27 kwietnia 2001 o odpadach, ustawa z dnia 4 lutego 1994 r. Prawo geologiczne i górnicze). Jednym z najwaniejszych instrumentów prawnych wprowadzonych przez te ustawy jest program gospodarowania odpadami, pozwalajcy organowi administracji oceni, czy podmiot go przedkładajcy zachował hierarchi postpowania z odpadami. Polega ona na deniu do ograniczenia i zminimalizowania negatywnego oddziaływania odpadu na rodowisko, zapewnia w pierwszej kolejnoci odzysk odpadów, a jeeli z przyczyn technologicznych jest on niemoliwy, lub nie jest uzasadniony z przyczyn ekonomicznych, do ich bezpiecznego unieszkodliwienia [Dulewski et al., 2008]. Wymagania prawne dotyczce ochrony rodowiska, wane w szczególnoci dla przemysłu naftowego i gazowniczego, ujto w nastpujcych dyrektywach i rozporzdzeniach: Dyrektywa Parlamentu Europejskiego i Rady w sprawie zapobiegania szkodom rodowiskowym i naprawy tych szkód (2004/35/WE), której przepisy przetransponowane zostały w Polsce do prawa krajowego przez Ustaw z dnia 13 kwietnia 2007 r. o zapobieganiu szkodom w rodowisku i ich naprawie, Decyzja Rady 2003/33/WE ustanawiajca kryteria i procedury przyjcia odpadów na składowiska, transponowana do prawa polskiego przez Rozporzdzenie Ministra Gospodarki i Pracy z dnia 7 wrzenia 2005 r. w sprawie kryteriów oraz procedur dopuszczenia odpadów do składowania na składowisku danego typu (Dz.U. Nr 186, poz. 1553), 38

36 Rozporzdzenie Ministra rodowiska z dnia 27 wrzenia 2001 r. w sprawie katalogu odpadów (Dz.U. Nr 112, poz. 1206), Rozporzdzenie Ministra rodowiska z dnia 9 wrzenia 2002 r. w sprawie standardów jakoci gleby oraz standardów jakoci ziemi (Dz.U. Nr 165, poz. 1359), Rozporzdzenie Ministra rodowiska z dnia 21 marca 2006 r. w sprawie odzysku lub unieszkodliwiania odpadów poza instalacjami i urzdzeniami (Dz.U. Nr 49, poz. 356). W wietle powyszych ustaw i rozporzdze w gospodarce odpadami wiertniczymi, minimalizacja iloci i obnienie stopnia szkodliwoci odpadów powstajcych podczas prowadzonych wierce poszukiwawczych, s działaniami priorytetowymi, które realizowane s poprzez: efektywne operacje oczyszczania płuczki wiertniczej, oszczdn gospodark płuczk, oszczdn gospodark wod, odrbne składowanie odpadów o rónym stopniu szkodliwoci. Oczyszczanie płuczki, przy uyciu wysokosprawnych sit wibracyjnych, linearnych i pitrowych, odpiaszczaczy, odmulaczy, wirówek, degazatorów, hydrocyklonów, stacji flokulacyjnych umoliwia powtórne jej wykorzystanie, zarówno do wiercenia kolejnego otworu, jak i zastosowanie jej jako osnowy do sporzdzania nowej płuczki wiertniczej. Takie działania, które w praktyce wiertniczej najczciej prowadzone s z płuczkami bentonitowymi, sprzyjaj oszczdnej gospodarce płuczk oraz stosowanymi rodkami. Bardzo due znaczenie dla minimalizacji iloci odpadów wiertniczych ma zasada ich segregacji, szczególnie odpadów powstałych podczas wiercenia płuczk o rónym stopniu zasolenia zawierajc polimery organiczne. Powstałe odpady s, gromadzone na terenie wiertni w szczelnych zbiornikach metalowych, które nastpnie po zakoczeniu wiercenia otworu, lub sukcesywnie w miar zapełniania zbiorników, poddawane s procesowi odzysku lub unieszkodliwiania. Materiały obecnie uywane do sporzdzania płuczek i regulacji jej właciwoci s dobrane w taki sposób, by spełniały swoje funkcje technologiczne i jednoczenie charakteryzowały si moliwie mał szkodliwoci dla rodowiska. Współczenie wytwarzane odpady wiertnicze pochodzce z wierce obrotowopłuczkowych, sklasyfikowano w grupie 01 Odpady powstajce przy poszukiwaniu i wydobywaniu kopalin w podgrupie płuczki wiertnicze i inne odpady wiertnicze i posiadaj one nastpujce oznaczenia (wg Dz.U. 112, poz. 1206): 39

37 Płuczki i inne odpady wiertnicze z odwiertów wody słodkiej, * Płuczki i odpady wiertnicze zawierajce rop naftow, * Płuczki i odpady wiertnicze zawierajce substancje niebezpieczne, Płuczki wiertnicze zawierajce baryt i odpady inne ni wymienione w * i *, Płuczki wiertnicze zawierajce chlorki i nie zawierajce odpadów wymienionych w * i *, Inne niewymienione odpady np. urobek skalny. Odpady o kodzie * i *, zaliczane do odpadów niebezpiecznych, nale- y likwidowa z wykorzystaniem technologii termicznego unieszkodliwiania, poprzez spalenie w piecach obrotowych z dopaleniem spalin w termoreaktorze. Technologia ta jest stosowana przez firm RAF-EKOLOGIA w Jedliczu oraz EKO-TOP w Rzeszowie. Obecnie płuczki sporzdza si na bazie wodnej, a zawarte w nich zanieczyszczenia ropopochodne pochodz z przewierconych warstw ropononych lub oleju mineralnego, dodawanego w celu uwolnienia przechwyconego w odwiercie przewodu wiertniczego i zgodnie z katalogiem odpadów s zaliczane do odpadów niebezpiecznych. Płuczki wiertnicze wystpujce wyłcznie w fazie ciekłej nie spełniaj podstawowego kryterium składowania wynikajcego z art. 55 ust. 1 ustawy o odpadach, który zakazuje składowania odpadów wystpujcych w postaci ciekłej, w tym odpadów zawierajcych wod w iloci 95% masy całkowitej. Odzysk odpadów wiertniczych w Polsce południowej odbywa si w Tarnogrodzie, gdzie wykorzystuje si wyrobisko, bdce pozostałoci po eksploatowanym w latach 60-tych XX w. złou glinki ceramicznej. Metoda odzysku (recyklingu) odpadu wiertniczego obejmuje jego przetwarzanie w procesie produkcyjnym, składajcym si z nastpujcych etapów [Macnar et al., 2008]: a) tymczasowe magazynowanie odpadów wiertniczych (oddzielenie urobku skalnego i zuytych płuczek), b) zestalenie urobku skalnego przy uyciu rodków wicych (cementu portlandzkiego, tlenku wapnia i dodatku zestalajcego w postaci szkła wodnego potasowego), c) odwodnienie odpadów (zuytych płuczek wiertniczych) w procesie koagulacji polichlorkiem glinu i filtracji w prasie filtracyjnej, zainstalowanej w przewonej stacji odwadniania, d) przemieszczenie uzyskanego wypełnienia mineralnego do miejsca docelowego zagospodarowania (rekultywacja wyrobiska glinki ceramicznej), 40

38 e) przemieszczenie cieków (filtratu i wód ze stacji odwadniania) do miejsca docelowej utylizacji (komunalna oczyszczalnia cieków). Składowanie odpadów wiertniczych obojtnych i innych ni niebezpieczne i obojtne, w Polsce południowo-wschodniej prowadzona jest na składowisku we Wronowie i Bukowcu. Skład stałych odpadów wiertniczych stanowi urobek z przewierconych pokładów skalnych, tj. margle, piaski, gliny, iły, anhydryty, dolomity. Skład płuczek natomiast jest znacznie bardziej zrónicowany i obejmuje zarówno składniki naturalne, jak i dodatki sztuczne uywane w procesie technologicznym wiercenia (m.in. bentonit, skrobia, pochodne celulozy, chlorek sodu, chlorek potasu, siarczan baru, polimery organiczne, materiały chemiczne do regulacji odczynu płuczki itp.). Ponadto składowisko we Wronowie posiada zezwolenie na składowanie substancji ropopochodnych o kodzie Składowisko we Wronowie powstało w 1997 r. i składa si z szeciu kwater składowania odpadów wiertniczych stałych i płynnych, o łcznej pojemnoci m 3. Monitoring rodowiska w otoczeniu składowiska prowadzony jest poprzez badania wód gruntowych z 3 piezometrów o głbokoci 6 m. Składowisko w Bukowcu posiada trzy uszczelnione foli HDPE zbiorniki o łcznej pojemnoci 31 tys. m 3, w których gromadzony jest urobek i zuyta płuczka. Obecnie cz składowiska jest w trakcie rekultywacji i zamykania [Baran et al., 1999]. Do innych metod likwidacji odpadów wiertniczych zalicza si technologie detoksykacyjne, np. prowadzone na dole urobkowym Husów. Procedura polega na transformacji osadu w wielowarstwow struktur detoksykacyjn, do której wprowadzono substancje katalizujce proces degradacji zwizków wglowodorowych. Wstpna faza tych katalitycznych i biochemicznych reakcji transformuje zwizki wglowodorowe w czciowo polarne substancje, które łcz si nastpnie z dozowanymi aktywatorami, umoliwiajcymi migracj wytworzonych kompleksów do warstwy powierzchniowej struktury detoksykacyjnej. Na powierzchni tak przygotowanej struktury nastpuje kontynuacja wczeniej rozpocztych procesów, wspomaganych przez reakcje fotochemiczne [Fijał et al., 2002]. Pomimo, e z kocem lat dziewidziesitych XX w. rozpoczto wiercenia bez dołów urobkowych, znacznie ograniczono iloci i szkodliwoci odpadów wiertniczych oraz zastosowano zaawansowane systemy oczyszczania płuczek, kwestii likwidacji odpadów wiertniczych cigle nie mona uzna za wystarczajco rozwizanej. Due głbokoci wierce (zwykle powyej 2000 m) oraz warunki geologiczne powoduj, e płuczki wiertnicze zawieraj w znacznych ilociach komponenty rozpuszczalnych składników organicznych, a w przypad- 41

39 ku wierce interwałów soli cechsztyskich musz by zasolone nawet do poziomu bliskiego nasyceniu. W rezultacie zawarto w odpadach wiertniczych wgla organicznego oraz jonów chlorkowych i substancji rozpuszczonych jest wysoka, co stwarza bariery w likwidacji tych odpadów. Ponadto odpady stanowice odwodnione płuczki wiertnicze obcione s barytem (zawarto baru przekracza 3000 mg/kg s.m.) i nie mona ich wykorzystywa do rekultywacji gruntów, jak równie składowa na składowiskach, ze wzgldu na przekroczenie zawartoci wskanika DOC (rozpuszczony wgiel organiczny). W Stanach Zjednoczonych zagadnienie odpadów powierniczych jest regulowane przez agencje stanowe i federalne. Regulacje te skupiaj si pozwoleniach na doły urobkowe, wyborem miejsc zrzutu, kontrol oraz ograniczeniem niektórych metod składowania czy te zrzutu pewnych rodzajów płuczek. W niektórych stanach wymagane s projekty poprzedzajce wiercenia włcznie z programem ochrony rodowiska. Szereg stanów na podstawie rozporzdze opublikowało graniczne zawartoci soli, metali cikich, i zanieczyszcze ropopochodnych w dołach urobkowych. Moliwoci zrzutu i/lub obróbki s ograniczone w tych stanach rezultatem chemicznych analiz zawartoci dołów urobkowych. Z tych powodów naley połoy główny nacisk na wstpny projekt systemu płuczkowego, z podkreleniem reperkusji zwizanych z ochron rodowiska naturalnego [Sadiq et al., 2003]. Liczne doły urobkowe zawierajce odpady, wytworzone podczas zakoczonych kilkadziesit lat temu wierce, s zlokalizowane w lasach województwa podkarpackiego (137 dołów urobkowych), a take w województwie małopolskim (75 dołów urobkowych) i stanowi uciliw pozostało po pracach wiertniczych, któr naley w moliwie jak najkrótszym czasie zlikwidowa [Steczko et al., 2008]. Złoe ropy naftowej Grabownica naley do najstarszych złó ropy odkrytych w polskiej czci Karpat Fliszowych. Składa si ono z kilku osobnych bloków tektonicznych, które z kierunku od wschodu na zachód oznaczone s jako: Wanda, Gaten, Graby, Genpeg. Prace wiertnicze na tym złou zapocztkowano pod koniec XIX wieku. Pierwsze prace poszukiwawcze przypadaj na rok 1921 (Graby-3, Gaten-1, Gaten-6). Ostatnie wiercenie rozpoczto w latach siedemdziesitych XX w. (Wanda r. i Wanda r.). Zgodnie z zachowan dokumentacj w latach (przed wybuchem II wojny wiatowej) rozpoczto 8 wierce na bloku Graby i Gaten. W okresie trwania wojny ( ) kontynu- 42

40 owano prace poszukiwawcze i rozpoczto 17 wierce w przewaajcej iloci na bloku Graby. W okresie powojennym ( ) zanotowano 21 wierce, a w nastpnym okresie obejmujcym lata , 23 wiercenia. Na pocztku lat szedziesitych XX w. rozpoczto 3 wiercenia na bloku Wanda. Naley zaznaczy, e nie została zachowana cała dokumentacja, dotyczca wszystkich wierce wykonywanych na złou Grabownica. Najwiksze wydobycie ropy w całej historii eksploatacji złoa, 43 tys. t uzyskano w 1951 r. ze 136 odwiertów produkcyjnych. Jak wynika z danych archiwalnych, pocztkowa głboko wiercenia wahała si w granicach od 400 do 600 m ppt. Wiercenia prowadzono metod udarow (erdziow lub linow). W kilkunastu przypadkach dokonano pogłbienia otworu do 800, a nawet do 1000 m ppt (np. Graby-55). Pogłbienia dokonywano metod obrotow stosujc w 5 odwiertach płuczki (Graby-55 płuczka iłowa, Graby-62 płuczka iłowa, Graby-95 płuczka bentonitowa, Gaten-45 płuczka iłowa, Gaten-48 płuczka iłowa). Z przedstawionych danych historycznych mona sdzi, e w dołach urobkowych znajduje si urobek skalny (gleba i ziemia) wymieszany z rop naftow, gdy w ówczenie stosowanej technologii wiercenie nie stosowano płuczek wiertniczych. W odnotowanych przypadkach zastosowane do pogłbiania otworu płuczki iłowych były sporzdzane na bazie materiału ilastego, zazwyczaj iłu bentonitowego, który zmieszany z wod tworzył układ koloidalny o odpowiednim ciarze właciwym, lepkoci, filtracji, własnociach strukturalnych i stabilnoci. Odwierty pogłbiano do głbokoci m ppt, co nie wymagało modyfikacji płuczki poprzez zastosowanie preparatów chemicznych, charakteryzujcych si znaczn szkodliwoci, np. rodków skrobiowych, polimerów celulozowych, zwizków organicznych, detergentów, materiałów obciajcych płuczki itp. Jedynym stosowanym dodatkiem pozwalajcym na regulacj ph był wodorotlenek sodu. Zgromadzone w dołach urobkowych odpady z wierce, prowadzonych celem pogłbienia otworów, powinny zawiera głównie urobek skalny, materiały ilaste (bentonit) oraz rop naftow z nawierconych warstw ropononych. Z tego wzgldu odpady te mona wstpnie zakwalifikowa jako gleba i ziemia zanieczyszczona substancjami ropopochodnymi, o kodzie ex *. W celu potwierdzenia tej klasyfikacji naley przeprowadzi odpowiednie badania fizyko-chemiczne, indywidualnie dla odpadu zgromadzonego w kadym dole urobkowym. W odpadach zgromadzonych w składowisku (dole urobkowym) przez kilkadziesit lat zachodziły róne reakcje chemiczne oraz procesy fizyczne, w tym procesy rozdziału faz, ale 43

41 dyfuzja zanieczyszcze w kierunku poziomym i pionowym jest bardzo wolna i nie dochodzi do wyrównywania ste. Z tego wzgldu due znaczenie dla charakterystyki rozkładu zanieczyszcze na poszczególnych dołach urobkowych bd miały badania reprezentatywnych prób składowanego materiału. Niezlikwidowane doły urobkowe czsto s słabo widoczne w terenie lenym, jeeli korony wałów s niskie, powierzchni pokrywa warstwa humusu, igliwia i lici, a dodatkowo jest ona zaronita traw i krzewami. Powierzchnia tych dołów jest niestabilna, miejscami pka i pojawia si wyciek wody ze ladami ropy. Niestabilno mechaniczna warstwy odpadu i ewentualna utrata elowej struktury koloidalnej w wyniku zjawiska tiksotropii, mog spowodowa zagroenie dla ludzi i wikszych zwierzt lenych. Uszczelnienia iłowe tych dołów w wikszoci przypadków skutecznie do tej pory powstrzymywały rozprzestrzenianie si zanieczyszcze w rodowisku, nie mona jednak uwaa, e bd spełniały to zadanie w przyszłoci. Naley spodziewa si moliwoci wystpowania skae wód podziemnych, gdy długotrwałe oddziaływanie składników ropy naftowej, wysychanie iłu, bd mechaniczne naruszenie struktury uszczelnienia moe spowodowa wzrost przepuszczalnoci warstwy izolujcej. Teren leny, na którym znajduj si niezlikwidowane doły urobkowe, jest zdegradowany i wskazane jest przywrócenie go do stanu naturalnego poprzez likwidacj dołów urobkowych, które pełni tylko funkcj składowisk odpadów nieulegajcych samoczynnej neutralizacji i wymagaj prowadzenia stałego nadzoru. Na fotografii 3.1 przedstawiono obraz wybranych dołów urobkowych przed rozpoczciem ich likwidacji. Jednym z istotnych obowizków zwizanych z usuwaniem niekorzystnego przekształcenia rodowiska w wyniku wydobywania kopalin uytecznych jest poprawne przygotowanie i wykonanie rekultywacji terenu po działalnoci górniczej. Kwesti odpowiedzialnoci za zaistniałe szkody reguluje wspomniana Dyrektywa nr 2004/35/WE i Ustawa z dnia 13 kwietnia 2007 r. o zapobieganiu szkodom w rodowisku i ich naprawie. Jednake przepisy obowizujcej ustawy nie dotycz co prawda starych szkód rodowiskowych powstałych przed wicej ni 30 laty, za które odpowiedzialno trudno przypisa obecnie istniejcym podmiotom, ale nie 44

42 GRABY-10 GRABY-67 GRABY-12 GRABY-95 GRABY-40 GRABY-13 Fot Tereny wybranych dołów urobkowych przed przystpieniem do prac rekultywacyjnych Pict Areas of selected waste pits before recultivation 45

43 oznacza to przyzwolenia na zaniechanie ich likwidacji. Przepisy przejciowe tej Ustawy stanowi, e w przypadku szkód dotyczcych powierzchni ziemi powstałych przed 30 kwietnia 2007 r. naley stosowa si do wymaga zawartych w Ustawie Prawo Ochrony rodowiska w ich dotychczasowym brzmieniu. Mówi one o koniecznoci przywrócenia zanieczyszczonej powierzchni gleby i ziemi (poprzez rekultywacj) do stanu, w którym dotrzymane zostan standardy jakoci okrelone w Rozporzdzeniu Ministra rodowiska z dnia 9 wrzenia 2002 r. w sprawie standardów jakoci gleby i ziemi. Obowizek rekultywacji wynika z mocy prawa (Ustawa z dnia 27 kwietnia 2001 r. Prawo Ochrony rodowiska, Dz.U. Nr 62, poz. 627, Dział XIV, Art i 103.2), a wic wydanie decyzji administracyjnie obligujcej do jej przeprowadzenia nie jest konieczne, natomiast warunki rekultywacji musz by uzgodnione i decyzja dotyczca ich uzgodnienia musi by wydana. Poprawne przygotowanie i wykonanie rekultywacji wymaga uwzgldnienia przepisów ochrony rodowiska w zakresie rekultywacji gruntów, ale równie przepisów innych ustaw. Rekultywacj starych dołów urobkowych na terenie kopalni Grabownica rozpoczto sporzdzajc projekt rekultywacyjny, na podstawie którego uzyskano decyzj wydan przez starost, ustalajc kierunek rekultywacji danego dołu urobkowego. W zwizku z Rozporzdzeniem Ministra rodowiska z dnia 21 marca 2006 r. (Dz.U. Nr 49, poz. 356) w sprawie odzysku i unieszkodliwiania odpadów poza instalacjami i urzdzeniami, poczyniono starania o uzyskanie decyzji zezwalajcej na prowadzenie działalnoci w zakresie unieszkodliwiania odpadów na danym obiekcie (dole urobkowym) metod in-situ. Dopuszczaln metod jest proces unieszkodliwienia D2 Obróbka gleby i ziemi (np. biodegradacja odpadów płynnych i szlamów w glebie i ziemi), okrelony w załczniku Nr 6 ustawy o odpadach z dnia 27 kwietnia 2001 r. (Dz.U. Nr 62 z 2001 r., poz. 628 z póniejszymi zmianami). W celu uzyskania powyszej decyzji, indywidualnie dla kadego rekultywowanego dołu urobkowego, przeprowadzono konsultacje z pracownikami Starostwa Powiatowego, uwzgldniono wymagania Departamentu rodowiska, zapisy Ustawy z dnia 27 kwietnia 2001 r. o odpadach (Dz.U. Nr 62, poz. 628 z pón. zmian.), Rozporzdzenie Ministra rodowiska w sprawie katalogu odpadów (Dz.U. Nr 112, poz 1206) oraz Rozporzdzenie Ministra rodowiska z dnia 21 marca 2006 r. w sprawie odzysku lub unieszkodliwiania odpadów poza instalacjami i urzdzeniami (Dz.U. Nr 49, poz 356 z 2006 r.), co pozwoliło na ustalenie formy wniosku zawierajcego wszystkie wymagane informacje [Steliga et al., 2007c]: 46

44 charakterystyk odpadów z danego dołu urobkowego przewidzianych do unieszkodliwienia, obejmujc przedstawienie danych archiwalnych, dotyczcych sposobu wiercenia i powstania dołu urobkowego, analizy chemiczne, mineralogiczne, mikrobiologiczne oraz toksykologiczne, które stanowi podstaw do stwierdzenia, e odpad mona zaklasyfikowa do grupy odpadów o kodzie ex * gleba i ziemia zanieczyszczona substancjami ropopochodnymi, okrelenie iloci odpadu, wskazanie miejsca i sposobu magazynowania, oznaczenie miejsca prowadzenia działa w zakresie unieszkodliwiania odpadów, szczegółowy opis stosowanych metod unieszkodliwiania odpadów wraz z okreleniem ich efektywnoci na podstawie bada przeprowadzonych w skali półtechnicznej (metod ex-situ), charakterystyk biopreparatu wraz z okreleniem efektywnoci jego działania w warunkach półtechnicznych i szkodliwoci dla ludzi i rodowiska naturalnego, przedstawienie moliwoci technicznych i organizacyjnych w zakresie unieszkodliwiania odpadów, dokumenty potwierdzajce tytuł prawny do terenu, na którym maj by prowadzone działania w zakresie unieszkodliwiania odpadów, dokumentacj hydrogeologiczn dołu urobkowego oraz projekt prac geologicznych w celu okrelenia warunków hydrogeologicznych dla projektowanej inwestycji, polegajcej na unieszkodliwianiu odpadów ropopochodnych metod in-situ, mogcej mie wpływ na jako wód podziemnych na terenie obszaru górniczego. Projekt prac geologicznych opracowany w zwizku z art. 32 ust. 1 Ustawy z dnia 4 lutego 1994 r. Prawo geologiczne i górnicze (tekst jednolity Dz.U. Nr 228, poz 1947 z 2005 r. z pón. zmian.), umoliwił wykonanie prac geologiczno-inynierskich w celu wykonania odwiertów badawczych i zamontowania piezometrów, co pozwala na okrelenie tła geochemicznego i hydrochemicznego. Po spełnieniu powyszych wymaga uzyskano decyzje zezwalajce Instytutowi Nafty i Gazu na prowadzenie działalnoci w zakresie odzysku i unieszkodliwiania odpadów metod insitu. Zostały one wydane indywidualnie dla kadego rekultywowanego dołu urobkowego (Genpeg-44, Graby-12, Graby-67, Graby-10, Graby-13, Graby-40, Graby-95, Graby-18, Graby-19). Warto zaznaczy, e s to pierwsze i do chwili obecnej jedyne decyzje w tym zakresie, wydane przez organy administracji pastwowej i spełniajce wszystkie wymogi formalno-prawne. 47

45 Schemat czynnoci koniecznych do uzyskania decyzji, zezwalajcej na odzysk i unieszkodliwianie gleby i ziemi zanieczyszczonej substancjami ropopochodnymi, uwzgldniono w schemacie postpowania administracyjnego przy rekultywacji starego dołu urobkowego (rys. 3.4). Krok I Decyzja właciwego organu administracji (starosty) ustalajca kierunek rekultywacji terenu dołu urobkowego Krok II Wykonanie projektu prac geologicznych Opracowanie dokumentacji hydrogeologicznej terenu przeznaczonego do rekultywacji Wykonanie prac terenowych (odwiercenie otworów badawczych) Krok III Opracowanie wniosku o zezwolenie na oczyszczanie odpadu na terenie dołu urobkowego metod in-situ Wykonanie analiz i bada laboratoryjnych oczyszczania odpadu wg opracowanej technologii Krok IV Wydanie decyzji zezwalajcej na odzysk i unieszkodliwianie odpadów na terenie dołu urobkowego metod in-situ (po ewentualnym zaopiniowaniu przez burmistrza) Krok V Opracowanie wniosku o uznanie rekultywacji terenu dołu urobkowego za zakoczon Krok VI Komisyjny odbiór prac rekultywacyjnych Krok VII Zaopiniowanie wykonanych prac oraz stanu oczyszczanego terenu przez właciwe organy administracji: urzd górniczy, nadlenictwo, burmistrza itp. Krok VIII Wydanie przez właciwy organ administracji (starostwo) decyzji o zakoczeniu rekultywacji oczyszczanego terenu Rys Schemat postpowania administracyjnego przy rekultywacji terenu starego dołu urobkowego Fig Administrative steps during recultivation of weathered waste pit 48

46 Polskie regulacje prawne w zakresie oczyszczania (rekultywacji) gruntów zaolejonych s ogólnikowe. Brakuje normatywów technicznych i obowizujcych procedur dokumentowania stanu zanieczyszczenia, projektowania i prowadzenia rekultywacji rodowiska gruntowo-wodnego oraz kontroli wykonawstwa i efektywnoci oczyszczania [Siuta, 2003]. Po zakoczeniu rekultywacji danego obiektu, działajc na podstawie art. 22 ust. 1 pkt 4 Ustawy z dnia 3 lutego 1995 r. o ochronie gruntów rolnych i lenych (Dz.U. Nr 16, poz. 78 z dnia 22 lutego 1995 r.) zwrócono si do Starostwa (Wydział Geodezji Kartografii Katastru i Nieruchomoci oraz Wydziału rodowiska i Rolnictwa) z pismem o wydanie decyzji, uznajcej za zakoczon rekultywacj czci działki, na której zlokalizowany był dół urobkowy. W załczeniu przekazywano opracowanie przebiegu prac rekultywacyjnych na dole urobkowym i wyniki kontroli ich efektywnoci. Starostwo ustaliło komisyjny odbiór prac rekultywacyjnych przy udziale przedstawicieli: PGNiG Oddział w Sanoku, Burmistrza Brzozowa, Okrgowego Urzdu Górniczego w Kronie oraz Dyrekcji Regionalnej Lasów Pastwowych w Kronie. Po pozytywnym zaopiniowaniu przez powysze organa wykonan rekultywacj terenu dołu urobkowego uznano za zakoczon. Starosta, w oparciu o Ustaw o ochronie gruntów rolnych i lenych i Rozporzdzenie Ministra rodowiska z dnia 9 wrze- nia 2002 r. w sprawie standardów jakoci gleby i ziemi (Dz.U. Nr 165, poz. 1359), wydał decyzj o zakoczeniu rekultywacji i przekazaniu terenu dołu urobkowego na uytek leny. Do chwili obecnej decyzje o zakoczeniu rekultywacji uzyskano dla 7 obiektów (dołów urobkowych), oczyszczonych według opracowanej w INiG etapowej technologii opartej na biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych prowadzonej metod in-situ, za pozostałe obiekty s w kocowej fazie rekultywacji. 49

47 Pracom poszukiwawczym w górnictwie nafty i gazu towarzyszy nieuchronnie konieczno gromadzenia i zagospodarowania znacznych iloci materiałów odpadowych, które w latach były składowane w dołach urobkowych. Rekultywacja terenów zestarzałych dołów urobkowych zdegradowanych przez skaenia substancjami ropopochodnymi, naley do kluczowych problemów ekologicznych, jakie staj przed bran naftow w Polsce. Na dołach urobkowych z tego okresu prowadzono wstpne zabiegi zmierzajce do ich likwidacji poprzez zmieszanie odpadu wiertniczego z ziemi lub torfem. Pod wzgldem chemicznym odpady te stanowi zrónicowane, wieloskładnikowe układy, które podczas deponowania i prowadzenia procesów oczyszczania uległy zmianom. Istotnym parametrem okre- lajcym zachodzce zmiany w składowanych odpadach jest obecno zanieczyszcze ropopochodnych, które starzej si wskutek przebiegu wielu procesów, m.in. odparowania, rozpuszczania, transportu substancji rozpuszczalnych w wodzie, biodegradacji [Qudot et al., 1989; Chaîneau et al., 1995]. Pierwszy kontakt z gruntem obnia podatno zanieczyszcze ropopochodnych na desorpcj, parowanie, biodegradacj i/lub ekstrakcj, obniajc skuteczno remediacji. Zanieczyszczenia ropopochodne zniekształcaj fizyczne, chemiczne i biologiczne własnoci gleb, gdy nastpuje [Siuta, 2001]: drastyczna zmiana w iloci i składzie chemicznym substancji organicznych, obnienie pojemnoci wodnej gleby i utrudnienie wymiany powietrznej na skutek zapełnienia porów, przy równoczesnym gwałtownym wzrocie zapotrzebowania na tlen, bardzo dua przewaga wgla organicznego nad zawartoci azotu i fosforu, powodujca ostry niedobór tych składników dla mikroorganizmów glebowych i rolin, daleko idce zniekształcenie mikroflory gleby, zaburzenia własnoci koloidów glebowych, w tym wymiany jonowej i odczynu gleby (wtórne zakwaszenie gleby). 50

48 Wglowodory ropopochodne w gruncie mog wystpowa w kilku podstawowych fazach (rys. 4.1) [Surygała et al., 2000; Malina et al., 1994; Van Eyk, 1997]: faza stała (asfalty, bituminy, ywice, woski naftowe), faza ciekła (wolny produkt naftowy), faza wodna (rozpuszczone w wodzie lub zdyspergowane jako emulsja olejowo-wodna), faza parowa. faza parowa faza stała ciekły film roztwór wodny w porach film wodny ciecz w porach powietrze ciecz pomidzy ziarnami ziarno gruntu film roztworu wodnego Rys Stan fizyczny zanieczyszcze ropopochodnych w gruncie Fig Physical type of petroleum pollutants appearance in soil Lyman [Lyman et al., 1982] stwierdził, e ciekłe wglowodory ropopochodne bezpo- rednio po rozlewie mog wystpowa w 13 fazach, jednak dla uproszczenia przyjmuje si, e w strefie aeracji wystpuj w trzech formach: jako niemobilne ciecze rezydualne, w formie parowej i rozpuszczone w wodzie. Udział poszczególnych form zaleny jest od własnoci zanieczyszczenia oraz od warunków hydrogeologicznych, a take od migracji zanieczyszcze w porach i szczelinach skalnych, z uwzgldnieniem wystpujcych podczas tego procesu zjawisk fizykochemicznych pomidzy fazami ciekłymi oraz faz stał i ciekł. Na ich transport i transformacj wpływaj m.in. rozpuszczalno, prno par, sorpcja, zdolno do utleniania, wymiany jonowej rozkładu fotochemicznego, a przede wszystkim podatno na biodegradacj. O parowaniu zanieczyszcze ropopochodnych decyduje prno par, która jest wysoka dla lekkich i lotnych frakcji alifatycznych (heksan, heptan) oraz aromatycznych (benzen, toluen). Wglowodory o słabym powinowactwie wzgldem orodka lub wystpujce w orodku o niskiej zdolnoci sorpcyjnej mog by wymywane, zanieczyszczajc warstw wodonon. 51

49 Szczególnie niebezpieczne s BTEX, gdy s relatywnie dobrze rozpuszczalne w wodzie w stosunku do pozostałych, mog przedostawa si do wód podziemnych i migrowa wraz z nimi. Natomiast cisze frakcje (powyej 10 atomów wgla) mog podlega bardzo wolnej migracji z uwagi na siln sorpcj, zwłaszcza w duej pojemnoci sorpcyjnej orodka [Malina, 2007]. Obecnie coraz czciej prowadzi si badania nad przyspieszeniem biodegradacji wglowodorów ropopochodnych na drodze procesów biotechnologicznych przy wykorzystaniu efektywnych kultur bakteryjnych uprzednio wyizolowanych z silnie skaonych rodowisk. Z uwagi na stosunkowo niskie koszty oraz wysok skuteczno, metody biologiczne znajduj praktyczne zastosowanie na skal techniczn [Farbiszewska et al., 1996; Swannell et al., 1996; Lazar et al., 1999; Matthew et al., 1999; Mishra et al., 2001; Saponaro et al., 2002; Katsivela et al., 2003; Evans, et al., 2004; Steliga, 2008a]. Zdolno mikroorganizmów do adaptacji zanieczyszcze odgrywa szczególnie istotn rol w rozkładzie ksenobiotyków. Na poziomie molekularnym adaptacja jest tłumaczona genetyczn zmiennoci mikroorganizmów (wynikajc np. z zachodzenia mutacji spontanicznych, obecnoci elementów genetycznych), a nastpnie selekcj tych komórek, które nabyły zdolno wykorzystania ksenobiotyków jako ródła wgla i energii [Libudzisz et al., 2008]. Bossert i Bartha [1984] przedstawili list mikroorganizmów zdolnych do rozkładu wglowodorów, obejmujc 22 gatunki bakterii i 31 gatunków grzybów, która w miar rozwoju biologii molekularnej jest nieustannie rozszerzana. Do najaktywniejszych bakterii posiadajcych zdolno biodegradacji wglowodorów ropopochodnych (alifatycznych i aromatycznych) i najczciej opisywanych w literaturze nale bakterie zestawione w tabeli 4.1. Wikszo grzybów strzpkowych nie przeprowadza całkowitej mineralizacji zwizków ropopochodnych (wyjtkiem s grzyby ligninolityczne). Jednake organizmy te odgrywaj znaczc rol w usuwaniu wglowodorów poprzez wytwarzanie produktów porednich, czsto o zmniejszonej toksycznoci i zwikszonej podatnoci na rozkład z udziałem bakterii. Do grzybów strzpkowych biorcych udział w biodegradacji wglowodorów alifatycznych naley zaliczy Cladosporium i Aspergillus, natomiast przy rozkładzie wglowodorów aromatycznych mog uczestniczy grzyby nalece do rodzaju: Cunninghamella, Penicillium, Fusarium, Aspergillus. 52

50 Tabela 4.1. Zestawienie bakterii rozkładajcych poszczególne grupy wglowodorów ropopochodnych, na podstawie doniesie literaturowych Table 4.1. Comparison in bacteria degrading petroleum hydrocarbon groups based on literature Rodzaj skaenia Bakterie (rodzaj/gatunek) Literatura Alkany C 2 -C 8 TPH(alkany C 10 -C 36 ), oleje, asfalteny Wglowodory monoaromatyczne (BTEX) Fenol Wielopiercieniowe wglowodory aromatyczne (WWA) Mycobacterium sp., Pseudonocardia sp., Pseudomonas butanoora Rhodococcus erythropolis, Ralstonia eutropha, Micrococcus luteus,, Nocardioides albus, Collimonas sp, Pseudomonas putida, Pseudomonas citronellolis, Pseudomonas oleovorans, Mycobacterium sp., Rhodococcus sp. Strain Q15, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas veronii., Rhizobium daejeonense, Flavabacterium sp., Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Gordonia sp., Corynebacterium sp., Acinetobacter lwoffi, Mycobacterium friederiksbergense, Alcanivorax borkumensis Pseudomonas putida F1, Rhodococcus sp. Strain DK17., Acinetobacter sp., Bjerkandera sp. Rhodococcus erythropolis Mycobacterium anbaalenii, Nocardioides sp., Sphingomonas sp., Mycobacterium friederiksbergense, Mycobacterium flavescens, Nocardia asteroides, Sphingomonas paucimobilis, Pseudomonas fluorescens, Sphingomonas yanoikuyae, Pseudomonas putida, Flavobacterium sp., Bacillus thermoleovorans, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas stutzeri, Flavobacterium sp., Achromobacter sp., Erytrobacter longus, Alcaligenes sp., Stappia sp., Pusillimonas sp. Burkholderia cepacia, Bacillus circulans, Azospirillum sp., Brevundimonas sp., Agrobacterium sp., Xanthomonas sp. Kotani et al., 2006; Kurth et al., 2008 Hamamura et al., 2006; Churchill et al., 1999; Abalos et al., 2004; Whyte et al., 1999; Lalucat et al., 2006; Popp et al., 2006; Kaplan et al., 2004; Mishra et al., 2001; Al- Hadhrami et al., 1997; Wattiau, 2002; Rling et al., 2004; Bhattacharya et al., 2003; Sabirova et al., 2006 Reardon et al., 2000; Choi et al., 2007; Debb et al., 1999; Chang et al., 1993; Kim et al., 2004; Kutturi et al.,1991 Kweon et al., 2007; Johnsen et al., 2002, Kim et al., 2006; Kim et al., 2007a; Johnsen et al., 2007; Shuttleworth et al., 2000; Chang et al., 1993; Chadhain et al., 2006; Zylstra et al., 1997; Kanaly et al., 2000; Cernigilia, 1992; Moody et al., 2001; Uyttebroek et al., 2007; Van Hamme et al., 2003;; Viñas et al., 2005; Wattiau, 2002; Yang et al., 1994; Juhasz et al., 2000, Saito et al., 2000, Rehmann et al., 2001 Grzyby ligninolityczne (np. Phanerochaete chrysosporium, Pleurotus ostreatus) wytwarzaj zewntrzkomórkowe enzymy, np. peroksydaz ligninow, biorce udział w rozkładzie lignin ciany komórkowej rolin oraz utlenianiu rónych ksenobiotyków. Drobnoustroje te przekształcaj WWA do pochodnych chinonowych, a w kolejnych etapach nastpuje rozszczepienie piercienia aromatycznego chinonów i całkowita mineralizacja [Libudzisz et al., 2008]. W literaturze przedstawiono szereg bada procesów biodegradacyjnych BTEX i WWA z wykorzystaniem grzybów. Prenafeta-Boldu i jego współpracownicy [2001; 2002] prowadzili badania nad wykorzystaniem grzyba Cladophialophoria sp. do mineralizacji wglowodorów monoaromatycznych (BTEX), które wykazały, e rozkład taki przebiega z wysz dynamik dla toluenu, etylobenzenu i m-ksylenu ni dla benzenu. Dopiero wprowadzenie bakterii rodzaju Rhodococcus sp. znacznie przyspieszyło przebieg procesu mineralizacji benzenu. Metaboliczne profile i inhibitory wzajemnego współdziałania natury wskazuj, e toluen, etylobenzen, m-ksylen zostały zdegradowane w bocznym łacuchu przez ten sam enzym monooxygenazy. 53

51 Biodegradacja WWA znacznie efektywniej przebiega po wzbogaceniu bakterii Pseudomonas putida o grzyby Pleurotus ostreatus i Irpex lacetus. Szczególnie widoczne jest zwikszenie biodegradacji dla 5 6 piercieniowych wglowodorów aromatycznych, gdzie zaobserwowano wzrost obnienia ich zawartoci o 16 19% [Yang et al., 1994; Cerniglia, 1997; Gramss, et al., 2000; Marquez-Rocha et al., 2001; Hestbjerg et al., 2003; Sašek et al., 2003]. Prowadzone były take badania procesu biodegradacji WWA biopreparatami sporzdzonymi na bazie bakterii autochtonicznych, wzbogaconych o gatunki grzybów Dichomitus squalens i Pleurotus ostreatus. Osignito zadowalajce efekty mineralizacji WWA, szczególnie widoczne dla 5 6 piercieniowych WWA, stosujc biopreparat na bazie bakterii autochtonicznych i powyszych grzybów [Lang et al., 1998; Canet et al., 2001; Wiesche et al., 2003; Steliga, 2008]. Do znanych grzybów posiadajcych zdolnoci biodegradacji zwizków aromatycznych (BTEX, WWA) naley zaliczy Phanerochaete chrysosporium [Bumpus, 1989; Yadav et al., 1993; Zheng et al., 2000; 2001; 2002]. Współdziałanie pomidzy grzybami a bakteriami jest korzystne dla przebiegu procesu mineralizacji wglowodorów ropopochodnych. Wymienione grzyby posiadaj metaboliczn zdolno biodegradacji BTEX i WWA, podobn w wielu aspektach do bakterii. Z tego wzgldu grzyby nie powinny zosta zignorowane w rozwoju skutecznych strategii bioremediacji. Połczenie technik molekularnych w badaniach rodowiskowych z technikami tradycyjnymi (metody hodowlane i mikroskopowe), pozwalaj nie tylko na zebranie informacji na temat rónorodnoci populacji mikroorganizmów, ich składu oraz identyfikacji dominujcych zespołów mikroorganizmów, ale równie na uchwycenie zmian w ich składzie ilociowym i jakociowym podczas biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych w rónych rodowiskach [Pearson et al., 2008]. Metody identyfikacji oparte na badaniu homologii kwasów nukleinowych nale do najnowoczeniejszych i staj si coraz bardziej powszechne. Sekwencja nukleotydów w łacuchu kwasu nukleinowego jest charakterystyczna dla danego gatunku organizmu, wic okre- lenie stopnia podobiestwa fragmentu DNA lub RNA badanego mikroorganizmu w odniesieniu do wzorca wiadomego pochodzenia, umoliwia identyfikacj [Libudzisz et al., 2007]. W analizie homologii DNA stosuje si technik PCR, polegajc na enzymatycznej amplifikacji (zwielokrotnieniu) in vitro sekwencji nukleotydów specyficznej dla danego organizmu. Łacuchowa reakcja polimerazy moe by stosowana do zwikszenia iloci DNA 54

52 identyfikowanego mikroorganizmu w konkurencyjnie krótkim czasie w stosunku do metod namnaania biomasy drobnoustrojów. Wyizolowany DNA identyfikowanego mikroorganizmu poddaje si działaniu enzymów restrykcyjnych, a nastpnie dokonuje si amplifikacji wybranej sekwencji za pomoc syntetycznych nukleodydów (primerów starterów reakcji). Wielokrotne powtarzanie procesu pozwala na otrzymanie wielu kopii DNA komplementarnych do fragmentu wyselekcjonowanego za pomoc primera i identyfikacj gatunku drobnoustroju. Do nowoczesnych technik biologii molekularnej nale: elektroforeza kwasów nukleinowych w elu poliakrylamidowym w gradiencie denaturujcym (DGGE) lub gradiencie temperatury (TTGE), analiza polimorfizmu konformacyjnego DNA jednoniciowego (SSCP), analiza polimorfizmu długoci fragmentów restrukcyjnych (T-RELP), analiza sekwencji fragmentu DNA zlokalizowanego pomidzy bakteryjnymi genami 16S rrna i 23S rrna (ARISA), analiza restrykcyjna r-dna amplifikowanego technik PCR (ARDRA), hybrydyzacja in-situ za pomoc sond fluorescencyjnych z RNA (FISH). Z wykorzystaniem technik biologii molekularnej prowadzono badania zmian ilociowych i jakociowych mikroorganizmów podczas biodegradacji stymulowanej nutrietami (PCR- DGE) [Röling et al., 2002; Viñas et al., 2005; Cebron et al., 2007]. Bordenave i współpracownicy [2007] wykorzystali technik T-RELP do bada nad obecnoci i zmianami mikroorganizmów w zestarzałych matach biologicznych zanieczyszczonych wglowodorami ropopochodnymi. Z zastosowaniem techniki ARDRA Röling i Chadhain prowadzili badania bioremediacji gleby zanieczyszczonej cikim olejem i WWA, w aspekcie zmian populacji mikroorganizmów [Röling et al., 2004, 2004a; Chadhain et al., 2006]. Badania społecznoci mikroorganizmów beztlenowych wystpujcych w asfaltach i dołach smołowych (ph 3 5) były przedmiotem rozwaa przy zastosowaniu techniki PCR-DGGE [Uyttebroek et al., 2007; Kim et al., 2007]. Badania molekularne w połczeniu z tradycyjnymi metodami biologicznymi s te pomocne przy doborze właciwych mikroorganizmów bdcych podstaw konsorcjum bakteryjnego [Mishra et al., 2001a; Bhattacharya et al., 2003; Arvanitis et al., 2008]. Liczba bakterii rozkładajcych wglowodory ropopochodne w rodowisku glebowym jest znaczca, jednake poszczególne mikroorganizmy mog metabolizowa ograniczony zakres wglowodorów. Z tego wzgldu do rozkładu wieloskładnikowego układu, jakim jest ropa naftowa, zdolne s mieszaniny kultur mikroorganizmów o rozbudowanym aparacie enzymatycznym. W celu uniknicia antagonistycznego oddziaływania mikroflory autochtonicz- 55

53 nej gleby na obce kultury drobnoustrojów nieprzystosowane do danego rodowiska, preferuje si sporzdzanie konsorcjów bakteryjnych biopreparatów na bazie uprzednio wyizolowanych z gleby mikroorganizmów autochtonicznych. Poniej przedstawiono skład kilku biopreparatów (konsorcjów bakteryjnych), charakteryzujcych si dobrymi zdolnociami biodegradacyjnymi w stosunku do wglowodorów alifatycznych i aromatycznych: Rhodococcus sp., Acinetobacter sp., Pseudomonas sp. [Yu et al., 2005], Pseudomonas sp. DS10-129, Bacillus sp. D-S6-86, Micrococcus sp, GS2-22, Corynebacterium sp.gs5-56, Flavobacterium sp. DS5-73 [Rahman et al., 2002], Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas citronellolis, Stenotrophomonas maltophilia (Hawle-Ambrosch et al., 2007), Acinetobacter baumannii, Burkholderia cepacia, Pseudomonas putida. [Mishra et al., 2001a], Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas mendocina, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Rhodococcus opacus, Arthrobacter sp., Acinetobacter sp. [Arvanitis et al., 2008], Sphingobacterium sp., Pseudomonas hatophila, Aquabacterium sp., Burkholderia phenazinium, Ralstonia eutropha, Sphingomonas paucimobilis, Mycobacterium ratisbonense, Alcaligenes sp. [Kanaly et al., 2000a], Pseudononas sp., Acinetobacter sp., Flavobacterium sp., Pleurotus ostreatus [Marquez-Rocha et al., 2001], Pseudomonas putida, Irpex lacteus, Pleurotus ostreatus [Sašek et al., 2003], Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Alcaligenes faecalis, Bacillus firms, Bacillus sphaericus [Kołwzan, 2005]. O biodegradacji wglowodorów ropopochodnych decyduj mechanizmy ich transportu z orodka porowego na powierzchni komórki oraz ich dalszej penetracji przez błon cytoplazmatyczn, która stanowi półprzepuszczaln przegrod i odpowiada za wymian substancji midzy komórk a rodowiskiem. Wglowodory ropopochodne nale do substratów trudno przyswajalnych ze wzgldu na swój lipidowy charakter i ograniczon rozpuszczalno w wodzie, jednake mikroorganizmy wykształciły kilka podstawowych mechanizmów, dziki którym s zdolne do wykorzystywania wglowodorów w charakterze substratu pokarmowego [Atlas, 1995]. Biodegradacji mog ulega wglowodory ropopochodne rozpuszczone w wodzie, z szybkoci zalen od tempa ich przechodzenia z innych faz do fazy rozpuszczonej. Pozostałe mechanizmy umoliwiaj mikroorganizmom rozkład wglowodorów zawieszonych w postaci drobnych kropel micelli w roztworach wodnych. Krople wiksze od komórek s 56

54 rozkładane przez bezporedni kontakt bakterii z zawieszonymi w wodzie czstkami niepolarnych zwizków organicznych. Na ich powierzchni rozwija si populacja mikroorganizmów i w miejscu kontaktu dochodzi do przechodzenia wglowodorów przez błon cytoplazmatyczn (pseudosolubilizacja). Wytworzone przez mikroorganizmy metabolity zewntrzkomórkowe o charakterze surfaktantów zmniejszaj wymiary czstek wglowodorów ropopochodnych poniej (1 μm) dla umoliwienia ich penetracji do wntrza komórki. W przypadku wglowodorów słabo rozpuszczalnych w wodzie, nastpuje rozwój kolonii na ich powierzchni i formowanie si aglomeratów zawierajcych klustery mikroorganizmów i wglowodorów, co ułatwia przenikanie substratu przez błon komórkow [Falatko et al., 1992; Malina, 1999]. Transport substratów i metabolitów przez błon komórkow moe odbywa si na drodze dyfuzji prostej (biernej), uwarunkowanej rónic ste lub potencjału wewntrz i na zewntrz komórki, bez potrzeby pobudzenia membrany komórkowej i zuycia zasobów energetycznych komórki oraz przy udziale permeaz swoistych przenoników (białka transportujce) dla rónych substratów tzw. transport aktywny. Transport aktywny odbywa si wbrew gradientowi ste przenoszonych substancji i przebiega z wydatkowaniem energii (na 1 czsteczk przypada 1 mol ATP) [Libudzisz et al., 2007]. Ponadto wystpuje tzw. dyfuzja ułatwiona, która te zachodzi przy udziale białek transportowych, ale z zachowaniem gradientu ste i bez uycia energii przez komórk. W zalenoci od danego mikroorganizmu transport wglowodorów moe przebiega zgodnie z jednym z powyej przedstawionych mechanizmów lub moe by ich kombinacj. Wytwarzane przez komórki mikroorganizmów biosurfaktanty maj wpływ na hydrofobowo komórek bakteryjnych oraz odgrywaj znaczc rol w adhezji komórek do wglowodorów. Do mikroorganizmów produkujcych biosurfaktanty przykładowo mona zaliczy: Pseudomonas aeruginosa, Arthrobacter paraffineus, Rhodococcus erythropolis, Mycobacterium spp., Bacillus brevis, Serratia marcesceces, Penicillium spiculisporum, Thiobacillus thiooxidans, Acinetobacter calcoaceticus, Candida lipolytica, Sphingomonas paucimobilis [Van Hamme et al., 2003]. ywa komórka jest uporzdkowan form materii i do jej utrzymania (ycia i syntezy składników komórkowych) wymagana jest energia, któr uzyskuje si w drodze metabolizmu. ródłem energii s substancje odywcze uzyskiwane ze rodowiska. Ich przekształcanie wewntrz komórki odbywa si w wielu nastpujcych po sobie reakcjach enzymatycznych, 57

55 głównie redoks, hydrolitycznych lub sprzonych, tworzcych swoiste szlaki metaboliczne. Energia reakcji utleniania jest udostpniana komórce heterotroficznej jako energia ATP (adenozynotrójfosforan), który po jej oddaniu przekształca si w ADP (adenozynodwufosforan). Biodegradacji aerobowej wglowodorów ropopochodnych towarzyszy wytworzenie ATP, uwarunkowane obecnoci tlenu, jako akceptora elektronów. Podczas utleniania wglowodorów ropopochodnych uwolnione atomy wodoru s zwizane przez noniki wodoru, np. dwunukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD forma zredukowana NADH 2 ) lub fosforan dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADP forma zredukowana NADPH 2 ) [Schlegel, 2008]. Wglowodory alifatyczne Wglowodory alifatyczne s podstawowym składnikiem ropy naftowej i mog by wykorzystywane przez mikroorganizmy w charakterze ródła wgla. Wikszo n-alkanów ulega hydroksylacji najczciej przy kocowym atomie wgla w łacuchu (utlenianie terminalne), rzadziej zachodzi utlenianie subterminalne. Reakcj katalizuj monooksygenazy z udziałem NAD(P)H. Dalsze utlenianie alkoholi pod wpływem dehydrogenazy alkoholowej prowadzi do powstania aldehydów, a nastpnie w reakcji katalizowanej przez dehydrogenaz aldehydow powstaj kwasy tłuszczowe, rozkładane w procesie β-oksydacji (rys. 4.2). NAD(P)H + H + /O 2 CH 3 (CH 2 ) n CH 3 CH 3 (CH 2 ) n CH=CH 2 NAD(P) + + H 2 O CH 3 (CH 2 ) n CH 2 CH 3 CH 3 (CH 2 ) n CH CH O NAD(P) + NAD(P)H + H + CH 3 (CH 2 ) n CHO CH 3 (CH 2 ) n -CHOH- COOH NAD(P) + NAD(P)H + H + CH 3 (CH 2 ) n COOH CH 3 (CH 2 ) n COOH + CO 2 rozkład na drodze β-oksydacji Rys Biodegradacja n-alkanów Fig N-alkanes biodegradation rozkład na drodze β-oksydacji Rys Biodegradacja alkenów Fig Alkenes biodegradation 58

56 Alkeny ulegaj hydroksylacji najczciej w miejscu podwójnego wizania, w dalszych etapach s rozkładane podobnie jak n-alkany (rys. 4.3). Alkany rozgałzione s metabolizowane przez drobnoustroje, podobnie jak wglowodory o prostych łacuchach, jednak przebieg degradacji jest powolniejszy ze wzgldu na obecno podstawników, które hamuj proces β-oksydacji wglowodorów [Watkinson et al., 1990]. Wglowodory aromatyczne Piercie aromatyczny rozszczepia wiele gatunków bakterii i grzybów. Tlenowy rozkład tych zwizków wymaga udziału wielu enzymów, ale tylko nieliczne s zdolne do ataku na struktur aromatyczn. Degradacj wglowodorów aromatycznych podzieli mona na nastpujce etapy: Przygotowanie do rozszczepienia piercienia aromatycznego Wikszo zwizków aromatycznych pocztkowo ulega degradacji przez mikroorganizmy do jednego lub dwóch zwizków katecholu i kwasu protokatechowego. Wiele pojedynczo lub podwójnie (1,2-di-) podstawionych piercieni aromatycznych np. w kwasie migdałowym, toluenie, fenolu, benzenie jest degradowanych do katecholu. Do kwasu protokatechowego s przekształcane piercienie aromatyczne podwójnie podstawione w pozycjach 1,3 i 1,4, jak równie piercienie podstawione wielokrotnie. Mikroorganizmy w degradacji wglowodorów aromatycznych wykorzystuj najczciej dioksygenazy. W wyniku ich działania nastpuje wprowadzenie dwóch atomów tlenu do piercienia aromatycznego, co osłabia jego stabilno, ułatwia rozerwanie wiza i dalszy rozkład prowadzcy do powstania cis-dihydrodioli, ulegajcych selektywnej dehydrogenacji do formy dihydroksylowej, pirokatechiny: O 2 XH 2 X X XH 2 benzen dioksygenaza cis 1,2 dihydro -1,2 dihydroksybenzen d hydrogenaza pirokatechina Inaczej dzieje si w przypadku zwizków fenolowych, które s hydroksylowane przez monooksygenazy. Jeden z atomów tlenu czsteczkowego zostaje wbudowany, a drugi zredukowany do wody. Jako donory wodoru mog słuy nukleotydy pirydynowe. 59

57 O 2 + XH 2 H 2 O + X fenol monooksygenaza pirokatechina Rozszczepienie piercienia aromatycznego czsto, lecz nie zawsze, poprzedzone jest usuniciem z niego podstawników. Grupy chlorowe, nitrowe i sulfonowe s zastpowane grupami hydroksylowymi. Alifatyczne boczne łacuchy mog by równie modyfikowane i skracane. toluen benzen O 2 O 2 fenol O 2 O 2 katechol meta orto H O 2 semialdehyd 2 hydroksymukonowy kwas cis,cis-mukonowy mukonolakton Kwas 4- hydroksy 2-ketowalerianowy acetylo-coa cykl Krebsa kwas pirogronowy cykl Krebsa Rys Droga rozkładu toluenu, benzenu i fenolu przez Pseudomonas putida [Gibson, 1984; Reardon et al., 2000; Libudzisz et al., 2008; Schlegel, 2008] Fig Decomposition pathway of toluene, benzene and phenol by Pseudomonas putida [Gibson, 1984; Reardon et al., 2000; Libudzisz et al., 2008; Schlegel, 2008] 60

58 Rozszczepienie rozgałzionego piercienia aromatycznego Rozszczepienie piercienia typu orto zachodzi pomidzy ssiadujcymi hydroksylowymi atomami wgla i prowadzi do powstania kwasów dikarboksylowych. Z kolei wewntrz czsteczkowe przekształcenia prowadz do zerwania wizania C-C z wytworzeniem kwasu cis,cis-mukonowego. Z rozszczepieniem typu meta mamy do czynienia, gdy nastpuje pknicie wizania midzy hydroksylowym i niehydroksylowym atomem wgla, co równie jest katalizowane przez dioksygenazy (rys. 4.4). W wyniku reakcji powstaj semialdehydy kwasu 2-hydroksymukonowego, które nastpnie wchodz w szlaki metabolizmu poredniego przez pirogronian, aldehyd octowy, szczawiooctan, fumaran i inne produkty porednie, zalene od typu podstawienia powstałych kwasów alifatycznych [Reardon et al., 2000; Schlegel, 2008; Libudzisz et al., 2008]. Wielopiercieniowe wglowodory aromatyczne (WWA) s rozkładane przez sukcesywne otwieranie kolejnych piercieni, które opiera si na mechanizmie zblionym do rozszczepiania piercienia benzenu (rys. 4.5). Przykłady czciowego utlenienia pirenu oraz fluorantenu przedstawiono na rys. 4.5 i 4.6. piren cis-4,5-dihydroxy- 4,5-dyhydropiren trans-4,5-dihydorksy- 4,5-dihydropiren kwas 6,6 -dihydroxy- 2,2 -bifenylo dikarboksylokwas fenantreno- 4,5-dikarboksylowy kwas ftalowy kwas fenantreno- 4-karboksylowy Rys Droga rozkładu pirenu przez bakterie Mycobacterium sp. [Cerniglia, 1992; Rehmann et al., 1998; Kanaly et al., 2000; Vila et al., 2001] Fig Decomposition pathway of pyrene by Mycobacterium sp. [Cerniglia, 1992; Rehmann et al., 1998; Kanaly et al., 2000; Vila et al., 2001] 61

59 Podatno wglowodorów aromatycznych na biodegradacj zaley od liczby piercieni i maleje z reguły wraz z jej wzrostem. Rys Droga rozkładu fluorantenu przez bakterie Mycobacterium sp. [Kanaly et al., 2000] Fig Decomposition pathway of fluorantene by Mycobacterium sp. [Kanaly et al., 2000] Wikszo grzybów strzpkowych nie przeprowadza całkowitej mineralizacji wglowodorów aromatycznych, a jedynie przekształca je do produktów porednich. Katalizatorem 62

60 pocztkowej epoksydacji jest monooksygenaza zawierajca cytochrom P-450, wprowadzajca do piercienia aromatycznego tylko jeden atom tlenu, natomiast drugi atom jest redukowany do czsteczki wody przez przyłczenie dwóch atomów wodoru. Powstały w reakcji epoksyd jest nietrwały i ulega reakcji nieenzymatycznej z powstaniem fenoli, te za s sprzgane w koniugaty z glukoz, kwasem glukuronowym, siarczanem lub ksyloz. Koniugaty s lepiej rozpuszczalne w wodzie i szybciej usuwane ze rodowiska. Ponadto epoksyd moe by przekształcony przez hydroksylaz epoksydow do trans-dihydrodiolu (rys. 4.7). benzen O 2 H 2 O epoksyd fenol tworzenie koniugatów trans-dihydrodiol Rys Droga rozkładu benzenu przez grzyby strzpkowe Fig Decomposition pathway of benzene by fungi Grzyby ligninolityczne np. Phanerochaete chrysosporium, Pleurotus ostreatus wytwarzaj zewntrzkomórkowe enzymy, np. peroksydaz ligninow, biorce udział w utlenianiu ksenobiotyków. Drobnoustroje te przekształcaj WWA do pochodnych chinonowych, a nastpnie nastpuje rozszczepienie piercienia aromatycznego chinonów i zachodzi całkowita mineralizacja [Schlegel, 2008; Libudzisz et al., 2008]. Beztlenowy rozkład zwizków ropopochodnych Skomplikowany i wieloetapowy proces biologicznego rozkładu substancji ropopochodnych moe zachodzi równie w warunkach beztlenowych pod warunkiem, e s obecne akceptory i donory elektronów (rys. 4.8). Kiedy dostp do tlenu jest utrudniony, efektywno procesu biodegradacji zaley od moliwoci wykorzystania innych akceptorów elektronów. W warunkach beztlenowych najwicej energii mikroorganizmy zyskuj w wyniku utleniania substancji organicznej w przypadku, gdy akceptorem elektronów jest ditlenek wgla. Proces biodegradacji w warunkach beztlenowych przebiega znacznie wolniej i powstaje wiksza ilo metabolitów ni podczas biodegradacji w warunkach tlenowych. 63

61 donor elektronów (np. benzen, toluen, fenol) CO 2 + H 2 O + energia zwizki WWA zawarte w ropie naftowej oksygenazy mikroorganizmów formy eposkydowe akceptor elektronów (NO 2, SO 4, CO 2 ) H 2 O, NH 4 +, H 2 S, CH 4 alkohole i kwasy tłuszczowe Rys Schemat biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych w warunkach beztlenowych [Kołoczek et al., 2006] Fig Scheme of petroleum pollutants biodegradation in anaerobic conditions [Kołoczek et al., 2006] Fakultatywne beztlenowce wytwarzaj enzymy biorce udział zarówno w procesach tlenowej, jak i beztlenowej biodegradacji. Beztlenowe drogi rozkładu to [Schlegel, 2008]: reakcje prowadzce do powstania metabolitów porednich w wyniku redukcji piercienia aromatycznego, redukcja piercienia z wytworzeniem 1,3-diketonu, a nastpnie jego hydroliza, -oksydacja. Główne metabolity porednie to floroglucyna i rezorcyna wytwarzane ze zwizków fenylowych. Kocowym produktem (metabolitem) jest acetylo-coa. Czynniki majce potencjalny wpływ na biodegradacj zwizane s z: 1) zanieczyszczeniem (budowa chemiczna, własnoci fizyko-chemiczne, poziom stenia), 2) rodowiskiem (tlen, obecno nutrietów, temperatura, ph, wilgotno), 3) obecnoci mikroorganizmów (skład jakociowy i ilociowy, rozkład przestrzenny, stopie adaptacji do wykorzystania wglowodorów, interakcje midzy gatunkami i w obrbie tych samych gatunków, aktywno enzymatyczna). 64

62 Podatno na biodegradacj Budowa chemiczna wglowodorów ropopochodnych (długo łacucha, jego rozgałzienia, obecno tlenu w czsteczce wglowodorów, obecno i połoenie podstawników, struktura i liczba piercieni) jest jednym głównych czynników decydujcych o ich podatnoci na biodegradacj. spadek podatnoci na biodegradacj O podatnoci wglowodorów alifatycznych decyduje długo łacucha [Huddlestone et al., 1986; Qudot et al., 1989; Chaîneau et al., 1999]. Alkany o długoci łacucha C 10 C 22 s substancjami najchtniej wykorzystywanymi przez bakterie [Wattiau, 2002; Abalos et al., 2004; Hamamura et al., 2006; Hawle-Ambrosch et al., 2007]. Alkany gazowe C 2 C 4 s rozkładane tylko przez niektóre grupy mikroorganizmów, np. Pseudomonas butanovora [Kurth et al., 2008]. Słaba rozpuszczalno w wodzie alkanów o długoci łacucha wglowego od C 5 do C 9 oraz powyej C 23 powoduje obnienie podatnoci na biodegradacj. Wglowodory cikie, o długoci łacucha powyej 30 atomów wgla w czsteczce, ulegaj biodegradacji bardzo powoli [Rehm et al., 1981; Pollard et al., 1999; Chaîneau et al., 2000]. Izoalkany (rozgałzione wglowodory alifatyczne) charakteryzuj si znacznie mniejsz zdolnoci do biodegradacji w stosunku do alkanów, gdy grupa metylowa podstawiona w pozycji 2 lub 3 utrudnia -oksydacj. Czsto zbyt dua liczba podstawników moe spowodowa, e np. pristan, fitan jest bardzo oporny na biodegradacj [Santas et al., 1999; Rosa et al., 2007]. Podstawienie wglowodorów grup -OH lub -COOH zwiksza ich biodegraalkany proste C 10 -C 22 alkany proste C 12 -C 18 gazy C 2 -C 4 alkany C 5 -C 9 alkany rozgałzione C 12 alkeny C 3 -C 11 alkeny rozgałzione C 10 -C 19 wglowodory aromatyczne cykloalkany Rys Wzgldna podatno na biodegradacj wglowodorów ropopochodnych [Huddlestone et al., 1986] Fig Relative flexibility of petroleum hydrocarbons to biodegradation [Huddlestone et al., 1986] 65

63 dowalno, natomiast podstawienie grupami -Cl, -NO 2, -SO 3 H zmniejsza szybko biodegradacji. Cykloalkany o małych masach czsteczkowych (np. cykloheksan) s rozkładane w warunkach aerobowych z mniejsz skutecznoci ni wglowodory monoaromatyczne, gdy uszkadzaj błony komórkowe i wykazuj znaczn toksyczno w stosunku do mikroorganizmów [Ooyama et al., 1985]. Wglowodory monoaromatyczne cechuj si znaczn toksycznoci, jednak w przypadku wystpowania w niewielkich steniach s szybko rozkładane przez wiele rodzajów bakterii i grzybów [Kanaly et al., 2000; Prenafeta-Boldu et al., 2002]. Zwizki wielopiercieniowe o 2 4 piercieniach w czsteczce, podlegaj biodegradacji z szybkoci odwrotnie proporcjonaln do stopnia kondensacji piercieni [Saponaro et al., 2002]. Zwizki o 5 lub wicej skondensowanych piercieniach nale do trudno rozkładalnych na drodze biologicznej. Wymagane jest w takich przypadkach zastosowanie konsorcjum mikroorganizmów na bazie bakterii i grzybów [Sašek et al., 2003; Wiesche et al., 2003, Steliga, 2008]. Asfalteny i inne cikie frakcje ropy naftowej s odporne na rozkład mikrobiologiczny ze wzgldu na du mas czsteczkow, nisk rozpuszczalno oraz tendencj wizania si z matryc glebow. Budowa chemiczna wglowodorów ropopochodnych oraz właciwoci fizykochemiczne zanieczyszcze (adsorpcja, desorpcja, dyfuzja, rozpuszczalno, obecno w fazie stałej) s czynnikami majcymi istotne znaczenie w procesie biodegradacji. Biodostpno zanieczyszcze zaley od struktury gleby, właciwoci geologicznych, pochodzenia zanieczyszcze i czasu kontaktu z gleb oraz od właciwoci fizjologicznych mikroorganizmów (w szczególnoci od zdolnoci produkcji biosurfaktantów) [Hatzinger et al., 1995; De Jonge et al., 1997; Chung et al., 1999; Tang et al., 1999, Alexander, 2000; Saponaro et al., 2002; Talley et al., 2002; Huesemann et al., 2003; Thorsen et al., 2004; Płaza, 2006]. Biodegradacja zmienia skład i proporcje mieszaniny zanieczyszcze ropopochodnych, powodujc procentowy wzrost zwizków mniej podatnych na rozkład biologiczny (np. wglowodorów o wikszej masie czsteczkowej i rozgałzionych łacuchach wglowych). Istnieje górna i dolna granica stenia wglowodorów ropopochodnych, decydujca o moliwo- ciach ich biodegradacji. Maksymalnym steniem jest stenie toksyczne dla mikroorganizmów, które wg danych literaturowych kształtuje si na poziomie 8% wag. [Amakiri et al., 1983; Chaîneau et al., 1995; 1999; 2003] oraz 10% wag. [Colleran, 1996]. Niskie stenie (dol- 66

64 na granica) hamuje procesy biodegradacji wówczas, gdy wglowodór wystpuje w tak małych ilociach, e wykorzystywany jest jako substrat drugorzdny, co znacznie obnia tempo jego rozkładu. Czynniki rodowiskowe Do biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych w rodowisku glebowym, oprócz obecnoci mikroorganizmów zdolnych do rozkładu tych zanieczyszcze, niezbdna jest take odpowiednia zawarto składników pokarmowych, natlenienie, warunki temperaturowe, odczyn (ph) gleby oraz odpowiednia wilgotno i eliminacja zwizków toksycznych. Temperatura Temperatura jest jednym z najwaniejszych czynników rodowiskowych warunkujcych przebieg procesów yciowych drobnoustrojów. Działa na organizmy bezporednio, wpływajc na szybko wzrostu, aktywno enzymów, skład chemiczny komórek i wymagania pokarmowe oraz porednio poprzez regulacj rozpuszczalnoci substancji wewntrz komórek, transport jonów i zmian własnoci osmotycznych błon komórkowych. Biodegradacja moe zachodzi w szerokim zakresie temperatur. Bezporedni wpływ temperatury na wzrost mikroorganizmów i biodegradacj wglowodorów ropopochodnych w rodowisku gruntowym mona opisa wprowadzajc szybko biodegradacji, zamiast stałych reakcji, do zmodyfikowanego równania Van t Hoffa-Arrheniusa [Miller et al., 1991; Schlegel, 2008]: ΔEa ( r ) = A exp deg (1) T RT gdzie: (r deg ) T szybko biodegradacji w temperaturze [T], Ea energia aktywacji [J. mol -1 ], A stała zalena od rodzaju gruntu i innych parametrów nietermicznych, R stała gazowa [J mol -1 K -1 ]. Wyizolowane bakterie, zarówno psychrofilne jak i mezo- oraz termofilne, zdolne s do wykorzystywania wglowodorów w charakterze jedynego ródła wgla i energii. Kady gatunek posiada optymaln temperatur wzrostu, w której szybko biodegradacji jest najwysza. Aktywno metaboliczn zaobserwowano w przedziale temperatur od 12 o C do +100 o C [Lyman et al., 1982], a biodegradacj substancji ropopochodnych od 1 o C do +70 o C [Atlas, 1981]. Mezofile, to drobnoustroje zdolne do wzrostu w temperaturach umiarkowanych. Przyjmuje si, e optymalna temperatura wzrostu, mieci si w zakresie od +20 o C do +45 o C w zalenoci od gatunku, chocia literatura podaje róne wartoci optymalnych tempe- 67

65 ratur: od +15 o C do 45 o C [Sims, 1993], od +20 o C do +37 o C [Bossert et al., 1984], od +20 o C do +30 o C [Zhou et al., 1995]. Niska temperatura dla drobnoustrojów psychrofilnych nie jest miertelna, ale kolejne zamarzania i tajanie gruntu mog spowodowa obumieranie niektórych gatunków. Psychrofile znalazły dobre warunki rozwoju w rejonach podbiegunowych, z których wyizolowane stanowi konsorcjum bakteryjne zdolne do biodegradacji alkanów w niskiej temperaturze (+5 o C) [Whyte et al., 1999; Stallwood et al., 2005; Eriksson et al., 1999; Delille et al., 2007]. Biodegradacja przy uyciu drobnoustrojów termofilnych moe zachodzi przy temperaturze w granicach: od +65 o C do +70 o C [Feitkenhauer et al., 2003] oraz w zakresie: od +37 o C do +100 o C [Płaza et al., 2006a]. Wyizolowana i poddana selekcji oraz namnoeniu populacja drobnoustrojów autochtonicznych, stanowica baz biopreparatu stosowanego do biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych w glebie, wykazuje du aktywno yciow w zakresie temperatur: od +5 do 35 o C, natomiast temperatura 10 o C nie powoduje ich obumierania [Farbiszewska et al., 1996; Steliga, 2006]. Zaleno szybkoci biodegradacji od temperatury przedstawi mona uywajc wskanika Q 10, okrelajcego krotno wzrostu szybkoci biodegradacji ze wzrostem temperatury o 10 o C. Eikelboom [1985] podaje nastpujce wartoci wskanika Q 10 oraz zakresy temperatur, dla których został okrelony: Q 10 = 3,3 dla zakresu temperatur 6 18 o C Q 10 = 2,1 dla zakresu temperatur o C Q 10 = 1,2 dla zakresu temperatur o C W umiarkowanej strefie klimatycznej zaobserwowano wzrost temperatury od 2,5 do 5 o C, a nawet 10 o C, zwizany z wytworzeniem ciepła spowodowanym zwikszon aktywno- ci metaboliczn podczas biodegradacji substancji ropopochodnych [Chaîneau et al., 2003; Siuta, 2003]. W trakcie prac bioremediacyjnych moliwoci utrzymania temperatury optymalnej dla wzrostu mikroorganizmów zale od przyjtej technologii. Zwykle w metodach in-situ oczyszczanie prowadzi si w warunkach normalnych, bez stosowania rygorów temperaturowych, gdy utrzymanie stałej temperatury oczyszczanego terenu jest nieuzasadnione, zarówno ze wzgldów technicznych, jak i ekonomicznych. Tlen Podczas biodegradacji aerobowej tlen jest akceptorem elektronów, a jego dostpno jest funkcj: objtoci porów i pustek w gruncie, cinienia czstkowego tlenu w powietrzu 68

66 porowym, szybkoci transferu tlenu z powietrza porowego do wody porowej i zuywania go przez mikroorganizmy oraz geometrii rozkładu tlenu w gruncie [Malina, 1996]. Wikszo drobnoustrojów rozkładajcych wglowodory to organizmy tlenowe, wykorzystujce tlen czsteczkowy w procesie utleniania substratu przez oksygenazy, dlatego te obok obecnoci substratu wymagaj obecnoci w rodowisku glebowym tlenu rozpuszczonego w iloci co najmniej 0,2 mg/dm 3, przy minimalnej zawartoci powietrza glebowego wynoszcej 10%, gdy jego niedobór jest istotnym czynnikiem ograniczajcym intensywno bioremediacji [Sims et al., 1993]. Zapotrzebowanie na tlen w zaolejonej glebie jest wielokrotnie wysze ni w homologicznej glebie wolnej od zanieczyszcze. Wilgotno ycie mikroorganizmów jest moliwe w obecnoci wody, gdy ich funkcje yciowe s uzalenione nie tylko od procentowej zawartoci wody w rodowisku, ale równie od stenia zwizków rozpuszczalnych. Zwizki te, ulegajc hydratacji, zmniejszaj zasoby wody dostpnej dla mikroorganizmów. Woda w gruncie umoliwia ruch mikroorganizmów, dyfuzj substratów i zwizków odywczych do komórki oraz usunicie z niej produktów metabolizmu, wpływajc jednoczenie na utrzymanie w komórce odpowiedniego cinienia osmotycznego i ph. Woda silnie zwizana z czstkami stałymi gleby moe by niedostpna dla mikroorganizmów. Wilgotno objtociowa gruntów waha si w granicach od 15 do 35% [Huddlestone et al., 1986]. Optymalna wilgotno gruntu przy biodegradacji aerobowej wynosi przecitnie 7 24% wilgotnoci objtociowej [Sims et al., 1993]. Do okrelania zapotrzebowania na wod drobnoustrojów, czsto przyjmuje si termin aktywno wody w rodowisku (a w ). Warto ta okrela stosunek cinienia par danego roztworu do cinienia par czystej wody. Dla wikszoci bakterii optymalna warto a w mieci si w granicach: 0,96 0,85. Grzyby w porównaniu z innymi drobnoustrojami mog si rozwija przy stosunkowo niskich wartociach a w = 0,91 0,60. Odczyn Optymalne ph gruntu dla biodegradacji wynosi 6 8, chocia efektywny metabolizm wystpuje take poza tym zakresem, przy ph = 5,5 8,5. Podczas biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych wg Atlasa [1981] optymalny odczyn gleby powinien kształtowa si na poziomie 7,5 7,8. Pocztkowa warto ph gleby zaley od jej składu chemicznego, natomiast w trakcie procesu biologicznego w zalenoci od charakteru metabolizmu i fizjologii mikroorganizmów, moe ulec zmianie. Nadmierne stenie jonów H + lub OH hamuje wiele prze- 69

67 mian, a przede wszystkim zakłóca proporcje midzy wytwarzaniem, a zuywaniem ATP w komórce oraz zmniejsza wydajnoci biomasy. Spadek ph poniej 7,2, tj. do poziomu, przy którym wikszo mikroorganizmów jest negatywnie naładowana, obnia jonizacj ujemnie naładowanych grup karboksylowych, podwyszajc ilo grup aminowych posiadajcych ładunek dodatni. Powoduje to osłabienie sił odpychania midzyczsteczkowego i wzrost adsorpcji [Herbold-Paschke, 1991; Fontes et al., 1991]. Pierwiastki biogenne Wglowodory ropopochodne, tak jak kada substancja organiczna, mog by wykorzystywane jako ródło wgla do budowy biomasy komórek. Rozwój drobnoustrojów warunkuje jednak take dostp do innych składników pokarmowych, takich jak azot, fosfor, siarka, wap, magnez i potas. W glebach, które uległy skaeniu substancjami ropopochodnymi drastycznie zostaje zakłócony stosunek azotu do fosforu. Niedobór, azotu i fosforu wynikajcy z nadmiaru wgla sprawia, e drobnoustroje nie mog w pełni wykorzystywa substratów wglowych. Do ich rozwoju bowiem niezbdna jest synteza białka, kwasów nukleinowych i zwizków wysokoenergetycznych, a jest to niemoliwe bez dostarczenia azotu, fosforu i siarki. Uzupełnienie składu gleby zwizkami azotu tak, aby stosunek C:N wynosił przynajmniej 120:1 jest niezbdnym warunkiem biodegradacji zanieczyszcze [Chang et al., 1992]. Fosfor jest drugim czynnikiem odywczym ograniczajcym biologiczny rozkład wglowodorów. Jest on dodawany łcznie z nawozem azotowym, gdy niektóre mikroorganizmy dziki wytwarzanym metabolitom mog rozpuszcza i przyswaja mineralne zwizki fosforu. Powszechnie uwaa si, e dla prawidłowej aktywnoci mikroorganizmów stosunek C:N:P powinien kształtowa si na poziomie 100:10:1 [Bragg et al., 1994; Liebieg et al., 1999; Jackson et al., 1999; Yerushaimi et al., 2003; Hejazi et al., 2004; Li et al., 2005]. Jednake, ze wzgldu na róne szybkoci rozkładu poszczególnych wglowodorów i nieznany stopie przyswajania nutrietów przez mikroorganizmy w zalenoci od rodzaju gleby, trudno jest ustali optymalne dawki nawozów mineralnych. Z tego wzgldu w literaturze podawane s jako optymalne proporcje C:N:P od 100:5:1 do 100:1:1 [Staps, 1990; Chang et al., 1996; Smith et al., 1998; Namkoong et al., 2002]. Wap i magnez s pierwiastkami, których obecno przyczynia si do skutecznej biodegradacji wglowodorów w rónorodny sposób. Wap poprawia właciwoci fizyczne i chemiczne gleby poprawiajc jednoczenie jej struktur. ródłem wapnia s minerały. Jest obecny 70

68 w postaci rozpuszczalnych wglanów wapnia w roztworze glebowym oraz jako kation wymienny w kompleksach sorpcyjnych. Wap sprzyja tworzeniu si struktury gruzełkowej powodujc koagulacj koloidów glebowych, dziki czemu poprawia warunki powietrzno-wodne w glebie. Poza tym wpływa na odczyn gleby. Wap i magnez zwikszaj przeywalno mikroorganizmów w kadym rodowisku poprzez ochron ich błon komórkowych przed dezintegrujcym wpływem wglowodorów [Kurek et al., 1998]. Czynniki biologiczne Znaczcy wpływ na przebieg i skuteczno procesu biodegradacji maj czynniki biologiczne, do których mona zaliczy [Kołwzan, 2005]: skład ilociowy i jakociowy mikroorganizmów, zdolno adaptacji mikroorganizmów do zmiennych warunków rodowiskowych, zdolno degradacji w stosunku do okrelonego typu ksenobiotyków, własnoci biogeniczne metabolitów powstajcych w czasie biodegradacji. W biologicznym oczyszczaniu gruntów zaleca si stosowanie metod opartych na naturalnym doborze mikroorganizmów. Przy wprowadzaniu inokulantów zawierajcych obce szczepy adaptacja czsto nie koczy si sukcesem, mimo e s one doskonale przystosowane do biodegradacji zwizków ropopochodnych. Dzieje si tak na skutek antagonistycznego oddziaływania mikroorganizmów autochtonicznych (zasada konkurencyjnego wypierania Gausego). Dlatego korzystne jest stosowanie inokulantów (biopreparatów) na bazie mikroorganizmów autochtonicznych, cechujcych si zdolno- ci rozkładu zanieczyszcze ropopochodnych. Warunkiem wyboru optymalnej metody oczyszczania gruntów (odpadów z dołów urobkowych) z zanieczyszcze ropopochodnych jest odpowiednia interdyscyplinarna analiza wyników, uzyskanych z bada laboratoryjnych i terenowych rodowiska gruntowo-wodnego. Prawidłowo wykonane badania pozwalaj na okrelanie najodpowiedniejszych technologii likwidacji zanieczyszcze ropopochodnych. Warunkiem koniecznym jest uwzgldnienie zagadnie zwizanych z geologi, hydrologi, gleboznawstwem, chemi, geochemi oraz mikrobiologicznym rozkładem substancji ropopochodnych w rodowisku gruntowo-wodnym [Riser-Roberts, 1998; Lazar et al., 1999; Zieko, 1999; Cunningham et al., 2004; Steliga et al., 2006a]. 71

69 W ostatnich latach coraz wiksze znaczenie uzyskuj prace badawczo-wdroeniowe zwizane z ochron rodowiska naturalnego, w tym wyrafinowane badania dotyczce wprowadzenia metod biologicznych do walki ze skaeniami substancjami ropopochodnymi. W minionej dekadzie obserwowany był dynamiczny rozwój metod biologicznych w zakresie unieszkodliwiania odpadów, stanowicych 28% udziału w stosowanych technologiach (termiczne i fizykochemiczne). Biologiczne metody rekultywacji obejmuj nastpujce grupy metod: metody bioremediacyjne, które stanowi 58% wszystkich metod biologicznych, fitoremediacyjne, kompostowanie, bioreaktory, biowentylancj [Kołoczek et al., 2006; Płaza, 2006]. Bioremediacja zanieczyszcze ropopochodnych w skaonym rodowisku uzaleniona jest zarówno od czynników abiotycznych, jak i biotycznych. Nale do nich: własnoci fizyko-chemiczne gleby/odpadu wiertniczego, stenie i struktura chemiczna zanieczyszcze ropopochodnych, stenie zwizków biogennych (azotu i fosforu), temperatura, zawarto tlenu, wilgotno, odczyn (ph), zawarto zwizków organicznych, obecno zwizków toksycznych, skład ilociowy i jakociowy mikroorganizmów obecnych w glebie oraz biodostpno wglowodorów, wynikajca z ich rozpuszczalnoci i procesów sorpcji wglowodorów w glebie [Bragg et al., 1994; Aleksander, 1994; Siuta, 2003; Steliga et al., 2003a; Xu et al., 2003; Wright et al., 2004; Li et al., 2005; Harmsen et al, 2007]. Istniej dwie strategie oczyszczania gruntów: 1) in-situ oczyszczanie rodowiska gruntowo-wodnego w miejscu jego wystpowania (spotyka si take okrelenie on-site, która polega na oczyszczaniu gruntu w miejscu wystpowania, ale po jego wydobyciu i/lub spompowaniu wody, jednake w niniejszej pracy okrelenie in-situ bdzie si odnosi do prac wykonywanych na terenie oczyszczanego dołu urobkowego), 2) ex-situ oczyszczanie wydobytego gruntu oraz spompowanych wód poza terenem wystpowania. Porównujc wymienione metody mona stwierdzi, e, metoda ex-situ w stosunku do in-situ posiada nastpujce zalety [Brown et al., 1998; Williams et al., 1999; Lee et al., 1999; Langwaldt et al., 2000; Boopathy, 2000;, Rubin et al., 2001; Carberry et al., 2001; Juteau et al., 2003]: zwiksza łatwo nadzoru i kontroli parametrów procesu oczyszczania, zapewnia szybkie tempo rozkładu zanieczyszcze, ułatwia dostp do oczyszczanego materiału przy obróbce pocztkowej, poredniej i kocowej, zapewnia korzystniejsze warunki rozwoju mikroorganizmów. Mimo wymienionych zalet, ze wzgldu na ograniczone rodki finansowe 72

70 oraz moliwo uniknicia deformacji struktury gruntu, rzeby terenu i nienaruszenia infrastruktury technicznej, coraz czciej preferuje si bioremediacj zanieczyszcze ropopochodnych bezporednio w terenie (metod in-situ). Do podjcia decyzji o prowadzeniu bioremediacji metod in-situ przyczynia si w duym zakresie doskonalenia sposobów napowietrzania terenu, zasilania rodowiska gruntowo-wodnego składnikami odywczymi i preparatami biologicznymi oraz zabezpieczenia przyległych terenów przed rozprzestrzenianiem si ropopochodnych substancji. Wybór optymalnej metody oczyszczania gruntów z zanieczyszcze ropopochodnych czsto jest uwarunkowany ograniczeniami finansowymi. W tabeli 4.2 przedstawiono przykładowo ocen ekonomiczn rónych rodzajów technologii bioremediacji. Tabela 4.2. Ocena efektywnoci rónych metod oczyszczania gruntu [Vidali, 2001] Table 4.2. Effectiveness estimation of various soil purification methods [Vidali, 2001] Grupa metod Metoda Koszt oczyszczenia [$/ ton] Czas oczyszczania (miesice) Niezawodno i łatwo remediacji Landfarming < lub > Dua Ekstrakcja rozpuszczalnikowa > 12 rednia Ex-situ Płukanie < 6 rednia Biopryzma < 12 rednia Bioreaktor rednia Naturalna bioremediacja > 10 > 36 Mała In-situ Biowentylacja < 12 rednia Płukanie gleby > 36 rednia Bioremediacja wspomagana rednia Metoda rowów i drenów Likwidacja zagroenia w przypadku silnie skaonego terenu (stare doły urobkowe) moe by zwizana z remediacj wstpn, polegajc na zebraniu produktu z powierzchni ziemi (NAPL) i wód powierzchniowych. W ostatnich latach wprowadzono szereg udoskonale istniejcych metod sczerpywania wód w celu zwikszenia efektywnoci usuwania wglowodorów (LNAPL) ze zwierciadła wody podziemnej oraz kompleksowego oczyszczania rodowiska gruntowo-wodnego [Malina, 2007]. Rowy i dreny stosuje si w warunkach niskiej przepuszczalnoci hydraulicznej oczyszczanego gruntu. Rów otwarty mona stosowa, jeeli wymagane jest szybkie działanie i spełnione s wymogi bezpieczestwa. Powinien on by zlokalizowany od niskogradientowej 73

71 strony zanieczyszczenia i zagłbiony minimum 1 m poniej spodziewanego, najniszego poziomu zwierciadła wody. LNAPL moe przemieszcza si do rowu w sposób naturalny (zgodnie z gradientem zwierciadła wody podziemnej) lub po wymuszeniu dopływu za pomoc pompowania. Jeli stateczno gruntu, bezpieczestwo lub inne wzgldy nie pozwalaj na zastosowanie rowu, wtedy na dnie rowu układa si rury perforowane tworzc układ drenów, a wykop zasypuje si ziemi. Wzdłu drenów w pewnych odległociach wykonuje si studnie zbiorcze, skd gromadzca si LNAPL jest wypompowywana [Adamek et al., 1995]. Do innych metod spompowania cieczy (wolnego produktu) z powierzchni ziemi oraz wód powierzchniowych i podziemnych naley zaliczy: sczerpywanie selektywne bez depresjonowania wody podziemnej, przy zastosowaniu skinerów pasywnych i mechanicznych, ekstrakcj wielofazow (MPE), polegajc na sczerpywaniu lekkiej cieczy organicznej połczonej z ekstrakcj powietrza porowego zanieczyszczonego substancjami lotnymi i usuwaniu fazy rezydualnej zanieczyszcze, metod BIO-VEPS, która jest kombinacj sczerpywania cieczy ze zwierciadła wody podziemnej wspomagana podcinieniem oraz biodegradacj rezydualnych zanieczyszcze ropopochodnych, metod z wykorzystaniem pulsacji cinienia (PPT), w której stosuje si cinienie pulsacyjne o wysokiej amplitudzie w celu wzbudzenia płynów oraz zwikszenia wydatku przepływu. Wybór metody i systemu sczerpywania zaley od przyjtego celu oraz wymaga projektowych i warunków terenowych. Zastosowanie po modyfikacji jednej z przedstawionych metod sczerpywania LNAPL na terenach dołów urobkowych umoliwi obnienie poziomu zanieczyszcze ropopochodnych do pułapu umoliwiajcego realizacj bioremediacji właciwej. Metody wspomagania samooczyszczania rodowiska glebowego (biodegradacja samoistna) W celu zwikszenia biodegradacji samoistnej zanieczyszcze ropopochodnych przez mikroorganizmy autochtoniczne stosuje si szereg zabiegów technicznych wspomagajcych jej szybko, w tym dostarczenie tlenu (akceptora elektronów), substancji biogennych, powierzchniowo-czynnych, regulacj wilgotnoci, temperatury, ph itp. Procesy i metody zwizane ze wspomaganiem samooczyszczania przedstawiono na rys

72 Wspomaganie samooczyszczania Obróbka agrotechniczna Biostymulacja aktywna stymulacja mikroorganizmów autochtonicznych w rodowisku gruntowo-wodnym Bioaugmentacja inokulacja mikroorganizmami zdolnymi do biodegradacji zanieczyszcze Fitoremediacja dostarczanie tlenu do strefy aeracji zatłaczanie pary wodnej do strefy aeracji płukanie gruntu dodatek substancji biogennych dodatek rodków powierzchniowo-czynnych bioelektroreklamacja chemiczne utlenianie zanieczyszcze Rys Procesy i metody wspomagania samooczyszczania rodowiska gruntowo-wodnego [Malina, 2007, zmodyfikowany] Fig Processes and supportive methods of self-purification of soil-water environment [Malina, 2007, modified] Bioremediacja stymulowana napowietrzaniem gruntu (biowentylacja SBV) Biowentylacja lub bioaeracja jest stosowana w remediacji gruntów strefy aeracji zanieczyszczonej substancjami ropopochodnymi i polega na dostarczeniu powietrza w celu usunicia lotnych frakcji oraz przyspieszenia rozkładu biologicznego frakcji cikich. Czsto oprócz napowietrzania wzbogaca si grunt w substancje biogenne i bakterie rozkładajce zanieczyszczenia ropopochodne. Biowentylacja, pomimo e jest efektywn metod in-situ jednoczesnej dekontaminacji gruntu i powietrza porowego, wymaga spełnienia kilku warunków w celu efektywnego zastosowania [Malina, 1999]: wysoka przepuszczalno hydrauliczna gruntów dla powietrza (k > 1 mm/d), oczyszczana warstwa gruntu powinna by homogeniczna, bez istotnych przewarstwie glin i torfów, dobrze rozpoznane i okrelone ognisko punktowe, a zanieczyszczenie nastpiło drog infiltracji, zanieczyszczenia podatne na biodegradacj i ulegajce parowaniu. 75

73 Na rys przedstawiono pogldowy schemat technologiczny instalacji do aktywnej wentylacji rodowiska gruntowo-wodnego. Wentylacja realizowana jest przez sie studni napowietrzajcych (2) za pomoc dmuchawy ssco-tłoczcej (1). Woda oczyszczona w separatorze (5) z substancji ropopochodnych kierowana jest do studni chłonnych (4) lub w zaleno- ci od zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych kierowana przez ekstraktor do zbiornika magazynowego (8). Pary wglowodorów i woda gruntowa odsysane s studniami ekstrakcyjnymi (3) i kierowane do oczyszczania w separatorze (5), a nastpnie na adsorberze wglowym (6) [Zieko, 1999] Rys Pogldowy schemat instalacji do aeracji rodowiska gruntowo-wodnego 1 dmuchawa ssco-tłoczca, 2 studnia napowietrzajca, 3 studnia ekstrakcyjna, 4 studnia chłonna, 5 separator, 6 adsorber wglowy, 7 ekstraktor, 8 zbiornik magazynowy, 9 plama substancji ropopochodnych Fig Installation for aerator of the ground water environment 1 suction and force blower, 2 aeration well, 3 extraction well, 4 adsorptive well, 5 separator, 6 coal adsorber, 7 extractor, 8 storage tank, 9 oil derivatives slick Ograniczenia szerszego stosowania biowentylacji zwizane s ze: zbyt nisk przepuszczalnoci orodka porowego dla wody i powietrza, dostpnoci zanieczyszcze dla mikroorganizmów, zwłaszcza w kocowej fazie procesu, transportem zanieczyszcze i mikroorganizmów, 76

74 niepełn biodegradacj, tworzeniem si toksycznych lub nieulegajcych biodegradacji metabolitów, nadmiernymi steniami rezydualnymi, długim czasem remediacji (1-4 lata). Biostymulacja substancjami biogennymi i surfaktantami Bioremediacja zanieczyszcze ropopochodnych moe by stymulowana poprzez dostarczanie do zanieczyszczonego rodowiska substancji biogennych w celu przyspieszenia biodegradacji samoistnej w przypadku, gdy brak tych substancji stanowi czynnik ograniczajcy metabolizm. Obecnie mona rozróni trzy strategie dozowania substancji biogennych (N i P), jako: rozpuszczalnych w wodzie minerałów: KNO 3, NaNO 3, NH 4 (PO 4 ) 3, NH 4 NO 3, K 2 HPO 4, MgNH 4 (PO 4 ) 2, nawozów oleofilowych, dostarczanych do zanieczyszczonego rodowiska w postaci granulek pokrytych substancj hydrofobow (parafina, olej rolinny), co pozwala na bezporednie dostarczenie substancji biogennych na granic faz wglowodory-woda, nawozów nieorganicznych z powolnym uwalnianiem azotu i fosforu (SRIF), które umoliwiaj cigłe dozowanie substancji biogennych. Zazwyczaj wystpuj w formie tabletkowej, a szybko uwalniania substancji biogennych jest zalena od powierzchni tabletki. Na uwag zasługuj nawozy, w których substancje biogenne s uwalniane przez błon na zasadzie osmozy [Oh et al., 2001; Young et al, 2001; Xu et al., 2003; Rling et al., 2004a; Margesin et al, 2007; Rosa et al., 2007]. Doniesienia literaturowe wskazuj, e zastosowanie optymalnej dawki substancji biogennych (C:N:P) zakresie (100:5:1 100:10:1), w postaci nawozów zawierajcych rozpuszczalne w wodzie minerały, umoliwia znaczne obnienie zawartoci wglowodorów ropopochodnych w granicach: 62 73%, ale nie pozwala na osignicie zadawalajcego poziomu zanieczyszcze (TPH). W celu dalszego obnienia zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych wskazane jest wzbogacenie populacji mikroorganizmów zdolnych do degradacji wglowodorów poprzez inokulacj gruntu biopreparatami [Walworth et al., 1995; Wrenn et al., 1997; Wright et al., 1997; Mattew et al., 1998; Qudot et al., 1998a; Jackson et al., 1999; Head et al., 1999; Wright et al., 2004]. Znacznie lepsze wyniki osignł w swoich pracach Chaîneau, który prowadzc prace bioremediacyjne metod ex-situ (w pryzmach) uzyskał obnienie zawartoci TPH o 85 89% z wyjciowego poziomu mg/kg, przy dawce substancji biogennych C:N:P = 100:10:1 77

75 i wzrocie liczebnoci mikroorganizmów degradujcych wglowodory ropopochodne z 9,5*10 5 do 1,7*10 7 jtk/g s.m. [Chaîneau,et al., 2003]. Wyniki bada prowadzonych pod ktem zastosowania nawozów oleofilowych (EAP Inipol-22) i nawozów z powolnym uwalnianiem N i P (Osmocote SRIF), w celu bioremediacji zanieczyszcze ropopochodnych zawartych zanieczyszczonym w piasku z play, przyniosły bardzo pozytywne efekty, gdy uzyskano obnienie w granicach: TPH (52 63%), nc 10 -n- C 35 (78 85%), WWA (38 49%) [Xu et al., 2003; 2003a, 2004, 2004a]. Rling w swoich badaniach nad biodegradacj zanieczyszcze ropopochodnych w procesie bioremediacji stymulowanej dodatkiem nawozu Osmocote, z wykorzystaniem technik molekularnych (PCR-DGGE) oszacował zmiany w bakteryjnej populacji w trakcie prowadzonych procesów, polegajce na drastycznym zmniejszeniu rónorodnoci bakteryjnej ze wzgldu na wypieranie gatunków słabszych przez dominujce, a take wzrost bakterii degradujcych wglowodory ropopochodne dziki zwikszeniu dostpnoci do azotu i fosforu [Rling, et al., 2002; 2004]. Zblione wyniki odnotowano take w innych pracach [Vias et al., 2005; Jimnez et al., 2007]. Istotnym czynnikiem, mogcym ograniczy biodegradacj samoistn, moe by hydrofobowa natura wikszoci zanieczyszcze. Proces pobierania substratu przez komórk bakteryjn zachodzi przez błon komórkow, zatem dodatek surfaktanta moe ułatwi biodegradacj wytwarzajc emulsj i pozwalajc na zwikszenie powierzchni midzyfazowej faza wodna-substrat, co powoduje wzrost biodostpnoci i zwiksza tempo biodegradacji [Alexander et al., 2002]. Zadowalajce efekty emulgacji mona uzyska poprzez: wprowadzenie syntetycznego emulgatora (np Arkopol N-060, Arkopol 1-100, Hosaf 541 KS, Tween-80) wzrost biodegradacji TPH o 35 46% w stosunku do próbki kontrolnej [Atagana et al., 2003, Tiem et al, 1997; Zoller et al, 2001; Zheng et al., 2000, 2001, 2002, 2002a], wprowadzenie biosurfaktantów produkowanych przez mikroorganizmy, które ze wzgldu na budow chemiczn dziel si na [Płaza, 2006]: o glikolipidy, o liposacharydy, o lipopeptydy, o fosfolipidy, o kwasy tłuszczowe. 78

76 Do metod wspomagajcych bioremediacj wglowodorów ropopochodnych w glebach ilastych naley zaliczy elektroosmoz, polegajc na ruchu zanieczyszczonej wody porowej midzy elektrodami, gdy np. połczenie metod biologicznego rozkładu i elektroosmozy w obecnoci surfaktanta zwikszyło redukcj np. benzo(p)pirenu o 16% [Niqui-Arroyo et al., 2007]. Bioaugmentacja biopreparatami bakteryjnymi Wspomaganie procesu bioremediacji moe by realizowane przez inokulacj (zaszczepienie) gruntu wyspecjalizowanymi szczepami bakteryjnymi. W technologiach biologicznych opartych na metodach biologicznych stosuje si zarówno biopreparaty na bazie mikroorganizmów pochodzcych ze skaonych rodowisk (autochtonicznych) jak i szczepów komercyjnych przygotowanych w wyspecjalizowanych laboratoriach mikrobiologicznych [Korda et al., 1997; Ramsay et a., 2000]. Wyizolowane, wyselekcjonowane i namnoone mikroorganizmy autochtoniczne s do powszechnie stosowane w bioremediacji in-situ. Oprócz duej skutecznoci rozkładu wglowodorów ropopochodnych cechuje je wiele dodatkowych cech umoliwiajcych adaptacj i rozwój w rodowisku, gdy wykazuj brak antagonistycznych oddziaływa z obecn naturaln mikroflor gleby. Nie powoduj one zachwiania równowagi biologicznej, co stwarza due prawdopodobiestwo przeycia w zanieczyszczonej biocenozie, a tym samym gwarantuje odpowiednio wysoki potencjał biodegradacyjny. Biopreparaty opracowane na bazie mikroorganizmów autochtonicznych powinny by bezpieczne dla człowieka i rodowiska, czyli nie powinny zawiera drobnoustrojów patogennych i chorobotwórczych. Biopreparaty komercyjne, które s wyselekcjonowane na drodze operacji genetycznych, budz kontrowersje, gdy ryzyko ich wprowadzenia do rodowiska nie jest jeszcze w pełni okrelone i trudny do przewidzenia jest ich wpływ na rodowisko i na ludzi. Biopreparaty mog by wprowadzane do gleby w postaci zawiesiny lub osadzone (immobilizowane) na noniku stałym, np. na wiórkach jesionowych [Kołwzan, 2005]. Sposób ich rozprowadzania uzaleniony jest od typu gruntów i mona stosowa wprowadzanie napowierzchniowe, iniekcj za pomoc urzdze pracujcych z wykorzystaniem nadcinienia i pola elektromagnetycznego do przyspieszania migracji bakterii w gruncie. Zastosowanie przedstawionych sposobów biostymulacji w kombinacji z bioaugmentacj stanowi obiecujc metod realizacji efektywnej bioremediacji gruntów zanieczyszczonych substancjami ropopochodnymi. 79

77 Fitoremediacja Zanieczyszczenie rodowiska zwizkami ropopochodnymi skłania do poszukiwania jak najbardziej skutecznych metod ich utylizacji. Samooczyszczanie w warunkach naturalnych jest procesem trwajcym wiele lat i dlatego te w dzisiejszych czasach jedn z bardziej obiecujcych metod jest fitoremediacja. Fitoremediacja polega na zastosowaniu rolin i zwizanych z nimi mikroorganizmów ryzosferycznych do unieruchomienia (fitostabilizacji), usuwania (fitoekstrakcji), odparowania (fitoodparowanie) i rozkładu (fitodegradacji) zanieczyszcze ropopochodnych (rys. 4.12) [Lin et al., 1998; Chaîneau et al., 2000; Banks et al., 2000; Hutchinson et al., 2001a]. parowanie akumulacja, fitoparowanie fitoekstrakcja fitostymulacja ocena fitoremediacji bezpieczna ekologiczna i efektywna zanieczyszczenie biodegradacja (ryzosfera) fitostabilizacja Rys Rodzaje fitoremediacji Fig Types of phytoremediation Obecno wydzielin korzeniowych zawierajcych cukry, aminokwasy, kwasy organiczne, humusy, witaminy oraz zwizki o duej masie czsteczkowej takie jak białka i spolimeryzowane wglowodory, sprawia, e strefa korzeniowa (ryzosfera) rolin jest dogodnym rodowiskiem do rozwoju mikroorganizmów. Z ryzosfery wyizolowano bakterie charakteryzujce si zdolnoci rozkładu zanieczyszcze ropopochodnych: Mycobacterium sp [Child et 80

78 al., 2007], Pseudomonas putida, Sphingomonas yanoikuyae, Comamonas testosteroni [Daane et al., 2001]. Penetracja systemu korzeniowego poprawia stosunki powietrzno-wodne. Uwalniane przez roliny wydzieliny korzeniowe działaj sprzyjajco na czstki glebowe, w wyniku czego tworz si agregaty istotne dla utrzymania prawidłowej struktury gleby. W ryzosferze zmienia si równie ph, stenie substancji mineralnych, koncentracja tlenu, potencjał redox, wilgotno. Rolina stwarza korzystne warunki stymulujce bioremediacj. W wielu pracach dotyczcych fitoremediacji stwierdzano, e w ryzosferze szczególnie intensywnie zachodz take procesy kometaboliczne rozkładu zanieczyszcze ropopochodnych (TPH i WWA). Prowadzone badania roli ryzosfery rolin jedno- i dwuliciennych wykazały, e stopie usunicia wglowodorów alifatycznych niepolarnych (TPH) dla koniczyny wynosił (64,1%), natomiast dla WWA (trójpiercieniowych) (60,2%) [Małachowska-Jutsz et al., 2000]. Parrish ze współpracownikami [2005] w swoich badaniach osignła take zadowalajce wyniki. Wykazała, e w cigu 9 miesicy przy zastosowaniu koniczyny (Festuca arundinacea Schreb i Melilotus officinalis Lam.) mona osign znaczne obnienie zawartoci WWA (2-piercieniowych 83,5 41,5%; 3-piercieniowych 66,3 53,2%; 4-piercieniowych 45,2 28,4%; 5-6-piercieniowych 26,3 7,9%) [Parrish et al., 2005]. Zbiene wyniki bada z wykorzystaniem koniczyny (Lolium perenne) w swoich pracach przedstawił Olson [Olson et al., 2007, 2008]. Biodegradacj zanieczyszcze ropopochodnych (TPH) podczas procesu bioremediacji mona stymulowa poprzez kontrol poziomu zawartoci azotu i fosforu w ryzosferze traw i koniczyn [Cunningham et al., 1996; Huthinson et al., 2001, 2001a; Li et al., 2005; Dickinson et al., 2006]. Doniesienia literaturowe wskazuj na du skuteczno fitoremediacji w przypadku zestarzałych gruntów z klasycznych gazowni skaonych zanieczyszczeniami ropopochodnymi, a szczególnie WWA charakteryzujcych si właciwoci rakotwórczymi, nisk rozpuszczalnoci w wodzie i silnymi cechami sorpcyjnymi w stosunku do matrycy glebowej. Przy wykorzystaniu do fitoremediacji hybrydowych topoli (Populus deltoides xp nigra DN) oraz wierzby (Salix nigra Marshall) w strefie ryzosfery redukcja zanieczyszcze wynosiła odpowiednio dla: pirenu 45,2%; fluorantenu 39,3%; benzo(p)pirenu 28,3%; fenantrenu 32,3%; antracenu 45,2% [Spriggs et al., 2005]. 81

79 Fitoremediacja zachodzi najintensywniej w strefie korzeniowej, a wic głboko wrastania korzeni stanowi jeden z najwaniejszych czynników ograniczajcych jej zasig. Ponadto wanym ograniczeniem s warunki rodowiskowe w skaonej glebie, a dotyczy to w szczególnoci toksycznoci wynikajcej ze stenia zanieczyszcze. Do tej pory brakuje konkretnych danych na temat maksymalnego stenia produktów ropopochodnych, gdy dowiadczenie fitoremediacyjne prowadzono na glebach zawierajcych stosunkowo niskie stenia tych zwizków. Obróbka agrotechniczna (Landfarming) Obróbka agrotechniczna naley do najczciej stosowanych metod usuwania zanieczyszcze ropopochodnych z gruntów, które utraciły agrotechniczn sprawno. Moe by stosowana w warunkach in-situ w ograniczonym zakresie, tj. w przypadku wystpowania zanieczyszczenia do głbokoci 0,50 m. Polega ona na naturalnej biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych poprzez stosowanie zabiegów agrorolniczych, do których nale: zaorywanie, bronowanie, wapnowanie, nawoenie (dodatek substancji biogennych), nawadnianie w okresie suszy. Czsto wprowadza si modyfikacj wykonywanych zabiegów poprzez inokulacj biopreparatami na bazie mikroorganizmów degradujcych wglowodory ropopochodne, które zostały wyizolowane i namnoone z oczyszczanych z gruntów i osadów dennych [Petersen et al., 1993; Łebkowska, 1996; Atagana et al., 2004; Hejazi et al., 2004; Harmsen et al., 2007]. Metoda ta moe by prowadzona take w warunkach ex-situ. Stałe zanieczyszczone odpady umieszcza si na podłou z przepuszczalnego piasku, z drenaem przyjmujcym i odprowadzajcym odcieki. Optymalna grubo warstwy nakładanych odpadów wynosi cm. Zalenie od chemicznych właciwoci reguluje si zawarto mineralnych składników pokarmowych (nawozowych) i odczynu rodowiska. Wapnowanie zaolejonych odpadów (do ph = 6,5 7,0) jest podane, a nawet konieczne. Stosuje si w tym celu dm 3 wapna nawozowego na 1 m 3 odpadu. W celu przyspieszenia biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych mona przeprowadzi modyfikacj metody poprzez wprowadzenie biopreparatów bakteryjnych [Siuta, 2003]. Przekrój poletka rekultywacyjnego przedstawiono na rys Pryzmy remediacyjne (kompostowanie) Metoda ex-situ polegajca na przemieszczeniu zanieczyszczonego gruntu i ułoeniu go w pryzmie, która zostaje technicznie uzbrojona w system drenay do nawietrzania i odprowadzania odcieków, spryskiwaczy dozujcych substancje biogenne oraz bioreaktorów do namnaania bakterii. Odcieki s biologicznie oczyszczane i zawracane na pryzm. 82

80 Oczyszczony grunt jest stopniowo usuwany z pryzmy i umieszczany na miejscu składowania [Chaîneau et al., 2003; Kołwzan, 2005; Płaza, 2006]. Kompostowanie jest zblionym procesem, lecz prowadzony jest w warunkach stałego mieszania wszystkich składników. Ponadto wykorzystuje si materiały spulchniajce (np. wióry, słoma) w celu napowietrzenia (poprawy stosunków powietrzno-wodnych). lizymetr pomiar wał ziemny wał ziemny drena system zbierania odcieków warstwa nieprzepuszczalna Rys Obróbka agrotechniczna przekrój przez poletko rekultywacyjne [Adamek et al., 1995] Fig Agrotechnical treatment recultivation field vertical (structure) section [Adamek et al., 1995] Metoda bioreaktorowa Bioremediacja gruntów w warunkach ex-situ moe polega na ich wydobyciu i unieszkodliwianiu w bioreaktorach szlamowych, gdzie zachodzi proces biodegradacji zanieczyszcze. Oczyszczanie w bioreaktorach odbywa si w wyniku reakcji biologicznych zachodzcych w zmieszanym z wod gruncie (uwodnienie 60 80%) [Williams et al., 1999; Brown et al., 1998; Rubin et al., 2001; Carberry et al., 2001; Saponaro et al., 2002; Juteau et al., 2003]. W bioreaktorze nastpuje intensywne napowietrzanie i mieszanie zawiesiny z dodatkiem substancji biogennych i biopreparatów bakteryjnych. Czsto w celu desorpcji wglowodorów ropopochodnych nierozpuszczalnych w wodzie dodawane s rodki powierzchniowo-czynne. W metodzie tej istnieje moliwo regulacji temperatury i ph oraz pełnej kontroli przebiegu procesu, co pozwala na znaczne skrócenie czasu prowadzenia procesu w porównaniu z metodami in-situ. Przykładowy schemat ideowy przedstawiono na rys Bioreaktory stosuje si najczciej do oczyszczania mułów, osadów dennych i ciekowych oraz zawiesin zaolejonych, a take zanieczyszczonych pestycydami, PCB oraz niektórymi wglowodorami chlorowanymi. 83

81 Alternatywnym sposobem w stosunku do stosowanych metod biologicznych w bioreaktorach jest utlenianie chemiczne. Jako utleniacze wykorzystuje si czsto podchloryn oraz nadtlenek wodoru [Bogan et. al., 2003]. Wysok efektywno chemicznego utleniania mona uzyska w przypadku fenoli, amin, aldehydów, zwizków siarki. Zastosowanie tej metody dla gruntu ograniczone jest obecnoci trudnych do rozdzielenia składników oraz olejów i smarów, ujemnie wpływajcych na efektywno utleniania. grunt zanieczyszczony sita mikroorganizmy substancje biogenne mieszalnik woda recyrkulacyjna regulacja temperatury bioreaktor sprarka napowietrzanie zawiesina odwodnienie grunt grunt oczyszczony oczyszczony Rys Schemat ideowy oczyszczania gruntu w bioreaktorze Fig Scheme of soil purification in bioreactor 84

82 Opracowanie etapowej technologii oczyszczania odpadów ze starych dołów urobkowych, zanieczyszczonych substancjami ropopochodnymi, wymaga przeprowadzenia kompleksowych bada. Obejmuj one analizy fizyko-chemiczne, mineralogiczne, mikrobiologiczne, a szczególnie analizy chromatograficzne w aspekcie oznacze jakociowych i ilociowych wglowodorów wchodzcych w skład zanieczyszcze ropopochodnych, co ma istotne znaczenie dla okrelenia efektywnoci prowadzonych procesów bioremediacyjnych. Prowadzony monitoring rozszerzono o badania toksykologiczne, pozwalajce na okre- lenie zawartoci substancji toksycznych w oczyszczanej glebie oraz na okrelenie po zakoczeniu procesu oczyszczania sposobu wykorzystania zrekultywowanego terenu. Głównym elementem umoliwiajcym okrelenie stopnia biodegradacji wglowodorów ropopochodnych w prowadzonych procesach bioremediacyjnych było opracowanie chromatograficznych metod analitycznych umoliwiajcych: sumaryczne oznaczenie zawartoci TPH w badanej glebie/odpadzie oraz jakociow i ilo- ciow identyfikacj poszczególnych wglowodorów wchodzcych w skład zanieczyszcze ropopochodnych, kontrol prowadzonych etapów oczyszczania gleby przez wyznaczenie zmian zawartoci wglowodorów ropopochodnych podczas procesu ich biodegradacji, która obok niezaprzeczalnych korzyci wynikajcych ze ledzenia postpu procesów oczyszczania pozwala take na uruchomienie rodków zaradczych w momencie obnienia si skutecznoci, zidentyfikowanie poszczególnych n-alkanów wchodzcych w skład zanieczyszcze TPH oraz BTEX i WWA i okrelenie ich zmian w trakcie prowadzonego procesu, co pozwala na ocen ich biodegradacji, czyli okrelenie efektywnoci procesu, 85

83 identyfikacj wglowodorów z grupy izoprenoidów (pristan i fitan), które nale do wglowodorów trudno biodegradowalnych, co pozwala na okrelenie stopnia biodegradacji wglowodorów ropopochodnych (n-alkanów) w postaci zmian wartoci wskaników n-c 17 /Pr i n-c 18 /F [Brown et al., 1998; Santas et al., 1999; Nadin et al., 2002; Rosa et al., 2007; Steliga et al., 2004c], połczenie wyników analiz chromatograficznych zawartoci substancji ropopochodnych (TPH) z analizami mikrobiologicznymi, co stanowi podstaw przy doborze swoistych mikroorganizmów i grzybów ukierunkowanych na biodegradacj wczeniej zidentyfikowanych zwizków, okrelenie efektywnoci obnienia zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych w oparciu o zastosowane biopreparaty na bazie mikroorganizmów autochtonicznych i grzybów [Steliga et al., 2007b; Steliga, 2008a; Steliga et al., 2009], opracowanie matematycznego modelu biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych podczas prowadzenia bada w skali laboratoryjnej (metoda ex-situ) przy zastosowaniu biomarkera: C 30-17(H),21β(H)-hopanu [Venosa et al., 1996,1997; Prince et al., 1994; Rling et al., 2004a; Xu et al., 2004a; Vias et al., 2005; Dickinson et al., 2006; Steliga, 2008, 2008a, 2008b; Steliga et al., 2009a]. Podstawowymi etapami przygotowania próbek gleby do analizy s: suszenie w temperaturze 40 o C (etap ten słuy równie do wyznaczania ubytku masy gleby, zwizanego z odparowaniem wody i lotnych wglowodorów), rozdrobnienie i przesianie przez sito o rednicy oczek 2 mm. Izolacj i wzbogacenie analitów prowadzi si najczciej metodami ekstrakcyjnymi (do fazy ciekłej, gazowej, nadkrytycznej). Klasyczn metod ekstrakcji w układzie ciecz-ciało stałe mona zmodyfikowa wprowadzajc nowe techniki w celu: skrócenia czasu ekstrakcji, zmniejszenia iloci rozpuszczalników, wydzielania rónych grup analitów. Nale do nich: ekstrakcja sekwencyjna wielokrotna ekstrakcja rónymi rozpuszczalnikami, specyficznymi dla danej frakcji, sonifikacja wspomaganie ekstrakcji ultradwikami (US EPA Method 3550C ultrasonic extraction), ekstrakcja płynem w stanie nadkrytycznym, 86

84 ekstrakcja przyspieszana w podwyszonej temperaturze i pod zwikszonym cinieniem: T=120 o C, P=14 MPa [Fismes et al., 2002; Wilcke et al., 2004; Van de Wiele et al., 2004]. Przebadano szereg rozpuszczalników opierajc si na posiadanych dowiadczeniach [Steliga et al., 2003b; Steliga et al., 2004c] i danych literaturowych: tetrachlorek wgla [Chaîneau et al., 2003], dichlorometan [Spriggs et al., 2005; Hutchinson et al, 2001a; Oh et al., 2001], heksan + chlorek metylenu + chloroform w stosunku 1:1:1 [Arvanitis et al., 2008; Li et al, 2005], heksan + aceton w stosunku 1:1 [Jackson et al, 1999; Xu et al., 2003, 2004a; Dickinson et al., 2006], heksan + dichlorometan w stosunku 1:1 [Katsivela et al., 2003], chlorek metylenu [Sharma et al., 2002], eter naftowy frakcja o C [Steliga et al., 2007, Steliga, 2008]. Jako optymalny rozpuszczalnik wytypowano dichlorometan przy stopniu odzysku 85,7%. Stopie odzysku analitów okrelano za pomoc standardu zastpczego, którym był o-terfenyl [Wang et al., 1994; Saweyr et al., 1996]. Izolacj analitów prowadzono metod rozpuszczalnikow, zmodyfikowan poprzez zastosowanie ultradwików. Zastosowanie w procesie ekstrakcji rozpuszczalnikowej wspomaganej sonifikacj spowodowało zwikszenie stopnia odzysku do 95,6% [Steliga, 2003]. Optymalny czas działania ultradwików o czstotliwoci 30 khz w temperaturze 40 o C wahał si od 20 do 35 minut [Chaîneau et al., 2003; Chang et al., 1992; Roche et al., 1991; Wang et al., 1994]. Dla uzyskania podanego stopnia odzysku analitów z matrycy glebowej wskazane jest powtórzenie ekstrakcji (2-3- krotne) nowymi porcjami rozpuszczalnika. W czasie poddawania próbki procesowi sonifikacji nie stwierdzono powstawania artefaktów. Stenia analitów w ekstraktach rozpuszczalnikowych s niewystarczajce i wymagaj wzbogacenia (zatenia) do poziomu powyej dolnej granicy oznaczalnoci. Oczyszczanie analitów z substancji polarnych przeprowadzono przy zastosowaniu kolumienek sorpcyjnych SPE, wypełnionych sorbentem o nazwie florisil [Van Delef et al., 1994; Waksmundzka-Hajnos, 1998]. Analiz zanieczyszcze ropopochodnych w glebie/odpadzie z dołu urobkowego obejmujc identyfikacj i ilociowe oznaczenie n-alkanów (n-c 6 n-c 44 ), wglowodorów z grupy izoprenoidów (Pr, F), sumarycznej zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych (TPH) oraz biomarkera C 30-17(H)21β(H)-hopanu wykonano na chromatografie Clarus 500 GC/FID firmy Perkin Elmer, wyposaonym w kolumn kapilarn Quadrex

85 (30 m x 0,53 mm) firmy Panalytica, przy przepływie gazu nonego (hel) 20 ml/min, temperaturze inektora PPS = 290 o C i detektora 320 o C. Program temperaturowy dla oznaczania wglowodorów alifatycznych: 30 o C przebieg izotermiczny przez 2 min., 30 o C 105 o C przyrost temperatury 10 o C/min, 105 o C 285 o C przyrost temperatury 5 o C/min, 285 o C przebieg izotermiczny 10 min. Program temperaturowy dla oznaczania biomarkera hopanu: 30 o C przebieg izotermiczny przez 2 min., 30 o C 105 o C przyrost temperatury 10 o C/min, 105 o C 320 o C przyrost temperatury 5 o C/min, 320 o C przebieg izotermiczny 20 min. Do oznaczenia ilociowego sumarycznej zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych (TPH) zastosowano zestaw standardów kalibracyjnych firmy Tusnovic Instruments (certyfikowany wzorzec: BAM K010), natomiast do ilociowego oznaczenia poszczególnych n-alkanów wchodzcych w skład zanieczyszcze ropopochodnych uyto wzorców certyfikowanych firmy Supelco i Restek (mieszanina wzorcowa nr D2807 wglowodorów parafinowych: n-c 6 n-c 44 oraz certyfikowanej mieszaniny wzorcowej nr A029668: Fuel Oil Degradation Mix n-c 17, pristan, n-c 18, fitan). Jako biomarker zastosowano wzorzec certyfikowany C 30-17(H)21β(H)-hopan firmy Supelco nr Do oznaczenia zawartoci BTEX w glebie opracowano metodyk analityczn z wykorzystaniem chromatografu gazowego Clarus 500, w połczeniu z przystawk HeadSpace TurboMatrix 16. Próbk gleby w iloci 3 g umieszczono w ampułce, któr nastpnie zakapslowano i umieszczono w autosamplerze przystawki. Próbk przed analiz wygrzewano przez okres 10 min. w temperaturze 90 o C. Ampułka była napełniana gazem nonym (hel), a nastpnie za pomoc igły dozujcej została pobrana próbka zdesorbowanych analitów gazowych, która przez lini transferow była przesyłana do inektora chromatografu. Analiz chromatograficzn wykonywano na chromatografie Clarus 500 firmy Perkin Elmer przy nastpujcych parametrach: temperatura inektora = 200 o C, temperatura detektora = 280 o C, kolumna RT-TCEP 60 m x 0,25 μm, przebieg temperaturowy pieca 60 o C przebieg izotermiczny przez 5 min, przyrost temperatury od 60 o C do 100 o C z szybkoci 5 o C/min., przebieg izotermiczny 10 min [Kolb et al., 2006]. Oznaczenie jakociowe i ilociowe wykonano z zastosowaniem mieszanin wzorcowych firmy Air Products i Restek. 88

86 W celu oznaczenia w glebie/odpadzie z dołów urobkowych wielopiercieniowych wglowodorów aromatycznych (WWA) opracowano chromatograficzn metodyk analityczn, która pozwala na zidentyfikowanie poszczególnych WWA (16 zwizków) oraz ilociowe okrelenie ich zawartoci wraz z biomarkerem C 30-17(H)21β(H)-hopanem. Badania nad izolacj frakcji aromatycznej metod ekstrakcji rozpuszczalnikowej przeprowadzono z szeregiem mieszanin rozpuszczalnikowych, wytypowanych na podstawie doniesie literaturowych: heksan:aceton 1:1 [Xu et al., 2003,2004; Miya et al., 2001], heksan: aceton 2:1 [Wilcke et al., 2004], heksan aceton 9:1 [Alexander et al., 2002], heksan:dichlorometan 1:1 [Fismes et al., 2002], chlorek metylenu: aceton 1:1 [Parrish et al., 2005; Chadhain et al., 2006], eter naftowy frakcja o C (Merck) [Steliga, 2008]. Porównujc stopie odzysku WWA z gleby przy zastosowaniu rónych układów ekstrahentów i sposobów izolacji frakcji aromatycznej przy uyciu gleby referencyjnej BAM ERMCC013 (firmy Tusnowics Instruments), stwierdzono, e zawiera si on w granicach 89,7 95,7%, przy czym najwyszy stopie odzysku uzyskano dla eteru naftowego frakcji o C, z zastosowaniem poniej przedstawionej metody izolacji frakcji aromatycznej. Metoda izolacji obejmuje: izolacj analitów (WWA), poprzez zastosowanie cigłej ekstrakcji (Soxhlet) za pomoc eteru naftowego o C i zateniu próbki do objtoci 5 ml, wydzielenie frakcji WWA przy zastosowaniu dwufazowych kolumienek Bakerbond SPE PAH Soil zawierajcych fazy: 500 mg cyjano/1000 mg silicagel, elucj analitów, z zastosowaniem mieszaniny rozpuszczalników aceton:toluen (3:1) w dawkach 3 x 3 cm 3, oczyszczenie analitu, z wykorzystaniem kolumienek SPE z faz Florisil firmy Supelco. Operacje te (z wyjtkiem ekstrakcji Soxhlet a) przeprowadzono w zestawie do ekstrakcji metod SPE firmy Baker. Analiz chromatograficzn umoliwiajc oznaczenie 16 WWA, sumarycznej zawartoci WWAs oraz hopanu wykonano na chromatografie Clarus 500 GC firmy Perkin Elmer, wyposaonym w kolumn kapilarn RTX-440, przy programie temperaturowym: 40 o C 89

87 przebieg izotermiczny przez 2 min, o C przyrost temperatury 30 o C/min, o C przyrost temperatury 8 o C/min, 320 o C przebieg izotermiczny przez 10 min. Do identyfikacji 16 WWA oraz ich ilociowego oznaczenia zastosowano zestaw standardów kalibracyjnych firmy Restek: mieszaniny certyfikowane zawierajce rozpuszczone 16 WWA w chloroformie: nr (po 2000 g/cm 3 ), Nr w zakresie g/cm 3, nr w zakresie g/cm 3. Mieszaniny te posłuyły do sporzdzenia krzywej kalibracyjnej (w programie TurboChrom 6.1), co umoliwia ilociowe oznaczenie poszczególnych WWA. Jako wzorzec biomarkera zastosowano certyfikowany wzorzec C 30-17(H)21β(H)- hopan firmy Supelco. Zastosowanie metodyki chromatograficznego oznaczania substancji ropopochodnych w ciekach (odciek) wymaga przeprowadzenia ich do innej matrycy oraz zwikszenia ich stenia. Dogodn i dokładn metod zatania substancji ropopochodnych bezporednio z wody jest ekstrakcja na złou sorpcyjnym metod ekstrakcji cigłej (Solid Phase Extraction SPE). Procedura ekstrakcji do fazy stałej składa si z nastpujcych po sobie etapów, wród których mona wyróni: kondycjonowanie złoa (dwukrotne przemywanie warstwy sorpcyjnej kolumienki metanolem w dawkach po 3 cm 3, a nastpnie przepłukanie złoa 2 porcjami wody destylowanej po 2 cm 3 ), przeprowadza si w urzdzeniu Flash Master Personal, nie dopuszczajc do wyschnicia złoa, zatenie próbki na złou sorpcyjnym kolumienki SPE przy skorygowanym odczynie (ph fazy wodnej), który na podstawie bada dla kolumienki z faz fenylow, przyjto ph = 5,0 [Steliga et al., 2003b; Steliga et al., 2004b; Steliga, 2005b], elucja zaadsorbowanych zanieczyszcze ropopochodnych z kolumienek SPE za pomoc dichlorometanu, którego wybór podyktowany był jego czasem retencji w analizie chromatograficznej (wyeliminowanie interferencji z pikami analizowanych wglowodorów) oraz efektywnoci wymywania substancji ropopochodnych (89,9%), oczyszczanie ekstraktu substancji ropopochodnych ze zwizków polarnych na kolumience z wypełnieniem Florisil, zatenie ekstraktu do poziomu stenia powyej granicy oznaczalnoci stosowanej metody analitycznej przy pomocy aparatu Kundera-Danischa. 90

88 Analiza chromatograficzna majca na celu identyfikacj analitów oraz ilociowe oznaczenie poszczególnych składników i sumarycznej zawartoci wglowodorów ropopochodnych (TPH), wykonana została na chromatografie Clarus 500 firmy Perkin Elmer z kolumn kapilarn DB (30 m x 0,53 mm) firmy Panalytica. Temperatura detektora FID = 300 o C, temperatura inektora PPS = 250 o C, gaz nony hel (15 ml/min), program temperaturowy: 28 o C przebieg izotermiczny przez 1 min., o C przyrost temperatury 10 o C/min, 250 o C przebieg izotermiczny przez 20 min. Analiz ilociow (n-c 6 n-c 44, pristan, fitan, TPH) wykonano w oparciu o wzorce kalibracyjne firm Supelco i Restek, które posłuyły do sporzdzenia krzywych kalibracyjnych w programie TurboChrom 6.1. Do oznaczenia zawartoci BTEX w ciekach opracowano metodyk analityczn z wykorzystaniem chromatografu gazowego Clarus 500 w połczeniu z przystawk HeadSpace Turbo- Matrix 16. Próbk zanieczyszczonych cieków w iloci 10 ml umieszczono w ampułce, któr nastpnie zakapslowano i umieszczono w autosamplerze przystawki. Próbk przed analiz wygrzewano przez okres 10 min. w temperaturze 80 o C. Po uzyskaniu równowagi termodynamicznej pomidzy faz wodn i faz gazow w zamknitym naczyniu, ampułka była napełniana gazem nonym (hel), a nastpnie za pomoc igły dozujcej była pobierana pobrana próbka zdesorbowanych analitów gazowych, która przez lini transferow była przesyłana do inektora chromatografu [Kolb et al.,2006]. Oznaczenie ilociowe i jakociowe analitów wykonywano przy zastosowaniu parametrów układu chromatograficznego identycznych, jak przy oznaczaniu BTEX w glebach. W celu chromatograficznego oznaczenia WWA w ciekach zastosowano metod polegajc na zataniu substratów bezporednio ze cieków metod ekstrakcji cigłej na złou sorpcyjnym (Soil Phase Extraction SPE). Procedura obejmuje nastpujce etapy: przygotowanie próbki polegajce na dodaniu 12 mg hyaminy 1622 do 1 dm 3 cieków, kondycjonowanie kolumienki 500 mg Amino/1000 mg oktadecyl (SPE Bakerond PAH Aqua) poprzez przemycie rozpuszczalnikami: 91

89 o o 1 x 4 ml cykloheksanu, 1 x 4 ml dichlorometanu, po kadym przemyciu rozpuszczalnikiem naley suszy złoe kolumienki przez 15 s (za pomoc powietrza), wskazane jest naniesienie 1 x 5 ml 2-propanolu i pozostawienie na 2 min., przepuszczanie próby wody przez kolumienk Bakerbond SPE PAH-Aqua z prdkoci 3-4 krople na sekund, przeprowadzenie elucji za pomoc rozpuszczalników (kadorazowo czas przepływu około 10 min.): o o 2 x 3 ml dichlorometanu, 1 x 2 ml dichlorometanu, zatenie ekstraktu do poziomu stenia powyej granicy oznaczalnoci stosowanej metody analitycznej w strumieniu azotu w temperaturze 37 o C przy pomocy aparatu Kundera- Danischa. Analiz chromatograficzn analitu wykonano na chromatografie Glarus 500 firmy Perkin Elmer, w programie temperaturowym opracowanym przy oznaczaniu WWA w glebie/odpadach (rozdział 5.1.3). W rentgenowskiej analizie fazowej wykorzystuje si zjawisko dyfrakcji (ugicia) promieni rentgenowskich na elementach strukturalnych ciała krystalicznego. Sie krystaliczna spełnia rol trójwymiarowej siatki dyfrakcyjnej. Zaleno kierunków interferencyjnie wzmocnionego promieniowania rentgenowskiego od odległoci midzypłaszczyznowych okrela równanie Bragga. Ugicie promieni rentgenowskich zwizane jest z interferencj fal elementarnych odbitych od systemu równoległych płaszczyzn sieciowych i zachodzi tylko przy ktach padania (odbłysku) okrelonych wzorem Bragga. Kad substancj krystaliczn charakteryzuje zbiór odległoci midzypłaszczyznowych zwizanych z charakterystycznym układem płaszczyzn sieciowych w komórce elementarnej, który jest uzupełniony zbiorem intensywno- ci odpowiadajcych im refleksów rentgenowskich (zmierzonych jako powierzchnia lub wysoko danego refleksu na dyfraktogramie). Badania rentgenowskie wykonywano na dyfraktometrze X Pert MPD firmy Philips (lampa rentgenowska Cu) wyposaonym w wysokostabilizowany generator wysokiego napicia, goniometr w układzie - z elektronik kontroln połoenia, gity monochromator grafitowy oraz ksenonowy detektor proporcjonalny. Zastosowano nastpujcy układ optyczny: 92

90 optyka wizki pierwotnej składa si ze szczeliny Solera 0,04 rad i szczeliny dywergencyjnej 1 o, a optyka wizki wtórnej ze szczeliny antyrozproszeniowej ¼ o i szczeliny odbiorczej 0,15 nm. Przy wszystkich pomiarach zastosowano napicia wzbudzenia 40 kv, natenia prdu anodowego 34 ma oraz krok pomiarowy 0,02 o 2. Zakres pomiarowy zmieniano w zalenoci od celu prowadzenia analizy i wynosił on odpowiednio: przy oznaczaniu składu ilociowego całej próbki od 5 do 65 o 2, przy analizie jakociowej frakcji ilastej wykonywanej na preparatach sedymentowanych od 2 o do 50 o 2. Rentgenowska analiza jakociowa. Analiz jakociow składu gleby/odpadów z dołu urobkowego przeprowadzono na preparatach proszkowych prasowanych (rednica ziaren w preparatach wynosiła poniej 20 m). Identyfikacji refleksów pochodzcych od poszczególnych minerałów na dyfraktogramach rentgenowskich dokonano w oparciu o karty identyfikacji ICDD, opublikowane przez Joint Committee on Powder Diffraction Standards oraz zestawienia podane przez Moor a i Reynolds a. Połoenie refleksów wyznaczono przy pomocy programu PC-APDW 4.0b Philipsa. Rentgenowska analiza ilociowa. Analiza została przeprowadzona metod wzorca wewntrznego zgodnie z procedur opracowan specjalnie dla skał zawierajcych du ilo minerałów ilastych [rodo et al., 1984; 2001]. Wzorcem wewntrznym w tej metodzie jest tlenek cynku (ZnO). Zawarto danego minerału w mieszaninie jest proporcjonalna do intensywnoci refleksu diagnostycznego tego minerału na dyfraktogramie rentgenowskim. W rentgenowskiej analizie ilociowej właciwa preparatyka jest nieodzowna dla uzyskania poprawnych wyników. Próbka zostaje zmielona do odpowiedniej wielkoci ziaren (poniej 20 m) i homogenicznie wymieszana ze wzorcem wewntrznym ZnO. Pomiary przeprowadza si na preparatach dezorientowanych, ładowanych z boku, co zapewnia uzyskanie rzeczywistych proporcji składników mineralnych wystpujcych w próbce. Analiza ilociowa składu mineralnego przeprowadzona została przy pomocy programu RockJock [Eberl, 2003]. Program tworzy dyfraktogram symetryczny z sumy dyfraktogramów czystych minerałów wzorcowych dobranych w odpowiednich proporcjach i porównuje go do dyfraktogramu mierzonej próbki. Coraz lepsze dopasowanie obu dyfraktogramów uzyskiwane jest poprzez zmian układu poszczególnych składników (minerałów wzorcowych) program wykorzystuje w tym celu funkcj Solver Excela. Identyfikacja minerałów ilastych. Minerały ilaste charakteryzuj si bardzo drobnym uziarnieniem (poniej 2 m), tworz kryształy o pokroju blaszkowatym i podczas sedymenta- 93

91 cji łatwo jest uzyska preparat, w którym wszystkie czstki s jednakowo zorientowane w kierunku prostopadłym do osi Z. Na dyfraktogramie preparatu sedymentowanego obserwujemy tylko refleksy pochodzce od płaszczyzn serii 001, które cechuj si du intensywno- ci. W celu wydzielenia frakcji ilastej próbki gleby/odpadu z dołu urobkowego zostały poddane odpowiedniej obróbce chemicznej (usuwanie wglanów, substancji organicznych i elaza, wymiana kationowa), a nastpnie wydzielono z nich frakcj ziarnow. Wykonano preparaty sedymentowane i zarejestrowano je po glikolowaniu, stosujc nastpujce warunki pomiarowe: napicie wzbudzenia 40 kv, prd anodowy 34 ma, czas nawietlania 2,5 s, krok pomiarowy 0,02 o (2 ), zakres ktowy pomiaru 2 50 (2 ). Przed przystpieniem do okrelenia liczebnoci mikroorganizmów w odpadzie wiertniczym pochodzcym z dołów urobkowych, 10 g wieego i ujednoliconego odpadu umieszczono aseptycznie w 90 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej zawierajcego 0,18% pirofosforanu sodu (Na 4 P 2 O 7 ). Cało wytrzsano przez 30 min., 200 obr./min. w temperaturze pokojowej. Po tym okresie nadscz przenoszono do sterylnej kolby, a nastpnie pobierajc 1 ml dokonywano seryjnych rozciecze. 1 ml kadego rozcieczenia wysiewano na szalki Petriego (metoda płytek lanych Kocha), albo do probówek pomiarowych (metoda NPL najbardziej prawdopodobnej liczby). Ogóln liczb mikroorganizmów oznaczano na podłou stałym o nastpujcym składzie na 1 litr: glukoza 0,5 g, ekstrakt drodowy 0,5 g, pepton 0,5 g, enzymatyczny hydrolizat kazeiny 0,5 g, skrobia rozpuszczalna 0,5 g, pirogronian sodu 0,3 g, K 2 HPO 4 0,3 g, MgSO 4 * 7 H 2 O 0,05 g, agar 15 g, ph =7,2. Ogóln liczb grzybów oznaczano na stałym podłou Czapex-Dox (zmodyfikowanym) zawierajcym odpowiednio na 1 litr: sacharoza 10 g, NaNO 3 3 g, K 2 HPO 4 1 g, KCl 0,5 g, MgSO 4 * 7 H 2 O 0,5 g, FeSO 4 * 7 H 2 O 0,01 g, agar 15 g, streptomycyna 30 mg, chlorotetracyklina 2 mg, ph = 7,3. W celu oznaczenia całkowitej liczby mikroorganizmów zdolnych do rozkładu zwizków ropopochodnych (mikroorganizmów utleniajcych wglowodory) stosowano podłoe mineralne wg Kijewskiej na 1 litr: NaCl 1 g, K 2 HPO 4 1 g, K 2 HPO 4 1 g, KNO 3 1 g, MgSO 4 0,2 g, CaCl 2 0,02 g, FeCl 3 1 mg, ropa naftowa 10 ml. 94

92 Oznaczenie wykonywano metod NPL w obecnoci chlorku jodonitrotetrazoliowego (3 g/l) wg [Wrenn et al., 1996]. Do podłoa mineralnego dodawano 2 ml roztworu mikroelementów o składzie na 1 litr: cytrynian elaza (III) 1 g, MnCl 2 4 H 2 O 10 mg, ZnCl 2 5 mg, LiCl 5 mg, KBr 2,5 mg, KI 2,5 mg, CuSO 4 5 mg, CaCl 2 1 g, Na 2 MoO 4 * 2 H 2 O 1 mg, CoCl 2 5 mg, SnCl 2 H 2 O 0, 5 mg, BaCl 2 0,5 mg, AlCl 2, 1 mg, H 3 BO 4 10 mg, EDTA 20 mg. Analizy prowadzono w temp. 25 o C. Mikroorganizmy izolowano z prób gleby pochodzcej z dołów urobkowych, na podłou mineralnym z dodatkiem 15 g agaru oraz ropy naftowej. Do izolacji wykorzystano po 10 prób (min. 100 g) pobranych w rónych miejscach kadego dołu urobkowego w celu uzyskania duej rónorodnoci gatunkowej mikroorganizmów zdolnych do degradacji substancji ropopochodnych. Wybrane kolonie przenoszono nastpnie na takie samo podłoe, ale płynne w celu wykluczenia mikroorganizmów wyrosłych na płytkach agarowych, wykorzystujcych ewentualne zanieczyszczenia obecne w agarze, wzgldnie pozostałoci zwizków organicznych pochodzcych z wysiewanych prób gleby. Mikroorganizmy ponownie przenoszono na podłoe stałe i dokonywano standardowego posiewu redukcyjnego w celu uzyskania czystych szczepów. Posiew redukcyjny powtarzano 3-7 razy, a wyizolowane w ten sposób szczepy dodawano do banku szczepów INiG. Poniewa analizy chromatograficzne wykazały istotn przewag wglowodorów alifatycznych w badanych zanieczyszczeniach ropopochodnych, selekcj prowadzono na podłou mineralnym z dodatkiem n-heksadekanu. Szczepy wykorzystujce n-heksadekan jako jedyne ródło wgla kwalifikowano do dalszych bada. W badaniach tych analizowano podstawowe cechy, takie jak ruchliwo, wzrost w warunkach tlenowych/beztlenowych, w zakresie temperatur 4 o C 40 o C, w szerokim zakresie ph oraz tolerancj stenia NaCl do 10%. Badania szczegółowe obejmowały zdolno wykorzystywania ropy naftowej i rozmaitych wglowodorów, jako jedynego ródła wgla. Ze wzgldu na fakt, e ropa naftowa moe zawiera zwizki hamujce wzrost mikroorganizmów, oprócz ropy naftowej pochodzcej z kopalni Grabownica wykorzystano ropy pochodzce z trzech innych złó, zlokalizowanych na Podkarpaciu. Jeli chodzi o wglowodory, to badano najpierw zdolno wykorzystania n-oktadekanu, jako jedynego ródła wgla (C 18 w naszej strefie klimatycznej po dostaniu si do gleby zachowuje praktycznie przez cały czas stały stan skupienia), a nastpnie innych wglowodorów alifatycznych i aromatycznych (w zale- 95

93 noci od potrzeb wykorzystywano podłoe mineralne ciekłe lub stałe). Badane wglowodory alifatyczne to: n-hepan, n-dekan, n-dodekan, n-nonadekan, n-dokozan i n-heksakozan, natomiast aromatyczne to: fenol, toluen, ksylen i naftalen. W przypadku wglowodorów lotnych oraz ropy naftowej, inkubacj prowadzono w eksykatorach w ich atmosferze, wglowodory o ciekłym stanie skupienia dodawano bezporednio do podłoa, a wglowodory charakteryzujce si stałym stanem skupienia albo dodawano bezporednio do podłoa (podłoe płynne), albo pokrywano nimi płytki agarowe stosujc metod sublimacji [Alley et al., 2000]. Wybierano mikroorganizmy cechujce si zdolnoci degradowania zarówno wglowodorów alifatycznych i aromatycznych, wzgldnie szerokiego spektrum wykorzystywania wglowodorów alifatycznych. Kolejnym kryterium selekcji była szybko tworzenia biofilmu na granicy faz, gdy w podłou mineralnym obecny był n-heksadekan, jako jedyne ródło wgla. Test wykonywano w kolbach 100 ml zawierajcych 75 ml podłoa + 5 ml n-heksadekanu, przenoszc kolonie rosnce uprzednio na podłou stałym, wzbogaconym zawierajcym dodatkowo octan sodu lub glukoz. Pozwalało to oceni jak szybko mikroorganizmy s w stanie dostosowa swój metabolizm do korzystania z wglowodorów. Test ten jest wiarygodniejszy, ni monitorowanie tempa wzrostu mikroorganizmów, gdy hodowla jest wytrzsana na wytrzsarce, poniewa wzrost na granicy faz lepiej odzwierciedla sytuacj panujc w warunkach naturalnych, gdy dostpno hydrofobowego substratu jest utrudniona. Ponadto nie faworyzuje organizmów szybko rosncych. Identyfikacj mikroorganizmów przeprowadzono zarówno metodami klasycznymi, jak i molekularnymi. Do oznaczenia bakterii korzystano z Bergey s Manual of Deteminative Bacteriology [Holt et al., 1994], a do oznaczenia grzybów korzystano z Identifying Filamentous Fungi: A Clinical Laboratory Handbook [St-Germain et al., 1996] oraz czciowo z atlasu Grzyby Pleniowe [Piontek, 1999]. Metody klasyczne obejmowały: ocen morfologii mikroorganizmów: kształt i barwa kolonii wyrosłych na podłou agarowym, a take grzybni (plechy) grzybów i pseudogrzybni promieniowców, techniki mikroskopowe: kształt komórek, konidioforów i konidiów, ocena ruchliwoci, barwienie metod Grama (fiolet krystaliczny, jodyna Grama, alkohol etylowy 95% i fuksyna karbolowa), Ziehl-Nielsena (bakterie kwasooporne: fuksyna karbolowa, 3% HCl 96

94 w alkohol etylowym, błkit metylenowy 3%), barwienie spor Dornera w modyfikacji Snydera (fuksyna karbolowa, alkohol etylowy 95%, nigrozyna 10%), barwienie otoczek (czerwie Kongo + barwnik Maneval a), badanie cech biochemicznych: katalaza, oksydaza, arylosulfataza, β-galaktozydaza, hydroliza eskuliny, kazeiny mocznika i elatyny, redukcja azotanów, tworzenie indolu, siarkowodoru, zastosowanie selektywnych podłoy. Wykorzystywano podłoa dostpne handlowo, lub przygotowywano je samodzielne w oparciu Handbook of Microbiological Media [Atlas, 2000]. Stosowano nastpujce selektywne podłoa dla: Acinetobacter zmodyfikowane LAM (na 1 litr: enzymatyczny hydrolizat kazeiny 15 g, pepton sojowy 5 g, NaCl 5 g, D-frukoza 5 g, sacharoza 5 g, D-mannitol 5 g, l-fenyloalanina 1 g, cytrynian elazowo-amonowy 0,4 g, czerwie fenolowa 0,02 g, agar 12 g, ph = 7,0), Agrobacterium (na 1 litr: mannitol 10 g, NaNO 3 4 g, MgCl 2 2 g, propionian wapnia 1,2 g, Mg 3 (PO 4 ) 2 0,2 g MgSO 4 0,1 g, MgCO 3 0,0075 g, NaHCO 3, suplement 100 ml, agar 20 g, ph = 7,1. Skład 100 ml suplementu: chlorek berberyny 0,275 g, cykloheksymid 0,2 g, bacytracyna 0,1 g, Na 2 SeO 3, penicylina G sól sodowa, siarczan streptomycyny 0,06 g), Bacillus (dostpne handlowo Fluka 92325), Fusarium DCPA (na 1 litr: pepton bakteriologiczny 15 g, KH 2 PO 4 1 g, MgSO 4 * 7 H 2 O 0,5 g, chloramfenikol 0,2 g, 2,6-dichloro-4-nitroanilina 0,2% roztwór w 95% etanolu 1 ml, agar 20 g, ph =6,2), Micrococcus zmodyfikowane FTO (CASO Agar dostpne handlowo, Merck , zawierajcy dodatkowo na 1 litr: tween 80-5 g, ekstrakt drodowy 1 g, furazolidon 50 mg, oil red 0,5% roztwór w acetonie 0,1 ml), Mycobacterium (Loewenstein-Jensen dostpne handlowo Merck ), Nocardia (MTM dostpne handlowo Thayer Martin Agar Base, Merck Thayer Martin Supplement I, Merck , Pseudomonas (dostpne handlowo Merck ). Wykonano tylko niektóre niezbdne oznaczenia, poniewa rutynowo identyfikowano mikroorganizmy wykorzystujc dostpne handlowo testy biochemiczne oraz automatyczny 97

95 system Mini API firmy Biomerieux, znajdujcy sie na wyposaeniu Zakładu Mikrobiologii INIG. Wykorzystano testy: ID 32GN, ID 32STAPH do identyfikacji automatycznej w aparacie Mini API oraz API Coryne i API 50CHB do identyfikacji manualnej. Dla przykładu ID 32 GN jest standaryzowanym zestawem do automatycznej identyfikacji pałeczek gram-ujemnych, który wykorzystuje 32 zminiaturyzowane testy asymilacyjne (biochemiczne) i baz danych. Składa si z 32 studzienek, z których kada zawiera odwodniony substrat (w wikszoci jest to substrat wglowodanowy). Na półpłynne, ubogie podłoe nanosi si zawiesin badanego mikroorganizmu i po godzinach inkubacji wykrywa si wzrost w kadej studzience przy uyciu aparatu miniapi. W studzience oznaczonej 1.0 znajduje si L-ramnoza, w studzience 1.1 N-acetyloglukozamina, w studzience 1.2 D-ryboza, 1.3 inozytol itd. Sekwencjonowanie DNA kodujcego 16S rrna bakterii [Weisburg et al., 1991] i 18S rrna grzybów zostało wykonane w Centrum Bada DNA, Laboratorium Genetyki Medycznej, ul. Mickiewicza 31, Pozna. DNA genomowy izolowano na podstawie zmodyfikowanej metody Marmura [1961] wykorzystujcej ekstrakcj roztworem fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (stosunek objtociowy 25:24:1). Nastpnie zastosowano metod enzymatycznej amplifikacji (PCR-I ang. polymerase chain reaction, czyli reakcji łacuchowej polimerazy) fragmentów DNA przy uyciu starterów flankujcych ok. 500 nukleotydowy fragment badanego genu i oceniano długo fragmentów DNA na elu agarozowym. Kolejny etap to enzymatyczna reakcja sekwencjonowania (PCR-II) z wykorzystaniem zestawu do sekwencjonowania BigDye Terminator v 3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Sequencing Kit firmy Amersham Biosystems. Analiz sekwencjonowania wykonano przy uyciu sekwenatora kapilarnego ABI Prizm 3100 Genetic Analyser. Identyfikacja była moliwa dziki bazie danych sekwencji 16S rdna MicroSeq, jak równie dziki programowi BLAST, znajdujcemu si na stronie National Center of Biotechnology Information pod adresem Naley jednak w tym miejscu podkreli, e identyfikacja metodami klasycznymi (tzn. opierajca si na cechach fenotypowych), w przypadku mikroorganizmów glebowych cechujcych si du zmiennoci, jest zadaniem trudnym, a oznaczenie do poziomu gatunku 98

96 w wielu przypadkach niemoliwym. Ponadto zarówno poznawanie nowych gatunków, jak i reklasyfikacja tych uprzednio scharakteryzowanych, cał, spraw jeszcze utrudnia. Porównywanie sekwencji kodujcych 16S rrna bakterii i 18S rrna grzybów jest duym ułatwieniem, ale znaczna cz dostpnych do porównania sekwencji dotyczy jednak poziomu rodzaju, a nie gatunku, tak wic identyfikacja te moe by obarczona niepewnoci, poza tym znane s przypadki gatunków o niemal identycznym 16S rrna, niepozwalajacym na ich rozrónienie bez poznania reszty genomu [Rosello-Mora et al., 2001]. Na podstawie bada przeprowadzonych tradycyjnymi technikami molekularnymi oraz metodami molekularnymi, najlepsze szczepy wykorzystano do przygotowania biopreparatów. Podstawowym problemem, jaki naleało przezwyciy, było wybranie tych mikroorganizmów, które nie tylko bd mogły koegzystowa ze sob, ale równie maksymalnie skutecznie degradowa substancje ropopochodne w glebie. Teoretycznie wydaje si, e najlepsze rozwizanie to otrzymanie hodowli wzbogaconej, gdy jedynym ródłem wgla jest ropa naftowa. Uycie ropy naftowej zamiast mieszaniny wglowodorów pozwala namnoy mikroorganizmy zdolne do degradacji szerokiego spektrum zwizków. To rozwizanie niesie za sob jednak niebezpieczestwo otrzymania tylko mikroorganizmów szybko rosncych, a niekoniecznie najbardziej podanych z punktu widzenia zdolnoci degradacyjnych. Ponadto moe si zdarzy, e na skutek oddziaływa antagonistycznych pomidzy mikroorganizmami otrzymana zawiesina bdzie zawiera tylko dwa lub trzy mikroorganizmy. Dlatego lepszym wydało si uprzednie wyizolowanie tak wielu mikroorganizmów, jak to moliwe, a nastpnie stworzenie na ich bazie biopreparatów. Mikroorganizmy łczono ze sob i hodowano na rozmaitych podłoach, zarówno na mineralnym z dodatkiem ropy naftowej lub wglowodorów modelowych (n-alkanów), jak i innych zwizków (octan, mleczan, pirogronian, glukoza itp), jako jedynego ródła wgla. Testowano równolegle hodowle prowadzone na podłou wzbogaconym w obecnoci lub braku wglowodorów. Nastpnie analizowano skład gatunkowy badanego konsorcjum, sprawdzajc czy nie nastpiła zmiana w jego składzie oraz czy wszystkie szczepy namnaaj si do satysfakcjonujcego poziomu. Przyjto zasad, e minimalna gsto, do jakiej namnaa si dany mikroorganizm, nie moe by mniejsza ni 1*10 6. Ponadto testowano szybko wzrostu mikroorganizmów na rozmaitych podłoach. Liczb mikroorganizmów monitorowano turbidymetrycznie, a dokładne oznaczenia wykonywano na 99

97 podłou stałym metod płytkow. Ostatecznie stwierdzono, e dla obu biopreparatów korzystne bdzie namnaanie mikroorganizmów w podłou wzbogaconym, zawierajcym 2% octanu sodu, a niezawierajcym wglowodorów. Pominicie wglowodorów podyktowane było take tym, e wstpn hodowl cigł prowadzono w fermentorze laboratoryjnym w Miniforms firmy INFORS AG, a obecno wglowodorów w medium hodowlanym miało niekorzystny wpływ na prac urzdzenia. Fermentor pozwalał na cigł hodowl mikroorganizmów w kontrolowanych warunkach temperatury (30 o C), odczynu rodowiska (ph = 7,0) i stenia tlenu (15 20 mg/l przy zachowaniu normalnego cinienia), i w zwizku z tym na szybkie osignicie maksymalnej liczby mikroorganizmów tj. na poziomie Jednak ze wzgldu na niewielkie rozmiary urzdzenia (365 mm 370 mm 550 mm), dalsz hodowl prowadzono w butlach o poj. 5 i 10 litr, łagodnie wytrzsajc zawarto (50 obr./min). Cały czas w trakcie hodowli monitorowano liczb i gatunek mikroorganizmów w biopreparatach. Mikroorganizmy poddane zostały badaniom identyfikacyjnym, okrelono ich przynaleno rodzajow oraz gatunkow dla wybranych, szczególnie aktywnych szczepów (analiza sekwencjonowania). Wykonano, równie badania z uyciem selektywnych podłoy majce na celu wykluczenie w biopreparatach mikroorganizmów patogennych. Wykorzystano PET Agar dla Bacillus anthracis (dostpne handlowo Fluka 55678), Cetrimide Agar dla Pseudomonas aeruginosa (dostpne handlowo Fluka 22470), HiCrome Salmonella Agar dla Salmonella i Escherichia coli (dostpne handlowo Fluka 05538), Baird-Parker Agar + Baird-Parker Sulfa Supplement + Baird-Parker RPF Supplement dla Staphylococcus aureus (dostpne handlowo Fluka 11705, B2052, 05939). Badania obecnoci tych mikroorganizmów s wymagane przez PZH przy wydawaniu atestów dla komercyjnych biopreparatów. Dodatkowo wykonano badania na obecno Enterococcus z wykorzystaniem Enterococus Selective Agar (dostpne handlowo Fluka 45183) i na obecno Clostridium perfringens z wykorzystaniem TSC Agar (dostpne handlowo Fluka 93745), stosujc metod filtracji membranowej. Nie wykazano obecnoci adnego z mikroorganizmów patogennych ani kałowych. Dziki wykonanym badaniom, na podstawie listy kategorii bezpieczestwa wg klasyfikacji stosowanej przez ATCC mona stwierdzi, czy opracowany biopreparat nie zawiera mikroorganizmów patogennych. 100

98 Oznaczanie aktywnoci dehydrogenazowej Pomiar aktywnoci dehydrogenazowej wykonano zmodyfikowan metod Casidy [Li et al., 2005; Xu et al., 2004], wykorzystujc zasad, e barwny chlorek trójfenylotetrazoliowy (TTC) jest akceptorem wodoru i ulega redukcji do formazanu, przyjmujc w roztworze czerwon barw. Intensywno zabarwienia jest miar aktywnoci dehydrogenazowej. Do probówki odwaono 5 g odpadu, który zmieszano z 1 ml 3% roztworu TTC, próbk intensywnie wymieszano i zamknito korkiem. Probówki inkubowano w temperaturze 37 o C przez 24 godziny w ciemnoci. Nastpnie dodawano 10 ml metanolu w celu wyekstrahowania powstałego formazanu (TF), intensywnie mieszano i cało przefiltrowano przez twardy sczek bibułowy. Przescz zbierano do kolb miarowych o pojemnoci 100 ml, a po ekstrakcji dopełniano metanolem. Intensywno zabarwienia ekstraktów metanolowych mierzono spektrofotometrycznie (spektrofotometr Labmda 40 firm Perkin Elmer) przy długoci fali 485 nm. Zawarto formazanu (TF) okrelono na podstawie wyznaczonej krzywej kalibracyjnej. Oznaczanie aktywnoci celulazowej Ze wzgldu na to, e celuloza jest najpowszechniej spotykanym wielocukrem rolinnym, jej mikrobiologiczny rozkład jest wanym procesem zachodzcym w glebie. Za wiksz cz tego procesu odpowiedzialne s grzyby, a aktywno celulazowa jest uznawana za jeden ze wskaników procesów biologicznych przebiegajcych w glebie. Pod pojciem aktywnoci celulazowej rozumiana jest suma aktywnoci trzech enzymów: endo-β-1,4-glukanazy, egzo-β- 1,4-glukanazy i β-glukozydazy. Aktywno celulazow oznaczano wg [Schinner et al., 1990]. Metoda ta pozwala w zasadzie na oznaczenie tylko aktywnoci endo-β-1,4-glukanazy i β-glukozydazy, ale jest zalecana dla gleb z terenów lenych. Metodyka oznaczania: 5 g odpadu umieszczano w kolbie, dodawano 15 ml buforu octanowego (2 M, ph = 5,5) i 15 ml 0,7% (w/v) roztworu karboksymetylocelulozy (KMC-sól sodowa) i inkubowano przez 24 godz. w temperaturze 50 o C. Po inkubacji zawiesin gleby przesczano. Próbk kontroln stanowiła taka sama zawiesina, do której dodawano 15 ml KMC po inkubacji tu przed sczeniem. 1 ml przesczu rozcieczano wod destylowan do objtoci 30 ml. Pobierano 1 ml roztworu, w którym zawarto cukrów redukujcych oznaczano z uyciem odczynnika dinitrosalicylowego, mierzc absorbancj przy 520 nm (spektrofotometr Marcel Media Eko). 101

99 W badaniach respirometrycznych dokonywano pomiaru poboru tlenu z wykorzystaniem systemu pomiarowego OxiTop Control firmy WTW. Podstaw metody jest rejestracja zuycia tlenu przez mikroorganizmy aerobowe przy jednoczesnym wydzieleniu dwutlenku wgla, który jest absorbowany w 1M roztworze NaOH. Zestaw OxiTop składa si z główki pomiarowej, kontrolera oraz naczynia pomiarowego z przykrywk zamykajc. Do naczy pomiarowych odwaano g badanego materiału glebowego przesianego przez sito i inkubowanego w temperaturze 20 o C w szafie termostatycznej. Nastpnie w naczyniu sorpcyjnym umieszczano 50 ml 1M roztworu NaOH i dokrcano główki pomiarowe OxiTop. Zestaw umieszczano w szafie termostatycznej w temperaturze 20 o C. Rejestracj wyników prowadzono przez okres 12 h. Na zakoczenie odczytywano wartoci zmian cinienia za pomoc kontrolera i przenoszono do komputera. Do tego celu wykorzystywano oprogramowanie ACHAT OC v Podstaw do oblicze było równanie: BA = [M R (O) 2 /(RT)] * [V fr /m Bt ] * [Δp] (2) gdzie: BA oddychanie gleby [mgo 2 /kg], M R(O)2 masa molowa tlenu [32000 mg/mol], V fr współczynnik bjtoci gazu [0,78 (200 g), 0,95 (150 g)], R stała gazowa [83,141 hpa mol -1 K -1 ], T temperatura pomiarowa [293 K], m Bt masa suchej gleby w zestawie pomiarowym [kg], Δp spadek cinienia w układzie pomiarowym [hpa]. Wszystkie pomiary wykonano w trzech powtórzeniach. Fot Zestaw OxiTop z podstaw mieszajc i inkubator OxiTop Pict OxiTop set with mixing basis and OxiTop incubator 102

100 Analiza bioindykacyjna jest czci rozległej wiedzy okrelanej mianem etotoksykologii. Współczesna etotoksykologia jest interdyscyplinarn, intensywnie rozwijajc si gałzi nauki obejmujc chemi, ekologi i toksykologi, której celem jest midzy innymi ocena stanu rodowiska i porednio ochrona zdrowia człowieka. Bioindykacja jest metod wykorzystujc jako wskanik ywy organizm, którego reakcja moe by podstaw do oceny ogólnej aktywnoci badanego układu. Reakcja ta obejmuje nie tylko sumaryczne działanie wszystkich substancji pochodzenia antropogenicznego oraz toksyn naturalnych, ale take daje obraz interakcji pomidzy substancjami toksycznymi a abiotycznymi i biotycznymi czynnikami rodowiska (ph, twardo wody, zawiesiny itp.). Produkty ropopochodne, które stanowi złoon mieszanin zwizków o zrónicowanych właciwociach biologicznych, mog by przyczyn niekorzystnych dla człowieka zmian zachodzcych w skaonych ekosystemach. Naley równie nadmieni, e na drodze przemian chemicznych i mikrobiologicznych mog powstawa metabolity o zrónicowanej lub słabo poznanej aktywnoci biologicznej. Całkowite wyeliminowanie zanieczyszcze w procesach bioremediacyjnych gleb skaonych substancjami ropopochodnymi jest niezmiernie trudne do osignicia, gdy nawet niewielkie iloci metabolitów mog by niebezpieczne. Oznaczenie poziomu ste pozostałych zanieczyszcze jest trudne i dlatego coraz czciej ocen stopnia skaenia wykonuje si za pomoc testów toksykologicznych, które ponadto daj obraz badanych populacji w zakresie miertelnoci, wzrostu, reprodukcji i zaburze fizjologicznych. Dobór metod testowych jest niezwykle wanym elementem w badaniach toksykologicznych. Zastosowany w biotestach ywy organizm musi odpowiada surowym wymaganiom, midzy innymi cigłej dostpnoci i jednorodnoci genetycznej. Obecnie wprowadzane s gotowe testy sporzdzane w postaci pakietów, pozwalajce na ocen toksycznoci badanych prób w krótkim czasie. Zawieraj one formy kryptobiotyczne bioindykatorów pochodzce ze standardowych hodowli, które mog by długo przechowywane i w razie potrzeby w krótkim czasie przygotowane do testu. Formy kryptobiotyczne organizmów stanowi przyszło bioindykacji, gdy moliwo stosowania tych organizmów przez zwykłe laboratoria (w tym równie chemiczne) pozwala traktowa je jako zwykły odczynnik chemiczny [Nałcz- Jawecki, 2003]. Uwzgldniaj one zastosowanie w charakterze bioindykatorów przedstawicieli trzech grup troficznych. Organizacje midzynarodowe zajmujce si standaryzacj (ISO, OECD, ASTM, DIN) polecaj ich stosowanie. 103

101 Na szczególn uwag zasługuje test Microtox, który jako pierwszy test bioindykacyjny powstał w 1979 r. w USA. Łczy on właciw bioindykacj z precyzj analityczn. Jako bioindykator zastosowane zostały bakterie luminescencyjne Vibrio fisheri (ISO ), które w normalnych warunkach zuywaj około 10% metabolizmu na wytwarzanie wiatła. W obecnoci substancji toksycznych luminescencja obnia si wraz ze wzrostem toksyczno- ci ogólnej próbki. W systemie transportu elektronów u tych bakterii, enzym lucyferaza (oksygenaza alkanowa) katalizuje utlenianie zredukowanego substratu (zredukowanego mononukleotydu flawinowego, fosforanu ryboflawinowego lub dwunukleotydu flawinowoadeninowego), a podczas tego procesu zachodzi luminescencja, która moe by mierzona fotometrem. Powstałe substraty uczestniczce w tej reakcji to tlen i aldehyd (długołacuchowy). W obecnoci substancji wpływajcych ujemnie na metabolizm komórkowy bakterie bardzo szybko reaguj spadkiem luminescencji [Harky et al., 2000; Casseils et al., 2000; Acheson et al., 2004; Araujo et al., 2005]. Zespół prof. Persoone z Belgii stworzył testy zwane Toxkits. Organizmy s dostarczane w formie kriobiotycznej: wrotki w formie cyst, skorupiaki w formie jaj przetrwalnikowych, natomiast glony jako komórki unieruchomione na noniku i zabezpieczone przed rozwojem specjalnym roztworem. Przed wykonaniem testu cysty musz by umieszczone w wodzie, w której pod wpływem silnego wiatła nastpuje rozwój form przetrwalnikowych i w czasie od 18 do 52 godzin nastpuje wylg młodych osobników gotowych do wykorzystania w tecie [Chial et al., 2003]. Tabela 5.1. Zestawienie testów stosowanych oceny toksykologicznej gleby z dołów urobkowych Table 5.1. Comparison in tests toxicological estimation of soil from waste pit Poziom troficzny Producenci Organizm Sorghium Sacharatum Lepidium sativum Sinapis alba Nazwa Reakcje testu testowe Roliny wysze Phytotoxkit TM Kiełkowanie i wczesny wzrost Skorupiaki Heterocypris Konsumenci Ostracodtoxkit TM Zahamowanie incongruens wzrostu, mier Bakterie Reducenci Vibro fischeri Microtox Zahamowanie SPT luminescencji Czas trwania testu Typ testu 3 dni Chroniczny 6 dni Ostry 15 min. Ostry 104

102 W niniejszej pracy ocen skutecznoci stosowanych zabiegów bioremediacyjnych oczyszczania gleby i ziemi z dołów urobkowych uzupełniono o monitoring toksykologiczny. Zastosowanie ywych organizmów, jako bioindykatorów nalecych do rónych grup taksonomicznych (bakterii, skorupiaków i rolin wyszych), reprezentujcych wszystkie grupy troficzne: producentów, konsumentów i reducentów (tabela 5.1), pozwala na kompleksow ocen stanu badanego rodowiska [Sawicki et al., 2007; Persoone et al., 2003]. Wiele zanieczyszcze ropopochodnych oraz metabolitów powstałych podczas procesu ich biodegradacji zawiera zwizki o charakterze rakotwórczym. Zastosowanie do ich identyfikacji metod analitycznych stwarza due problemy, gdy zwizki te w rodowisku wystpuj w ladowych ilociach. W przypadku gruntów silnie skaonych substancjami ropopochodnymi, które poddane zostały zabiegom rekultywacyjnym, wskazane jest rozszerzenie testów biologicznych o wykrywanie substancji o potencjalnych właciwociach mutagennych i rakotwórczych. Do tego celu wykorzystano test Ames a [Maron et al., 1983; Zeiger et al., 1992], który jest wykorzystywany nie tylko do bada pojedynczych zwizków, ale i rónego rodzaju mieszanin, np. ropa naftowa, woda pitne, cieki itp. Zasada testu Ames a polega na okreleniu mutacji powrotnych z histydynowej auksotrofii do prototrofii w mutantach, którymi s szczepy testowe Salmonella triphimurium. Szczepy testowe s mutantami niezdolnymi do syntezy histydyny aminokwasu niezbdnego do ycia. Pod wpływem substancji o właciwociach mutagennych dochodzi do rewersji mutacji i przywrócona zostaje zdolno do syntezy histydyny, czego efektem jest pojawienie si kolonii rewertantów na podłou bez histydyny [Kołwzan, 2005]. Przygotowanie prób do testów toksylogicznych Analizy toksykologiczne przeprowadzono na próbkach gleby/odpadu pobranych z rónych obszarów wytypowanych do oczyszczania dołów urobkowych Graby-67 i Graby- 12. Były to próbki gleby surowej, gleby po bioremediacjii podstawowej, po I serii inokulacji mikroorganizmami autochtonicznymi i po zakoczeniu rekultywacji. Badaniami toksykologicznymi objto proces bioremediacji realizowany zarówno metod ex-situ w warunkach półtechnicznych, jak równie prowadzony w warunkach przemysłowych metod in-situ. Analizie tej poddano próbki gleb oraz ekstrakty wodne. Ekstrakty wodne z gleb przeznaczonych do bada toksykologicznych testem Microtox Soil Phase przygotowano poprzez zmieszanie 7 g gleby w zlewce plastikowej i dodanie odczynnika Microtox SPT Diluent (3,5% NaCl) w iloci 35 ml. Próbk homogenizowano 105

103 w sonifikatorze przez 1 minut, a nastpnie mieszano na mieszadle magnetycznym 20 minut. Po przesczeniu przez filtr bdcy w zestawie (filtr membranowy 0,22 m) przeprowadzono test z bakteriami Vibro fischeri. Ekstrakty rozpuszczalnikowe przeznaczonego testu Ames a przygotowano przez przeprowadzenie ekstrakcji za pomoc dichlorometanu. 5 g próbki gleby/odpadu ekstrahowano w aparacie Soxhlet a przez 16 godzin z uyciem 40 ml rozpuszczalnika. Ekstrakt zagszczano pod zmniejszonym cinieniem do objtoci 1 ml, a nastpnie odparowano. Uzyskany osad rozpuszczono jest w 0,5 ml dimetylosulfotlenku (DMSO), który nie jest toksyczny i genotoksyczny dla testowanych organizmów i moe by stosowany w testach w steniach od 1% do 3%. Test Microtox Solid Phase test fazy stałej Test Microtox Solid Phase umoliwia bezporedni kontakt bakterii luminescencyjnych z próbk gleby, co pozwala na wykrycie nie tylko substancji rozpuszczalnych w wodzie, ale take zwizków lipofilnych lub słabo rozpuszczalnych w wodzie. Test ten jest produkowany przez firm SDI (USA) i rozprowadzony w Polsce przez firm Tigret. Zakupione liofilizowane bakterie mog by przechowywane przez 1 rok w temperaturze 20 o C i uyte do testu w kadej chwili po zawieszeniu w wodzie dejonizowanej. Test przesiewowy wykonuje si wg standardowej procedury (SDI) z uyciem analizatora Delta Tox i liofilizowanych bakterii Vibro fischeri. W naczyniach testowych umieszcza si nierozcieczone próbki. Do próbek dodaje si 10-krotnie rozcieczonego wodnego roztworu NaCl, aby dostosowa cinienie osmotyczne do wymaganego przez bakterie luminescencyjne (2% NaCl). Próbki kontrolne stanowiły roztwory zalecane przez producenta testu Nastpnie wprowadzano bioindykatory i przeprowadzano test wg standardowej procedury(sdi). Wykonywano po 3 powtórzenia dla kadej próbki. Po inkubacji (15 min.) w kadej próbce odczytywano reakcj testow ( PE). Wyniki podzielono na trzy kategorie: próbki nietoksyczne PE < 20% próbki niskotoksyczne 20% PE < 50% próbki toksyczne PE 50% Test zasadniczy przeprowadzono dla próbek, które w tecie przesiewowym były toksyczne. W naczyniach testowych wykonywano jest szereg rozciecze badanego materiału stosujc nietoksyczne roztwory zalecane przez producenta (płyny do rozciecze). Wprowadzano bioindykatory i po okrelonym czasie inkubacji odczytano reakcj testowa dla kadego rozcieczenia, korzystajc z oprogramowania SDI. Wyniki toksycznosci obliczono jako EC 50, 106

104 czyli takie stnie badanej próbki, które powoduje powstanie 50% reakcji testowej przeyciowej (PE). Wartoci toksycznoci wyraono w miligramach gleby na litr wody. Dla lepszego zobrazowania wyników, wartoci EC 50 przeliczono na jednostki toksycznoci: TU = 100 (3) EC 50 Skala toksycznoci próbek rodowiskowych (gleby) w tecie Microtox SPT [Sawicki et al., 2007] przedstawia si nastpujco: TU < 10 brak istotnego efektu toksycznego próbka nietoksyczna, 10 TU < 25 istotny efekt toksyczny próbka niskotoksyczna, 25 TU < 100 istotny efekt toksyczny próbka toksyczna, 100 TU istotny efekt toksyczny próbka wysoko toksyczna. Test bezporedniego kontaktu Ostracodtoxkit F TM Test Ostracodtoxkit(F) TM naley do testów bezporedniego kontaktu (TBK) oceny toksycznoci chronicznej z wykorzystaniem skorupiaka Heterocypris incongruens. Został on opracowany przez zespół prof. Persoone z Belgii. Naley on do grupy testów produkowanych przez MicroBiotest z Belgii i rozprowadzanych w Polsce przez firm Tigret. Biotest pierwszego kontaktu jest przeprowadzany przy uyciu młodych dennych skorupiaków (Heterocypris incongruens), wylgłych z cyst przetrwalnikowych w cigu 52 godzin (zgodnie z procedur producenta) (fot. 5.2). Fot Obraz mikroskopowy (powikszenie x 40) skorupiaka (Heterocypris incongruens) Pict Microscope view (40x) of crustacea Heterocypris incongruens Test wykonuje si w polistyrenowych, 6-dołkowych mikropłytkach. Standardow po- ywk stanowi zawiesina glonów, któr wprowadza si po 2 ml zawiesiny oraz po 10 szt. małoraczków do kadej celi mikropłytki. Do szeregu A mikropłytki wprowadza si 0,5 g 107

105 gleby kontrolnej, a do kolejnych szeregów po 0,5 g badanej próbki gleby. Inkubacja prowadzona jest przez okres 6 dni w temperaturze 25 o C. Interpretacja wyników polega na obliczeniu iloci ywych mikroorganizmów w kadym dołku mikropłytki oraz zmierzeniu ich długo- ci. Na tej podstawie mona obliczy: % ΔLbad 100 zahamowania wzrostu = 100% ΔLkont gdzie: ΔL bad redni przyrost długoci mikroorganizmów w celach z badan próbk gleby, ΔL kont redni przyrost długoci mikroorganizmów w celi z gleb kontroln. Kryteria prowadzenia testu: o miertelno jeeli dla zastosowanych mikroorganizmów przekracza 50%, efekt przeyciowy (obnienie przyrostu mikroorganizmów) nie jest brany pod uwag i w tabeli wyników oznaczany jest znakiem X, o redni % miertelnoci w próbce kontrolnej nie moe przekroczy 20%, o redni przyrost długoci w próbce kontrolnej musi wynosi przynajmniej 400 m. Test fitotoksycznoci Konwencjonalnie testy fitotoksycznoci produkowane wg midzynarodowych lub krajowych norm s skomplikowane, wymagaj duej przestrzeni laboratoryjnej i s czasochłonne. Specyfika testu Phytotoxkit TM omija niepraktyczne i czasochłonne czynnoci zwizane z kiełkowaniem nasion wystpujce w wielu oznaczeniach fitotoksycznoci i umoliwia bezporedni pomiar długoci korzeni metod analizy obrazu [Czerniawska-Kusza et al., 2006]. Naley do grupy testów toxkit produkowanych przez firm MicroBiotest i rozprowadzany w Polsce przez firm Tigret. Test Phytotoxkit TM naley do testów oceny toksycznoci chronicznej i jest oparty na ocenie kiełkowania i wczesnego wzrostu rolin. W standardowym tecie uywane s 3 rodzaje rolin, wyselekcjonowanych ze wzgldu na szybko kiełkowania i szybko wzrostu korzeni, co umoliwia wykonanie pełnego testu w cigu jedynie 3 dni inkubacji: jednolicienne sorgo (Sorghum saccharatum), dwulicienne rzeucha (Lapidium sativum), dwulicienne gorczyca (Sinapis alba). Oznaczenie przeprowadzono si w trzech powtórzeniach dla kadej testowej roliny. Test wykonano w polistyrenowych, przeroczystych płytkach. Nawodnione próbki gleby ba- 108

106 danej oraz próbk gleby kontrolnej (WCH = 100%) naniesiono, w iloci około 90 ml, na doln cz płytki. Na powierzchni gleby umieszczono papierowy filtr. W jednej linii (około 1 cm od rodka płytki) w równych odstpach umieszczono si 10 szt. nasion i przykryto płytk nakrywkow. Płytki testowe umieszczono si pionowo w stojaku i inkubowano w ciemno- ci w temperaturze 25 o C przez okres 72 godz. Wykonano równolegle po trzy powtórzenia dla kadej roliny. Rejestracja wygldu płytki testowej na kocu trwania testu moe by wykonana przy uyciu aparatu fotograficznego lub skanera płaskiego. W celu analizy obrazu oraz pomiaru długoci korzeni rolin uyto program ImageTool. Zdjcia wykonano na tle ramki umoliwiajcej kalibracj. Analiza testu polega na: obliczeniu iloci wykiełkowanych rolin obliczenie % kiełkowania, pomiarze długoci korzenia kadej roliny, obliczeniu procentowego zahamowania wzrostu korzenia w stosunku do próbki kontrolnej. Standardowy test Phytotoxkit analizuje dwa efekty skaenia w glebie badanej w odniesieniu do gleby kontrolnej analogicznie do normy ISO Okrelenie efektów skaenia gleby. Cz I Metoda pomiaru zahamowania wzrostu korzenia. Fot Przykładowy obraz wzrostu rolin testowych na próbce gleby kontrolnej test Phytotoxkit TM Pict Exemplary growth of tested plants on sample of controlled soil Phytotoxkit TM test Test Ames a W celu zbadania, czy oczyszczona gleba nie zawiera zwizków mutagennych, wykonano test bazujcy na powszechnie znanej metodzie Amesa. Metoda (test) Amesa polega na wykrywaniu mutacji powrotnych z histydynowej auksotrofii do prototrofii w wielu szczepach Salmonella typhimurium. Szczepy testowe tej bakterii charakteryzuj si rónymi typami mutacji w genach odpowiedzialnych za syntez histydyny, w zwizku z czym wymagaj jej obecnoci w podłou do wzrostu. Standardowo wykorzystuje si dwa szczepy TA98 i TA100, posiadajce odpowied- 109

107 nie mutacje polegajce na tzw. przesuniciu ramki odczytu i substytucji pary zasad, oraz dwa mutageny, tj. 2-nitro-fluoren i azydek sodu. W obecnoci substancji o właciwociach mutagennych dochodzi do pierwszej mutacji (poprzez rewersj) i przywrócona zostaje zdolno syntezy histydyny, której objawem jest pojawienie si rewertantów na podłou bez histydyny. Liczba rewertantów jest miar aktywnoci mutagennej badanej próbki. Standardowy test Amesa wykorzystuje płytki agarowe. W obecnym tecie wykorzystano modyfikacj metody w postaci testu Muta-Chromoplate Kit dostarczanego przez firm Environmental Bio-Detection Products Inc. (Ontario, Canada). Istotna rónica polega na tym, e test wykonuje si w podłou płynnym, stosujc płytki 48-studzienkowe (tzw. test fluktuacji [Bridges, 1980]). Jego przewag nad klasycznym testem jest wiksza czuło oraz moliwo wykonywania go take przez mniej wyspecjalizowane laboratoria, ze wzgldu na gotow procedur. Rezultatem jest reakcja barwna; kolor ółty oznacza wystpienie mutacji powrotnej, a purpurowy jej brak. Porównanie liczby studzienek, w których nastpiła mutacja pod wpływem badanego czynnika w stosunku do liczby studzienek, gdzie nastpiła mutacja spontaniczna, pozwala przy pomocy programu komputerowego dostarczonego przez producenta, na statystyczn ocen mutagennoci badanych próbek. Przed wykonaniem testu naley uaktywni mikroorganizmy które dostarczane s w postaci liofilizowanej, przez dodanie podłoa wzrostowego i inkubacj w 37 o C przez godz. Mieszanin reakcyjn przygotowuje si przez zmieszanie gotowych roztworów: 43,24 ml soli Davis-Mingioli, 9,5 ml D-glukozy, 4,76 ml purpury bromokrezolowej, 2,38 ml D-biotyny i 0,12 ml L-histydyny. Jako rozpuszczalnika badanych ekstraktów zanieczyszcze ropopochodnych, zawartych w analizowanych próbkach uywa si DMSO, przy czym jego ilo dodana do mieszaniny reakcyjnej zgodnie z zaleceniami producenta nie moe przekracza 0,5 ml. Badane próbki przescza si przez filtr 0,22 μm. Nastpnie przenosi si aseptycznie po 2,5 ml mieszaniny reakcyjnej do probówek testowych, które dopełnia do 17,5 ml roztworem (próba badana, bezporednio działajcy mutagen lub sama woda). Do wszystkich probówek dodaje si po 5 μl szczepu testowego i po dokładnym wymieszaniu rozporcjowuje si po 200 μl do kadej studzienki. Na rysunku 5.1 przedstawiono schematyczny tok postpowania podczas testu Amesa. W tecie zastosowano aktywator frakcj mikrosomaln S9 z wtroby szczura. Rola ekstraktu polega na enzymatycznym przekształceniu badanej substancji, co prowadzi do ujawnienia jej ewentualnych właciwoci mutagennych. 110

108 Rys Schemat testu Ames a Fig Scheme of Ames test Zakres oznacze fizyko-chemicznych wraz ze stosowanymi metodami i normami zestawiono w tabeli 5.2. Tabela 5.2. Zakres oznacze fizyko-chemicznych wraz ze stosowanymi metodami i normami Table 5.2. Methods, standards and references for physico-chemical analyses Wskaniki Metody badawcze Normy stosowane ph r-ru wodnego Elektrochemiczna PN EN 10390:1997 Przewodnictwo elektryczne Konduktometryczna PN EN 27888:1999 N Tot Kiejdahla PN-EN :2001 OWO Kolorometryczna PN C :1994 ChZT Miareczkowa PN-74/C-04758/03 Spektrometryczna PN-ISO 8467:2001 P Tot Spektrometryczna PN-EN 1189; N-NH 4 Spektrometryczna PN-EN :2002 N-NO 3 Spektrometryczna PN-87/C P-PO 4 Kolorymetryczna PN-89/C Chromatografia jonowa PN-EN ISO :2001 S-SO 4 Wagowa PN-ISO 9280:2002 Cl Miareczkowa PN-ISO 9297:1994 Fenole Spektrometryczna PN- ISO 10301:2004 Cr, Ba, Zn, Cd, Cu, Co, Ni, Pb, Mo, As, Mn, Fe, Al, Ca, Atomowa Spektrometria Absorpcyjna (Analyst-800 Perkin Elmer) PN EN ISO , PN EN ISO 15586:2005, PN EN ISO 15586:2005, PN EN ISO 8288:2002, PN EN ISO 11885:2001, PN EN-82 C

109 Analiza statystyczna Analiz statystyczn wyników bada chromatograficznych, toksykologicznych przeprowadzono metodami analityczn i graficzn. Do analizy wyników zastosowano metody statystyczne, m.in. analiz wariancji (prosta ANOVA) i analiz prostych korelacji liniowych Pearsona. Umoliwiła ona eliminacj danych analitycznych (chemicznych i biologicznych) statystycznie nieistotnych, na poziomie istotnoci p < 0,05. Do statystycznego przetworzenia uzyskanych danych analitycznych zastosowano program Statistica ver.7.1. w rodowisku Windows. Do bada procesu bioremediacji zanieczyszcze ropopochodnych sporód 9 starych dołów urobkowych, na których prowadzono zabiegi bioremediacyjne, wytypowano dwa doły: Graby-67 i Graby-12, znajdujce si na terenie kopalni ropy naftowej Graby, ze wzgldu na wystpujce znaczne rónice w zawartoci i charakterze zanieczyszcze ropopochodnych (fot. 5.4 i fot. 5.5). Graby-67 powierzchnia 212,3 m 2 głboko 1,7 m objto zgromadzonych odpadów = 360,9 m 3 Graby-12 powierzchnia 708,3 m 2 głboko 1,6 m objto zgromadzonych odpadów = 1133,2 m 3 Dół urobkowy Graby-67 był jednym z najtrudniejszych do prowadzenia procesu oczyszczania dołów urobkowych. Charakteryzował si tym, e na jego powierzchni znajdowała si warstwa wody zmieszanej z zanieczyszczeniami ropopochodnymi i szlamem do głbokoci cm. Teren dołu urobkowego Graby-67 stwarzał powane zagroenie dla ludzi i zwierzt. Wstpna faza procesu remediacyjnego polegała na spompowaniu warstwy wody wraz z zanieczyszczeniami do beczkowozów i wywiezieniu jej do zbiorników magazynowych wody złoowej, gdzie po odseparowaniu warstwy ropy naftowej, cieki poddano procesowi oczyszczania w przepływowej instalacji oczyszczania cieków i wód złoowych, pracujcej na kopalni Grabownica [Steliga 2005c; 2006c; Steliga et al., 2004a; 2005]. Natomiast dół urobkowy Graby-12 był zaliczany dołów suchych, z widocznymi na jego powierzchni plamami i kałuami zanieczyszcze ropopochodnych (fot. 5.5). 112

110 Dla okrelenia rozkładu zanieczyszcze na obszarze dołu urobkowego Graby-67 (po osuszeniu i udostpnieniu terenu) oraz Graby-12 dokonano poboru szeregu próbek odpadu/gleby z całego profilu glebowego dołów urobkowych w punktach rozmieszczonych równomiernie na całym oczyszczanym terenie. Graficzny obraz rozkładu zanieczyszcze ropopochodnych na terenie dołów urobkowych uzyskano stosujc metod krigingu, której procedura polega na rozmieszczeniu punktów pomiarowych w postaci gstej siatki, w której dokonuje si interpolacji badanego parametru [Corlon et al., 2001]. Na podstawie wykonanych analiz chromatograficznych zanieczyszcze ropopochodnych (TPH) i ich rozkładu, okrelonego z wykorzystaniem metody krigingu na terenach dołów urobkowych, wyodrbniono obszary o zblionym stopniu skaenia substancjami ropopochodnymi, co miało znaczcy wpływ na przebieg prowadzonych procesów bioremediacyjnych, gdy było pomocne w rozplanowaniu usytuowania rowów odciekowych oraz rozmieszczenia rur melioracyjno-drenaowych w trakcie remediacji wstpnej. Ponadto pozwoliło na optymalny dobór iloci wapna nawozowego, substancji biogennych (nawozy mineralne) oraz biopreparatu bakteryjnego, co z kolei przekłada si na wymierne koszty finansowe i uzyskiwan wysok skuteczno prowadzonych zabiegów bioremediacyjnych. Ze wzgldu na wysoki stopie skaenia substancjami ropopochodnymi terenów wytypowanych do bada dołów urobkowych (Graby-67 i Graby-12), wskazane było przeprowadzenie wstpnej remediacji, obejmujcej drena melioracyjno-odciekowy. Polegał on na wykonaniu, na obszarach o najwyszym poziomie skaenia substancjami ropopochodnymi, rowu odciekowego o głbokoci 1,0 1,5 m usytuowanego zgodnie ze spadkiem terenu i zamontowaniu dwukomorowej łapaczki w jego kocowym odcinku. W celu zapewnienia odpływu ciekłych zanieczyszcze ropopochodnych, wykonano drena za pomoc rur melioracyjnych o rednicy 100 mm, które rozmieszczono na głbokociach od 40 do 140 cm. Zanieczyszczenia ropopochodne wraz z wod zbierane były w łapaczce i sukcesywnie wywoone do zbiorników magazynowych wody złoowej w celu oddzielenia frakcji ropnej, a nastpnie oczyszczane w instalacji przepływowej [Steliga et al., 2004a; Steliga 2005a]. Proces wstpnej remediacji na dole urobkowym Graby-67 prowadzono przez okres 8 miesicy, a na dole urobkowym Graby-12 przez 6 miesicy. Pozwolił on na obnienie zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych w glebie/odpadzie z dołów urobkowych do poziomu umoliwiajcego przystpienie do dalszych prac nad biodegradacj zanieczyszcze ropopochodnych. wiadcz o tym wyniki prowadzonego monitoringu fizyko-chemicznego obej- 113

111 mujcego, chromatograficzne oznaczanie zanieczyszcze ropopochodnych (TPH, BTEX, WWA, fenoli). W celu stwierdzenia, czy zanieczyszczenia ropopochodne zdeponowane w wytypowanych dołach urobkowych nie migruj do rodowiska gruntowo-wodnego w skutek niewidocznego uszkodzenia obwałowania dołu urobkowego, wykonano w ssiedztwie kadego testowanego obiektu po dwa piezometry (otwory badawcze), usytuowane zgodnie z kierunkiem spływu wód podziemnych i podskórnych. Ponadto podczas wierce otworów pobrano do analizy próbki gruntu, co po wykonaniu analiz chemicznych pozwoliło na okrelenie tła geochemicznego i hydrologicznego otaczajcych terenów. Przyjto, e przeprowadzenie bada laboratoryjnych w skali półtechnicznej (metoda ex-situ) jest niezbdne, gdy umoliwia opracowanie wytycznych prowadzenia procesów oczyszczania dołów urobkowych realizowanych w warunkach terenowych metod in-situ, pomimo e przetransponowanie wyników bada laboratoryjnych na warunki przemysłowe jest trudne. Badania laboratoryjne pozwalaj na: ustalenie, przy modyfikacji struktury gruntu/odpadu z dołów urobkowych, korzystnych proporcji zmieszania z czyst ziemi, dobór optymalnych dawek wapna nawozowego i substancji biogennych, zapoznanie si z efektywnoci działania biopreparatów opracowanych indywidualnie dla kadego dołu urobkowego: Graby-67 (G-67-1) i Graby-12 (G-12-1) na bazie mikroorganizmów autochtonicznych oraz biopreparatów zmodyfikowanych poprzez wzbogacenie o wybrane gatunki grzybów (G-67-2 i G-12-2) w kocowym etapie bioaugmentacji, okrelenie efektywnoci kolejnych etapów kompleksowej technologii oczyszczania gruntów z zanieczyszcze ropopochodnych, opracowanie modelu matematycznego biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych. Badania laboratoryjne prowadzono na specjalnie skonstruowanych stanowiskach badawczych (4 szt.). Bezporednio na posadzce została ułoona folia słuca do ochrony przed rozprzestrzenianiem si zanieczyszcze ropopochodnych i skaeniem pomieszczenia. Na folii skonstruowano postument równie zabezpieczony foli, którego konstrukcja pozwalała na odprowadzanie wód i ciekłych zanieczyszcze spływajcych z pryzmy. Na postumencie uło- ono warstw podsypki ze wiru. Wewntrz warstwy podsypki umieszczono system perforo- 114

112 wanych rur, przez które wtłaczano powietrze z dwóch agregatów sprarkowych w celu wła- ciwego natlenienia gruntu. Nastpnie uformowano pryzmy z badanych gruntów pobranych z obszarów wyodrbnionych na terenie oczyszczanych dołów urobkowych w iloci około 150 kg kada. W trakcie prowadzenia procesów oczyszczania gleba/odpad na pryzmach była zasilana substancjami biogennymi oraz prowadzono inokulacj odpadu biopreparatami mikrobiologicznymi. Wilgotno odpadu utrzymywano na poziomie 10 20% poprzez zraszanie wod, natomiast odczyn stabilizowano na poziomie 7,5 7,8 dawkujc wapno nawozowe. Pryzmy zostały przykryte tunelem foliowym, który pozwalał na utrzymanie wewntrz pryzm stałej temperatury na poziomie o C, moliwej do osignicia w warunkach terenowych. Odciek z pryzm zbierano w zbiorniku odcieków zainstalowanym poniej poziomu postumentu. Przykładowy schemat jednego ze stanowisk badawczych, wykorzystywanych podczas prowadzenia procesu oczyszczania gleby/odpadu w skali półtechnicznej (metod ex-situ), przedstawiono na rys zraszanie wod inokulacja biopreparatami dawkowanie substancji biogennych tunel foliowy dawkowanie wapna nawozowego stabilizacja temperatury napowietrzanie (rury perforowane) zbiornik wód odciekowych agregat sprarkowy Rys Schemat stanowiska badawczego do prowadzenia procesu oczyszczania gruntu z zanieczyszcze ropopochodnych w warunkach półtechnicznych (metoda ex-situ) Fig Research site scheme of oil-contaminated soil purification process semi-industrial conditions Badania modyfikacji struktury gleby i ziemi z wydzielonych obszarów danego dołu urobkowego po wstpnej remediacji polegały na zmieszaniu jej w rónych proporcjach z czyst ziemi, a nastpnie uformowaniu z nich pryzm na stanowiskach badawczych. Ustalenie najkorzystniejszych proporcji zmieszania gleby z czyst ziemi dla poszczególnych obszarów testowanych dołów urobkowych, okrelono opierajc si na dyfraktogramach rentgenowskich frakcji ilastej i badaniach aktywnoci dehydrogenazowej zmieniajcej si w cigu 30 dni. 115

113 Kolejny etap bada polegał na doborze optymalnych proporcji substancji biogennych C: N:P dla gleby pochodzcej z poszczególnych obszarów wyznaczonych na terenie dołów urobkowych. Po dokonaniu modyfikacji struktury, próbki gleby z badanych dołów urobkowych umieszczano w formie pryzm na stanowiskach badawczych i dozowano substancje biogenne (azot i fosfor) w postaci nawozu mineralnego Azofoska o składzie: 13,6% azotu całkowitego, 5,5% azotu azotanowego, 8,1% azotu amonowego, 6,4% rozpuszczalnego P 2 O 5, 19,1% K 2 O w postaci K 2 SO 4, 4,4% MgO w postaci MgSO 4 oraz mikroelementy (0,17% Fe, 0,27% Mn, 0,18% Cu, 0,045% Zn, 0,09% Mo). W celu zwikszenia zawartoci azotu w oczyszczanej partii gleby/odpadu stosowano saletr amonow. Dobór substancji biogennych jest wanym elementem w procesie bioremediacji, szczególnie dla gleb i ziemi pochodzcej z dołów urobkowych, które naley zaliczy do gleb cikich. Nie jest wskazane wprowadzanie zbyt duej iloci substancji biogennych, gdy nastpuje wzrost cinienia osmotycznego na zewntrz komórek bakteryjnych, co moe hamowa pobieranie wody przez bakterie, a nawet, w skrajnych przypadkach, powoduje ich odwodnienie. Substancje biogenne dozowano porcjami w taki sposób, aby w cigu 30 dni osign zakładany stosunek azotu i fosforu. Optymalny stosunek C:N:P dla gleby i ziemi, pochodzcych z poszczególnych obszarów danego dołu urobkowego, wytypowano na podstawie monitorowania zmian takich parametrów jak: aktywno dehydrogenazowa oraz obnienie si zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych [Matthew et al., 1999; Xu et al., 2004; 2004a; Kołwzan, 2005]. Główne badania procesu biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych przeprowadzono na dwóch pryzmach uformowanych z gleby pobranej po przeprowadzeniu procesu wstpnej remediacji. Materiał badawczy (gleba) został pobrany z wyznaczonego na terenie danego dołu urobkowego obszaru charakteryzujcego si najwyszym stopniem skaenia substancjami ropopochodnymi. Schemat przebiegu bada laboratoryjnych przedstawiono na rysunku 5.3. Analizie fizykochemicznej poddano, równie próbki odcieku zbieranego podczas prowadzonego procesu biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych. Przebieg procesu biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych kontrolowano prowadzc monitoring wyznaczonych parametrów fizyko-chemicznych, ze szczególnym uwzgldnieniem analiz chromatograficznych zanieczyszcze ropopochodnych oraz mikrobiologicznych, obejmujcych: odczyn, wilgotno, zawarto azotu amonowego, zawarto azotu azotanowego, zawarto fosforu, zawarto fenoli, zawarto wglowodorów wchodzcych w skład zanieczyszcze ropopochodnych (jakociowa i ilociowa analiza chromatograficzna), ogóln liczb 116

114 bakterii, liczb bakterii degradujcych wglowodory ropopochodne, liczb grzybów, aktywno dehydrogenazow i celulozow. Próbka odpadu po procesie remediacji wstpnej Analizy fizykochemiczne, mineralograficzne, oznaczenie aktywnoci dehydrogenazowej Modyfikacja struktury odpadu 0 30 Analizy mikrobiologiczne (klasyczne oraz z zastosowaniem technik molekularnych) opracowanie składu biopreparatu Proces bioremediacji podstawowej stymulowany przez: - napowietrzanie, - korekta wilgotnoci - korekta odczynu - dodatek substancji biogennych (C:N:P) czas trwania procesu [dni] Analizy fizykochemiczne chromatograficzne i mikrobiologiczne okrelenie efektywnoci procesu 156 Proces inokulacji biopreparatem na bazie bakterii autochtonicznych 216 Analizy mikrobiologiczne (klasyczne oraz z zastosowaniem technik molekularnych) zmodyfikowanie składu biopreparatu Analizy fizykochemiczne, chromatograficzne, mikrobiologiczne, toksykologiczne okrelenie kocowej efektywnoci procesu oczyszczania Proces inokulacji biopreparatem na bazie bakterii autochtonicznych Proces inokulacji biopreparatem na bazie bakterii autochtonicznych i grzybów czas trwania procesu [dni] Analizy fizykochemiczne, chromatograficzne, mikrobiologiczne, toksykologiczne okrelenie kocowej efektywnoci procesu oczyszczania Rys Schemat przebiegu bada laboratoryjnych oczyszczania odpadów (metoda pryzmowania ex-situ) Fig Laboratory research scheme of oil waste purification process (windrow, ex-situ) 117

115 Analiza uzyskanych wyników pozwoliła na opracowanie wytycznych prowadzenia procesu biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych dla dołów urobkowych Graby-67 i Graby- 12 w warunkach terenowych metod in-situ. Stanowiły one podstaw do opracowania projektów rekultywacyjnych dla wytypowanych dołów urobkowych: Graby-67 (GN-60181/06) i Graby-12 (GN /04) oraz sporzdzenia wniosków o uzyskanie decyzji zezwalajcych na prowadzenie działalnoci w zakresie unieszkodliwiania odpadów na dołach urobkowych Graby- 67 (Decyzja SR /07) i Graby-12 (SR /07). Opracowane, na podstawie przeprowadzonych bada biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych w skali półtechnicznej (metoda ex-situ), wytyczne prowadzenia etapowego procesu oczyszczania terenów dołów urobkowych w warunkach przemysłowych (metoda in-situ) wymagały weryfikacji, z uwagi na sezonowo i zmienno warunków atmosferycznych w czasie trwania oczyszczania gleby. Przebieg procesu bioremediacji realizowanej w warunkach terenowych kontrolowano prowadzc rozbudowany monitoring parametrów fizyko-chemicznych gleby i ziemi z oczyszczanych dołów urobkowych. Szczególn uwag zwrócono na zmiany zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych, kontrolowane przez wykonywane analizy chromatograficzne oraz zmiany stanu mikroflory badania mikrobiologiczne. Próbki do analiz gleby i ziemi pobierano z punktów rozmieszczonych równomiernie na wyodrbnionych obszarach, rónicych si stopniem skaenia w obrbie danego dołu urobkowego oraz z rónych głbokoci obejmujcych cały profil głbokociowy oczyszczanego obiektu. Wyniki bada monitoringowych pozwoliły na ledzenie zmian zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych w glebie i ziemi zgromadzonej w dołach urobkowych, a to z kolei umoliwiło płynne sterowanie procesem bioremediacji i ustalenie optymalnych ram czasowych przebiegu poszczególnych etapów oczyszczania. Przebieg prac bioremediacyjnych na wytypowanych dołach przedstawiono na fotografiach: (Graby-67 fot. 5.4) i (Graby-12 fot. 5.5) oraz schematycznie zobrazowano na rys Po przeprowadzeniu zabiegu wstpnej remediacji polegajcej na drenau melioracyjno-odciekowym, przystpiono do dalszych prac bioremediacyjnych. Due zrónicowanie poziomu zawartoci substancji ilastych na obszarach obu dołów urobkowych, spowodowało przyjcie rónych proporcji gleby zanieczyszczonej do czystej ziemi w trakcie modyfikacji 118

116 struktury gleby. Proporcje odpadu do czystej ziemi zostały ustalone w badaniach laboratoryjnych i wynosiły dla dołu urobkowego Graby-67 (obszar AR i BR 20:1, obszar CR 10:1), za dla dołu urobkowego Graby-12 (obszar I i III 25:1, obszar II 15:1). Zadaniem zabiegu było rozlunienie struktury gleby/odpadu z dołów urobkowych, dziki czemu wzrosła biodostpno mikroorganizmów oraz substancji biogennych do zanieczyszcze ropopochodnych. I rok oczyszczania Wstpne osuszenie terenu dołu urobkowego Remediacja wstpna drena melioracyjno-odciekowy (6-8 miesicy) wiosna lato jesie II rok oczyszczania Inokulacja biopreparatem na bazie bakterii autochtonicznych: Seria II (50 dni) Inokulacja biopreparatem na bazie bakterii autochtonicznych: Seria I (55 dni) Bioremediacja podstawowa (60 dni) Modyfikacja struktury gleby i ziemi (30 dni) jesie lato wiosna kontrola parametrów prowadzenia procesu III rok oczyszczania Bioremediacja podstawowa (60 dni) Inokulacja biopreparatem na bazie bakterii autochtonicznych: Seria I (60 dni) Inokulacja biopreparatem na bazie bakterii autochtonicznych i grzybów: Seria II (70 dni) wiosna lato jesie Rys Schemat przebiegu biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych w warunkach przemysłowych Fig Scheme of oil-contaminants biodegradation process industrial conditions Nastpnie na poszczególnych obszarach dołów urobkowych o zrónicowanym stopniu zanieczyszczenia, przeprowadzono zabieg wapnowania w celu skorygowania odczynu gleby. Stosowano wapno nawozowe w ilociach wyznaczonych dowiadczalnie. W przypadku dołu 119

117 urobkowego Graby-67 dawka wapna nawozowego wynosiła odpowiednio: dla obszarów AR i BR 500 kg/ha, obszaru CR 650 kg/ha. Natomiast w przypadku dołu urobkowego Graby- 12 dawki wapna nawozowego kształtowały si na poziomie: obszary I i III 600 kg/ha, obszar II 750 kg/ha. Przedawkowanie wapna nawozowego nie jest szkodliwe, poniewa wapno poprawiajc własnoci fizyczne i chemiczne gleby, poprawia jednoczenie jej struktur. Gleb i ziemi zdeponowan w dołach urobkowych przemieszano i po 2 tygodniach przystpiono do nawoenia nawozami mineralnymi ( Azofosk ), które były stopniowo dozowane przez okres 4 tygodni. Ze wzgldu na zrónicowany charakter gleby z poszczególnych, wydzielonych w obrbie dołów urobkowych obszarów, rónicych si dodatkowo stopniem ska- enia substancjami ropopochodnymi, stosowano zrónicowane porcje nawozów mineralnych. Wyznaczone w badaniach laboratoryjnych dawki nawozów na poszczególnych obszarach dołu urobkowego Graby-67 wynosiły: obszar AR dawka nawozów 80 kg/ha, przy stosunku C:N:P = 100:5:1; obszar BR dawka nawozów 60 kg/ha przy stosunku C:N:P = 100:4:1; obszar CR dawka nawozów 45 kg/ha (C:N:P = 100:3:1). Natomiast na wyodrbnionych obszarach dołu Graby12 stosowano nastpujce dawki nawozów mineralnych: obszary I i III (C:N:P = 100:4:1) 120 kg/ha, obszar II (C:N:P = 100:3:1) 80 kg/ha. W celu lepszego natlenienia i przyspieszenia procesów biologicznych w czasie nawo- enia, gleb ujednolicono oraz napowietrzano warstwy wgłbne. Nastpny etap procesu oczyszczania polegajcy na inokulacji biopreparatami, opracowanymi na bazie mikroorganizmów autochtonicznych, realizowano w dwóch seriach, w okresie lato-jesie, stosujc zraszanie powierzchniowe oraz dozowanie wgłbne na głboko 1,5 m. Wykorzystywano w tym celu perforowane rurki wbijane w ziemi, przez które wtłaczano biopreparat za pomoc kompresora i dodatkowo napowietrzano głbsze warstwy dołów urobkowych. W celu osignicia poziomu zanieczyszcze odpowiadajcego standardom jakoci gleby i ziemi, proces bioremediacji na dołach urobkowych kontynuowano w nastpnym roku. Wczesn wiosn przystpiono do powtórnego zabiegu bioremediacji podstawowej, obejmujcej wapnowanie oczyszczanych obszarów. Dla dołu urobkowego Graby-67 stosowane dawki wapna wynosiły: obszar AR 250 kg/ha, obszar BR 350 kg/ha, Obszar CR 450 kg/ha. Natomiast dla dołu urobkowego Graby-12 na poszczególnych obszarach dawki wapna nawozowego wynosiły: obszar I i III 380 kg/ha, obszar II 550 kg/ha. Na podstawie bada laboratoryjnych ustalono optymalne proporcje azotu i fosforu dla poszczególnych obszarów dołów urobkowych (III roku oczyszczania), które kształtowały si 120

118 na nastpujcym poziomie: dla dołu urobkowego Graby-67: obszar AR C:N:P = 100:6:1 (dawka nawozów 70 kg/ha), obszar BR C:N:P = 100:6:1 (65 kg/ha), obszar CR C:N:P = 100:5:1 (55 kg/ha). W przypadku dołu urobkowego Graby-12 dawki nawozów mineralnych wynosiły odpowiednio: obszary I i III C: N:P = 100:6:1 (90 kg/ha), obszar II C:N:P = 100:5:1 (60 kg/ha). Proces bioremediacji podstawowej na dole urobkowym Graby-67 prowadzono przez okres 60 dni (marzec maj), a na dole urobkowym Graby-12 przez 60 dni (kwiecie maj). Zabieg inokulacji przeprowadzono w okresie letnim, w dwóch seriach. W pierwszej serii (maj czerwiec lipiec) dozowano biopreparaty sporzdzone na bazie mikroorganizmów autochtonicznych (na dole Graby-67 był to biopreparat G-67-1, a na dole Graby-12 biopreparat G-12-1). W drugiej serii inokulacji prowadzonej w okresie lipiec wrzesie zastosowano biopreparaty zmodyfikowane o wybrane gatunki grzybów: na dole urobkowym Graby-67 było to biopreparat G-67-2, a na dole urobkowym Graby-12 biopreparat G Biopreparaty dozowano napowierzchniowo i wgłbnie. W okresach ograniczonych opadów atmosferycznych tereny dołów urobkowych zraszano wod w celu utrzymania optymalnej wilgotno- ci gleby. Biopreparaty stosowano w postaci zawiesiny o gstoci 1*10 9 jtk/cm 3 w ilociach zapewniajcych liczebno bakterii degradujcych wglowodory ropopochodne na poziomie jkt/g.s.m./odpadu. Wykonane analizy chromatograficzne zanieczyszcze ropopochodnych w próbkach gleby i ziemi pobranych po zakoczeniu rekultywacji z poszczególnych obszarów oraz z rónych głbokoci dołów urobkowych, wykazały obnienie zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych podczas procesu oczyszczania do poziomu okrelonego w obowizujcych standardach glebowych (Rozporzdzenie Ministra rodowiska z dnia 9 wrzenia 2002 r. w sprawie standardów jakoci gleby i ziemi Dz.U. Nr 165, poz 1359). Po przedstawieniu wymaganych dokumentów (rozdział 3) w Starostwie Brzozowskim i dokonaniu komisyjnego odbioru prac rekultywacyjnych uzyskano decyzje o zakoczeniu rekultywacji terenu dołu urobkowego Graby-67 (Decyzja Nr GN: /08) i dołu urobkowego Graby-12 (Decyzja Nr GN: /08) wydane przez Starost Brzozowskiego. 121

119 Skaenie terenu dołu urobkowego Graby-67 przed rozpoczciem prac i po osuszeniu terenu Contamination of Graby-67 waste pit before and after drying I etap (I stage) II etap (II stage) Drena melioracyjno-odciekowy terenu dołu urobkowego Graby-67 (I rok oczyszczania) Drainage of Graby-67 waste pit (1st year of purification) Prace bioremediacyjne na terenie dołu urobkowego Graby-67 Bioremediation works in Graby-67 waste pit Iniekcja wgłbna biopreparatu G-67-1 (II rok oczyszczania) Deep seated injection of G-67-1 biopeparations (2nd year of purification) 122

120 Bioremediacja i inokulacja biopreparatem G-67-1 oraz G-67-2 (III rok trwania procesu oczyszczania) Bioremediation and inoculation with G-67-1 and G-67-2 biopreparations (3rd year of purification) Teren dołu urobkowego Graby-67 po zakoczeniu prac rekultywacyjnych Graby-67 waste pit area after finished recultivation Fot Przebieg prac remediacyjnych na dole urobkowym Graby-67 Pict Steps of remediaton works in Graby-67 waste pit 123

121 Skaenia na terenie dołu urobkowego Graby-12 przed rozpoczciem prac rekultywacyjnych Contamination of Graby-12 waste pit before recultivation Drena melioracyjno-odciekowy terenu dołu urobkowego Graby-12 (I rok) Drainage of Graby-12 waste pit (1st year of purification) Prace bioremediacyjne na terenie dołu urobkowego Graby-12 Bioremediation works in Graby-12 waste pit Inokulacja poprzez iniekcj wgłbn oraz napowierzchniow biopreparatu G-12-1 (II rok oczyszczania) Deep seated and surface injection of G-12-1 biopeparations (2nd year of purification) 124

122 Bioremediacja i inokulacja biopreparatami G-12-1 oraz G-12-2 (III rok oczyszczania) Bioremediation and inoculation with G-12-1 and G-12-2 biopreparations (3rd year of purification) Teren dołu urobkowego Graby-12 po zakoczeniu prac rekultywacyjnych Graby-12 waste pit area after finished recultivation Fot Przebieg prac rekultywacyjnych na dole urobkowym Graby-12 Pict Steps of remediaton works in Graby-12 waste pit 125

123 Odpady składowane w dołach urobkowych uległy podczas ich deponowania strefowemu zanieczyszczeniu wglowodorami ropopochodnymi. Celem bada było rozpoznanie intensywnoci skaenia, wykonanie chemicznej, mikrobiologicznej oraz mineralogicznej charakterystyki odpadów. Wyniki bada s konieczne do nadania im odpowiedniego kodu charakteryzujcego odpad (zgodnie Rozporzdzeniem Ministra rodowiska z dnia 27 wrzesie 2001 r. w sprawie katalogu odpadów Dz.U. Nr 186, poz i Rozporzdzeniem Ministra rodowiska z dnia 21 marca 2006 r. w sprawie odzysku lub unieszkodliwiania odpadów poza instalacjami i urzdzeniami. Dz.U. Nr 49, poz. 356, Zał. Nr 3) oraz do podjcia decyzji odnonie remediacji skaonych odpadów. W celu okrelenia rozkładu zanieczyszcze ropopochodnych na terenie dołu urobkowego Graby-67, po wstpnym jego osuszeniu dokonano poboru szeregu próbek (ponumerowanych kolejno od 1 do 40) z głbokoci 30 cm ppt oraz z wybranych punktów (4, 6, 8, 9, 11, 13, 14, 16, 19, 21, 23, 24, 25, 29, 32, 33, 34, 36, 38, 40) z głbokoci 80 cm ppt. W pobranych próbkach odpadu oznaczono chromatograficznie sumaryczn zawarto zanieczyszcze ropopochodnych (TPH) i wykorzystujc metod krigingu przedstawiono graficzny obraz rozkładu zanieczyszcze: w warstwie powierzchniowej (30 cm ppt) na rys. 6.1 oraz na głbokoci 80 cm ppt na rys Mapa rozkładu koncentracji zanieczyszcze ropopochodnych ukazuje obszary zanieczyszcze i sugeruje kierunki ich rozprzestrzeniania. Zanieczyszczenia ropopochodne s rozmieszczone w sposób niejednorodny. Na terenie dołu urobkowego Graby-67 wyodrbniono 3 obszary (w warstwie powierzchniowej), charakteryzujce si zrónicowanym stopniem skaenia substancjami ropopochodnymi: 126

124 Obszar A obejmujcy punkty (1, 2, 10, 11, 12, 25, 26, 40), który charakteryzuje si stopniem skaenia na poziomie: mg/kg s.m. Obszar B zajmujcy najwiksz, rodkow cz dołu urobkowego, obejmujcy punkty (3, 4, 6, 7, 8, 9, 13, 14, 15, 16, 17, 22, 23, 24, 27, 28, 29, 38, 39), który cechuje si bardzo wysok zawartoci wglowodorów ropopochodnych ( mg/kg s.m.). Obszar C obejmujcy punkty (5, 18, 19, 20, 21, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37), posiadajcy stopie skaenia substancjami ropopochodnymi zbliony do obszaru A ( mg/kg s.m.). Rozkład zanieczyszcze ropopochodnych na głbokoci 80 cm ppt był zbliony do rozkładu okrelonego w warstwie powierzchniowej i z tego wzgldu wydzielono równie 3 obszary wgłbne (rys. 6.2), pokrywajce si z obszarami powierzchniowymi: Obszar A-w obejmujcy punkty (11, 24, 25, 40), charakteryzujcy si stopniem skaenia na poziomie: mg/kg s.m. Obszar B-w obejmujcy punkty (4, 6, 8, 9, 13, 14, 16, 21, 23, 29, 38, 36) o najwyszym stopniu skaenia TPH w zakresie: mg/kg s.m. Obszar C-w obejmujcy punkty (19, 32, 33, 34) o stopniu skaenia w zakresie: mg/kg s.m. długo [m] Obszar A 4 Obszar B Obszar C długo [m] TPH [mg*10 3 /kg s.m.] Rys Rozkład zanieczyszcze ropopochodnych (TPH) na dole urobkowym Graby-67 w warstwie powierzchniowej (30 cm ppt) z zaznaczonymi punktami poboru próbek analitycznych Fig Petroleum hydrocarbons (TPH) concentration on surface level (interval 0-30 cm) in Graby-67 waste pit with points of sampling 127

125 długo [m] Obszar A-w Obszar B-w długo [m] 21 Obszar C-w Rys Rozkład zanieczyszcze ropopochodnych (TPH) na dole urobkowym Graby-67 na głbokoci 80 cm ppt z zaznaczonymi punktami poboru próbek analitycznych Fig Petroleum hydrocarbons (TPH) concentration on level 80 cm under the surface in Graby-67 waste pit with points of sampling W celu dokonania pełnej oceny stopnia zanieczyszczenia substancjami ropopochodnymi odpadu z dołu urobkowego Graby-67, wytypowano punkty z poszczególnych obszarów A, B i C, a nastpnie z głbokoci: 30, 50, 80, 100, 120, 150 i 180 cm ppt pobrano próbki materiału glebowego do analizy. Wyniki analiz, charakteryzujce zawarto zanieczyszcze w przekroju głbokociowym dołu urobkowego Graby-67 przedstawiono na rys TPH [mg*10 3 /kg s.m.] zawarto TPH [m/kg s.m.] Obszar A punkt Obszar C punkt Obszar C punkt Obszar B punkt Obszar B punkt cm ppt 50 cm ppt 80 cm ppt 100 cm ppt 120 cm ppt 150 cm ppt 180 cm ppt Rys Porównanie zawartoci TPH w próbkach surowych pobranych z rónych głbokoci dołu urobkowego Graby-67 Fig Comparison in TPH contents of crude samples taken from Graby-67 waste pit on various depths 128

126 Zawarto zanieczyszcze ropopochodnych zmniejsza si wraz ze wzrostem głbokoci próbkowania, ale dopiero na głbokoci 180 cm ppt stopie skaenia jest zbliony do standardów glebowych. Opracowane chromatograficzne metodyki analityczne pozwoliły na identyfikacj jakociow oraz ilociow wglowodorów wchodzcych w skład zanieczyszcze ropopochodnych, pochodzcych z odpadu zdeponowanego na dole urobkowym Graby-67. Do bada przygotowano próbki zestawione poniej (tabela 6.1). Próbki z kadej podsekcji mieszano i tworzono próbk urednion, która stanowiła materiał wyjciowy do przeprowadzenia analiz chromatograficznych, fizyko-chemicznych, mineralogicznych i mikrobiologicznych. Tabela 6.1. Zestawienie próbek punktowych wchodzcych w skład próbek urednionych z poszczególnych podsekcji dołu urobkowego Graby-67 Table 6.1. Point samples included in averaged samples from consecutive parts of Graby-67 waste pit Próbka uredniona (podsekcja) Próbki składowe (punkty poboru) Głboko poboru [cm ppt] P-1A Próbki z obszaru A pobrane z punktów: 1, 2, 10, 11, 12, 25, P-2A Próbki z obszaru A pobrane z punktów: 11, 24, 25, P-3A Próbki z obszaru A pobrane z punktów: 11, 24, 25, P-1B Próbki z obszaru B pobrane z punktów: 3, 4, 6, 7, 8, 9, 13, 14, 16, 17, , 23, 24, 27, 28, 29, 38, 39 P-2B Próbki z obszaru B pobrane z punktów: 4, 6, 8, 9, 13, 14, 16, 21, 23, 29, , 38 P-3B Próbki z obszaru B pobrane z punktów: 4, 6, 8, 9, 13, 14, 16, 21, 23, 29, , 38 P-1C Próbki z obszaru C pobrane z punktów: 5, 18, 19, 20, 21, 30, 31, 32, 33, , 35, 36, 37 P-2C Próbki z obszaru C pobrane z punktów: 19, 32, 33, P-3C Próbki z obszaru C pobrane z punktów: 19, 32, 33, Zawarto zanieczyszcze ropopochodnych (TPH) w urednionych próbkach z rónych interwałów głbokociowych dołu urobkowego Graby-67 zawiera si w nastpujcych granicach: obszar A: mg/kg s.m. obszar B: mg/kg s.m. obszar C: mg/kg s.m. Dane analityczne wskazuj na zdecydowane obnianie si zawartoci TPH wraz ze wzrostem głbokoci próbkowania na całym obszarze dołu urobkowego. Przewaajcy udział w sumarycznej zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych maj wglowodory alifatyczne (n-alkany), które stanowi na obszarze A: 74,3 88,1% ogólnej zawartoci zanieczyszcze, na obszarze B: 79,8 89,5% oraz na obszarze C: 73,2 82,6%. Porównanie udziału poszczegól- 129

127 nych zidentyfikowanych n-alkanów w próbkach urednionych z rónych interwałów głboko- ciowych dołu urobkowego Graby-67 zilustrowano na rys zawarto n-alkanów [mg/kg n-c6 n-c7 n-c8 n-c9 n-c10 n-c11 n-c12 n-c13 n-c14 n-c15 n-c16 n-c17 Pr n-c18 F n-c19 n-c20 n-c21 n-c22 n-c23 n-c24 n-c25 n-c26 n-c28 n-c30 n-c32 n-c34 n-c36 P-1A P-2A P-3A zawarto n-alkanów [mg/kg s.m.] n-c6 n-c7 n-c8 n-c9 n-c10 n-c11 n-c12 n-c13 n-c14 n-c15 n-c16 n-c17 Pr n-c18 F n-c19 n-c20 n-c21 n-c22 n-c23 n-c24 n-c25 n-c26 n-c28 n-c30 n-c32 n-c34 n-c36 P-1 B P-2 B P -3 B zawarto n-alkanów [mg/kg s.m.] n-c6 n-c7 n-c8 n-c9 n-c10 n-c11 n-c12 n-c13 n-c14 n-c15 n-c16 n-c17 Pr n-c18 F n-c19 n-c20 n-c21 n-c22 n-c23 n-c24 n-c25 n-c26 n-c28 n-c30 n-c32 n-c34 n-c36 P-1 C P-2 C P-3 C Rys Porównanie udziału poszczególnych n-alkanów zidentyfikowanych w próbkach urednionych z rónych interwałów głbokociowych na poszczególnych obszarach dołu urobkowego Graby-67 (liczba pomiarów n = 9-10, p < 0,05) 130

128 Fig Comparison of n-alkanes identified in averaged samples from various depths on consecutive areas of Graby-67 waste pit (repetition number n = 9-10, p < 0.05) Tabela 6.2. Zestawienie zawartoci BTEX i WWA oznaczonych w analizowanych próbkach gleby z dołu urobkowego Graby-67 (liczba powtórze n = 9-10, p < 0,05) Table 6.2. BTEX and WWA contents determined in soil samples from Graby-67 waste pit (repetition number n = 9-10, p < 0.05) Benzen Oznaczany składnik Etylobenzen Toluen Ksyleny ΣBTEX Naftalen Próbka ujednolicona z obszaru A Próbka ujednolicona z obszaru B Próbka ujednolicona z obszaru C P-1A P-2A P-3A P-1B P-2B P-3B P-1C P-2C P-3C [mg/kg s.m.] 61,2 36,2 ±8,7 ±3,6 19,5 7,2 ±3,1 ±0,8 28,3 14,2 ±3,9 ±2,1 19,9 8,7 ±2,1 ±1,3 129,1 66,3 ±14,5 ±7,1 1,214 ±0,154 Wglowodory monoaromatyczne 17,3 ±1,8 3,8 ±0,5 5,2 ±0,9 2,8 ±0,6 27,2 ±3,1 89,2 62,2 ±15,5 ±8,2 22,7 1,8 ±3,8 ±2,4 3,1 11,2 ±3,9 ±1,8 21,8 9,3 ±3,8 ±1,2 167,8 93,5 ±29,5 ±9,7 21,6 ±2,8 5,2 ±1,1 7,6 ±1,9 3,8 ±0,5 39,2 ±3,8 Wielopiercieniowe wglowodory aromatyczne 0,474 ±0,098 0,128 ±0,019 1,871 ±0,305 1,470 ±0,178 0,358 ±0,167 62,5 32,5 ±7,8 ±3,4 17,5 8,2 ±2,9 ±0,9 23,2 18,3 ±3,5 ±2,4 21,2 10,2 ±2,8 ±1,6 124,4 69,2 ±13,8 ±7,9 1,041 ±0,167 0,587 ±0,099 17,3 ±2,1 4,2 ±0,9 6,9 ±1,5 3,1 ±0,7 31,5 ±3,4 0,132 ±0,020 Acenaften n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. Fluoren Fenantren Antracen 0,025 ±0,003 0,016 ±0,002 0,075 0,032 ±0,009 ±0,007 0,027 ±0,003 n.s. n.s. 0,013 ±0,002 n.s. 0,058 ±0,006 0,026 ±0,035 0,153 0,058 ±0,019 ±0,009 0,085 0,025 ±0,009 ±0,004 n.s. 0,032 0,019 0,009 ±0,005 ±0,003 ±0,004 0,023 0,088 0,042 0,018 ±0,003 ±0,010 ±0,009 ±0,003 n.s. 0,025 ±0,003 n.s. n.s. Piren n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. Benzo(a)antracen 0,028 0,017 0,048 0,028 0,048 0,028 0,009 n.s. n.s. ±0,004 ±0,002 ±0,009 ±0,004 ±0,005 ±0,003 ±0,001 Chryzen 0,044 0,021 0,009 0,082 0,032 0,012 0,054 0,035 0,012 ±0,005 ±0,003 ±0,001 ±0,010 ±0,005 ±0,002 ±0,007 ±0,004 ±0,002 Benzo(a)piren 0,152 0,062 0,015 0,282 0,082 0,032 0,181 0,071 0,010 ±0,028 ±0,007 ±0,004 ±0,038 ±0,004 ±0,008 ±0,031 ±0,009 ±0,002 Benzo(b)fluoranten 0,187 0,087 0,045 0,398 0,108 0,045 0,201 0,105 0,057 ±0,035 ±0,015 ±0,009 ±0,053 ±0,023 ±0,010 ±0,029 ±0,018 ±0,010 Benzo(k)flooranten 0,052 0,018 0,009 0,083 0,023 0,047 0,012 0,005 n.s. ±0,006 ±0,005 ±0,001 ±0,012 ±0,009 ±0,006 ±0,004 ±0,001 Dibenzo(a,h)antracen n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. Indeno(1,2,3-0,025 0,008 0,052 0,022 0,033 0,009 n.s. n.s. cd)piren ±0,005 ±0,001 ±0,015 ±0,008 ±0,004 ±0,001 n.s. Benzo(ghi)perylen 0,015 0,049 0,018 0,027 n.s. n.s. n.s. ±0,003 ±0,038 ±0,005 ±0,007 n.s. n.s. ΣWWA 1,758 0,758 0,239 2,127 1,424 0,514 1,747 0,917 0,248 ±0,394 ±0,157 ±0,040 ±0,589 ±0,325 ±0,098 ±0,298 ±0,177 ±0,041 Przeprowadzona analiza chromatograficzna wykazała, e rozkład n-alkanów w poszczególnych próbkach jest zbliony. Wystpuj wglowodory z zakresu n-c 6 n-c 36, jednak- e przewaaj n-alkany n-c 6 n-c 17, które w urednionej próbce z obszaru A stanowi 81,3%, 131

129 z obszaru B 88,3%, a z obszaru C 79,8%. We wszystkich badanych próbkach zidentyfikowano wglowodory z grupy izoprenoidów, nalece do zwizków trudno biodegradowalnych: pristan (Pr) i fitan (F). W odpadzie z dołu urobkowego Graby-67 stwierdzono obecno wglowodorów aromatycznych (BTEX i WWA), co udokumentowano w tabeli 6.2. Najwysz zawarto wglowodorów monoaromatycznych (BTEX) zanotowano na obszarze B w granicach: 167,8 39,2 mg/kg s.m., która wraz z głbokoci ulega zmniejszeniu. W przewaajcej iloci, przekraczajcej dopuszczalne standardy glebowe, wystpuje benzen i toluen. Wielopiercieniowe wglowodory aromatyczne (WWA) wystpuj w ladowych ilo- ciach. Na obszarze B (o najwyszym stopniu skaenia) ΣWWA zmniejsza si wraz z głbokoci od 2,127 do 0,514 mg/kg s.m. Najwysze zawartoci sporód zidentyfikowanych WWA wykazuje naftalen (1,871 0,358 mg/kg s.m.), a pozostałe zidentyfikowano w ilociach ladowych, nieprzekraczajcych standardów glebowych. Na pozostałych obszarach (A i C) zawartoci BTEX i WWA s zblione (nieznacznie nisze) do obszaru B. W celu wykazania, e stare doły urobkowe, na których przeprowadzono zabiegi oczyszczania, róni si charakterem zanieczyszcze ropopochodnych, przedstawiono charakterystyk zanieczyszcze kolejnego dołu urobkowego Graby-12, który przeznaczono do rekultywacji. Dół ten naleał do dołów suchych, z widocznymi plamami substancji ropopochodnych na powierzchni. Wykorzystujc metod krigingu przedstawiono graficzny rozkład zanieczyszcze ropopochodnych (TPH) z punktów rozmieszczonych na całym terenie dołu urobkowego Graby-12 (punkty 1 42) z głbokoci 30 cm ppt (rys. 6.5) oraz z głbokoci 80 cm ppt (rys. 6.6). Na podstawie uzyskanego obrazu wydzielono 3 obszary, charakteryzujce si rónym stopniem skaenia substancjami ropopochodnymi: Obszar I obejmujcy punkty (14, 15, 16, 25, 26, 27, 28, 37, 38), charakteryzujcy si najniszym stopniem skaenia na poziomie: mg/kg s.m. Obszar II zajmujcy najwiksz, rodkow cz dołu urobkowego Graby-12, obejmujcy punkty (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 17, 18, 23, 24, 29, 30, 35, 36, 39, 40), który cechuje si bardzo wysok zawartoci wglowodorów ropopochodnych ( mg/kg s.m.). 132

130 Obszar III obejmujcy punkty (8, 9, 10, 19, 20, 21, 22, 31, 32, 33, 34) o skaeniu substancjami ropopochodnymi na poziomie: mg/kg s.m Obszar III długo [m] Obszar I Obszar II Rys.6.5. Rozkład zanieczyszcze ropopochodnych (TPH) na dole urobkowym Graby-12 na głbokoci 30 cm ppt z zaznaczonymi punktami poboru próbek analitycznych Fig Petroleum hydrocarbons (TPH) concentration on surface level (interval 0-30 cm) in Graby-12 waste pit with points of sampling długo[m] długo [m] Obszar IIIw TPH [mg*10 3 /kg s.m.] TPH [mg*10 3 /kg s.m.] Obszar Iw Obszar IIw długo [m] Rys Rozkład zanieczyszcze ropopochodnych (TPH) na dole urobkowym Graby-12 na głbokoci 80 cm ppt Fig Petroleum hydrocarbons (TPH) concentration on level of 80 cm under the surface in Graby-12 waste pit with points of sampling 133

131 Rozkład zanieczyszcze ropopochodnych na głbokoci 80 cm ppt jest zbliony do rozkładu w warstwie powierzchniowej i z tego wzgldu wyróniono 3 obszary: Obszar Iw obejmujcy punkty (15, 27, 37, 38), który charakteryzuje si stopniem skaenia na poziomie: mg/kg s.m. Obszar IIw obejmujcy punkty (1, 2, 3, 4, 7, 12, 18, 24, 29, 35, 36, 40) o stopniu skaenia TPH w zakresie: mg/kg s.m. Obszar IIIw obejmujcy punkty (9, 10, 21, 22, 31, 33) o stopniu skaenia w granicach: mg/kg s.m. Na wyodrbnionych obszarach wytypowano punkty, w których pobrano próbki do analizy przekrojowej z rónych głbokoci dołu urobkowego Graby-12. Wyniki analiz zanieczyszcze ropopochodnych (TPH) zilustrowano na rys Dowodz one, e odpad z dołu urobkowego Graby-12 jest silnie skaony do głbokoci 120 cm ppt, dopiero na głbokoci 180 cm ppt stopie skaenia jest zbliony do standardów glebowych. W celu identyfikacji jakociowej i ilociowej wglowodorów wchodzcych w skład zanieczyszcze ropopochodnych w odpadzie z dołu urobkowego Graby-12 oraz wykonania dalszych bada i analiz, przygotowano próbki urednione (tabela 6.3). zawarto TPH [mg/kg s.m.] Obszar I punkt Obszar II punkt Obszar II punkt Obszar II punkt Obszar III punkt cm ppt 50 cm ppt 80 cm ppt 100 cm ppt 120 cm ppt 150 cm ppt 180 cm ppt Rys Porównanie zawartoci TPH w próbkach surowych pobranych z rónych głbokoci dołu urobkowego Graby-12 Fig Comparison in TPH contents of crude samples taken from Graby-12 waste pit on various depths 134

132 Tabela 6.3. Zestawienie próbek punktowych wchodzcych w skład próbek urednionych z poszczególnych podsekcji dołu urobkowego Graby-12 Table 6.3. Point samples included in averaged samples from consecutive parts of Graby-67 waste pit Próbka uredniona (podsekcja) Próbki składowe (punkty poboru) Głboko poboru [cm ppt] P-1I Próbki z obszaru I pobrane z punktów: 14, 15, 16, 25, 26, 27, 28, 37, P-2I Próbki z obszaru I pobrane z punktów: 15, 27, 37, P-3I Próbki z obszaru I pobrane z punktów: 15, 27, 37, P-1II Próbki z obszaru II pobrane z punktów: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 17, , 23, 24, 29, 30, 35, 36, 39, 40 P-2II Próbki z obszaru II pobrane z punktów: 1, 2, 3, 4, 7, 12, 18, 24, 29, 35, , 40 P-3II Próbki z obszaru II pobrane z punktów: 1, 2, 3, 4, 7, 12, 18, 24, 29, 35, 36, P-1III Próbki z obszaru III pobrane z punktów: 8, 9, 10, 19, 20, 21, 22, 31, 32, , 34 P-2III Próbki z obszaru III pobrane z punktów: 9, 10, 21, 22, 31, P-3III Próbki z obszaru III pobrane z punktów: 9, 10, 21, 22, 31, Obszar II rodkowa cz dołu urobkowego Graby-12 charakteryzuje si najwyszym stopniem skaenia. Wraz ze wzrostem głbokoci zawarto zanieczyszcze ulega zmniejszeniu, od do mg/kg s.m. Na pozostałych obszarach (I i III) zanieczyszczenie substancjami ropopochodnymi jest nisze. Podobnie, jak w przypadku dołu urobkowego Graby-67, n-alkany zidentyfikowane na terenie dołu urobkowego Graby-12 stanowi przewaajc cz zanieczyszcze ropopochodnych i w zalenoci od analizowanego obszaru zawieraj si w przedziale: obszar I 71,6 79,9%, obszar II 79,4 89,4%, obszar III 70,1 77,2%. Rozkład zidentyfikowanych n-alkanów n-c 6 n-c 36 w urednionych próbkach z rónych interwałów głbokociowych z obszarów wyznaczonych na terenie dołu urobkowego Graby-12, zilustrowano na rys Stwierdzono widoczne rónice w ich rozkładzie na poszczególnych, wyodrbnionych obszarach, szczególnie w przypadku wglowodorów z zakresu n-c 6 n-c 10, które w najwikszych ilociach wystpuj na obszarze II, najsilniej skaonym. Ogólnie mona stwierdzi, e w najwikszych ilociach wystpuj wglowodory z zakresu n-c 11 n-c 22. W analizowanych próbkach stwierdzono obecno wglowodorów z grupy izoprenoidów (pristan i fitan). Na podstawie wykonanych analiz chromatograficznych stwierdzono, e odpad z dołu urobkowego Graby-12 (tabela 6.4) zawiera prawie dwukrotnie nisz zawarto wglowodorów monoaromatycznych (BTEX), ni odpad z dołu urobkowego Graby-67. Zawarto wielopiercieniowych wglowodorów aromatycznych (WWA), wród których dominuje naftalen oraz benzo(b)fluoranten, jest prawie dwukrotnie wysza ni w przy- 135

133 padku dołu Graby-67. Pozostałe WWA, których obecno stwierdzono w zanieczyszczeniach z dołu urobkowego Graby-12, wystpuj w ilociach ladowych, nieprzekraczajcych standardów glebowych. Benzen Tabela 6.4. Zestawienie zawartoci BTEX i WWA oznaczonych w analizowanych próbkach gleby z dołu urobkowego Graby-12 (liczba powtórze n = 9-10, p < 0,05) Table 6.4. BTEX and WWA contents determined in soil samples from Graby-67 waste pit (repetition number n = 9-10, p < 0.05) Oznaczany składnik Etylobenzen Toluen Ksyleny BTEX Próbka ujednolicona z obszaru I Próbka ujednolicona z obszaru II Próbka ujednolicona z obszaru III P-1I P-2I P-3I P-1II P-2II P-3II P-1III P-2III P-3III [mg/kg s.m.] Wglowodory monoaromatyczne 21,1 14,8 3,7 37,1 21,2 8,6 31,7 16,7 4,2 ± 2,7 ± 1,7 ± 0,4 ± 3,9 ± 2,8 ± 0,9 ± 3,5 ± 1,9 ± 0,5 6,7 3,8 1,5 15,8 7,5 2,7 7,5 3,5 1,4 ± 0,8 ± 0,5 ± 0,2 ± 1,7 ± 1,1 ± 0,4 ± 0,9 ± 0,5 ± 0,2 15,7 6,8 2,4 27,5 14,4 3,5 19,4 7,2 3,1 ± 1,9 ± 0,8 ± 0,3 ± 3,2 ± 1,8 ± 0,6 ± 1,9 ± 0,9 ± 0,4 7,9 4,5 1,1 14,7 5,7 1,5 8,3 5,5 1,8 ± 0,9 ± 0,6 ± 0,2 ± 1,7 ± 0,7 ± 0,3 ± 0,9 ± 0,6 ± 0,3 51,4 30,1 8,7 95,4 48,9 16,3 67,1 33,1 10,5 ± 6,4 ± 3,4 ± 1,0 ± 10,5 ± 5,7 ± 2,3 ± 7,2 ± 3,8 ± 1,2 Wielopiercieniowe wglowodory aromatyczne Naftalen 1,614 0,647 0,204 2,818 2,078 0,578 1,794 1,407 0,215 ± 0,219 ± 0,097 ± 0,037 ± 0,647 ± 0,351 ± 0,078 ± 0,224 ± 0,1027 ± 0,039 Acenaften 0,062 0,042 0,021 0,075 0,068 0,035 0,059 0,034 0,015 ± 0,009 ± 0,005 ±0,003 ± 0,018 ± 0,009 ±0,004 ± 0,008 ± 0,005 ±0,003 Fluoren 0,068 0,030 0,010 0,178 0,058 0,025 0,081 0,048 0,016 ± 0,009 ± 0,005 ± 0,002 ± 0,028 ± 0,008 ± 0,003 ± 0,014 ± 0,009 ± 0,003 Fenantren 0,201 0,058 0,021 0,358 0,157 0,037 0,226 0,062 0,024 ± 0,045 ± 0,007 ± 0,003 ± 0,069 ± 0,018 ± 0,004 ± 0,046 ± 0,012 ± 0,004 Antracen 0,051 0,021 0,017 0,099 0,048 0,028 0,067 0,032 0,019 ± 0,009 ± 0,004 ± 0,002 ± 0,015 ± 0,007 ± 0,003 ± 0,009 ± 0,005 ± 0,004 Piren 0,021 0,017 0,048 0,027 0,035 0,012 n.s. n.s. ± 0,004 ± 0,003 ± 0,009 ± 0,003 ± 0,006 ± 0,003 n.s. Benzo(a)antracen 0,034 0,027 0,015 0,088 0,057 0,024 0,045 0,034 0,018 ± 0,005 ± 0,004 ± 0,002 ± 0,013 ± 0,008 ± 0,003 ± 0,008 ± 0,005 ± 0,004 Chryzen 0,028 0,019 0,009 0,045 0,030 0,011 0,032 0,024 0,010 ± 0,003 ± 0,003 ± 0,001 ± 0,008 ± 0,005 ± 0,002 ± 0,005 ± 0,004 ± 0,002 Benzo(a)piren 0,150 0,064 0,022 0,294 0,099 0,042 0,164 0,078 0,015 ± 0,024 ± 0,009 ± 0,004 ± 0,030 ± 0,013 ± 0,007 ± 0,032 ± 0,015 ± 0,003 Benzo(b)fluoranten 0,289 0,104 0,051 0,478 0,224 0,067 0,301 0,089 0,021 ± 0,051 ± 0,018 ± 0,008 ± 0,078 ± 0,037 ± 0,014 ± 0,058 ± 0,017 ± 0,004 Benzo(k)flooranten 0,042 0,027 0,009 0,083 0,045 0,015 0,058 0,032 0,009 ± 0,007 ± 0,004 ± 0,002 ± 0,012 ± 0,008 ± 0,003 ± 0,009 ± 0,005 ± 0,002 Dibenzo(a,h)antracen n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. Indeno(1,2,3-cd)piren Benzo(ghi)perylen ΣWWA 0,019 ± 0,004 0,009 ± 0,002 0,045 0,018 ± 0,009 ± 0,004 2,714 1,178 ± 0,421 ± 0,197 n.s. n.s. 0,381 ± 0,169 0,039 ± 0,010 0,021 ± 0,008 0,068 0,027 ± 0,012 ± 0,004 4,711 2,997 ± 1,178 ± 0,478 n.s. n.s. 0,862 ± 0,148 0,027 ± 0,006 0,010 ± 0,002 0,057 0,019 ± 0,010 ± 0,004 3,125 1,891 ± 0,589 ± 0,357 n.s. n.s. 0,378 ± 0,

134 zawarto n-alkanów [mg/kg s.m.] n-c6 n-c7 n-c8 n-c9 n-c10 n-c11 n-c12 n-c13 n-c14 n-c15 n-c16 n-c17 Pr n-c18 F n-c19 n-c20 n-c21 n-c22 n-c23 n-c24 n-c25 n-c26 n-c28 n-c30 n-c32 n-c34 n-c36 P-1 I P-2 I P-3 I zawarto n-alkanów [mg/kg s.m.] n-c6 n-c7 n-c8 n-c9 n-c10 n-c11 n-c12 n-c13 n-c14 n-c15 n-c16 n-c17 Pr n-c18 F n-c19 n-c20 n-c21 n-c22 n-c23 n-c24 n-c25 n-c26 n-c28 n-c30 n-c32 n-c34 n-c36 P-1 II P-2 II P-3 II zawarto n-alkanów [mg/kg s.m.] n-c6 n-c7 n-c8 n-c9 n-c10 n-c11 n-c12 n-c13 n-c14 n-c15 n-c16 n-c17 Pr n-c18 F n-c19 n-c20 n-c21 n-c22 n-c23 n-c24 n-c25 n-c26 n-c28 n-c30 n-c32 n-c34 n-c36 P-1 III P-2 III P-3 III Rys Porównanie udziału poszczególnych n-alkanów zidentyfikowanych w próbkach urednionych z rónych interwałów głbokociowych na poszczególnych obszarach dołu urobkowego Graby-12 (liczba pomiarów n = 9-10, p < 0,05) Fig Comparison of n-alkanes identified in averaged samples from various depths on consecutive areas of Graby-12 waste pit (repetition number n = 9-10, p < 0.05) 137

135 Badaniami fizyczno-chemicznymi objto próbki odpadów z dołów urobkowych Graby-67 i Graby-12, które zostały pobrane z rónych interwałów na wyodrbnionych obszarach (tab. 6.5 i tab. 6.6). Przewodno elektryczna właciwa wycigów wodnych odpadów (10:1) jest stosunkowo niska i mało zrónicowana, zarówno dla prób z rónych głbokoci i obszarów danego dołu, jak i prób z obu testowanych dołów urobkowych. Zmierzone wartoci przewodnoci elektrycznej w warstwie powierzchniowej na ogół mieszcz si w zakresie S/cm, natomiast w głbszych warstwach nieznacznie wzrastaj. Wartoci te s nieznacznie wysze ni zmierzone w wycigach wodnych gleby nieskaonej substancjami ropopochodnymi, zbli- one do wartoci wycigu wodnego ropy karpackiej i znaczco nisze od wartoci uzyskiwanych dla wycigów wodnych odpadów wiertniczych z wierce obrotowo-płuczkowych, które mieszcz si w zakresie S/cm. Uzyskane wyniki pomiarów przewodnoci elektrycznej wiadcz o braku w badanych odpadach obcych, tzn. wprowadzonych wraz z płuczk, elektrolitów (soli nieorganicznych). Wartoci ph wycigów wodnych odpadów (10:1) z obu badanych dołów urobkowych s mało zrónicowane i mieszcz si dla wszystkich badanych prób w zakresie: 6,02 6,59. Oznaczone wartoci s znacznie nisze ni wystpujce w odpadach z wierce obrotowopłuczkowych, gdzie ph czsto przekracza 9,0, co jest spowodowane regulowaniem odczynu płuczki przez dawkowanie rozpuszczalnych wodorotlenków lub wodorowglanów. Zawarto substancji o organicznych (ChZT Cr ) w wycigach wodnych z badanych odpadów mieci si w zakresie mg O 2 /dm 3 i nie przekracza wartoci oznaczanych w odpadach wiertniczych (wiercenia metod obrotowo-płuczkow), które przewanie przekra-czaj 1500 mg O 2 /dm 3, a w niektórych przypadkach osigaj 9000 mg O 2 /dm 3. Przedstawione wyniki bada przemawiaj za tym, e odpady ze starych dołów urobkowych (Graby-67 i Graby-12) nie zawieraj odpadów płuczek stosowanych w wierceniach obrotowo-płuczkowych (np. zwizków skrobiowych, celulozowych, polimerów i innych substancji organicznych). Zawarto metali cikich w analizowanych próbkach nie przekracza dopuszczalnych wartoci, okrelonych przez standardy jakoci gleby i ziemi, podane w rozporzdzeniu Ministra rodowiska z dnia 9 wrzenia 2002 r. (Dz.U. nr 165, poz. 1359). Kształtuj si one na 138

136 niskim poziomie, widoczne jest jedynie nieznaczne podwyszenie zawartoci baru w próbkach z interwału cm ppt na obszarach obu testowanych dołów urobkowych, co jest zwizane ze stosowaniem przy pogłbianiu otworów płuczek na bazie bentonitu. Tabela 6.5. Fizyko-chemiczna charakterystyka odpadów z dołu urobkowego Graby-67 Table 6.5. Physico-chemical characteristics of waste from Graby-67 waste pit Oznaczenie Jednostka Próbka ujednolicona z obszaru A Próbka ujednolicona z obszaru B Próbka ujednolicona z obszaru C P-1A P-2A P-3A P-1B P-2B P-3B P-1C P-2C P-3C Odczyn roztworu wodnego (1:10) ph 6,35 6,18 6,02 6,48 6,31 6,20 6,59 6,43 6,12 Przewodno elektryczna r-ru S/cm wodnego (1:10) ChZT (Cr) roztworu mg O 2/dm wodnego (1:10) Wilgotno % 37,5 31,5 24,8 42,8 30,5 25,8 39,5 40,5 29,5 TPH mg/kg s.m Fenole mg/kg s.m. 19,5 8,5 3,2 28,5 12,3 3,4 22,3 9,8 2,8 Cl mg/kg s.m. 75,8 79,8 71,5 108,4 98,5 88,4 78,5 81,2 79,1 2 SO 4 g/kg s.m. 331,2 524,4 412,5 674,5 983,5 652,4 497,8 624,8 507,5 + NH 4 mg/kg s.m. 32,8 31,5 28,4 31,2 30,5 29,5 33,8 31,5 28,4 NO 3 mg/kg s.m. 61,2 58,2 50,1 62,1 60,4 54,1 69,4 68,4 49,5 3 PO 4 mg/kg s.m. 51,7 48,2 45,8 68,2 67,5 58,4 70,6 69,2 65,4 Al 2O 3 g/kg s.m. 612,5 874,5 622,7 712,4 927,4 687,5 668,7 897,4 647,8 SiO 2 g/kg s.m. 449,8 507,5 459,1 478,5 531,7 498,5 467,8 521,8 445,9 Fe 2O 3 g/kg s.m. 18,4 17,8 10,8 19,5 20,7 12,5 18,5 16,7 10,5 CaO g/kg s.m. 6,4 7,5 5,8 7,2 8,2 6,4 9,4 9,3 8,1 MgO g/kg s.m. 3,1 3,0 2,7 3,0 2,9 2,7 3,8 3,2 2,0 As mg/kg s.m. 2,0 2,5 2,1 2,2 2,7 2,4 1,5 1,6 1,2 Ba mg/kg s.m. 68,4 193,8 129,5 109,2 289,2 152,3 72,9 223,8 135,8 Cd mg/kg s.m. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. Cr mg/kg s.m. 26,8 22,8 19,8 39,5 48,5 31,5 27,6 22,5 16,4 Co mg/kg s.m. 2,3 3,4 1,5 2,7 3,1 2,1 1,7 1,6 1,3 Cu mg/kg s.m. 22,7 25,9 16,8 23,5 27,3 19,5 23,5 24,6 20,9 Pb mg/kg s.m. 24,8 20,4 15,9 29,5 31,2 25,8 26,3 20,5 15,8 Mo mg/kg s.m. 2,8 2,5 1,6 3,2 4,0 3,5 2,5 2,3 2,0 Sn mg/kg s.m. 8,1 7,2 6,1 9,7 10,2 8,2 8,1 9,2 6,4 Zn mg/kg s.m. 23,7 26,8 15,6 22,5 27,2 17,2 24,1 22,1 13,7 Ni mg/kg s.m. 7,3 8,1 6,9 7,2 9,3 5,2 8,3 9,4 8,1 Zawarto metali cikich Obliczone, na podstawie wykonanych analiz chemicznych, proporcje zawartoci C:N:P odbiegaj od optymalnych i kształtuj si odpowiednio: dla dołu urobkowego Graby-67 w zakresie: 100:2:1 100:3:1, a dla dołu urobkowego Graby-12 w przedziale: 100:1:9 100:1:10. Dowodzi to, e procesy mikrobiologiczne w rodowisku glebowym s zahamowane i bez odpowiedniego wzbogacenia gleby w substancje biogenne mikroorganizmy autochtoniczne nie zostan uaktywnione. Wysoki poziom skaenia substancjami ropopochodnymi gleby na dołach urobkowych dokumentuj wyniki analiz chromatograficznych, przedstawione w rozdziale 6.1. Ponadto oznaczono obecno fenoli w warstwach powierzchniowych obu omawianych dołów w zakresie: 16,1 28,5 mg/kg s.m., co przekracza dopuszczalne wartoci ste w glebie i ziemi. 139

137 Tabela 6.6. Fizyko-chemiczna charakterystyka odpadów z dołu urobkowego Graby-12 Table 6.6. Physico-chemical characteristics of waste from Graby-12 waste pit Oznaczenie Odczyn roztworu wodnego (1:10) Przewodno elektryczna r-ru wodnego (1:10) Jednostka Próbka ujednolicona z obszaru I Próbka ujednolicona z obszaru II Próbka ujednolicona z obszaru III P-1I P-2I P-3I P-1II P-2II P-3II P-1III P-2III P-3III ph 6,32 6,16 6,05 6,23 6,13 6,02 6,26 6,12 6,09 S/cm ChZT (Cr) roztworu mg O 2/dm wodnego (1:10) Wilgotno % 29,5 22,1 19,8 28,2 21,4 16,7 27,4 22,5 17,2 TPH mg/kg s.m Fenole mg/kg s.m. 16,2 8,1 2,8 21,5 10,2 3,1 18,2 9,5 3,0 Cl mg/kg s.m. 85,1 92,1 90,2 102,2 112,2 99,1 112,4 127,1 107,2 2 SO 4 g/kg s.m. 312,5 387,1 297,1 47,5 617,2 507,2 319,2 418,2 407,2 + NH 4 mg/kg s.m. 6,2 4,2 3,1 3,1 2,2 1,6 3,2 2,5 1,9 NO 3 mg/kg s.m. 23,3 20,1 15,4 14,7 13,4 10,5 18,2 17,3 11,2 3 PO 4 mg/kg s.m. 142,3 140,2 138,4 134,5 130,1 124,1 129,4 128,0 124,5 Al 2O 3 g/kg s.m. 721,2 758,1 627,5 778,1 814,2 784,7 731,2 789,2 712,7 SiO 2 g/kg s.m. 817,2 898,1 807,2 824,5 899,2 804,7 827,1 810,1 812,4 Fe 2O 3 g/kg s.m. 10,3 11,5 8,6 10,8 8,2 6,2 10,5 9,0 7,2 CaO g/kg s.m. 5,2 4,9 4,8 5,4 5,6 4,8 5,1 4,9 4,3 MgO g/kg s.m. 4,1 4,4 4,0 4,2 4,7 4,3 5,1 4,9 4,5 As mg/kg s.m. 4,2 4,2 4,3 5,7 5,5 3,1 6,1 5,8 5,1 Ba mg/kg s.m. 71,4 143,2 103,2 89,1 227,1 158,4 62,1 167,1 117,2 Cd mg/kg s.m. 1,1 1,0 1,0 1,5 1,4 1,4 1,2 1,3 1, 1 Cr mg/kg s.m. 8,7 8,8 7,5 9,8 8,1 7,1 9,2 8,7 7,8 Co mg/kg s.m. 4,2 3,1 2,1 5,1 3,1 2,4 2,8 2,2 2,1 Cu mg/kg s.m. 10,2 8,1 7,5 12,2 10,2 9,1 8,3 9,1 7,2 Pb mg/kg s.m. 19,2 21,7 16,2 12,5 13,7 10,8 19,1 20,7 12,7 Mo mg/kg s.m. 5,3 4,2 3,7 5,4 5,7 5,0 7,2 7,3 6,1 Sn mg/kg s.m. 4,2 3,2 2,3 6,1 5,9 4,3 8,4 7,2 7,0 Zn mg/kg s.m. 15,0 14,6 13,5 22,4 20,8 16,7 19,0 15,4 13,7 Ni mg/kg s.m. 15,1 14,3 10,2 18,2 17,3 16,2 15,2 13,2 10,2 Zawarto metali cikich Charakterystyka mineralogiczno-fazowa gleby i ziemi z dołów urobkowych została dokonana głównie na podstawie wyników dyfraktometrycznych bada rentgenograficznych. Wyniki bada wykonanych na próbkach z rónych interwałów zestawiono w tabelach 6.7 i 6.8 oraz przedstawiono przykładowo dyfraktogramy rentgenowskie dla dołu urobkowego Graby-67 obszar B (rys ) oraz Graby-12 obszar II (rys ). Głównymi składnikami analizowanych próbek s minerały ilaste oraz kwarc. Towarzysz im nieznaczne iloci skaleni, chlorytu, dolomitu, halitu, anhydrytu i pirytu. Zawarto minerałów ilastych w obrbie jednego dołu urobkowego jest zrónicowana w odpadzie z dołu urobkowego Graby-67 na obszarze B wynosi 65 68%, a na pozostałych obszarach jest znacznie nisza i zawiera si w granicach 36 38%. Analiza frakcji ilastej z terenu dołu urob- 140

138 kowego Graby-67 na obszarze B wykazała, e głównym jej składnikiem jest minerał mieszanopakietowy illit/smektyt o zawartoci pakietów smektytowych wynoszcej około % (rys. 6.10). Tabela 6.7. Ocena składu mineralnego odpadu z dołu urobkowego Graby-67 na podstawie interpretacji dyfraktogramu rentgenowskiego Table 6.7. Mineral content of soil from Graby-67 waste pit based on X-ray diffractogramme results Próbka Q [%] Sk [%] C [%] D [%] P [%] Ha [%] A[%] il [%] Obszar A P-2A <1 38 P-3A <1 35 Obszar B P-2B <1 68 P-3B <1 65 Obszar C P-2C <1 37 P-3C <1 36 Tabela 6.8. Ocena składu mineralnego odpadu z dołu urobkowego Graby-12 na podstawie interpretacji dyfraktogramu rentgenowskiego Table 6.8. Mineral content of soil from Graby-12 waste pit based on X-ray diffractogramme results Próbka Q [%] Sk [%] C [%] D [%] P [%] Ha [%] A[%] il [%] Obszar I P-2 I <1 27 P-3 I <1 19 Obszar II P-2 II <1 43 P-3 Ii <1 36 Obszar III P-2 III <1 26 P-3 III <1 18 Symbole: Q kwarc, ; C kalcyt, 5-586; D dolomit, ; P piryt, 6-710; Ha halit, A anhydryt, Sk skalenie, identyfikacja grupowa; M miki i min. z grupy illitu; Kl kaolinit; Ch chloryt; Σil suma min. ilastych; Zn cynkit, wzorzec Rys Dyfraktogram rentgenowski odpadu z dołu urobkowego Graby-67 (obszar B) Fig X-ray diffractogramme of soil from Graby-67 waste pit (area B) 141

139 czarna linia - próbka w stanie powietrzno-suchym, czerwona linia - preparat glikolowany; kolorem niebieskim podano połoenia refleksów I/S wykorzystanych do oznaczenia zawartoci pakietów S Symbole: I illit; I/S minerał mieszanopakietowy illit/smektyt; Kl kaolinit; Ch chloryt; Q kwarc Rys Dyfraktogram rentgenowski frakcji ilastej z dołu urobkowego Graby 67 (obszar B) Fig X-ray diffractogramme of clay fraction from Graby-67 waste pit (area B) Symbole: Q kwarc, ; C kalcyt, 5-586; D dolomit, ; P piryt, 6-710; Ha halit, A anhydryt, Sk skalenie, identyfikacja grupowa; M miki i min. z grupy illitu; Kl kaolinit; Ch chloryt; Σil suma min. ilastych; Zn cynkit, wzorzec Rys Dyfraktogram rentgenowski odpadu z dołu urobkowego Graby-12 ( obszar II) Fig X-ray diffractogramme of soil from Graby-12 waste pit (area II) Odpad z dołu urobkowego Graby-12 charakteryzuje si nisz zawartoci minerałów ilastych, w porównaniu z odpadem pochodzcym z dołu urobkowego Graby-67, która jest take zrónicowana w zalenoci od wydzielonego obszaru i ulega zmniejszeniu wraz z głbokoci. Najwysz zawarto minerałów ilastych w odpadzie z dołu Graby-12 odnotowano na obszarze II w granicach: 36 43%. Dyfraktogram rentgenowski frakcji ilastej dokumentuje stan wysokiej delaminacji minerałów o strukturze pczniejcej (mieszano-pakietowy illit/smektyt), o zawartoci pakietów smektytowych wynoszcej około: 69 80%, co mona stwierdzi na podstawie rozmytego pasma dyfrakcyjnego w zakresie niskoktowym 4 10 o 2 (rys. 6.12). 142

140 czarna linia próbka w stanie powietrzno-suchym, czerwona linia preparat glikolowany; kolorem niebieskim podano połoenia refleksów I/S wykorzystanych do oznaczenia zawartoci pakietów S Symbole: I illit; I/S minerał mieszanopakietowy illit/smektyt; Kl kaolinit; Ch chloryt; Q kwarc Rys Dyfraktogram rentgenowski frakcji ilastej z dołu urobkowego Graby 12 (obszar II) Fig X-ray diffractogramme of clay fraction from Graby-12 waste pit (area II) Wyniki bada enzymatycznych, mikrobiologicznych i respirometrycznych odpadów surowych z dołów urobkowych Graby-67 i Graby-12 zestawiono w tabelach 6.9 i Aktywno mikrobiologiczna mierzona aktywnoci dehydrogenazow kształtowała si na niskim poziomie i wyranie uległa obnieniu w głbszych warstwach odpadu z badanych dołów. Ogólna liczba bakterii w próbkach odpadu z obu oczyszczanych dołów urobkowych była zbliona i kształtowała si na poziomie: 8,1*10 5 2,2*10 6 jtk/g s.m., natomiast liczba bakterii degradujcych wglowodory ropopochodne mieciła si w zakresie: 1,0*10 5 1,9*10 5 jtk/g s.m. Oznaczona liczba grzybów mieciła si w granicach 1,0*10 2 3,9*10 2 jtk/g s.m. Wraz ze wzrostem głbokoci, liczba bakterii i grzybów ulegała wyranemu obnieniu na terenach opisywanych dołów urobkowych. Wyniki bada respirometrycznych pozwalaj na stwierdzenie, e procesy biodegradacji przebiegaj z wysz szybkoci w płytkich warstwach dołu urobkowego produkcja CO 2 jest trzykrotnie wysza ni w warstwach głbszych. Wyniki bada respirometrycznych koreluj z wynikami bada aktywnoci dehydrogenazowej. 143

141 Tabela 6.9. Kształtowanie si wybranych parametrów bada enzymatycznych, mikrobiologicznych i respirometrycznych odpadu dołu urobkowego Graby-67 Table 6.9. Exemplary parameters of enzymatic, microbiological and respirometrical tests led in Graby-67 waste pit Próbka Aktywno dehydrogenazowa [g TF/g s.m./24h] Ogólna liczba bakterii [jtk/g s.m.] Liczba bakterii degradujcych wglowodory [jtk/g s.m] Liczba grzybów [jtk/g s.m] Ilo wydzielonego CO 2 [mg CO 2 /g s. m./12h] Ilo pobieranego O 2 [mg O 2 /g s. m./12h] Obszar A P-1 A 8,41 2,2 * ,9 * ,9 * ,101 0,187 P-2 A 7,52 1,8 * ,4 * ,1* ,078 0,167 P-3A 3,51 9,7 * ,0 * ,0 * ,031 0,158 Obszar B P-1 B 7,24 2,0 * ,8 * ,1* ,094 0,184 P-2 B 6,45 1,9 * ,2 * ,4 * ,079 0,178 P-3 B 3,56 1,1 * ,1 * ,7* ,034 0,138 Obszar C P-1 C 8,91 2,6 * ,7 * ,0 * ,098 0,178 P-2 C 7,12 2,4 * ,1 * ,1 * ,075 0,160 P-3 C 4,15 8,1 * ,5 * ,9 * ,037 0,147 Tabela Kształtowanie si wybranych parametrów bada enzymatycznych, mikrobiologicznych i respirometrycznych odpadu dołu urobkowego Graby-12 Table Exemplary parameters of enzymatic, microbiological and respirometrical tests led in Graby-12 waste pit Próbka Aktywno dehydrogenazowa [g TF/g s.m./24h] Ogólna liczba bakterii [jtk/g s.m.] Liczba bakterii degradujcych wglowodory [jtk/g s.m] Liczba grzybów [jtk/g s.m] Ilo wydzielonego CO 2 [mg CO 2 /g s. m./12h] Ilo pobieranego O 2 [mg O 2 /g s. m./12h] Obszar I P-1 I 12,71 1,9 * ,3 * ,1 * ,131 0,221 P-2 I 10,27 1,5 * ,0 * ,1 * ,085 0,207 P-3 I 5,42 9,8 * ,1 * ,1 * ,045 0,198 Obszar II P-1 II 10,15 1,7 * ,4 * ,9 * ,111 0,224 P-2 II 9,26 1,5 * ,1 * ,8 * ,065 0,207 P-3 II 4,24 9,1 * ,8 * ,1 * ,055 0,195 Obszar III P-1 III 11,15 1,6 * ,3 * ,2 * ,104 0,214 P-2 III 7,56 1,4 * ,1 * * ,068 0,192 P-3 III 5,13 1,4 * ,1 * * ,035 0,

142 Z danych archiwalnych dotyczcych wierce i eksploatacji otworów na kopalni Grabownica oraz dołów urobkowych, w których gromadzono odpad wiertniczy pochodzcy z tych wierce wynika, e: dół urobkowy Graby-67 powstał w latach podczas wiercenia otworu Graby-67, wykonanego metod udarow (1951 r. 644 m ppt, 1952 r. 733 m ppt, 1962 r. 816,5 m ppt), dół urobkowy Graby-12 powstał w latach podczas wiercenia otworu Graby-12, wykonanego metod udarow (1938 r. 659 m ppt, 1939 r. 738 m ppt, 1941 r. 845 m ppt, 1944 r. 873 m ppt). Odpad wiertniczy z powyszych dołów urobkowych zawiera urobek skalny (ziemi), reprezentujcy cały przewiercony profil geologiczny w postaci utworów czwartorzdowych i trzeciorzdowych (rozdział 7), a take rop z nawierconych warstw wodononych, w postaci zmieszanej i rozpuszczonej oraz zaadsorbowanej na powierzchni ziaren ziemi. Zanieczyszczenia ropopochodne pod wpływem czasu ulegały przemianom na skutek procesów rozpuszczania odparowania i biodegradacji, co miało wpływ na ich teraniejszy skład. Czsto do ostatniego pogłbiania otworu (np. Graby-67) uywano metody obrotowo-płuczkowej, w której płuczk stanowiła wodna zawiesina iłu (płuczka iłowo-bentonitowa), poniewa wobec małej głbokoci otworów (do 1000 m ppt) nie było koniecznoci uycia do komponowania płuczki rodków chemicznych. wiadcz o tym parametry okrelone w analizach fizykochemicznych: przewodno elektryczna, ph, ChZT (Cr), zawarto metali cikich. Ponadto odpady ze starych dołów urobkowych mog zawiera piasek, torf, ziemi stosowan w latach siedemdziesitych do wstpnego ich oczyszczenia (rozdział 3). Na podstawie przeprowadzonych analiz oraz przegldu danych archiwalnych stwierdzono, e odpady z dołów urobkowych Graby-67 i Graby-12 zawieraj gleb i ziemi bardzo silnie skaon substancjami ropopochodnymi i mona je zakwalifikowa do grupy odpadów o kodzie ex * gleba i ziemia zanieczyszczona substancjami ropopochodnymi. Dokonana charakterystyka odpadów z dołów urobkowych Graby-67 i Graby-12 umoliwiła ich zakwalifikowanie do grupy odpadów o kodzie ex *, co było jednym z wymogów uzyskania zezwolenia na unieszkodliwianie odpadów zanieczyszczonych substancjami ropopochodnymi metod in-situ. Ponadto stanowiła podstaw przy podejmowaniu właciwych decyzji przy opracowywaniu technologii ich oczyszczania z zanieczyszcze ropopochodnych. 145

143 W przypadku niedostatecznego uszczelnienia dołu urobkowego, zlokalizowanego w niekorzystnych warunkach geologicznych, moe nastpi skaenie wód podziemnych infiltrujcymi z niego zanieczyszczeniami. Do oceny zagroenia rodowiska gruntowo-wodnego niezbdna jest znajomo składu i iloci odcieków oraz warunków hydrogeologicznych wystpujcych w rejonie składowania odpadu [Macuda et al., 1999]. Celem wykonanych prac było okrelenie budowy geologicznej i warunków hydrogeologicznych w rejonie projektowanej inwestycji, polegajcej na unieszkodliwianiu metod in-situ odpadów w postaci ziemi i gleby zanieczyszczonych substancjami ropopochodnymi o kodzie ex *, zdeponowanych w dołach urobkowych Graby-67 i Graby-12. Posłuyły one do opracowania dokumentacji hydrogeologicznej dla potrzeb inwestycji. Dokumentacje opracowano indywidualnie dla kadego dołu urobkowego, zgodnie z wymogami okrelonymi w Rozporzdzeniu Ministra rodowiska z dnia 3 padziernika 2005 r. w sprawie szczegółowych wymaga, jakim powinny odpowiada dokumentacje hydrogeologiczne i geologiczno-inynierskie (Dz.U. Nr 201, poz z 2005 r.). Były one jednym z podstawowych elementów niezbdnych do uzyskania decyzji, zezwalajcej na prowadzenie działalnoci w zakresie unieszkodliwiania zanieczyszcze ropopochodnych na dołach urobkowych Graby- 67 i Graby-12. Teren, na którym zlokalizowane s doły urobkowe Graby-67 i Graby-12, połoony jest na zboczu lokalnego wzniesienia bez nazwy, o długim płaskim grzbiecie i przebiegu SE i SW. Bezwzgldna wysoko terenu w rejonie prowadzonych prac wynosi około m n.p.m., natomiast pobliskie wzniesienia sigaj wysokoci 381 m n.p.m. Rzdne koryt potoków w re- 146

144 jonie prac osigaj około 320 m n.p.m. Deniwelacja obszaru bada wynosi ok 9,0 m. Sie hydrograficzn tworz w rejonie bada liczne potoki płynce dolinami, drenujc zbocza pobliskich wzniesie. Na południowy-wschód w odległoci około 1800 m od terenu prac przepływa potok Grabownica, który stanowi prawy dopływ rzeki Stobnica, bdcej dopływem Wisłoka. Omawiany teren pod wzgldem geologicznym połoony jest w Karpatach zewntrznych (fliszowych), w obrbie jednostki tektonicznej zwanej płaszczowin lsk. W podłou projektowanej inwestycji (dołów urobkowych Graby-67 i Graby-12) wystpuj utwory trzeciorzdowe i czwartorzdowe. Rejon ten połoony jest na południowym skrzydle antykliny Strachociny-Jurowiec. Fałd ten zbudowany jest z utworów kredowych w jdrze oraz utworów trzeciorzdowych, z których na powierzchni w rejonie Grabownicy Starzeskiej ukazuj si warstwy kronieskie, a bardziej w kierunku południowo-wschodnim łupki pstre eoceskie, warstwy menilitowe oraz warstwy istebniaskie. Budowa tego fałdu jest prawidłowa, miejscami posiada tylko wsteczne odchylenia ku południowi. Na skrzydłach antykliny wystpuj utwory warstw kronieskich o bardzo stromych upadach ok o. Podłoe trzeciorzdowe w rejonie prac buduj warstwy kronieskie dolne wykształcone w postaci piaskowców rednioławicowych i łupków oraz łupki pstre z wkładkami piaskowców. W rejonie dołu urobkowego Graby-67 podłoe trzeciorzdowe nawiercono na głboko od 2,70 m ppt (otwór PB-1/67), poprzez 4,58 m ppt (otwór PB-2/67) do 5,20 m ppt (otwór PB-3/67), w postaci warstw kronieskich wykształconych w formie piaskowcowołupkowej. W rejonie dołu urobkowego Graby-12 podłoe trzeciorzdowe nawiercono na głbokoci od 2,70 m ppt (otwór PB-1/12), poprzez 3,78 m ppt (PB-2/12), do głbokoci 4,70 m ppt (otwór PB-3/12), wykształcone w postaci eoceskich pstrych łupków. W czasie prowadzonych prac pobrano z powyszych otworów próbki gruntu i wody do bada laboratoryjnych celem oznaczenia tła hydrogeologicznego i geochemicznego rodowiska gruntowo-wodnego w rejonie dołu urobkowego Graby-67 i Graby-12. Na utworach trzeciorzdowych zalegaj utwory czwartorzdowe reprezentowane przez osady deluwialne, wykształcone w postaci glin piaszczystych i iłów. Miszo utworów czwartorzdowych w rejonie dołu urobkowego Graby-67 wynosi około 2,30 5,20 m, a w okolicach dołu Graby-12 od 1,70 do 4,20 m. Przypowierzchniow warstw stanowi gleba. 147

145 Omawiany teren, w oparciu o hydrogeologiczn map Polski, połoony jest w obrbie jednostki hydrogeologicznej Region Karpacki. W rejonie bada mona wyróni trzeciorzdowy i czwartorzdowy poziom wodono- ny. Trzeciorzdowy poziom wodonony wystpuje w spkaniach i szczelinach piaskowców zaliczanych do warstw kronieskich dolnych i górnych. Wodonono tego poziomu uzaleniona jest od systemów spka i szczelin wystpujcych w obrbie ławic piaskowcowych. Zwierciadło wód wykazuje charakter naporowy, który wystpuje na głbokoci od kilku do kilkudziesiciu metrów pod powierzchni terenu. Czwartorzdowy poziom wodonony wystpuje w obrbie utworów wirowo-piaskowcowych rzeki Stobnicy i jej dopływów. Poziom czwartorzdowy zwizany jest równie z utworami deluwialnymi, wykształconymi w postaci utworów glinasto-piaszczystych i pylastych przewarstwianych piaskami. Jest to z reguły poziom niecigły, o charakterze sczeniowym. Charakteryzuje si zmienn głbokoci wystpowania oraz zmienn intensywnoci. Wydajnoci tego poziomu s niewielkie i poziom ten nie ma praktycznie znaczenia uytkowego. W trakcie prowadzonych prac w rejonie dołu urobkowego Graby-67 stwierdzono wystpowanie poziomu wodononego o charakterze sczeniowym. Jest to poziom niecigły, zwizany z utworami deluwialnymi, wykształconymi w postaci glin piaszczystych. Poziom sczeniowy został nawiercony w dwóch wykonanych otworach PB-2/67 i PB-3/67. W otworze PB-1/67 nie stwierdzono wystpowania poziomu wodononego. Poziom wody gruntowej ustabilizował si tylko w otworze PB-2/67 na głbokoci 1,35 m ppt. W trakcie prac prowadzonych w rejonie dołu urobkowego Graby-12 poziom sczeniowy został nawiercony w dwóch wykonanych otworach: PB-1/12 i PB-3/12. W otworze PB-2/12 nie stwierdzono wystpowania poziomu wodononego. Poziom wody gruntowej w otworze PB-1/12 ustabilizował si na poziomie 1,90 m ppt, a w otworze PB-3/12 na poziomie 2,60 m ppt. Zasilanie wód wystpujcych na omawianych terenach nastpuje głównie poprzez infiltracj wód opadowych i roztopowych. W zwizku z tym poziom wód na wyszym terenie moe podlega znacznym wahaniom. Zmianom moe podlega równie jego intensywno, a w okresach długotrwałych susz moe całkowicie zanika. Z drugiej strony, w okresie intensywnych opadów atmosferycznych i roztopów, intensywno tego poziomu moe znacznie wzrasta. 148

146 Woda gruntowa o charakterze sczeniowym wystpujca zarówno w rejonie dołu urobkowego Graby-67, jak równie Graby-12, nie ma znaczenia praktycznego. W rejonie dołów urobkowych Graby-67 i Graby-12 spływ wód generalnie odbywa si w kierunku południowo-wschodnim i jest zgodny z morfologi trenu. Współczynnik filtracji (k) przewierconych warstw w rejonach dołów urobkowych Graby-67 i Graby12 ustalono w oparciu o dane literaturowe [Pazdro, et al., 1983]. Współczynnik filtracji wydzielonych warstw wahał si w granicach 1*10-12 do 4*10-6 [m/s]. Tak wic wystpujce w tym rejonie utwory mona zaliczy do skał słabo przepuszczalnych i nieprzepuszczalnych (tabela 7.1). Tabela 7.1. Wyniki bada hydrogeologicznych prowadzonych na terenie dołu urobkowego Graby-67 i Graby-12 Table 7.1. Results of hydrogeological research led in Graby-67 and Graby-12 waste pits Nr otworu Głboko otworu [m ppt.] Poziom zwierciadła wody nawiercone [m ppt.] Chłonno otworu Graby-67 PB-1/67 2,30 Brak PB-2/67 4,58 2,90 sczenie 4,50 nawiercony 1,35 Słabo przepuszczalne Półprzepuszczalne Słabo przepuszczalne Półprzepuszczalne Słabo przepuszczalne Półprzepuszczalne Zwierciadło napite PB-3/67 5,20 4,70 sczenie - Brak PB-1/12 2,70 1,90 1,90 Graby-12 PB-2/12 3,78 Brak PB-3/12 4,20 2,60 2,60 Bardzo sł. przepuszczalne Półprzepuszczalne Bardzo sł. przepuszczalne Półprzepuszczalne Bardzo sł. przepuszczalne Półprzepuszczalne Zwierciadło swobodne Szacunkowa wielko współczynnika przepuszczalnoci 0,0-0,4 m ,4-2, ,0-0,5 m ,5-4, ,0-0,9 m ,9-5,2 m ,0-1,1 m ,1-2, ,0-2,0 m ,0-2, ,0-1,2m ,2-4,2m Uwagi ustabilizowane [m ppt.] Zwierciadło swobodne 149

147 Tabela 7.2. Wyniki analiz gruntu z otworów PB -1/67, PB -2/67, PB-3/67 Table 7.2. Results of soil analyses from wells PB-1/67, PB-2/67, PB-3/67 Zanieczyszczenie Próbki gruntu z otworów PB-1/67, PB-2/67, PB-`3/67 PB-1a 2 /67 PB-2a 2 /67 PB-3a 2 /67 Próbki gruntu Wartoci z otworów dopuszczalne 4 PB-1/67, PB-3/67 PB-1b 3 /67 PB-3b 3 /67 Wartoci dopuszczalne 5 [mg/kg s.m.] Benzyna (Σ C 6 C 12 ) 96,3 85,2 76, ,6 41,1 750 Olej mineralny (Σ C 12 C 35 ) 1222,1 864, ,7 855, Benzen 1,21 1,21 2, ,10 1, Etylobenzen 0,73 0,85 0, ,82 0, Toluen 1,53 0,98 1, ,51 0, Ksyleny 0,31 0,35 0, ,21 0, Naftalen 0,25 0,35 0, ,15 0,41 40 Fenantren 0,11 0,25 0, ,12 0,25 40 Fluoranten 0,09 0,04 0, ,07 0,08 40 Chrysen 0,08 n.s. 0, Benzo(a)fluoranten n.s. n.s. 0, ,05 0,04 40 Chrom 45,8 49,1 35, ,5 30,1 800 Bar 98,4 88,9 92, ,6 78, Kadm 0,23 n.s. 0, ,15 n.s. 20 Nikiel 15,4 19,4 32, ,4 15,4 500 Ołów 29,4 32,1 38, ,6 12, Cynk 38,4 28,1 23, ,4 18, Mied 21,5 16,1 25, ,8 19, ) 3) 4) 5) próbka gruntu pobrana z głbokoci 0,90 m p.p.t. symbol literowy a próbka gruntu pobrana z głbokoci 2,20 m p.p.t. symbol literowy b wartoci dopuszczalne ste w glebie lub ziemi dla grupy gruntów C, obejmujcej tereny przemysłowe, uytki kopalne, tereny komunikacyjne i dla głbokoci 0-2 m zgodnie z Rozporzdzeniem Ministra rodowiska z dnia 9 wrzenia 2002 r. w sprawie standardów jakoci gleby oraz standardów jakoci ziemi (Dz.U. z 2002 r., Nr 165, poz z pón. zm.) wartoci dopuszczalne ste w glebie lub ziemi dla grupy gruntów C, obejmujcej tereny przemysłowe, uytki kopalne, tereny komunikacyjne i dla głbokoci 2-15 m przy wodoprzepuszczalnoci gruntów poniej l x 10-7 m/s zgodnie z Rozporzdzeniem Ministra rodowiska z dnia 9 wrzenia 2002 r. w sprawie standardów jakoci gleby oraz standardów jakoci ziemi (Dz.U. z 2002 r., Nr 165, poz z pón. zm.) Tabela 7.3. Wyniki bada mikrobiologicznych wodzie gruntowej z odwiertu PB-2/67 i PB-1/12 Table 7.3. Results of biological analyses of water from wells PB-2/67 and PB-1/12 Mikroorganizm Objto próbki Wynik badania PB-2/67 PB-1/12 PB-2/67 PB-1/12 Liczba bakterii grupy coli fekalnego 100 ml < 1 < 1 Liczba bakterii grupy coli 100 ml < 1 < 1 Clostridium perfringens 100 ml < 1 < 1 Enterokoki kałowe 100 ml < 1 < 1 Enterococcus faecalis 100 ml < 1 < 1 Ogólna liczba bakterii w 37 o C po 48 godz. 1 ml Ogólna liczba bakterii w 22 o C po 72 godz. 1 ml Ogólna liczba bakterii rozkładajcych zwizki ropopochodne 1 ml

148 Tabela 7.4. Wyniki analiz gruntu z otworów PB -1/12, PB -2/12 i PB-3/12 Table 7.4. Results of soil analyses from wells PB-1/12, PB-2/12, PB-3/12 Próbki gruntu z otworów PB-1/12, PB-2/12, PB-3/12 Próbki gruntu Wartoci z otworów dopuszczalne 4 PB-1/12, PB-2/12 PB-1b 3 /12 PB-2b 3 /12 Wartoci dopuszczalne 5 Zanieczyszczenie PB-1a 2 /12 PB-2a 2 /12 PB-3a 2 /12 [mg/kg s.m.] Benzyna (Σ C 6 C 12 ) 42,3 152,4 74, ,2 61,7 750 Olej mineralny (Σ C 12 C 35 ) 1095,3 973,9 1156, ,2 847, Benzen 1,21 1,95 1, ,03 0, Etylobenzen 0,75 0,98 0, ,52 0, Toluen 0,45 0,72 0, ,82 0, Ksyleny 0,35 0,45 0, ,02 0, Naftalen 0,27 0,24 0, ,17 0,18 40 Fenantren 0,14 0,12 0, ,11 0,10 40 Fluoranten 0,05 0,05 0, ,05 0,02 40 Chrysen 0,03 0,01 0, ,04 n.s. 40 Benzo(a)fluoranten 0,03 0,02 0, ,02 n.s. 40 Chrom 35,8 41,5 48, ,4 40,9 800 Bar 84,1 78,2 70, ,1 73, Kadm 0,12 n.s. 0,15 15 n.s. n.s. 20 Nikiel 18,2 15,2 21, ,1 14,5 500 Ołów 21,5 19,4 20, ,8 18, Cynk 31,2 29,1 25, ,5 28, Mied 28,1 17,2 14, ,4 18, ) 3) 4) 5) próbka gruntu pobrana z głbokoci 0,90 m p.p.t. symbol literowy a próbka gruntu pobrana z głbokoci 2,20 m p.p.t. symbol literowy b wartoci dopuszczalne ste w glebie lub ziemi dla grupy gruntów C, obejmujcej tereny przemysłowe, uytki kopalne, tereny komunikacyjne i dla głbokoci 0-2 m zgodnie z Rozporzdzeniem Ministra rodowiska z dnia 9 wrzenia 2002 r. w sprawie standardów jakoci gleby oraz standardów jakoci ziemi (Dz.U. z 2002 r., Nr 165, poz z pón. zm.) wartoci dopuszczalne ste w glebie lub ziemi dla grupy gruntów C, obejmujcej tereny przemysłowe, uytki kopalne, tereny komunikacyjne i dla głbokoci 2-15 m przy wodoprzepuszczalnoci gruntów poniej l x 10-7 m/s zgodnie z Rozporzdzeniem Ministra rodowiska z dnia 9 wrzenia 2002 r. w sprawie standardów jakoci gleby oraz standardów jakoci ziemi (Dz.U. z 2002 r., Nr 165, poz z pón. zm.) Rejon objty badaniami znajduje si na terenie lenym, który podlega ochronie prawnej, tzn. znajduje si na Wschodniobeskidzkim Obszarze Chronionego Krajobrazu. W zwizku z tym, e teren ten jest zwizany z przemysłem naftowym ju od pocztku XX w. (1913 r.), jako standardy jakoci dla okrelonych grup zanieczyszcze w badanych próbkach gruntu odniesiono jak dla rodzaju gruntów zaliczanych do grupy C. Wyniki bada oznaczonych zanieczyszcze wraz z ich dopuszczalnymi wartociami dla terenu okalajcego dół urobkowy Graby-67 zestawiono w tabeli 7.2, a dla dołu urobkowego Graby-12 w tab

149 W przypadku podjcia prac rekultywacyjnych terenów wyznaczonych dołów urobkowych naley dotrzyma standardów jakoci gleby i ziemi obowizujcych dla grupy B. Wyniki bada mikrobiologicznych przedstawiono w tabeli 7.3, za wyniki bada próbek wody w odniesiono do klasyfikacji ujtej w Rozporzdzeniu Ministra rodowiska w sprawie kryteriów i sposobów oceny stanu wód podziemnych (Dz.U. 143, poz. 896 z dnia 23 lipca 2008 rzestawiono w tabeli 7.5. Z przedstawionych danych dotyczcych wykonanych bada gruntu (tab. 7.2 i 7.3) wynika, e na terenach otaczajcych doły urobkowe Graby-67 i Graby-12 stenia badanych zanieczyszcze nie przekraczaj wartoci dopuszczalnych dla grupy C. Tabela 7.5. Wyniki chemicznej analizy próbek wody z otworów PB-2/67, PB-1/12, PB-3/12 Table 7.5. Results of chemical analyses of water from wells PB-2/67, PB-1/12 and PB-3/12 Wskanik Jednostka Odwiert Klasa jakoci wód PB-2/67 PB-1/12 PB-3/12 podziemnych 1 Odczyn 7,2 7,3 7,2 Chrom mg/dm 3 0,005 0,004 0,007 I Bar mg/dm 3 0,023 0,028 0,033 I Kadm mg/dm 3 n.s. n.s. n.s. I Nikiel mg/dm 3 0,005 0,004 0,004 I Ołów mg/dm 3 0,010 0,009 0,010 I Cynk mg/dm 3 0,013 0,011 0,018 I Mied mg/dm 3 0,009 0,010 0,007 I Substancje ropopochodne mg/dm3 0,025 0,035 0,034 II BTEX mg/dm 3 0,001 0,002 0,002 I/II WWA mg/dm 3 n.s. n.s. n.s. I 1) klas jakoci wód podziemnych ustalono w oparciu o Rozporzdzenie Ministra rodowiska w sprawie kryteriów i sposobów oceny stanu wód podziemnych (Dz.U. 143, poz. 896 z dnia 23 lipca 2008 r.). Nie okrelono klasy jakoci wody w zakresie substancji ropopochodnych, BTEX i WWA Woda gruntowa w rejonach oczyszczanych dołów urobkowych w zakresie oznaczanych wskaników została zaliczona do klasy Ia (przy czym nie brano pod uwag substancji ropopochodnych, BTEX i WWA). Oznaczone wskaniki przedstawione w powyszych tabelach proponuje si traktowa jako tło hydrochemiczne i tło geochemiczne podmiotowych terenów. W rejonach dołów urobkowych Graby-67 i Graby-12, w których zdeponowano odpady w postaci ziemi i gleby zanieczyszczonej substancjami ropopochodnymi o kodzie ex 152

150 *, wystpuj korzystne warunki hydrogeologiczne, poniewa w trakcie prac stwierdzono wystpowanie warstw słabo przepuszczalnych i nieprzepuszczalnych, stanowicych dobre warstwy izolacyjne dla prowadzenia procesu oczyszczania z zanieczyszcze ropopochodnych materiału glebowego, zgromadzonego na dołach urobkowych. Na omawianych terenach nie stwierdzono poziomu wodononego, który miałby znaczenie praktyczne. Na kierunku spływu wód podziemnych zamontowano piezometry, które bd słuy do prowadzenia lokalnego monitoringu jakoci wód podziemnych, a take obserwacji poziomu zwierciadła wód podziemnych w trakcie prowadzenia procesu unieszkodliwiania odpadów. Metoda unieszkodliwiania odpadów zdeponowanych w dołach urobkowych nie powinna mie negatywnego wpływu na rodowisko naturalne oraz zdrowie i ycie ludzi. 153

151 Wysoka zawarto zanieczyszcze ropopochodnych w glebie i ziemi na terenie dołów urobkowych Graby-67 i Graby-12 uniemoliwia prowadzenie efektywnych zabiegów bioremediacyjnych. Z tego wzgldu przeprowadzono czciow likwidacj (odzysk) zanieczyszcze ropopochodnych poprzez zastosowanie wstpnej remediacji, polegajcej na drenau melioracyjno-odciekowym. Zanieczyszczenia ropopochodne spływajce wraz z wod zbierano w łapaczkach zamontowanych w dolnych odcinkach rowów odciekowych, które po zapełnieniu były opróniane. Wod wraz z zanieczyszczeniami przewoono do separatora i po oddzieleniu fazy wglowodorowej łczono ze ciekami eksploatacyjnymi, które poddawano nastpnie procesowi oczyszczania. Dziki zabiegowi wstpnej remediacji w I etapie (5 miesicy w okresie lato-jesie) w poddanych analizie ujednoliconych próbkach gleby i ziemi z poszczególnych obszarów dołu urobkowego (P-1A, P-2A, P-3A, P-1B, P-2B, P-3B, P-1C, P-2C, P-3C dokładny opis w rozdziale 6) stwierdzono znaczne obnienie zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych (TPH, BTEX, WWA, fenoli), co zostało przedstawione w tab Na obszarze A dołu urobkowego zawarto zanieczyszcze ropopochodnych (TPH) w warstwie powierzchniowej uległa obnieniu z mg/kg s.m. do mg/kg s.m., co stanowi 56% redukcji. W miar wzrostu głbokoci próbkowania zawarto TPH ulega obnieniu w mniejszym stopniu minimalnie o 36%. Na obszarze B charakteryzujcym si najwyszym stopniem skaenia w warstwie powierzchniowej uzyskano obnienie TPH do poziomu mg/kg s.m. (67,8% redukcji), natomiast w głbszych warstwach obnienie zawartoci zanieczyszcze osignło poziom: 27,5 32,2%. 154

152 Tabela 8.1. Zestawienie wyników analiz chemicznych próbek gleby pobranych z dołu urobkowego Graby-67 po I etapie remediacji wstpnej (drena melioracyjno-odciekowy) (liczba powtórze n = 10-11, p < 0,05) Table 8.1. Chemical analyses of soil samples from Graby-67 waste pit after 1 st stage of initial remediation (drainage) repetition number n = 10-11, p < 0.05 Oznaczenie Jednostka TPH BTEX Σ WWA Fenole mg/kg s.m. Próbka ujednolicona z obszaru A Próbka ujednolicona z obszaru B Próbka ujednolicona z obszaru C P-1A P-2A P-3A P-1B P-2B P-3B P-1C P-2C P-3C ± ,7 ±7,1 1,425 ±0,31 7,17 ±0, ± ,1 ±3,1 0,523 ±0,14 5,75 ±0, ±658 14,2 ±2,6 0,189 ±0,029 2,12 ±0, ± ,2 ±6,8 1,642 ±0,31 10,3 ±1, ±395 41,7 ±5,9 1,036 ±0,24 6,7 ±0, ±897 20,8 ±3,9 0,425 ±0,078 3,9 ±0, ± ,7 ±6,2 1,384 ±0,29 12,2 ±1, ± ,8 ±5,9 0,721 ±0,098 5,2 ±0, ± ,3 ± 3,5 0,404 ±0,074 3,1 ±0,4 Na obszarze C dołu urobkowego Graby-67 obnienie zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych kształtowało si w granicach: 62,3 42,8%. Obnienie zawartoci wglowodorów monoaromatycznych (BTEX) na obszarze A wynosiło: 61,2 47,7%, na obszarze B wyniosło od 63,3 do 48,7%, a na obszarze C 54,3 38,7%. Zawarto wielopiercieniowych wglowodorów aromatycznych (WWA), wystpujcych w niewielkich ilociach, obniyła si w warstwie powierzchniowej o 19,2 20,1%, a w głbszych warstwach o 1,8 2,4%. Zawarto fenoli uległa bardzo wyranemu zmniejszeniu szczególnie w płytkich warstwach dołu urobkowego i w zalenoci od obszaru kształtowała si na poziomie: dla obszaru A 62,8%, dla obszaru B 52,8%, dla obszaru C 54,3%. W głbszych warstwach odnotowano nieco nisze obnienie zawartoci fenoli wynoszce od 32,3 do 36,7%. Wysoka zawarto zanieczyszcze ropopochodnych w całej objtoci oczyszczanej gleby i ziemi zgromadzonej w dole urobkowym skłania do przypuszcze, e rozkład zanieczyszcze ropopochodnych w okresie zimowym, po I etapie remediacji wstpnej, mógł ulec zmianie. Z tego wzgldu wczesn wiosn pobrano próbki gleby i ziemi z całego obszaru dołu urobkowego Graby-67 i po okreleniu zawartoci TPH (na podstawie analiz chromatograficznych), przedstawiono graficzny obraz rozkładu zanieczyszcze ropopochodnych, wykorzystujc do tego celu metod krigingu (rys. 8.1). Na podstawie wykonanych analiz chromatograficznych na terenie dołu urobkowego Graby-67 wyodrbniono 3 obszary o rónym stopniu skaenia substancjami ropopochodnymi, które wielkoci i połoeniem róniły si od obszarów wyznaczonych na pocztku podjtych prac remediacyjnych: 155

153 obszar AR obejmujcy punkty: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 18, 19, 20, 33, który cechuje si skaeniem substancjami ropopochodnymi w zakresie: mg/kg s.m., obszar BR obejmujcy punkty: 11, 12, 13, 14, 16, 17, 21, 24, 25, 26, 32, 34, 35 w którym stenie zanieczyszcze kształtowało si na poziomie: mg/kg s.m., obszar CR obejmujcy punkty: 22, 23, 27, 28, 29, 30, 31, 36, 37, 38, 39, 40, charakteryzujcy si najwyszym stopniem skaenia wglowodorami w granicach: do mg/kg s.m. długo [m] Obszar AR Obszar BR Obszar CR długo [m] TPH [mg*10 3 /kg s.m.] Rys Rozkład zanieczyszcze ropopochodnych na dole urobkowym Graby-67 w warstwie powierzchniowej (30 cm ppt) po I etapie remediacji (po przerwie zimowej) Fig Petroleum hydrocarbons (TPH) concentration on surface level (interval 0-30 cm) in Graby-67 waste pit after 1 st stage of remediation (after winter break) Rozkład zanieczyszcze ropopochodnych w głbszych warstwach dołu urobkowego był porównywalny do rozkładu w warstwie powierzchniowej. Po przeprowadzeniu I etapu remediacji wstpnej, nastpiła zmiana w rozkładzie zanieczyszcze. Zanieczyszczenia z górnej czci dołu urobkowego uległy czciowemu przemieszczeniu do czci dolnej zgodnie ze spadkiem terenu wystpujcym na obszarze dołu urobkowego Graby-67. Odnotowano take zjawisko oddolnego zaolejania, co przejawia si w punktowym wzrocie zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych w warstwie powierzchniowej. 156

154 Ze wzgldu na utrzymujc si wysok zawarto zanieczyszcze ropopochodnych przeprowadzono II etap remediacji wstpnej, polegajcy na drenau melioracyjnoodciekowym, który zmodyfikowano poprzez zmian biegów rowów odciekowych oraz wykonaniu dwóch rowów przecinajcych obszary wystpowania widocznych ognisk skae. Ponadto zwikszono liczb rur melioracyjnych. Zabieg prowadzono przez okres 4 miesicy do momentu stwierdzenia, e zawarto substancji ropopochodnych w odciekach utrzymywała si na stałym, niskim poziomie. Dokonano poboru próbek gleby z poszczególnych obszarów dołu urobkowego Graby-67 z rónych interwałów głbokociowych, które nastpnie zostały ujednolicone i poddane analizie. Poniej przedstawiono opis poszczególnych próbek. Próbka uredniona (podsekcja) Próbki składowe (punkty poboru) Głboko poboru [cm ppt] P-1AR Próbki z obszaru AR pobrane z punktów: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 18, 19, 20, P-2AR Próbki z obszaru AR pobrane z punktów: 2, 4, 6, 7, 9, 15, 18, 19, 20, P-3AR Próbki z obszaru AR pobrane z punktów: 4, 6, 8, 9, 15, 20, P-1BR Próbki z obszaru BR pobrane z punktów: 11, 12, 13, 14, 16, 17, 21, 24, 25, 26, 32, 34, P-2BR Próbki z obszaru BR pobrane z punktów: 11, 13, 14, 17, 21, 24, 25, , P-3BR Próbki z obszaru BR pobrane z punktów: 11,13, 15, 21, 25, 32, P-1CR Próbki z obszaru CR pobrane z punktów: 22, 23, 27, 28, 29, 30, 31, 36, 37, 38, 39, P-2CR Próbki z obszaru CR pobrane z punktów: 22, 23, 28, 30, 31, 36, 38, 39, P-3CR Próbki z obszaru CR pobrane z punktów: 22, 28, 30, 36, 31, 38, Wyniki analiz chromatograficznych obrazujce poziom zanieczyszcze ropopochodnych po II etapie remediacji wstpnej zestawiono w tabeli 8.2. Dane analityczne wskazuj, e na obszarze AR uzyskano obnienie zawartoci TPH do poziomu mg/kg s.m., co stanowi 34,4% redukcji zawartoci zanieczyszcze, na obszarze BR zawarto TPH obniyła si do mg/kg s.m. (37,9% redukcji), za na obszarze CR do mg/kg s.m. (48,6%). W głbszych warstwach gleby z dołu urobkowego Graby-67 redukcja zawartoci wglowodorów ropopochodnych utrzymywała si na niszym poziomie od 16,9 do 24,4%. Odnotowano widoczne obnienie zawartoci BTEX w warstwie powierzchniowej od 25,4 do 36,6% i w warstwach głbszych 3,9 27,1%. Istotne jest równie obnienie zawartoci fenoli w zakresie: 29,4 32,2%, natomiast redukcj zawartoci WWA odnotowano na niskim poziomie: 1,9 6,1%. W celu pełnego zobrazowania efektywnoci II etapu remediacji wstpnej, wykonano analizy próbek gleby pobranych z całego profilu głbokociowego w wytypowanych punk- 157

155 tach na poszczególnych obszarach dołu urobkowego Graby-67. Wyniki analiz TPH w próbkach pobranych z rónych głbokoci zilustrowano na rys Tabela 8.2. Zestawienie wyników analiz chemicznych próbek gleby pobranych z dołu urobkowego Graby-67 po II etapie remediacji wstpnej (drena melioracyjno-odciekowy) liczba powtórze n = 10-11, p < 0,05 Table 8.2. Chemical analyses of soil samples from Graby-67 waste pit after 2 nd stage of initial remediation (drainage) repetition number n = 10-11, p < 0.05 Oznaczenie Jednostka Próbka ujednolicona z obszaru AR Próbka ujednolicona z obszaru BR Próbka ujednolicona z obszaru CR P-1AR P-2AR P-3AR P-1BR P-2BR P-3BR P-1CR P-2CR P-3CR TPH ± ± ± ± ± ± ± ± ±801 BTEX 32,2 ±4,7 21,8 ±2,5 10,3 ±1,6 36,7 ±4,1 29,3 ±3,9 14,8 ±2,2 39,8 ±5,1 29, 6 ±3,9 12,9 ±2,3 Σ WWA 1,245 ±0,25 0,492 ±0,081 0,167 ±0,019 1,432 ±0,21 0,925 ±0,19 0,389 ±0,058 1,024 ±0,21 0,675 ±0,071 0,328 ±0,061 Fenole 5,2 4,0 1,69 7,2 4,9 2,0 8,1 3,8 2,0 ±0,7 ±0,4 ±0,2 ±0,8 ±0,5 ±0,2 ±0,9 ±0,4 ±0,2 mg/kg s.m zawarto TPH [m/kg s.m.] Obszar AR, punkt 32 Obszar AR, punkt 20 Obszar BR, punkt 11 Obszar CR, punkt 36 Obszar CR punktkt cm ppt 50 cm ppt 80 cm ppt 100 cm ppt 120 cm ppt 150 cm ppt 180 cm ppt Rys Porównanie zawartoci TPH w próbkach gleby po wstpnej remediacji (po II etapie) pobranych z rónych głbokoci dołu urobkowego Graby-67 Fig TPH content in soil samples from various depths of Graby-67 waste pit after 2 nd stage of initial remediation Wykonane analizy chromatograficzne próbek ujednoliconych z poszczególnych wyznaczonych obszarów dołu urobkowego pozwoliły na zidentyfikowanie n-alkanów, wchodzcych w skład zanieczyszcze ropopochodnych. Porównanie zmian zawartoci zidentyfikowanych n-alkanów w warstwie powierzchniowej (0 50 cm ppt) podczas zabiegu remediacji wstpnej (I i II etap) terenu dołu urobko- 158

156 wego Graby-67 przedstawiono na rys Na obszarze AR najwysz efektywno procesu remediacji wstpnej stwierdzono dla n-alkanów z zakresu n-c 6 n-c 12 (obnienie zawartoci o 80,7 87,8%). Zawarto wglowodorów z grupy n-c 13 n-c 21 uległa obnieniu o 50,4 70,3%, a w przypadku wglowodorów cikich n-c 22 n-c 36 w zakresie od 28,3 do 37,7% (rys. 8.3). Na pozostałych obszarach BR i CR (rys. 8.4 i 8.5) obnienie zawartoci poszczególnych grup zidentyfikowanych n-alkanów kształtowała si na zblionym poziomie próbka po osuszeniu próbka po I etapie remediacji wstpnej próbka po II etapie remediacji wstpnej 0 n-c6 n-c7 n-c8 n-c9 n-c10 n-c11 n-c12 n-c13 n-c14 n-c15 n-c16 n-c17 Pr n-c18 F n-c19 n-c20 n-c21 n-c22 n-c23 n-c24 n-c25 n-c26 n-c28 n-c30 n-c32 n-c34 n-c36 zawarto n-alkanów [mg/kg s.m.] Rys Porównanie zawartoci zidentyfikowanych n-alkanów w trakcie wstpnej remediacji w ujednoliconych próbkach z interwału 0-0,50 m ppt z obszaru A i AR na dole urobkowym Graby-67 (liczba powtórze n = 9-10, p < 0,05) Fig Identified n-alkane content during initial remediation in averaged samples from depth interval m (area A and AR) of Graby-67 waste pit (repetition number n = 9-10, p < 0.05) W przypadku zawartoci BTEX w glebie z dołu urobkowego Graby-67 odnotowano widoczne jej obnienie, wynoszce dla obszaru AR: 44,3 70,1%, dla obszaru BR: 57,8 72,5% oraz dla obszaru CR: 44,3 70,1% (rys. 8.6). Naley zaznaczy, e zmniejszenie zawartoci było najbardziej widoczne dla benzenu, nieco mniej dla etylobenzenu i toluenu, a w przypadku ksylenów obnienie zawartoci było najnisze. 159

157 12000 zawarto n-alkanów [mg/kg s.m.] próbka po osuszeniu próbka po I etapie remediacji wstpnej próbka po II etapie remediacji wstpnej 0 n-c6 n-c7 n-c8 n-c9 n-c10 n-c11 n-c12 n-c13 n-c14 n-c15 n-c16 n-c17 Pr n-c18 F n-c19 n-c20 n-c21 n-c22 n-c23 n-c24 n-c25 n-c26 n-c28 n-c30 n-c32 n-c34 n-c36 Rys Porównanie zawartoci zidentyfikowanych n-alkanów w trakcie wstpnej remediacji w ujednoliconych próbkach z interwału 0-0,50 m ppt z obszaru B i BR na dole urobkowym Graby-67 (liczba powtórze n = 9-10, p < 0,05) Fig Identified n-alkane content during initial remediation in averaged samples from depth interval m (area B and BR) of Graby-67 waste pit (repetition number n = 9-10, p < 0.05) zawarto n-alkanów [mg/kg s.m.] próbka po osuszeniu próbka po I etapie remediacji wstpnej próbka po II etapie remediacji wstpnej 0 n-c6 n-c7 n-c8 n-c9 n-c10 n-c11 n-c12 n-c13 n-c14 n-c15 n-c16 n-c17 Pr n-c18 F n-c19 n-c20 n-c21 n-c22 n-c23 n-c24 n-c25 n-c26 n-c28 n-c30 n-c32 n-c34 n-c36 Rys Porównanie zawartoci zidentyfikowanych n-alkanów w trakcie wstpnej remediacji w ujednoliconych próbkach z interwału 0-0,50 m ppt z obszaru C i CR na dole urobkowym Graby-67 (liczba powtórze n = 9-10, p < 0,05) Fig Identified n-alkane content during initial remediation in averaged samples from depth interval m (area C and CR) of Graby-67 waste pit (repetition number n = 9-10, p < 0.05) 160

158 zawarto BTEX [ mg/kg s.m.] OBSZAR A/AR zawarto BTEX [ mg/kg s.m.] OBSZAR B/BR 0 benzen toluen etylobenzen ksyleny 0 benzen toluen etylobenzen ksyleny próbka po osuszeniu próbka po I etapie remediacji wstpnej próbka po II etapie remediacji wsrpnej próbka po osuszeniu próbka po I etapie remediacji wstpnej próbka po II etapie remediacji wstpnej 70 zawarto BTEX [ mg/kg s.m.] OBSZAR C/CR 0 benzen toluen etylobenzen ksyleny próbka po osuszeniu próbka po I etapie remediacji wstpnej próbka po II etapie remediacji wstpnej Rys Porównanie zidentyfikowanych BTEX w trakcie remediacji wstpnej w ujednoliconych próbkach z interwału 0-0,50 m ppt z poszczególnych obszarów dołu urobkowego Graby-67 (liczba powtórze n = 9-10, p < 0,05) Fig Identified BTEX content during initial remediation in averaged samples from depth interval m from individual areas of Graby-67 waste pit (repetition number n = 9-10, p < 0.05) 161

159 Pierwszy etap zabiegu wstpnej remediacji (trwajcy 4 miesice w okresie jesiennym) umoliwił znaczne obnienie zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych (TPH, BTEX, WWA), czego dowodz wyniki analiz chromatograficznych próbek gleby i ziemi, pobranych z terenu dołu urobkowego Graby-12 (P-1I, P-2I, P-3I, P-1II, P-2II, P-3II, P-1III, P-2III, P-3III opis próbek w rozdziale 6). Wyniki analiz zestawiono w tabeli 8.3. Tabela 8.3. Zestawienie wyników analiz chemicznych próbek gleby pobranych z dołu urobkowego Graby-12 po I etapie remediacji wstpnej (drena melioracyjno-odciekowy) liczba powtórze n = 8-10, p < 0,05 Table 8.3. Chemical analyses of soil samples from Graby-12 waste pit after 1 st stage of initial remediation (drainage) repetition number n = 8-10, p < 0.05 Oznaczenie Jednostka TPH BTEX Σ WWA Fenole mg/kg s.m. Próbka ujednolicona z obszaru I Próbka ujednolicona z obszaru II Próbka ujednolicona z obszaru III P-1 I P-2 I P-3 I P-1 II P-2 II P-3 II P-1 III P-2 III P-3 III ± 3345 ± 2978 ± 874 ± 7175 ± 3874 ± 947 ± 5187 ± 3014 ± ,4 18,4 5,7 53,7 28,7 11,5 34,1 18,2 7,2 ± 3,9 ± 2,9 ± 1,6 ± 6,8 ±3,2 ± 2,3 ± 3,5 ±2,9 ± 1,9 2,111 0,924 0,301 3,514 2,114 0,675 2,511 1,245 0,352 ± 0,568 ±0,152 ±0,051 ±0,647 ±0,478 ±0,101 ±0,426 ±0,148 ±0,045 9,2 7,8 3,1 10,3 6,1 4,9 8,7 4,1 2,1 ± 0,9 ± 0,8 ± 0,3 ± 0,9 ± 0,5 ± 0,6 ± 0,9 ± 0,3 ±0,2 W wyniku realizowanego zabiegu na obszarze I dołu urobkowego Graby-12, zawarto zanieczyszcze ropopochodnych w warstwie powierzchniowej 0-30 cm ppt uległa widocznemu obnieniu z do mg/kg s.m., co stanowi 47,9%. W głbszych warstwach ziemi z dołu urobkowego Graby-12 (obszar I) równie uzyskano zadowalajce obni- enie zawartoci TPH w granicach: 32,2 36,3%. Obszar II charakteryzujcy si najwyszym stopniem skaenia, został oczyszczony do poziomu: mg/kg s.m., co stanowi 51,2% redukcji zawartoci TPH. W miar wzrostu głbokoci stopie obnienia zawartoci wglowodorów ropopochodnych zmieniał si od 36,7 do 43,6%. Natomiast na obszarze III, o stopniu zanieczyszczenia porównywalnym do obszaru I, redukcja zawartoci TPH w warstwie powierzchniowej wynosiła 42,3%, a w warstwach wgłbnych wahała si od 30,2 do 32,4%. Poziom zanieczyszcze wglowodorami aromatycznymi (BTEX), który był znacznie niszy w porównaniu z dołem urobkowym Graby-67, uległ zadowalajcemu obnieniu: na obszarze I w zakresie od 34,2 do 40,1%, na obszarze II od 28,3 do 42,3%, a na obszarze III od 31,3 do 49,2%. Zawarto zanieczyszcze w postaci WWA wyranie wysza w glebie z dołu urob- 162

160 kowego Graby-12 ni w przypadku dołu Graby-67 ze wzgldu na wysok zawarto naftalenu w warstwie powierzchniowej uległa obnieniu o 22,3 26,3%, a w warstwach głbszych w zakresie od 4,5 do 16,2%. Zawartoci fenoli uległa widocznemu obnieniu, szczególnie na obszarze II, gdzie stwierdzono spadek zawartoci z 21,5 do 10,3 mg/kg s.m. Po przerwie zimowej pobrano próbki gleby i ziemi z dołu urobkowego Graby-12 i wykonano analizy zawartoci TPH celem graficznego przedstawienia rozkładu zanieczyszcze na poszczególnych obszarach dołu urobkowego. Przeprowadzone badania wykazały, e rozkład zanieczyszcze jest zbliony do rozkładu uzyskanego przed przystpieniem do zabiegu wstpnej remediacji i wobec tego podział terenu dołu urobkowego na poszczególne obszary nie uległ zmianie. Ze wzgldu na utrzymujc si wysok zawarto zanieczyszcze ropopochodnych przeprowadzono w okresie wiosennym II etap remediacji wstpnej, kontynuujc drena melioracyjno odciekowy. Uzyskane wyniki chromatograficznych analiz zanieczyszcze ropopochodnych w próbkach gleby pobranych po zakoczeniu zabiegu zestawiono w tabeli 8.4. Tabela 8.4. Zestawienie wyników analiz chemicznych próbek gleby pobranych z dołu urobkowego Graby-12 po II etapie remediacji wstpnej (drena melioracyjno-odciekowy) liczba powtórze n = 8-10, p < 0,05 Table 8.4. Chemical analyses of soil samples from Graby-12 waste pit after 2 nd stage of initial remediation (drainage) repetition number n = 8-10, p < 0.05 Oznaczenie Jednostka TPH BTEX Σ WWA Fenole mg/kg s.m. Próbka ujednolicona z obszaru I Próbka ujednolicona z obszaru II P-1 IR P-2 IR P-3 IR P-1 IIR P-2 IIR P-3 IIR ± 3078 ± 1578 ± 614 ± 3915 ± 2045 ± ,7 12,7 4,5 37,4 21,5 8,2 ± 2,9 ±2,4 ± 1,6 ± 4,9 ± 3,1 ± 1,9 2,034 0,799 0,289 2,912 1,474 0,475 ± 0,352 ± 0,143 ± 0,042 ± 0,598 ± 0,301 ± 0,065 5,5 3,5 1,2 6,6 3,9 2,1 ± 0,6 ± 0,4 ± 0,2 ± 0,7 ± 0,4 ± 0,2 Próbka ujednolicona z obszaru III P-1 P-2 P-3 IIIR IIIR IIIR ± 3274 ± 1874 ± ,4 13,5 5,4 ±3,4 ±2,3 ± 1,6 1,478 0,947 0,214 ± 0,298 ± 0,187 ± 0,035 4,9 2,3 1,1 ± 0,5 ± 0,3 ± 0,1 Dowodz one, e na obszarze I dołu urobkowego Graby-12 uzyskano obnienie zawartoci TPH do poziomu: mg/kg s.m. (o 31,2%), na obszarze II do mg/kg s.m. (o 45,2%), a na obszarze III do mg/kg s.m. (o 24,2%). W głbszych warstwach ziemi z dołu urobkowego Graby-12 odnotowano obnienie zawartoci TPH na poziomie od 19,2 do 23,2%. Drugi etap drenau melioracyjno-odciekowego przyczynił si równie do widocznego obnienia zawartoci BTEX w granicach: 21,8 31,2%, co pozwoliło na osignicie poziomu 163

161 nieprzekraczajcego standardów jakoci gleby i ziemi. Odnotowano równie nieznaczne obnienie zawartoci WWA na obszarze II i III dołu urobkowego Graby-12. W celu dokonania dokładnej kontroli efektywnoci zabiegu wstpnej remediacji wytypowano punkty na poszczególnych obszarach dołu urobkowego Graby-12, w których pobrano próbki ziemi z całego profilu głbokociowego dołu urobkowego. Wyniki analiz pobranych próbek gleby i ziemi przedstawiono na rys Uzyskane wyniki w porównaniu z wynikami analiz gleby surowej (rys. 6.5), wskazuj na celowo przeprowadzonego zabiegu. Z wyznaczonych punktów nalecych do poszczególnych obszarów wydzielonych na terenie dołu urobkowego Graby-12, z warstwy powierzchniowej (0-50 cm ppt) pobrano próbki gleby, które nastpnie zostały urednione i poddane analizie chromatograficznej. Analizy chromatograficzne, wykonane zgodnie z opracowan metodyk, umoliwiły zidentyfikowanie i okrelenie ilociowe zawartoci poszczególnych n-alkanów, wchodzcych w skład zanieczyszcze ropopochodnych i stanowicych ponad 80% masy tych zanieczyszcze (rys ). zawarto TPH [m/kg s.m.] Obszar I punkt 37 Obszar II punkt 18 Obszar II punkt 12 Obszar III punkt 35 Obszar III punkt cm ppt 50 cm ppt 80 cm ppt 100 cm ppt 120 cm ppt 150 cm ppt 180 cm ppt Rys Porównanie zawartoci TPH w próbkach po wstpnej remediacji (I i II etap) pobranych z rónych głbokoci dołu urobkowego Graby-12 Fig TPH content in soil samples from various depths of Graby-12 waste pit after (1 st and 2 nd stage) initial remediation 164

162 zawarto n-alkanów [mg/kg s.m.] próbka surowa próbka po I etapie remediacji wstpnej próbka po II etapie remediacji wstpnej 0 n-c6 n-c7 n-c8 n-c9 n-c10 n-c11 n-c12 n-c13 n-c14 n-c15 n-c16 n-c17 Pr n-c18 F n-c19 n-c20 n-c21 n-c22 n-c23 n-c24 n-c25 n-c26 n-c28 n-c30 n-c32 n-c34 n-c36 Rys Porównanie zidentyfikowanych n-alkanów w trakcie remediacji wstpnej w ujednoliconych próbkach z interwału 0-0,50 m ppt z obszaru I na dole urobkowym Graby-12 (liczba powtórze n = 9-10, p < 0,05) Fig Identified n-alkane content during initial remediation in averaged samples from depth interval m (area I) of Graby-12 waste pit (repetition number n = 9-10, p < 0.05) zawarto n-alkanów [mg/kg s.m.] próbka surowa próbka po I etapie remediacji wstpnej próbka po II etapie remediacji wstpnej 0 n-c6 n-c7 n-c8 n-c9 n-c10 n-c11 n-c12 n-c13 n-c14 n-c15 n-c16 n-c17 Pr n-c18 F n-c19 n-c20 n-c21 n-c22 n-c23 n-c24 n-c25 n-c26 n-c28 n-c30 n-c32 n-c34 n-c36 Rys Porównanie zidentyfikowanych n-alkanów w trakcie remediacji wstpnej w ujednoliconych próbkach z interwału 0-0,50 m ppt z obszaru II na dole urobkowym Graby-12 (liczba powtórze n = 9-10, p < 0,05) Fig Identified n-alkane content during initial remediation in averaged samples from depth interval m (area II) of Graby-12 waste pit (repetition number n = 9-10, p < 0.05) 165

163 próbka surowa próbka po I etapie remediacji wstpnej próbka po II etapie remediacji wstpnej 0 n-c6 n-c7 n-c8 n-c9 n-c10 n-c11 n-c12 n-c13 n-c14 n-c15 n-c16 n-c17 Pr n-c18 F n-c19 n-c20 n-c21 n-c22 n-c23 n-c24 n-c25 n-c26 n-c28 n-c30 n-c32 n-c34 n-c36 zawarto n-alkanów [mg/kg s.m.] Rys Porównanie zidentyfikowanych n-alkanów w trakcie remediacji wstpnej w ujednoliconych próbkach z interwału 0-0,50 m ppt z obszaru III na dole urobkowym Graby-12 (liczba powtórze n = 9-10, p < 0,05) Fig Identified n-alkane content during initial remediation in averaged samples from depth interval m (area III) of Graby-12 waste pit (repetition number n = 9-10, p < 0.05) Uzyskane wyniki pozwoliły na stwierdzenie, e na obszarze I najwyszy stopie obni- enia zawartoci uzyskano dla wglowodorów z zakresu n-c 6 n-c 12 (68,9 81,2%), natomiast zawarto wglowodorów z grupy n-c 13 n-c 22 uległa redukcji w granicach: 46,1 62,3%. Wglowodory cisze z zakresu n-c 23 n-c 36 (słabo rozpuszczalne w wodzie) uległy obnieniu w mniejszym stopniu ze wzgldu na wystpowanie zjawiska adsorpcji przez minerały ilaste wystpujce w glebie. Zawarto BTEX w glebie i ziemi z dołu urobkowego Graby-12 uległa zadowalajcemu obnieniu (rys. 8.12), zwłaszcza w przypadku benzenu. Po przeprowadzonym zabiegu remediacji wstpnej, stopie obnienia zawartoci poszczególnych zwizków aromatycznych kształtował si nastpujco: benzen (69,4 73,0), etylobenzen (62,2 64,2%), toluen (62,2 63,9%), ksyleny (32,9 53,7%). W wyniku przeprowadzenia zabiegów wstpnej remediacji na dwóch dołach urobkowych rónicych si pod wzgldem charakterystyki zanieczyszcze uzyskano, zrónicowane efekty, które dobrze obrazuj rozpatrywane zmiany zawartoci poszczególnych zidentyfikowanych n-alkanów i wglowodorów aromatycznych, wchodzcych w skład zanieczyszcze ropopochodnych. 166

164 25 zawarto BTEX [ mg/kg s.m.] OBSZAR I zawarto BTEX [ mg/kg s.m.] OBSZAR II 0 benzen toluen etylobenzen ksyleny 0 benzen toluen etylobenzen ksyleny próbka surowa próbka po I etapie remediacji wstpnej próbka po II etapie remediacji wstpnej próbka surowa próbka po I etapie remediacji wstpnej próbka po II etapie remediacji wstpnej 40 zawarto BTEX [ mg/kg s.m.] OBSZAR III benzen toluen etylobenzen ksyleny próbka surowa próbka po I etapie remediacji wstpnej próbka po II etapie remediacji wstpnej Rys Porównanie zidentyfikowanych BTEX w trakcie remediacji wstpnej w ujednoliconych próbkach z interwału 0-0,50 m ppt z poszczególnych obszarów dołu urobkowego Graby-12 (liczba powtórze n = 9-10, p < 0,05) Fig Identified BTEX content during initial remediation in averaged samples from depth interval m from individual areas of Graby-12 waste pit (repetition number n = 9-10, p < 0.05) 167

165 Zawarto wglowodorów o długoci łacucha wglowego z zakresu n-c 6 n-c 12, która jest znacznie wysza w odpadzie z dołu urobkowego Graby-67 (obszar A), uległa obnieniu o 63% wicej w porównaniu z odpadem z dołu urobkowego Graby-12 (obszar I). Podobn tendencj zanotowano dla monoaromatycznych wglowodorów. W przypadku ciszych wglowodorów (n-c 23 n-c 36 ) rónice w efektywnoci obnienia ich zawartoci, w wyniku wstpnej remediacji na obu testowanych dołach urobkowych, s znacznie nisze. Przeprowadzony zabieg remediacji wstpnej przyczynił si do znacznego obnienia zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych (TPH, BTEX i WWA), które osignły pułap umoliwiajcy przeprowadzenie dalszych etapów oczyszczania, tj. bioremediacji podstawowej i inokulacji biopreparatami mikrobiologicznymi. Zanieczyszczenia ropopochodne, zmieszane z wod pochodzc z oczyszczanego terenu dołu urobkowego i opadów atmosferycznych, zbierane w rowie, spływały grawitacyjnie do łapaczek, które regularnie opróniano. Zebrane zanieczyszczenia wywoono do zbiorników magazynowych, w których nastpował rozdział wglowodorów ropopochodnych (ropy) od wody (cieków). cieki kierowano do pracujcej na kopalni Grabownica przepływowej oczyszczalni cieków kopalnianych (fot. 8.1). Fot Przepływowa instalacja oczyszczania cieków na kopalni Grabownica Pict Flowline installation of sewage purification with biological module Grabownica oil plant 168

166 Majc na uwadze potrzeby i wymagania przemysłu oraz popraw stanu rodowiska naturalnego, opracowano w INiG nowatorskie rozwizanie przepływow instalacj oczyszczania cieków, która pozwalała na znaczne obnienie zawartoci substancji szkodliwych (zwłaszcza zanieczyszcze ropopochodnych), przy niskich kosztach inwestycyjnych oraz znikomych kosztach ruchowych. Instalacja ta została objta ochron patentow zgłoszenie patentowe Nr z dnia r. Etapowa technologia oczyszczania cieków eksploatacyjnych [Steliga, 2005a; 2005c; 2006c; Steliga et.al., 2006d] polegała na skojarzeniu jednostkowych procesów oczyszczania: napowietrzanie drobnopcherzykowe, koagulacja połczona z flokulacj wprowadzono nowy sposób dozowania odczynników zastosowano koagulant (siarczan glinu) oraz flokulanty (Magnafloc AN-1 i Magnafloc AN-2) w postaci bloków zanurzanych w przepływajcych ciekach, filtracja osadów pokoagulacyjnych z wykorzystaniem filtra z wkładem workowym (bawełna). Schemat ideowy przepływowej instalacji oczyszczania cieków przedstawiano na rys Okrelenie parametrów pracy instalacji wymagało przeprowadzenia prac optymalizacyjnych podczas wstpnego uruchomienia [Steliga et al., 2004a; 2005]. Zakres bada optymalizacyjnych obejmował ustalenie nastpujcych parametrów: dobór czasu i intensywnoci napowietrzania, wysokoci i rozmieszczenia przegród sedymentacyjnych w rynnie przepływowej, głboko zanurzenia bloków koagulanta i flokulantów w przepływajcych ciekach, dobór prdkoci wypływu napowietrzonych cieków, dobór właciwej tkaniny filtracyjnej. Przeprowadzenie etapowego oczyszczania cieków (odcieki po drenau melioracyjnoodciekowym i rozdziale fazy wglowodorowej od fazy wodnej) umoliwiło znaczne obnienie zawartoci poszczególnych zanieczyszcze, które kształtowało si na nastpujcym poziomie (tab. 8.5): TPH 77,9%, BTEX 23,4%, ChZT (Cr) 74,6%, BZT 5 69,5%, fenole 46,5%, zawiesiny 86,3%. W celu głbszego oczyszczenia cieków (odcieku z dołu urobkowego) zastosowano doczyszczanie w module biologicznym, który stanowił uzupełniajcy zespół przepływowej instalacji (rys. 8.14). Przed przystpieniem do procesu biologicznego oczyszczania cieków korygowano odczyn do poziomu 7,5-7,8. Przez cały okres trwania procesu prowadzono napowietrzanie cieków za pomoc spronego powietrza, doprowadzanego przez układ dyfuzorów zamontowanych na dnie zbiornika. Jako biopreparat zastosowano zawiesin aktywnych bakterii wyizolowanych, wyselekcjonowanych i namnoonych, pochodzcych ze szla- 169

167 mów ropopochodnych, pozyskanych z łapaczek zainstalowanych na kopalni ropy naftowej Grabownica. Gsto aktywna zawiesiny wynosiła 1*10 9 jtk/cm 3 [Steliga et al., 2004d; Steliga, 2005b, Steliga et al., 2005]. Rys Schemat ideowy przepływowej instalacji oczyszczania cieków kopalnianych Fig Scheme of flowline installation of sewage purification 1 wastewater store container, 2 aeration container, 3 pump, 4 air compressor,5 wastewater flow regulation valve, 6 flow drainpipe, 7 coagulant block, 8 flocculants blocks, 9 coagulant dosing system, 10 flocculant dosing system, 11 sedimentation barriers, 12 sedimentation container, 13 bag filter Rys Schemat biologicznego modułu doczyszczania cieków 1 wlot cieków, 2 zbiornik napowietrzajcy, 3 układ napowietrzajcy, 4 zawór regulacyjny wypływu cieków, 5 filtr workowy, 6 zrzut cieków oczyszczonych, 7 wlot cieków z instalacji przepływowej, 8 filtr workowy, 9 poredni zbiornik magazynowy, 10 pompa do cieków, 11 zbiornik biopreparatu, 12 rczna pompa, 13 agregat sprarkowy, 14 wlot spronego powietrza Fig Scheme of flowline installation of sewage purification biological module 1 wastes inlet, 2 aeration container, 3 aeration system, 4 wastewater flow-out regulation valve, 5 bag filter, 6 purified wastes outlet, 7 wastes inlet from a flow installation, 8 bag filter, 9 direct store container, 10 pump, 11 container for biopreparations, 12 hand pump, 13 air compressor, 14 compressed air inlet 170

168 Monitorowanie przebiegu procesu biologicznego oczyszczania cieków pod ktem zmian zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych, a szczególnie wglowodorów ropopochodnych oznaczanych metod SPE/GC, pozwoliło na okrelenie optymalnego czasu trwania oraz efektywnoci procesu. Wyniki uzyskane w trakcie prowadzonych bada wiadcz o tym, e najszybszy spadek zawartoci substancji ropopochodnych wystpował w okresie 4-7 dni trwania procesu. Procentowe obnienie zawartoci zanieczyszcze podczas biologicznego doczyszczania przedstawiono w tab. 8.5 i na rys Badany parametr Tabela 8.5. Zestawienie badanych parametrów w kolejnych etapach oczyszczania cieków zanieczyszczonych substancjami ropopochodnymi Table 8.5. Testing parameters contents during consecutive stages of oiled-waste purification Jednostka surowe po napowietrzaniu cieki po koagulacji z flokulacj i filtracji po oczyszczaniu biologicznym Dopuszczalne zawartoci zanieczyszcze podane w pozwoleniu wodno-prawnym dla kopalni Grabownica Przewodnictwo S/cm właciwe ph 6,99 7,01 7,8 7,8 6,5-9,0 ChZT (C) mg O 2 /dm ,0 150 BZT 5 mg O 2 /dm 3 132, 72,3 40,2 28,0 50 OWO mg/dm ,3 10,5 50 Zawiesiny mg/dm 3 183, 83,2 51,3 32,5 50 TPH mg/dm 3 282,0 102,3 62,3 7,50 50 BTEX mg/dm 3 12,3 8,2 2,5 0,40 Fenole mg/dm 3 0,52 0,48 0,32 0,11 WWA mg/dm 3 0,45 0,35 0,31 0,12 Chlorki mg/dm 3 15,8 15,9 72,5 70, Siarczany mg/dm 3 10,5 9,7 6,2 3, Azot (NO 3 ) mg/dm 3 6,20 5,3 3,2 1,50 Azot (NH 4 ) mg/dm 3 4,20 2,9 1,9 0,10 elazo ogólne mg/dm 3 1,80 1,2 0,52 0,50 Prowadzony proces biologicznego doczyszczania cieków, z wykorzystaniem bakterii autochtonicznych zdolnych do degradacji wglowodorów wystpujcych w oczyszczanych ciekach, spowodował znaczne obnienie zawartoci wglowodorów alifatycznych (n-alkanów) o długoci łacucha n-c 12 n-c 21 w zakresie: 62,5 80,3%. N-alkany z zakresu n-c 22 n-c 26 trudniej ulegaj bioremediacji, ale w zadowalajcym stopniu, gdy redukcja ich zawartoci mieciła si w przedziale: 39,4 53,2%. O zadowalajcym stopniu biodegradacji wiadcz zmiany wartoci przyjtych wskaników stopnia biodegradacji n-c 17 /Pr i n-c 18 /F, które dla odcieku (cieków) uzyskiwanego podczas drenau melioracyjno-odciekowego z obszaru dołu urobkowego Graby-67, ulegały nastpujcemu zmniejszeniu: 171

169 n-c 17 /Pr z 1,914 do 0,402 n-c 18 /F z 1,884 do 0, obnienie zaw. z anieczyszcze [%] ChZT(Cr) BT EX Fenole OWO TPH WWA BZ T czas [dni] Rys Wpływ czasu prowadzenia procesu oczyszczania biologicznego na zawarto mierzonych parametrów w ciekach Fig Influence of biological purification time on amount of measured waste water parameters W wyniku przeprowadzonego procesu oczyszczania cieków z dołów urobkowych: Graby-67 i Graby-12 uzyskano obnienie zawartoci zanieczyszcze do poziomu nieprzekraczajcego najwyszych dopuszczalnych wartoci, okrelonych w obowizujcych obecnie normach i zezwoleniu wodno-prawnym dla kopalni Grabownica. 172

170 Celem prowadzonych bada laboratoryjnych było rozpoznanie przebiegu biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych w odpadach z dołów urobkowych Graby-67 i Graby-12, które zostały zakwalifikowane jako odpady o kodzie ex * gleba i ziemia zanieczyszczone substancjami ropopochodnymi. Wyniki bada stanowi podstaw przy opracowaniu wytycznych prowadzenia procesu oczyszczania dołów w warunkach terenowych metod in-situ. Pomimi tego, e przetransponowanie wyników bada laboratoryjnych na skal przemysłow nie jest łatwe, ze wzgldu na du złoono układu i przebiegajcych procesów i przemian, a prowadzone procesy oczyszczania w warunkach terenowych bd wymagały weryfikacji, to jednak dane uzyskane w badaniach metod ex-situ powinny stanowi skuteczne narzdzie sterowania przebiegiem biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych realizowanej metod in-situ. Jako materiał do bada laboratoryjnych wykorzystano gleb i ziemi z dołów urobkowych Graby-67 i Graby-12 po przeprowadzeniu wstpnej remediacji obejmujcej drena melioracyjno-odciekowy. Badania obejmujce modyfikacj struktury gleby i ziemi z wytypowanych dołów urobkowych oraz dobór optymalnych iloci substancji biogennych przeprowadzono indywidualnie dla kadego obszaru, wyznaczonego na terenie dołów urobkowych Graby-67 i Graby-12. Ze wzgldu na szeroki zakres badawczy, badania biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych przedstawiono przykładowo na odpadzie z wybranych obszarów obu dołów urobkowych: obszar BR z dołu Graby-67 oraz obszar III z dołu urobkowego Graby-12. Wyniki analiz chromatograficznych, umoliwiajcych zidentyfikowanie poszczególnych wglowodorów wchodzcych w skład zanieczyszcze ropopochodnych, zilustrowano na 173

171 rys Przy zblionej sumarycznej zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych (TPH) w odpadach z dołów urobkowych Graby-67 ( mg/kg s.m.) i Graby-12 ( mg/kg s.m.), widoczne jest zrónicowanie zawartoci poszczególnych grup n-alkanów. W odpadzie z dołu urobkowego Graby-67 stwierdzono, na podstawie przedstawionych wyników analiz, wysz zawarto wglowodorów z zakresu n-c 6 n-c 12 (20%) ni w przypadku gleby z dołu urobkowego Graby-12 (12%). Wglowodory o dłuszym łacuchu wglowym (n-c 13 n-c 19 ) przewaaj natomiast w odpadzie z dołu urobkowego Graby % 1,4% 50% 2% 20% 23% 3,7% 11,8% 12% 25% 2% 9% n-c6 - n-c12 izoprenoidy Pr i F n-c26 - n-c36 n-c13 - n-c19 n-c20 - n-c25 niezidentyfikowane n-c6 - n-c12 izoprenoidy n-c26 - n-c34 n-c13 - n-c19 n-c20 - n-c25 niezidentyfikowane Rys Procentowy udział zidentyfikowanych wglowodorów wchodzcych w skład zanieczyszcze ropopochodnych na dołach urobkowych Graby-67 (obszar CR) i Graby-12 (obszar III) Fig Percentage of identified hydrocarbons from petroleum pollutants in Graby-67 (area CR) and Graby-12 (area III) waste pits Wglowodory monoaromatyczne BTEX wystpuj w odpadzie z dołu urobkowego Graby-67 w nieznacznie wyszych ilociach (30,7 mg/kg s.m., z czego benzen oznaczono w iloci 19,8 mg/kg s.m., etylobenzen 5,5 mg/kg s.m., toluen 6,6 mg/kg s.m., ksyleny 5,0 mg/kg s.m.) ni w odpadzie z dołu urobkowego Graby-12, w którym ich zawarto oznaczono na poziomie 23,4 mg/kg s.m. (benzen 10,8 mg/kg s.m., etylobenzen 2,7 mg/kg s.m., toluen 6,9 mg/kg s.m., ksyleny 3,1 mg/kg s.m.). Wykonane analizy chromatograficzne wykazały, e zawarto WWA po zabiegu remediacji wstpnej utrzymuje si na niskim poziomie: Graby-67 1,132 mg/kg s.m. i Graby-12 1,478 mg/kg s.m., z czego 80% stanowi naftalen, natomiast pozostałe oznaczone WWA wystpuj w ilociach ladowych. 174

172 Analizy mineralogiczne odpadów z wytypowanych do bada dołów urobkowych wykazały obecno materiałów ilastych o strukturze pczniejcej (pakiety smektyt/smektyt-illit), co zmusza do modyfikacji struktury odpadu w celu poprawy warunków biodostpnoci. Biodostpno substancji odywczych i mikroorganizmów do wglowodorów ropopochodnych jest czynnikiem limitujcym szybko ich biodegradacji [De Jonge et al., 1997; Talley et al., 2002; Huesemann et al., 2003; Thorsen et al., 2004]. Zawarto minerałów ilastych na poszczególnych obszarach dołów urobkowych jest zrónicowana i dla dołu Graby-67 zawiera si w przedziale od 36 do 68%, za na terenie dołu urobkowego Graby-12 w granicach: od 18% do 43% (tab. 6.5 i tab. 6.6). Przyjto, e zmieszanie odpadu z dołu urobkowego z czyst ziemi, nie zawierajc zanieczyszcze ropopochodnych oraz charakteryzujc si nisk zawartoci minerałów ilastych w odpowiednio dobranych proporcjach, powinno przynie oczekiwane rezultaty. W ramach opisywanych bada majcych na celu ustalenie optymalnych proporcji zmieszania odpadu z czyst ziemi, przeprowadzono: porównanie dyfraktogramów frakcji ilastych w próbkach odpadu po zmieszaniu z czyst ziemi w rónych proporcjach, analizy zmian aktywnoci dehydrogenazowej w zalenoci od iloci czystej ziemi, wprowadzonej do odpadu z dołu urobkowego. Porównujc dyfraktogramy rentgenowskie frakcji ilastej odpadów z oczyszczanych dołów urobkowych po zmieszaniu ich z czyst ziemi widoczne jest obnienie zawartoci frakcji ilastej, co wie si z rozlunieniem struktury gleby/odpadu z dołu urobkowego Graby-67 (rys. 9.2) i Graby-12 (rys. 9.3). Ponadto aktywno dehydrogenazowa ulega wzrostowi, co wiadczy o zwikszeniu si aktywnoci biologicznej gleby, przyczyniajc si do wzrostu tempa przebiegu procesów bioremediacyjnych (tab. 9.1). Opierajc si na przyjtych kryteriach porównawczych mona stwierdzi, e aby utrzyma zadawalajce tempo przebiegu procesów bioremediacyjnych na obszarze CR dołu urobkowego Graby-67, o skaeniu utrzymujcym si na poziomie: mg/kg s.m. i wysokiej zawartoci minerałów ilastych, naley zmiesza odpad z czyst ziemi w stosunku 10:1 (tab. 9.1, rys. 9.2). Dla mniej skaonych substancjami ropopochodnymi obszarów AR i BR 175

173 (TPH od do mg/kg s.m.) i zawartoci minerałów ilastych w zakresie: 35 38%, proporcje te wynosz 20:1 (tab. 9.1). W przypadku odpadu z dołu urobkowego Graby-12, który posiada nisz zawarto minerałów ilastych, proporcje zmieszania z czyst ziemi kształtuj si na niszym poziomie i wynosz: dla obszaru II (najwysze skaenie, TPH = mg/kg s.m.) 15:1, a dla obszarów I i II, o zawartoci minerałów ilastych 18 27%, proporcje te zostały obnione do poziomu 25:1. Zbyt dua ilo wprowadzonej czystej ziemi nie jest wskazana, gdy wzrost iloci substancji organicznej innej ni wglowodory moe zachci bakterie do korzystania z innych ródeł wgla i energii ni zwizki ropopochodne, bdce głównym zanieczyszczeniem. Tabela 9.1. Kształtowanie si aktywnoci dehydrogenazowej [μg TF/g s.m./24 h] w glebie i ziemi z dołów urobkowych Graby-67 i Graby i 12 zmieszanej z czyst ziemi w zalenoci od proporcji wprowadzonej ziemi nie zawierajcej zanieczyszcze ropopochodnych Table 9.1. Dehydroganaze activeness [μg TF/g d.m./24 h] in soil and ground from Graby-67 and Graby-12 waste pits mixed with pure soil according to proportions of pollutants-free soil Proporcje Termin poboru prób (dni) zmieszania z ziemi GRABY-67 Obszar AR i BR Kontrolna 4,5 14,1 19,1 21,2 25:1 6,7 8,3 18,4 25,4 20:1 8,3 16,2 32,1 42,4 10:1 8,4 17,2 32,8 43,1 5:1 8,6 19,2 33,2 45,8 Obszar CR Kontrolna 14,1 21,7 32,4 39,4 25:1 15,7 22,4 33,5 41,5 20:1 17,2 24,5 39,1 49,4 10:1 24,5 32,7 48,1 56,5 5:1 25,4 33,1 49,1 57,2 GRABY-12 Obszar I i III Kontrolna 5,1 12,4 20,7 27,7 30:1 7,3 10,8 18,4 29,4 25:1 10,4 19,2 32,4 48,1 20:1 10,5 19,4 29,4 49,2 10:1 10,4 20,7 33,4 50,1 Obszar II Kontrolna 9,2 14,4 28,8 32,6 30:1 8,3 11,8 29,1 39,4 20:1 10,5 15,2 32,1 45,4 15:1 19,2 28,9 39,2 59,1 10:1 20,1 29,4 39,7 60,7 176

174 Odpad z dołu urobkowego Graby-67 2 Theta Odpad Graby-67 zmieszany z czyst ziemi 20:1 2 Theta Odpad Graby-67 zmieszany z czyst ziemi 10:1 2 Theta Rys Porównanie dyfraktogramów rentgenowskich frakcji ilastej odpadu surowego oraz po zmieszaniu w rónych proporcjach z czyst ziemi dół urobkowy Graby-67 Fig X-ray diffractogrammes of crude waste (soil) silty fraction and after mixing with pure soil Graby-67 waste pit 177

175 Odpad z dołu urobkowego Graby-12 2 Theta Odpad Graby-12 zmieszany z czyst ziemi 25:1 2 Theta Odpad Graby-12 zmieszany z czyst ziemi 15:1 2 Theta Rys Porównanie dyfraktogramów rentgenowskich frakcji ilastej odpadu surowego oraz po zmieszaniu w rónych proporcjach z czyst ziemi dół urobkowy Graby-12 Fig X-ray diffractogrammes of crude waste (soil) silty fraction and after mixing with pure soil Graby-12 waste pit Właciwy dobór substancji biogennych i ustalenie ich ste w glebie jeszcze przed przystpieniem do prac bioremediacyjnych w warunkach terenowych jest niezmiernie wane, nie tylko ze wzgldu na uzyskanie maksymalnej efektywnoci procesu oczyszczania, ale równie ze wzgldów ekonomicznych. Gleba i ziemia z wytypowanych do oczyszczania dołów urobkowych na poszczególnych wyznaczonych obszarach jest zrónicowana nie tylko pod wzgldem zawartoci substancji ropopochodnych, ale take ze wzgldu na znaczce rónice w jej składzie. Cz obszarów mona zaliczy do gleb cikich, a pozostałe do rednich, co skutkuje zrónicowanym 178

176 zapotrzebowaniem bakterii na pierwiastki biogenne. Wikszo autorów opracowa z zakresu bioremediacji uwaa za optymalny dla rozwoju mikroorganizmów udział poszczególnych pierwiastków biogennych w stosunku C:N:P = 100:10:1, czyli zblionym poziomie ich zawartoci w komórkach drobnoustrojowych [Jackson et al., 1999; Chaîneau et al., 2003; Xu et al., Obbard, 2003; Wright et al, 2004; Rosa et al., 2007]. Cz badaczy sugeruje jednake indywidualny dobór zawartoci substancji biogennych na znacznie niszym poziomie C:N:P w zakresie od 100:5:1 do 100:3:1 [Sims et al., 1993; Namkoong et al., 2002]. Intensyfikacj procesów biodegradacyjnych w zalenoci od proporcji dozowanych substancji biogennych najkorzystniej mona okreli analizujc aktywno dehydrogenazow gleby [Mathew et al, 1999; Namkoong et al., 2002; Xu et al., 2004; Xu et al., 2004a; Kołwzan, 2005]. Badania przeprowadzono na glebie i ziemi z wydzielonych obszarów dołów urobkowych Graby-67 i Graby-12. Czas trwania eksperymentu wynosił około 40 dni dla kadej serii rónicej si proporcjami substancji biogennych (C:N:P). Pocztkowa aktywno dehydrogenazowa kształtowała si na niskim poziomie, ale w zwizku z regulacj parametrów prowadzenia bada, tzn. temperatury, odczynu oraz wilgotnoci nastpował jej powolny wzrost. W trakcie prowadzonych bada zaobserwowano widoczne rónice pomidzy aktywnoci dehydrogenazow poszczególnych prób (pomidzy 20 a 30 dniem) w zalenoci od proporcji wprowadzanych substancji biogennych (C:N:P) oraz od typu gleby badanej próbki z danego obszaru dołu urobkowego. Wyniki bada zalenoci dehydrogenazowej w glebie i ziemi z dołu urobkowego Graby-67 na poszczególnych jego obszarach od proporcji wprowadzanych pierwiastków biogennych zilustrowano na rys. 9.4, natomiast dla dołu Graby-12 na rys Gleba i ziemia pochodzca z dołu urobkowego Graby-67 naley do gleb cikich, ale nieznacznie rónicych si na poszczególnych wydzielonych obszarów. Przeprowadzone badania uwidoczniły zrónicowane wymagania gleby i ziemi z dołu urobkowego Graby-67. W toku stymulacji aktywnoci enzymatycznej najwiksze przyspieszenia procesów yciowych mikroorganizmów odnotowano przy nastpujcych proporcjach wprowadzanych pierwiastków biogennych (azot i fosfor): obszar AR C:N:P = 100:5:1 obszar BR C:N:P = 100:4:1 obszar CR C:N:P = 100:3:1 179

177 120 Obszar AR aktywno dehydrogenazowa [μg TF/s.m./24] [dni] Próbka kontrolna C:N:P =100:10:1 C:N:P =100:5:1 C:N:P =100:4:1 C:N:P =100:3:1 Obszar BR 120 aktywno dehydrogenazowa [μg TF/s.m./24] [dni] 40 Próbka kontrolna C;N:P = 100:10:1 C:N:P =100:5:1 C:N:P =100:4:1 C:N:P = 100:3:1 Obszar CR 120 aktywno dehydrogenazowa [μg TF/s.m./24] [dni] 40 Próbka kontrolna C:N:P =100: 10:1 C:N:P =100:5:1 C:N:P =100:3 :1 C:N:P=100:2:1 Rys Zaleno aktywnoci dehydrogenazowej [μg TF/g s.m./24 h] w glebie i ziemi z dołu urobkowego Graby-67 na poszczególnych jego obszarach od proporcji wprowadzonych pierwiastków biogennych Fig Relation between dehydrogenaze activeness [μg TF/g d.m./24 h] in soil and ground on consecutive areas of Graby-67 waste pit and proportions of applied biogenic elements 180

178 100 Obszar I aktywno dehydrogenazowa [μg TF/s.m.24 h] [dni] 40 Próbka kontrolna C:N:P = 100:10:1 C:N:P = 100:5:1 C:N:P =100:4:1 C:N:P = 100:3:1 Obszar II 80 aktywno dehydrogenazowa [μg TF/s.m. 24 h] [dni] 40 Próbka kontrolna C:N:P=100:10:1 C:N:P = 100:5:1 C:N:P = 100:3:1 C:N:P = 100:2 :1 Obszar III 120 aktywno dehydrogenazowa [μg TF/s.m.24 h] [dni] 40 Próbka kontrolna C:N:P = 100:10:1 C:N:P =100:5:1 C:N:P =100:4:1 C:N:P =100:3 :1 Rys Zaleno aktywnoci dehydrogenazowej [μg TF/g s.m./24 h] w glebie i ziemi z dołu urobkowego Graby-12 na poszczególnych jego obszarach od proporcji wprowadzonych pierwiastków biogennych Fig Relation between dehydrogenaze activeness [μg TF/g d.m./24 h] in soil and ground on consecutive areas of Graby-12 waste pit and proportions of applied biogenic elements 181

179 Natomiast na terenie dołu urobkowego Graby-12 odnotowano nastpujce optymalne proporcje azotu i fosforu na poszczególnych obszarach: obszar I C:N:P = 100:4:1 obszar II C:N:P = 100:3:1 obszar III C:N:P = 100:4:1. Postp biodegradacji był wikszy w glebie cikiej o wysokiej zawartoci substancji ropopochodnych (Graby-67 obszar CR i Graby-12 obszar II) przy niszym stosunku C:N:P, ze wzgldu na to, e gleby cikie i mocno skaone nie wymagaj uzupełnienia pierwiastków biogennych do poziomu uwaanego powszechnie za optymalny (tab. 9.2). Tabela 9.2. Zaleno skutecznoci biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych (TPH) od proporcji wprowadzanych pierwiastków biogennych Table 9.2. Relation between effectiveness of TPH biodegradation and proportions of applied biogenic elements Proporcje GRABY-67 GRABY-12 pierwiastków biogennych Zawarto TPH [mg/kg s.m.] Obni. [%] Zawarto TPH [mg/kg s.m.] Obni. [%] C:N:P pocztkowa po 30 dniach pocztkowa po 30 dniach Obszar AR Obszar I 100:0:0 kontrolna , ,1 100:10: , , :5: , ,2 100:4: , :3: , ,6 Obszar BR Obszar III 100:0:0 kontrolna , ,7 100:10: , , :5: , ,9 100:4: , ,4 100 :3: , ,6 Obszar CR Obszar II 100:0:0 kontrolna , ,4 100:10: , ,7 100:5: , ,8 100:3 : , ,0 100 :2: , ,4 Na pozostałych obszarach dołów urobkowych Graby-67 (obszar BR i AR) i dołu urobkowego Graby-12 (obszar I i III), które charakteryzuj si zblionym stopniem skaenia i podobnym typem gleb, wyznaczone laboratoryjnie optymalne proporcje azotu do fosforu były zblione. Stwierdzono ponadto w glebach cikich (Gray-67 obszar CR i Graby-12 ob- 182

180 szar II) wystpowanie hamowania procesu rozkładu zanieczyszcze ropopochodnych przy wprowadzeniu wikszych ni optymalne dawek substancji biogennych. Naley nadmieni, e jednorazowe wprowadzenie całej dawki substancji biogennych nie przynosiło zadowalajcych efektów. Wskazane jest stopniowe dozowanie nawozów w celu uniknicia wzrostu cinienia osmotycznego na zewntrz komórki bakteryjnej. Przedstawione wyniki przeprowadzonych bada wskazuj na prost zaleno pomidzy zmierzon aktywnoci dehydrogenazow, steniem substancji ropopochodnych, a ilo- ci wprowadzonych pierwiastków biogennych. Optymalne dawki substancji biogennych (nawozów mineralnych) naley okreli indywidualnie dla danego obszaru wyodrbnionego na terenie dołu urobkowego. Teren kadego zestarzałego dołu urobkowego silnie skaonego substancjami ropopochodnymi bdzie wykazywał inne zapotrzebowanie na pierwiastki biogenne przy przebiegu procesu biodegradacji wglowodorów na zadowalajcym poziomie. Celem bada mikrobiologicznych była charakterystyka bakterii i grzybów wyizolowanych ze rodowiska gruntowego (odpadu wiertniczego) pod ktem zdolnoci biodegradacji wglowodorów alifatycznych i aromatycznych stanowicych zanieczyszczenia ropopochodne. Ponadto stosowane mikroorganizmy powinny by bezpieczne dla rodowiska i zdrowia człowieka. Z tego wzgldu wytypowane szczepy poddano badaniom z wykorzystaniem techniki molekularnej opartej na sekwencjonowaniu DNA kodujcego 16S rrna dla bakterii i 18S rrna dla grzybów, co pozwoliło na zakwalifikowanie ich do właciwych gatunków. Uzyskane wyniki bada były podstaw przy doborze składu biopreparatów dla oczyszczanych dołów urobkowych. Z zanieczyszczonego odpadu pochodzcego z dołu urobkowego Graby-12 wyizolowano łcznie 24 szczepy bakteryjne, charakteryzujce si zdolnoci wykorzystania ropy naftowej i wglowodorów jako jedynego ródła wgla. Reprezentowani byli przedstawiciele nastepujcych rodzajów: Acinetobacter (1 szczep), Arthrobacter (1 szczep), Bacillus (1 szczep), Gordonia (1 szczep), Micrococcus (2 szczepy), Mycobacterium (3 szczepy), Nocardia (3 szczepy), Nocardioides (2 szczepy), Rhizobium (1 szczep), Rhodococcus (7 szczepów), Pseudomonas (2 szczepy). Oprócz tego wyizolowano trzy aktywne szczepy grzybów pleniowych, nalece do rodzajów Aspergillus, Fusarium i Penicillium oraz Phanerochaete. Z zanieczyszczonego odpadu pochodzcego z dołu urobkowego Graby-67 wyizolowano łcznie 26 szcze- 183

181 pów bakteryjnych, nalecych do rodzajów Agrobacterium (1 szczep), Alcaligenes (1 szczep), Arthrobacter (1 szczep), Enterobacter (2 szczepy) Flavobacterium (1 szczep), Gordonia (2 szczepy) Klebsiella (1 szczep), Micrococcus (2 szczepy), Mycobacterium (3 szczepy), Nocardia (2 szczepy) Rhodococcus (7 szczepów), Pseudomonas (2 szczepy), Sphingomonas (1 szczep) oraz 4 szczepy grzybów nalece do rodzajów Cladosporium, Trichoderma, Penicillium i Phanerochaete. Sporód wszystkich wyizolowanych mikroorganizmów zdecydowan przewag mieli przedstawiciele z rzdu Actinomycetales (typ Actinobacteria). Nie było to wielkim zaskoczeniem, poniewa grupa ta jest typowym przedstawicielem mikroorganizmów glebowych i cechuje si zdolnoci rozkładu szeregu wglowodorów ropopochodnych i innych ksenobiotyków. Szczególnie licznie reprezentowany był rodzaj Rhodococcus. Wyizolowane szczepy oznaczono zgodnie z nomenklatura przyjt wczeniej w INiG dla szczepów bakteryjnych i grzybów (skrót literowy + liczba oznaczajca numer kolejny szczepu w kolekcji). Wyniki testów zdolnoci wykorzystania rozmaitych wglowodorów jako jedynego ródła wgla przedstawiono w tabeli 9.3 i 9.4. Oceniano tylko wzrost lub jego brak. Nie oceniano natomiast szybkoci wzrostu mikroorganizmów, gdy test ten jest mało przydatny i faworyzuje organizmy szybko rosnce (tzn. jest przydatny do oceny zdolnoci wykorzystywania kilku zwizków przez jeden i ten sam organizm) Wyizolowane szczepy charakteryzowały si dobrymi zdolnociami degradowania wglowodorów alifatycznych. Wikszo wykorzystywała wszystkie testowane zwizki alifatyczne jako jedyne ródło wgla, cho pewnym zaskoczeniem moe by fakt, e niektóre nie potrafiły wykorzystywa n-heptanu i n-dekanu. Wiele szczepów wykorzystywało take wglowodory aromatyczne. Sporód wglowodorów aromatycznych najczciej wykorzystywany był fenol, co jest zrozumiałe zwaywszy fakt, e jest to zwizek rozpuszczalny w wodzie, a wic jego dostpno dla mikroorganizmów jest wiksza ni zwizków o wikszej hydrofobowoci. Szerokie spektrum wykorzystywania wglowodorów sugeruje, e mikroorganizmy musiały przej długi okres adaptacyjny, poniewa wspólne szlaki wykorzystywania wglowodorów alifatycznych i aromatycznych nie s zjawiskiem powszechnym. Poniewa zanieczyszczenia ropopochodne były obecne w glebie znajdujcej si na obszarze obu dołów przez kilkadziesit lat, mona oczekiwa, e mikroorganizmy, które przetrwały w tym niekorzystnym rodowisku s ukierunkowane na rozkład rozmaitych zwizków wchodzcych w skład ropy naftowej. Tez t potwierdza wyizolowanie mikroorga- 184

182 nizmów nalecych do rodzajów takich, jak Agrobacterium, Klebsiella, czy Rhizobium, u których zdolno wykorzystywania wglowodorów jako jedynego ródła wgla jest do rzadko spotykana. Nastpnym etapem była selekcja mikroorganizmów. Poniewa załoono maksymaln biorónorodno biopreparatów, z kadego wyizolowanego rodzaju wybrano ten szczep, który najszybciej tworzył biofilm na granicy faz, okrelany wizualnie. Tabela 9.3. Wykorzystanie wglowodorów jako jedynego ródła wgla przez szczepy wyizolowane ze rodowiska glebowego dołu urobkowego Graby-12 Table 9.3. Use of hydrocarbons as the only source of carbon for strains isolated from Graby-12 waste pit Szczep n-c7 n-c10 n-c16 n-c18 n-c19 n-c22 n-c26 fenol toluen ksylen naftalen Acinetobacter IN Arthrobacter IN Bacillus IN Gordonia IN Micrococcus IN Micrococcus IN Mycobacterium IN Mycobacterium IN Mycobacterium IN Nocardia IN Nocardia IN Nocardia IN Nocardioides IN Nocardioides IN Rhizobium IN Rhodococcus IN Rhodococcus IN Rhodococcus IN Rhodococcus IN Rhodococcus IN Rhodococcus IN Rhodococcus IN Pseudomonas IN Pseudomonas IN Aspergillus G Fusarium G Penicillium G Phanerochaete G oznacza efekt pozytywny (wzrost w obecnoci danego wglowodoru efekt negatywny (brak wzrostu) 185

183 Tabela 9.4. Wykorzystanie wglowodorów jako jedynego ródła wgla przez szczepy wyizolowane ze rodowiska glebowego dołu urobkowego Graby-67 Table 9.4. Use of hydrocarbons as the only source of carbon for strains isolated from Graby-67 waste pit Szczep n-c7 n-c10 n-c16 n-c18 n-c19 n-c22 n-c26 fenol toluen ksylen naftalen Agrobacterium IN Alcaligenes IN Arthrobacter IN Enterobacter IN Enterobacter IN Flavobacterium IN Gordonia IN Gordonia IN Klebsiella IN Micrococcus IN Micrococcus IN Mycobacterium IN Mycobacterium IN Mycobacterium IN Nocardia IN Nocardia IN Rhodococcus IN Rhodococcus IN Rhodococcus IN Rhodococcus IN Rhodococcus IN Rhodococcus IN Rhodococcus IN Pseudomonas IN Pseudomonas IN Sphingomonas IN Cladosporium G Trichoderma G Penicillium G Phanerochaete G oznacza efekt pozytywny (wzrost w obecnoci danego wglowodoru), efekt negatywny (brak wzrostu) Po wstpnych badaniach przynaleno taksonomiczn oceniano wykonujc testy API. Badania potwierdzajce dla Bacillus wykonano posługujc si testem API 50 CHB, dla Acinetobacter, Alcaligenes, Agrobacterium, Enterobacter, Klebsiella, Pseudomonas i Sphingomonas testem ID 32 GN, dla Micrococcus Arthrobacter, Gordonia, Nocardia, Nocardioides i Rhodococcus testem Api Coryne. Test Api Coryne przeprowadzono take w celach porównaw- 186

184 czych dla Micrococcus, Nocardioides i Mycobacterium (jako nalecych do tego samego rzdu Actinomycetales). W tabeli 9.5 przedstawiono charakterystyk Actinomycetales promieniowców, a w tab przykładowo wybranych bakterii, które zostały wykorzystane do przygotowania biopreparatów. W celu dokładnej identyfikacji mikroorganizmów wchodzcych w skład biopreparatów wykonano sekwencjonowanie genu kodujcego 16S rrna dla bakterii i 18S rrna dla grzybów. Wyniki tych bada wskazuj, e s one obecnie niezbdne dla prawidłowej identyfikacji, poniewa metody klasyczne nie zawsze s wystarczajce. W tabelach 9.7 i 9.8 podano dokładn identyfikacj mikroorganizmów wchodzcych w skład biopreparatów G-12-1 i G-12-2 oraz G-67-1 i G Tabela 9.5. Charakterystyka szczepów nalecych do rzdu Actinomycetales (promieniowców) wchodzcych w skład biopreparatów G-12-1 i G-67-1 Table 9.5. Characteristics of strains belonging to Actinomycetale included in G-12-1 and G-67-1 bioperpartions Badana cecha Gordonia IN 79 Micrococcus IN 51 Micrococcus IN 81 Mycobacterium IN 53 Mycobacterium IN 84 Rhodococcus IN 87 Rhodococcus IN 60 Rhodococcus IN 66 Rhodococcus IN 90 Barwienie Grama Barwienie Ziehl-Nielsena + + +/ Wzrost tlenowy Wzrost beztlenowy Ruchliwo Kształt ziarniaki, pałeczki ziarniaki ziarniaki pałeczki pałeczki ziarniaki, pałeczki ziarniaki, pałeczki ziarniaki, pałeczki ziarniaki, pałeczki Wygld kolonii na podłou agarowym gładkie, lnice, barwy łososiowej gładkie, lnice, barwy zółtej gładkie, lnice, barwy zółtej gładkie, lnice lub matowe, barwy ółtej przewanie szorstkie, matowe, barwy ółtej niewielkie, gładkie, matowe, barwy czerwonawej lnice gładkie, barwy białej do ółtawej lnice, gładkie, barwy kremowej lnice, gładkie barwy kremowej Tolerancja NaCl 5% 5% 10% 5% 5% 10% 10% 5% 5% Wzrost w temp. 4 o C/22 o C/ +/+/+/ +/+/+/ +/+/+/ /+/+/+ /+/+/+ /+/+/+ +/+/+/+ /+/+/+ /+/+/+ 30 o C/37 o C Katalaza Oksydaza

185 Tabela 9.5 cd. Badana cecha Gordonia IN 79 Micrococcus IN 51 Micrococcus IN 81 Mycobacterium IN 53 Mycobacterium IN 84 Rhodococcus IN 87 Rhodococcus IN 60 Rhodococcus IN 66 Rhodococcus IN 90 Arylosulfataza n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. Redukcja azotanów Pyrazynamidaza Arylamidaza pirolidonylu Kwana fosfataza β Glukuronidaza β Galaktozydaza α Glukozydaza N-Acetylo--D glukozaminidaza Hydroliza eskuliny Hydroliza elatyny Ureaza Glukoza + + Ryboza Ksyloza Mannitol Maltoza + Laktoza + + Sacharoza + Glikogen + oznacza efekt pozytywny efekt negatywny n.b. nie badano W dwóch przypadkach identyfikacja metod sekwencjonowania wskazała na inn przynaleno rodzajow. Szczep oznaczony IN 60 i zaklasyfikowany wczeniej do rodzaju Nocardioides został zidentyfikowany jako Rhodococcus erythropolis, poniewa nastpiła reklasyfikacja trzech szczepów wzorcowych, oznaczonych wczeniej jako Nocardioides simplex [Yoon et al., 1997]. Szczep ten rónił si zarówno morfologicznie, jak i niektórymi cechami biochemicznymi od innych szczepów zidentyfikowanych jako Rhodococcus erythropolis, tym niemniej naley uzna analiz sekwencji DNA kodujcej 16S rrna jako ostateczny dowód. 188

186 Wyniki w tabelach 9.5 i 9.6 poczynajc od badania zdolnoci redukcji azotanów do badania zdolnoci do fermentacji glikogenu, otrzymano posługujc si testem API Coryne firmy Biomerieux. Nazwy cukrów odnosz si do testów fermentacyjnych i nie oznaczaj zdolnoci (lub jej braku) do wykorzystywania danego zwizku jako ródła wgla. Substraty wymienione w tabeli słuyły jako jedyne ródło wgla lub/i azotu. Wyniki otrzymane na podstawie testów API 20 NE i API 32 GN firmy Biomerieux. Tabela 9.6. Charakterystyka wybranych szczepów wchodzcych w skład biopreparatu G-12-1 Table 9.6. Characteristics of other strains included in G-12-1 biopreparation Cecha badana Pseudomonas IN 71 Rhizobium IN 62 Barwienie Grama Wzrost tlenowy + + Wzrost beztlenowy W obecnoci azotanów + Ruchliwo + + Kształt Pałeczki Pałeczki Wygld kolonii na podłou agarowym Gładkie, lnice, barwy białej Gładkie, lnice, barwy białej, półprzeroczyste Tolerancja NaCl 5% 2% Wzrost w temperaturze 4 o C/22 o C/30 o C/37 o C +/+/+/ /+/+/+ Tolerancja ph Tworzenie przetrwalników Tworzenie indolu Katalaza + + Oksydaza + + Redukcja azotanów + Kwana fosfataza + + β Galaktozydaza + + α Glukozydaza + + Hydroliza elatyny + Hydroliza eskuliny + Hydroliza kazeiny + Ureaza + Cytrynian + Malonian + Octan + + Glukoza + + Ryboza + + Arabinoza + + Fukoza + Ksyloza + + Mannitol + + Maltoza + + Laktoza + + Sacharoza

187 Tabela 9.6 cd. Cecha badana Pseudomonas IN 71 Rhizobium IN 62 Ramnoza + Melibioza Glikogen Inozytol + + Sorbitol + + Salicyna 2-ketoglukonian + 5-ketoglukonian + Kwas dekanowy + + Kwas3-hydroksybenzoesowy + Kwas4-hydroksybenzoesowy + + Kwas 3-hydroksymasłowy + + Kwas itakonowy + Kwas mlekowy + + Kwas propionowy + + Kwas suberynowy Kwas walerianowy + + N-acetyloglukozamina Alanina + + Histydyna + + Prolina + Seryna oznacza efekt pozytywny efekt negatywny Tabela 9.7. Przynaleno gatunkowa szczepów mikroorganizmów wchodzcych w skład biopreparatów G-12-1 i G-12-2 Table 9.7. Species status of microorganisms strains included in G-12-1 and G-12-2 biopreparations Oznaczenie szczepu Identyfikacja metodami klasycznymi Identyfikacja metod sekwencjonowania Biopreparat G-12-1 IN 51 Microccoccus sp. Micrococcus luteus IN 53 IN 60 Mycobacterium sp. Nocardioides sp. Mycobacterium frederiksbergense Rhodococcus erythropolis (dawniej Nocardioides simplex) IN 62 Rhizobium sp. Rhizobium daejeonense IN 66 Rhodococcus sp. Rhodococcus erythropolis IN 71 Pseudomonas sp. Pseudomonas veronii Biopreparat G-12-2 IN 51 Microccoccus sp. Micrococcus luteus IN 53 Mycobacterium sp. Mycobacterium frederiksbergense % identyczno- ci/najbardziej podobna sekwencja w GenBank 99% EU % AF % U % AY % AP % DQ % EU % AF Kategoria bezpieczestwa wg ATCC

188 Tabela 9.7 cd. Oznaczenie szczepu IN 60 Identyfikacja metodami klasycznymi Nocardioides sp. Identyfikacja metod sekwencjonowania Rhodococcus erythropolis (dawniej Nocardioides simplex) IN 62 Rhizobium sp. Rhizobium daejeonense IN 66 Rhodococcus sp. Rhodococcus erythropolis IN 71 Pseudomonas sp. Pseudomonas veronii G 123 Penicillium sp. Penicillium chrysogenum G-124 Phanerochaete sp. Phanerochaete chrysosporium % identyczno- ci/najbardziej podobna sekwencja w GenBank 98% U % AY % AP % DQ % FJ % AF Kategoria bezpieczestwa wg ATCC Rhodococcus erythropholis IN 60 Gordonia terrae IN 79 Mycobacterium fredericksbergense IN 53 Micrococcus luteus IN 51 Mycobacterium hodleri IN 84 Rhodococcus corynebacteriodes IN 87 Fot Rozwój przykładowo wybranych kultur bakteryjnych wchodzcych w skład opracowanych biopreparatów Pict Growth of exemplary bacterial cultures included in created biopreparations biopreparat G

189 Tabela 9.8. Przynaleno gatunkowa szczepów mikroorganizmów wchodzcych w skład biopreparatów G-67-1 i G-67-2 Table 9.8. Species status of microorganisms strains included in G-67-1 and G-67-2 biopreparations Oznaczenie szczepu Identyfikacja metodami klasycznymi Identyfikacja metod sekwencjonowania Biopreparat G-67-1 IN 79 Gordonia sp. Gordonia terrae IN 82 Micrococcus sp. Micrococcus luteus IN 84 Mycobacterium sp. Mycobacterium hodleri IN 87 Nocardia sp. Rhodococcus corynebacterioides (dawniej: Nocardia corynebacterioides) IN 90 Rhodococcus sp.. Rhodococcus erythropolis IN 96 Pseudomonas sp. Pseudomonas fluorescens Biopreparat G-67-2 IN 79 Gordonia sp. Gordonia terrae IN 82 Micrococcus sp. Micrococcus luteus IN 84 Mycobacterium sp. Mycobacterium hodleri IN 87 Nocardia sp. Rhodococcus corynebacterioides (dawniej: Nocardia corynebacterioides) IN 90 Rhodococcus sp. Rhodococcus erythropolis IN 96 Pseudomonas sp. Pseudomonas fluorescens G 672 Trichoderma sp Trichoderma asperellum G 674 Phanerochaete sp. Phanerochaete chrysosporium % identyczno- ci/najbardziej podobna sekwencja w GenBank 99% EU % AJ % X % X % AY % AY % EU % AJ % X % X % AY % AY % EUO % AF Kategoria bezpieczestwa wg ATCC (wg DSMZ) (wg DSMZ) Z kolei szczep oznaczony jako IN 87 i zaklasyfikowany jako rodzaj Nocardia został zidentyfikowany jako Rhodococcus corynebacterioides. W tym wypadku równie nastpiła reklasyfikacja gatunku [Yassin et al., 2005]. Natomiast nie wszystkie mikroorganizmy udało si zidentyfikowa do poziomu gatunku, przy zadawalajcym poziomem identycznoci sekwencji. Te mikroorganizmy nie zostały uwzgldnione w czasie przygotowywania biopreparatów. Dotyczyło do szczególnie bakterii z rodzajów Enterobacter, Klebsiella i Nocardia, gdzie istniało podejrzenie, e mog wród nich znale si mikroorganizmy patogenne. Wród szczepów zaklasyfikowanych do gatunku znalazł si szczep IN 72 Agrobacterium tumefaciens, który posiada specyficzne cechy. Po pierwsze zdolno wykorzystania w

190 glowodorów jak jedynego ródła wgla przez ten gatunek nie była dotychczas dobrze udokumentowana. Po drugie, potrafi (podobnie jak Pseudomonas veronii IN 71 i Pseudomonas fluorescens IN 96) rosn w warunkach beztlenowych, co jest przydatn cech dla procesów bioremediacyjnych in-situ. Najwaniejsz by moe jej cech jest ta, e bakteria ta ta posiada zdolno przkazywania informacji genetycznej za pomoc horyzontalnego transferu genów. co oznacza, e moe przekaza take geny odpowiedzialne za degradacj wglowodorów (które najprawdopodobniej sama nabyła, dostosowujc si do warunków, w których dominowały zanieczyszczenia ropopochodne) do organizmów eukariotycznych. Jednake, zaliczana jest ona do patogenów rolin, wobec czego podjto decyzj o niewłczaniu jej biopreparatu G Sporód zidentyfikowanych mikroorganizmów, które znalazły si w składzie biopreparatów, bakterie Mycobacterium frederiksbergense, Mycobacterium hodleri, Rhizobium daejeonense, Rhodococcus corynebacteroides, Rhodococcus erythropolis i Pseudomonas veroni, Pseudomonas fluorescens, jak równie grzyby: Phanerochaete chrysosporium, Trichoderma asperellum, nie były przyczyn infekcji u ludzi. Natomiast jeli chodzi o pozostałe gatunki, tj. Gordonia terrae, Micrococcus luteus i Penicillum chrysogenum, to take uznawane s one za niepatogenne i oznaczone s wg klasyfikacji stosowanej przez American Type Culture Collection numerem 1 (Biosafety Level-1), co oznacza, e nie s znane przypadki wywoływania chorób u zdrowych, dorosłych ludzi. Ponadto naley zwróci uwag, e w przypadku wszystkich szczepów nalecych do omawianych gatunków charakterystyczn cech był brak wzrostu w temperaturze 37 o C, czyli w temperaturze ciała ludzkiego. Najwysza temperatura, przy której zaobserwowano wzrost wynosiła dla 33 o C dla Penicillum chrysogenum G 123, oraz 35 o C dla Micrococcus luteus IN 51 i IN 82, jak równie Gordonia terrae IN 79. Natomiast szczepy te były aktywne metabolicznie w 4 o C. Tak wic omawiane szczepy nie stanowiły zagroenia dla zdrowia ludzkiego. Naley zreszt zwróci uwag, e wród szczepów bakteryjnych wykorzystanych do przygotowania biopreparatów take, kilka innych szczepów charakteryzowało si wzrostem w temperaturze 4 o C, co sugeruje przystosowanie do warunków rodowiskowych. Kady biopreparat wykonano w 2 postaciach, zawierajcy tylko bakterie oraz zawierajcy bakterie i grzyby (dół urobkowy Graby-12 tab. 9.7, dół urobkowy Graby-67 tab. 9.8). Podstawowym celem bada optymalizacyjnych było zbadanie, czy składy biopreparatów nie 193

191 ulegn zmianie. Mikroorganizmy wchodz ze sob w róne interakcje, wydzielajc róne substancje, hamujce wzrost potencjalnych konkurentów. Wstpne dowiadczenia przeprowadzone na podłou mineralnym w obecnoci ropy naftowej jako jedynego ródła wgla wykazały, e mikroorganizmy majc tak złoony układ jak ropa naftowa nie konkuruj ze sob i nie nastpuje dominacja jednych gatunków. Co wicej, niektóre wykazuj pewien rodzaj synergizmu, np. wzrost Rhizobium i Mycobacterium odbywał si szybciej, gdy szczepy rosły wspólnie, ni gdy rosły osobno. Jednak, ze wzgldu na konieczno wyeliminowania ropy naftowej na etapie produkcji biopreparatów, naleało przeprowadzi dowiadczenia z uyciem innych ródeł wgla. Biopreparat mona przygotowa na bazie mineralnej, bd organicznej. Zalet pierwszego sposobu jest niszy koszt, natomiast zalet drugiego moliwo dłuszego utrzymywania rozwoju mikroorganizmów w fazie stacjonarnej. Dobre wyniki uzyskuje si stosujc standardowy bulion wzbogacony, jednak jego koszt jest zbyt wysoki dla warunków produkcyjnych. Wykazano, e stosowanie bulionu wzbogaconego nie wpływa znaczco na zmniejszenie rónorodnoci biopreparatu pod warunkiem, e w podłou obecny jest równie octan sodu (który zastpuje wglowodór). Jednak koszt bulionu jest zbyt wysoki. Zbadano wic moliwoci stosowania szeregu substancji organicznych w rozmaitych steniach, dc równoczenie do minimalizacji stosowanych ste. Niekorzystny wpływ ma glukoza, której dodatek wpływa najprawdopodobniej na zbyt szybki rozwój niektórych kultur kosztem innych. Nie nastpuje natomiast utrata zdolnoci wykorzystywania wglowodorów jako jedynego ródła wgla, co sugerowali niektórzy autorzy. Co wicej nie nastpuje opónienie tworzenia błonki bakteryjnej, po przeniesieniu na podłoe z wglowodorem w porównaniu do mikroorganizmów hodowanych w warunkach kontrolnych tj. na podłou mineralnym. Badajc rozmaite kombinacje okazało si, e najkorzystniejsze połczenie stanowi połczenie octanu i peptonu w poywce wzrostowej buforowanej fosforanami potasu. Ta kombinacja pozwala na szybkie wykorzystanie octanu jako ródła wgla, a peptonu jako ródła azotu, a nastpnie po wyczerpaniu octanu tylko peptonu jako ródła zarówno wgla, jak i azotu. Buforowanie poywki fosforanami okazało si korzystne, poniewa aczkolwiek pepton sam posiada własnoci buforujce, to w momencie pojawiania si w roztworze wolnych aminokwasów i stopniowego zwikszania stenia jonów HCO 3, mog nastpowa niepodane skoki ph, co mimo tolerowania przez mikroorganizmy zakresu kilku jednostek z reguły nie wpływa dobrze na wzajemne oddziaływania pomidzy poszczególnymi szczepami. Efektem buforowania fosforanami jest dłusze pozostawanie mikroorganizmów w fazie stacjonarnej, 194

192 a wic tej, w której ich liczba jest najwiksza przy maksymalnej aktywnoci metabolicznej. Wyniki bada przykładowo zilustrowano dla biopreparatu G-12-1 na rys 9.6, przy czym w celu lepszej przejrzystoci przedstawiono tylko cztery z kilkunastu stosowanych kombinacji. Mikroorganizmy hodowane na podłou buforowanym fosforanami i zawierajcym octan oraz pepton pozostawały w fazie stacjonarnej przez około 18 dni, co jest czasem wystarczajco długim, gdyby zachodziła konieczno opónienia aplikacji biopreparatu z niezalenych przyczyn. Wykonano równie wstpne badania wpływu niskich temperatur na aktywno biopreparatu. Biopreparat po namnoeniu do optymalnej gstoci przenoszono do temperatury 4 o C i w okrelonych odstpach czasu przenoszono do temperatury 30 o C badajc liczb mikroorganizmów oraz ich aktywno metaboliczn. Obnienie temperatury nie wpłynło na liczb mikroorganizmów, natomiast zdecydowanie wydłua si czas, jaki jest wymagany do osignicia przez mikroorganizmy pełnej aktywnoci metabolicznej (rys. 9.7). Jak wida z przedstawionych wyników dla biopreparatu G-12-1, ju 72 godz. przebywanie mikroorganizmów w temperaturze 4 o C powoduje drastyczny spadek ich aktywnoci oraz istotnie wydłua czas wymagany do jej przywrócenia. Ma to znaczenie, jeli chodzi o zdolno działania mikroorganizmów in-situ. Rys Badanie wpływu substancji wzrostowych na zmiany całkowitej liczby mikroorganizmów wchodzcych w skład biopreparatu G-12-1 Fig Influence of growth substances on alternation in total number of microorganisms from G-12-1 biopreparation Zbyt wczesna aplikacja biopreparatu bdzie oznaczała spowolnienie jego działania, wynikajce nie tylko z samego faktu wystpienia niskich temperatur, ale równie adaptacji mikroorganizmów. Zbyt póna aplikacja (np. w jesieni, gdy pojawi si pierwsze przygruntowe przymrozki) moe mie jeszcze gorsze skutki i w kracowym przypadku, mimo dobrych 195

193 warunków pogodowych, mikroorganizmy mog nie osign wymaganej aktywnoci. Dlatego niesłychanie istotne jest, aby wszystkie prace przygotowawcze na obiekcie wykonywa na tyle wczenie, aby mikroorganizmy mogły działa w optymalnych warunkach temperaturowych, a jednoczenie termin realizacji prac powinien by dostosowany do warunków klimatycznych, aby maksymalnie wykorzysta wysokie temperatury w okresie letnim. 100% aktywno mikroorganizmów (% kontroli) 80% 60% 40% 20% 0% czas [dni] 24 godz. 48 godz. 72 godz. 96 godz. Rys Wpływ niskiej temperatury (4 o C) na aktywno metaboliczn mikroorganizmów wchodzcych w skład biopreparatu G-12-1 Fig Influence of low temperature (4 o C) on metabolic activeness of microorganisms from G-12-1 biopreparation Rozpoznanie zanieczyszcze ropopochodnych (TPH) w zestarzałych odpadach z dołów urobkowych Graby-67 i Graby-12, majcych wpływ na przebieg procesu biodegradacji, przeprowadzono na podstawie analiz chromatograficznych, mikrobiologicznych i chemicznych, wykorzystujcych najnowoczeniejsze techniki instrumentalne. Pozwoliło to na opracowanie technologii obejmujcej nastpujce etapy oczyszczania zestarzałego odpadu z terenu dołów urobkowych: modyfikacj struktury gleby, bioremediacj podstawow oraz inokulacj biopreparatami na bazie mikroorganizmów autochtonicznych i grzybów. Badania kolejnych etapów oczyszczania z zanieczyszcze ropopochodnych gleby i ziemi z dołów urobkowych Graby-67 (obszar CR) i Graby-12 (obszar III) prowadzono na próbkach po uprzedniej modyfikacji struktury gleby, poprzez zmieszanie z czyst ziemi w proporcjach ustalonych na podstawie bada laboratoryjnych (Graby-67 10:1, Graby-12 25:1). 196

194 Proces bioremediacji stymulowano poprzez napowietrzanie pryzmy oraz wzbogacanie rodowiska gruntowego w składniki biogenne w ilociach ustalonych w badaniach laboratoryjnych (Graby-67 C:N:P = 100:3:1; Graby-12 C:N:P = 100:4:1), przy zachowaniu optymalnego odczynu gleby na poziomie ph = 7,5 7,7, wilgotnoci 14 20% i temperaturze wewntrz pryzmy wynoszcej 20 o C. Próbki do bada pobierano w trakcie realizowanego procesu oczyszczania w tygodniowych odstpach, w iloci N = 10. Próbki nastpnie ujednolicano i poddawano analizom. Tabela 9.9. Opis oznacze próbek Table 9.9. List of samples notation Oznaczenie próbki Pr G-67 Pr G-67 BrP G-67-1 G-67-2 PrI G-67-1 PrII G-67-1 PrII G-67-2 Pr G-12 Pr G-12BrP G-12-1 G-12-2 PrI G-12-1 PrII G-12-1 PrII G-12-2 Opis Próbka gleby z dołu Graby-67 po remediacji wstpnej Próbka po bioremediacji podstawowej gleby z dołu Graby-67 Biopreparat na bazie bakterii autochtonicznych pochodzcych z dołu urobkowego Graby-67 Biopreparat na bazie bakterii autochtonicznych wzbogacony o grzyby pochodzce z dołu urobkowego Graby-67 Próbka po inokulacji biopreparatem G-67-1 jedna seria inokulacji Próbka po inokulacji biopreparatem G-67-1 dwie serie inokulacji Próbka po inokulacji biopreparatem G-67-1 pierwsza seria i biopreparatem G-67-2 druga seria Próbka gleby z dołu Graby-12 po remediacji wstpnej Próbka po bioremediacji podstawowej gleby z dołu Graby-12 Biopreparat na bazie bakterii autochtonicznych pochodzcych z dołu urobkowego Graby-12 Biopreparat na bazie bakterii autochtonicznych wzbogacony o grzyby pochodzce z dołu urobkowego Graby-12 Próbka po inokulacji biopreparatem G-12-1 jedna seria inokulacji Próbka po inokulacji biopreparatem G-12-1 dwie serie inokulacji Próbka po inokulacji biopreparatem G-12-1 pierwsza seria i biopreparatem G-12-2 druga seria Bioremediacja podstawowa polegajca jedynie na uaktywnieniu naturalnej mikroflory skaonego terenu umoliwiła obnienie zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych (TPH) na obszarze CR dołu urobkowego Graby-67 z do mg/kg s.m. Stopie obnienia zawartoci TPH w toku prowadzonej w warunkach laboratoryjnych bioremediacji podstawowej kształtował si nastpujco: po 4 tygodniach 19,9%, po 10 tygodniach 40,6%, po 18 tygodniach 53,9% (tempo bioremediacji uległo zmniejszeniu i utrzymywało si na zblionym poziomie). Ponadto stwierdzono obnienie zawartoci BTEX o 20,5%, WWA o 18,9% oraz fenoli o 30,8% (tab. 9.10). Na podstawie przeprowadzonego monitoringu mikrobiologicznego mona stwierdzi, e nastpił wzrost aktywnoci biologicznej oczyszczanej gleby i ziemi z dołu urobkowego Graby-67, wyraony wzrostem aktywnoci dehydrogenazowej z poziomu 14,5 do 51,8 g 197

195 TF/g s.m./24 h, który korelował ze wzrostem całkowitej liczby bakterii. Zanotowano w pocztkowym okresie prowadzenia procesu bioremediacji podstawowej (8 tygodni) zwikszenie liczebnoci bakterii degradujcych wglowodory z 1,8*10 5 do 7,9*10 5 jtk/g s.m. (rys. 9.8) oraz nieznaczny wzrost liczby grzybów (tab. 9.10). Tabela Zestawienie wyników analiz chemicznych i mikrobiologicznych wykonanych podczas prowadzenia procesu bioremediacji podstawowej gleby z dołu urobkowego Graby-67 po wstpnej remediacji (badania laboratoryjne metoda ex-situ) Table Results of chemical and microbiological analyses led during initial bioremediation of soil from Graby-67 waste pit after initial remediation (laboratory tests, ex-situ method) Oznaczenie Jednostka PrG-67 Czas trwania procesu bioremediacji podstawowej gleby i ziemi z dołu urobkowego Graby-67 2 tyg. 4 tyg. 6 tyg. 10 tyg. 14 tyg. 18 tyg. Odczyn ph 6,21 7,22 7,31 7,35 7,50 7,58 7,70 Wilgotno % 14,5 14,1 15,5 14,5 14,3 14,2 15,8 TPH mg/kg s.m ±4125 ±3578 ±3278 ±2814 ±2487 ±2045 ±1947 BTEX mg/kg s.m. 39,8 38,2 36,4 33,7 32,5 31,9 31,7 ±4,4 ±4,1 ±4,0 ±3,5 ±3,2 ±3,1 ±2,9 WWA mg/kg s.m. 1,124 1,101 1,072 0,990 0,940 0,921 0,911 ±0,198 ±0,189 ±0,193 ±0,162 ±0,152 ±0,143 ±0,132 Fenole mg/kg s.m. 6,8 6,2 5,8 5,5 4,9 4,8 4,7 Aktywno dehydrogenazowa Całkowita liczba bakterii gtf/g s.m./24h 14,5 29,5 32,5 47,5 49,5 51,0 51,8 jtk/g.s.m. 2,1*10 6 2,8*10 6 5,2*10 6 6,2*10 6 8,9*10 6 9,9*10 6 1,0*10 7 Grzyby jtk/ g.s.m. 4,1*10 2 4,9*10 2 5,3*10 2 5,9*10 2 6,6*10 2 7,4*10 2 7,7*10 2 Prowadzona bioremediacji podstawowa gleby i ziemi z dołu urobkowego Graby-12 (obszar III) w warunkach laboratoryjnych umoliwiła obnienie zawartoci TPH z do mg/kg s.m. Dynamika przebiegu biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych była porównywalna do zanotowanej dla dołu urobkowego Graby-67 i kształtowała si nastpujco: po 4 tygodniu prowadzenia procesu nastpiło obnienie zawartoci TPH o 18,1%, po 10 tygodniach o 34,5%, po 18 tygodniach o 52,6%. Odnotowano take obnienie zawartoci BTEX o 20,8%, WWA o 15,4% oraz fenoli o 33,0% (tab. 9.11). Monitoring mikrobiologiczny prowadzony przez czas trwania procesu bioremediacji podstawowej odpadu z dołu urobkowego Graby-12 wskazuje, e wzrost aktywnoci dehydrogenazowej (z poziomu 12,5 do 50,5 g TF/g s.m./24 h) jest porównywalny z wynikami uzyskanymi podczas bioremediacji odpadu z dołu urobkowego Graby-67. Podobn wzrostow tendencj zaobserwowano dla grzybów. Jedynie wzrost liczby bakterii degradujcych wglo- 198

196 wodory ropopochodne do poziomu 4,5*10 5 jtk/g s.m. w przypadku odpadu z dołu urobkowego Graby-12 jest nieco niszy ni w przypadku odpadu z dołu Graby-67, który kształtuje si na poziomie 7,8*10 5 jtk/g s.m (rys. 9.8) liczebno bakterii degradujcych wglowodory [jtk/g s.m.] czas [tygodnie] Pr G-67-BrP Pr G-12 BrP Kontrola Rys Liczebno bakterii degradujcych wglowodory podczas oczyszczania gleby i ziemi z dołów urobkowych Graby-67 i Graby-12 w trakcie bioremediacji podstawowej Fig Number of bacteria degrading hydrocarbons during purification of soil from Graby-67 and Graby-12 waste pits basic bioremediation Tabela Zestawienie wyników analiz chemicznych i mikrobiologicznych wykonanych podczas prowadzenia procesu bioremediacji podstawowej gleby z dołu urobkowego Graby-12 po wstpnej remediacji (badania laboratoryjne metoda ex-situ) Table Results of chemical and microbiological analyses led during initial bioremediation of soil from Graby-12 waste pit after initial remediation (laboratory tests, ex-situ method) Oznaczenie Jednostka PrG-12 Czas trwania procesu bioremediacji podstawowej gleby i ziemi z dołu urobkowego Graby-12 2 tyg. 4 tyg. 6 tyg. 10 tyg. 14 tyg. 18 tyg. Odczyn ph 6,09 7,12 7,22 7,32 7,51 7,64 7,71 Wilgotno % 14,5 14,1 15,5 14,5 14,3 14,2 15,8 TPH mg/kg s.m ±3248 BTEX mg/kg s.m. 23,4 ±2,2 WWA mg/kg s.m. 1,478 ±0, ± ± ± ± ± ± ,0 22,1 21,3 20,4 19,9 18,5 ±2,1 ±2,0 ±1,9 ±1,8 ±1,7 ±1,7 1,421 1,389 1,358 1,304 1,284 1,247 ±0,204 ±0,197 ±0,210 ±0,187 ±0,198 ±0,175 Fenole mg/kg s.m. 6,9 6,2 6,0 5,8 5,2 4,8 4,6 Aktywno dehydrogenazowa Całkowita liczba bakterii gtf/g s.m./24h 12,5 19,4 25,2 32,5 42,2 49,8 50,5 jtk/g.s.m. 1,8*10 6 2,2*10 6 2,9*10 6 3,5*10 6 4,5*10 6 5,7*10 6 7,1*10 6 Grzyby jtk/ g.s.m. 3,9*10 2 4,2*10 2 4,6*10 2 4,9*10 2 5,5*10 2 6,5*10 2 7,6*

197 Przeprowadzenie zabiegu bioremediacji podstawowej umoliwiło obnienie zawarto- ci zanieczyszcze ropopochodnych do poziomu, przy którym zabieg inokulacji biopreparatami opracowanymi na bazie mikroorganizmów autochtonicznych przebiegał z wysz efektywnoci [Steliga et al., 2004; Steliga et al., 2006b; Steliga, 2008; Steliga et al., 2009]. Kolejny etap oczyszczania inokulacj prowadzono równolegle na dwóch pryzmach uformowanych z odpadów z danego dołu urobkowego, stosujc nastpujce biopreparaty: I pryzma biopreparat na bazie mikroorganizmów autochtonicznych (pierwsza seria inokulacji), a nastpnie biopreparat z mikroorganizmów autochtonicznych wzbogacony o grzyby (druga seria inokulacji). II pryzma inokulacja biopreparatem na bazie mikroorganizmów autochtonicznych dwie serie inokulacji. W wyniku przeprowadzonej inokulacji biopreparatem G-67-1 (I seria) w okresie 9 tygodni uzyskano obnienie zawartoci TPH z poziomu do 5689 mg/kg s.m. (odpad z dołu urobkowego Graby-67). Stopie obnienia TPH w toku procesu inokulacji biopreparatem G-67-1 (I seria) przedstawiał si nastpujco: po 1 tygodniu 9,2%, po 2 tygodniach 10,7%, po 3 tygodniach 31,4%, po 6 tygodniach 67,2%, po 9 tygodniach 81,2%. Odnotowano znaczne obnienie zawartoci BTEX (o 36,7%), WWA (o 31,9%) i fenoli (o 42,5%) (tab. 9.12). Monitoring mikrobiologiczny umoliwił przedstawienie krzywych obrazujcych kształtowanie si liczebnoci mikroorganizmów degradujcych wglowodory ropopochodne w trakcie prowadzenia procesu inokulacji biopreparatem G-67-1 (I seria). Na podstawie przebiegu wyznaczonych krzywych mona stwierdzi, e w pocztkowym okresie zanotowano powolny wzrost liczby bakterii (w okresie 14 dni nastpiło wrcz zahamowanie wzrostu), a nastpnie widoczny jest wyrany wzrost populacji bakterii, przy czym maksimum liczebno- ci bakterii wystpuje po około 6 tygodniach trwania procesu (rys. 9.9). W nastpnych tygodniach (7-9 tydzie) liczba bakterii degradujcych wglowodory ropopochodne kształtuje si na zblionym poziomie. Mona sdzi, e zasiedlenie oczyszczanego ekosystemu gleby z obszaru CR dołu urobkowego Graby-67 dodatkow porcj bakterii autochtonicznych, wprowadzonych wraz stosowanym do inokulacji biopreparatem G-67-1, spowodowało zaostrzenie konkurencji i antagonizmów pomidzy bakteriami rozwijajcymi si naturalnie w rodowisku glebowym oraz wpompowanie w tych warunkach grupy bakterii lepiej przystosowanych do zanieczyszczonego rodowiska [Zabłocka-Golewska et al., 2003]. 200

198 W wyniku przeprowadzonego procesu inokulacji biopreparatem G-67-1 liczba bakterii degradujcych wglowodory wzrosła do poziomu 3,8*10 6 jtk/g s.m., a zmiany ich liczebnoci w toku procesu były skorelowane z tempem obniania si zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych (tab. 9.12, rys. 9.9). Odnotowany wzrost aktywnoci dehydrogenazowej do poziomu 73,3 g TF/g s.m./24 h równie koreluje z ubytkiem zanieczyszcze ropopochodnych w oczyszczanym odpadzie z dołu urobkowego Graby-67 (tab. 9.12). W prowadzonym eksperymencie liczba grzybów uległa widocznemu wzrostowi do poziomu 3,5*10 3 jtk/g s.m. (tab. 9.11) liczebno bakterii degradujcych wglowodory [jtk/g s.m.] czas [tygodnie] Pr I G-67-1 Pr I G-12-1 kontrola Rys Porównanie liczebno bakterii degradujcych wglowodory podczas inokulacji gleby i ziemi z dołów urobkowych: Graby-67 biopreparatem G-67-1 i Graby-12 biopreparatem G-12-1 Fig Comparison in number of degrading hydrocarbon bacteria during inoculation of soil from waste pits: Graby-67 (G-67-1 biopreparation) and Graby-12 (G-12-1 biopreparation) Prowadzenie procesu inokulacji tylko biopreparatem G-67-1 (II seria) nie przyniosło zadowalajcych efektów uzyskano obnienie TPH z poziomu 5689 do 2305 mg/kg s.m., co nie spełnia wymaga okrelonych w standardach jakoci gleby i ziemi. Natomiast, zastosowanie drugiej serii inokulacji biopreparatu na bazie mikroorganizmów autochtonicznych, wzbogaconego o wytypowane gatunki grzybów (G-67-2), przyczyniło si do dalszego obnienia zawartoci TPH z poziomu 5686 do 1002 mg/kg s.m. W trakcie II serii w pocztkowym okresie tempo biodegradacji TPH było wysokie (po 2 tygodniach odnotowano spadek zawartoci wglowodorów o 30,7%, po 5 tygodniach o 73,3%), a w nastpnych tygodniach szybko biodegradacji zmniejszyła si i widoczne było nieznaczne obnienie zawartoci TPH o 81,3%. Inokulacja biopreparatem G-67-2 pozwoliła nie tylko na obnienie zawartoci TPH do niskiego pułapu, ale równie na uzyskanie znacznie wyszego 201

199 stopnia redukcji w porównaniu z I seri inokulacja biopreparatem na bazie bakterii autochtonicznych, zawartoci BTEX (o 69,5%), WWA (o 53,7%) i fenoli (o 68,8%), co przedstawiono w tabeli Liczebno bakterii degradujcych wglowodory ropopochodne wzrosła do poziomu 1,6*10 7 jtk/g s.m., przy czym maksimum wzrostu przypada na 5 tydzie realizacji eksperymentu, co koreluje si z obnieniem zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych. Ponadto na podstawie monitoringu mikrobiologicznego mona stwierdzi, e proces adaptacyjny wprowadzanych w postaci biopreparatu G-67-2 mikroorganizmów (bakterii i grzybów) był zadawalajcy (rys. 9.10). Wzrost aktywnoci dehydrogenazowej (w kocowej fazie procesu wynoszcej 105,8 g TF/g s.m./24 h) wiadczy o wzrocie aktywnoci biologicznej oczyszczanej gleby z dołu urobkowego Graby-67 (tab. 9.12) liczebno bakterii degradujcych wglowodory [jtk/g s.m.] czas [tygodnie] Pr II G-67-2 Pr II G-12-2 kontrola Rys Porównanie liczebno bakterii degradujcych wglowodory podczas inokulacji gleby i ziemi z dołów urobkowych: Graby-67 biopreparatem G-67-2 i Graby-12 biopreparatem G-12-2 Fig Comparison in number of degrading hydrocarbon bacteria during inoculation of soil from waste pits: Graby-67 (G-67-2 biopreparation) and Graby-12 (G-12-2 biopreparation) Porównujc wyniki analiz aktywnoci celulazowej, mona stwierdzi, e nastpił jej znaczny wzrost po przeprowadzeniu II serii inokulacji biopreparatem G-67-2 oczyszczanego odpadu dołu urobkowego Graby-67 (tab. 9.12). Analiza tego parametru pozwala na oszacowanie, czy nastpuje proces prawidłowego rozwoju grzybów w oczyszczanej glebie, jako e za rozkład celulozy w warunkach glebowych odpowiedzialne s grzyby. Jak wida obecno grzybów w biopreparacie G-67-2 bezporednio przekłada si na wzrost aktywnoci celulazowej, czyli na prawidłowy proces adaptacyjny grzybów do rodowiska glebowego oraz postpujcy proces oczyszczania gleby. Podobn tendencj zanotowano w trakcie inokulacji biopreparatem G-12-2 odpadu z dołu urobkowego Graby-12 (tab ). 202

200 Tabela Zestawienie wyników analiz chemicznych i mikrobiologicznych wykonywanych podczas prowadzenia procesu inokulacji biopreparatem G-67-1 (I seria) i biopreparatem G-67-2 (II seria) badania laboratoryjne metod ex-situ Table Results of chemical and microbiological analyses led during inoculation with G-67-1 biopreparation (1 st series) and G-67-2 biopreparation (2 nd series) of soil from Graby-67 waste pit (laboratory tests, ex-situ method) 203

201 Tabela Zestawienie wyników analiz chemicznych i mikrobiologicznych wykonywanych podczas prowadzenia procesu inokulacji biopreparatem G-12-1 (I seria) i biopreparatem G-12-2 (II seria) badania laboratoryjne metod ex-situ Table Results of chemical and microbiological analyses led during inoculation G-12-1 biopreparation (1 st series) and G-12-2 biopreparation (2 nd series) of soil from Graby-12 waste pit (laboratory tests, ex-situ method) 204

202 Proces inokulacji odpadu z dołu urobkowego Graby-12 (obszar III) w warunkach laboratoryjnych biopreparatem G-12-1 (I seria) przyczynił si w cigu 9 tygodni do obnienia zawartoci TPH z do 4850 g/kg s.m. Dynamika biodegradacji TPH kształtowała si nastpujco: po 2 tygodniach procesu uzyskano redukcj zawartoci TPH o 23,9%, po 3 tygodniach o 41,8%, po 6 tygodniach o 67,2%, a nastpnie proces uległ zahamowaniu i w kocowej fazie oczyszczania osignito redukcj zawartoci zanieczyszcze o 71,2% (tab ). Porównujc przedstawione dane z przebiegu procesu biodegradacji TPH w odpadzie z dołu urobkowego Graby-12 mona wnioskowa, e w pocztkowej fazie szybko biodegradacji była wysza ni w przypadku dołu Graby-67, co moe by zwizane z lepsz adaptacj wprowadzanych bakterii autochtonicznych w postaci biopreparatu G W I serii inokulacji biopreparatem G-12-1 odpadu z dołu urobkowego Graby-12 uzyskano zbliony efekt redukcji zawartoci BTEX (o 36,7%), WWA (o 28,8%) i fenoli (o 43,7%), jak w przypadku inokulacji biopreparatem G-67-1 odpadu z dołu urobkowego Graby-67 (tab. 9.13). Przebieg krzywych obrazujcych kształtowanie si liczebnoci bakterii degradujcych wglowodory ropopochodne dowodzi lepszej adaptacji bakterii wprowadzanych w postaci zawiesiny (biopreparat G-12-1) do odpadu z dołu urobkowego Graby-12. Obserwowano stopniowy wzrost liczebnoci bakterii do maksimum uzyskanym w szóstym tygodniu realizacji eksperymentu (3,0*10 6 jtk/g s.m.). W nastpnych tygodniach stwierdzono nieznaczny ich spadek (rys. 9.9). Liczebno bakterii rozkładajcych wglowodory ropopochodne koreluje z ubytkiem zawartoci TPH i wzrostem aktywnoci dehydrogenazowej (tab. 9.13). Analizy mikrobiologiczne wykazuj stopniowy wzrost liczby grzybów do poziomu 3,5*10 3 jtk/g s.m. (rys. 9.11). Inokulacja biopreparatem G-12-2 (II seria) umoliwiła dalsze obnienie zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych do dopuszczalnych wartoci okrelonych przez standardy glebowe, czyli z poziomu 4890 do 1003 mg/kg s.m. Obnienie zawartoci TPH w trakcie 9 tygodni realizacji inokulacji biopreparatem G-12-2 (II seria) kształtowało si na nastpujcym poziomie: po 2 tygodniach obnienie zawartoci o 30,2%, po 3 tygodniach o 41,8%, po 4 tygodniach o 60,8%, po 9 tygodniach o 83,3 %. Widoczne obnienie zawartoci BTEX do poziomu 5 mg/kg s.m. (57,5% redukcji zawartoci wyjciowej), WWA obnienie o 59,9%, fenoli o 80,7% jest efektem zastosowania do inokulacji biopreparatu G Analizy mikrobiologiczne wykazuj znaczny wzrost całkowitej liczby bakterii (do 3,8*10 8 jtk/g s.m.) oraz grzybów (do 2,3*10 4 jtk/g s.m.), dane zamieszczono w tabeli 9.13 i na rysunku

203 Krzywe obrazujce przebieg wzrostu liczebnoci bakterii degradujcych wglowodory ropopochodne wskazuj, e w pocztkowym okresie realizacji inokulacji widoczny jest znaczny ich wzrost, przy czym maksimum (1,5*10 7 jtk/g s.m.) przypada na 4 tydzie prowadzenia procesu, a nastpnie odnotowano nieznaczne obnienie ich liczebnoci, co równie koreluje z szybko- ci ubytku zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych (tab. 9.13, rys. 9.10) liczebno grzybów [jtk/g s.m.] czas [tygodnie] Pr I G-67-1 Pr I G-12-1 kontrola Rys Porównanie liczebnoci grzybów podczas inokulacji gleby i ziemi z dołów urobkowych: Graby-67 biopreparatem G-67-1 i Graby-12 biopreparatem G-12-1 Fig Comparison in number of fungi during inoculation of soil from waste pits: Graby-67 (G-67-1 biopreparation) and Graby-12 (G-12-1 biopreparation) liczebno grzybów [jtk/g s.m.] Pr II G-67-2 Pr II G-12-2 Kontrola czas [tygodnie] Rys Porównanie liczebnoci grzybów podczas inokulacji gleby i ziemi z dołów urobkowych: Graby-67 biopreparatem (G-67-2) i Graby-12 biopreparatem (G-12-2) Fig Comparison in number of fungi during inoculation of soil from waste pits: Graby-67 (G-67-2 biopreparation) and Graby-12 (G-12-2 biopreparation) 206

204 Porównujc przeprowadzone badania monitoringowe poszczególnych etapów oczyszczania odpadów z dołów urobkowych Graby-67 i Graby-12 w warunkach laboratoryjnych (metoda ex-situ), mona stwierdzi, e osignito zakładane cele. Modyfikacja biopreparatu na bazie bakterii autochtonicznych o wytypowane gatunki grzybów pozwoliła na zwikszenie efektywnoci procesu biodegradacji BTEX, WWA, fenoli oraz całkowitej zawartoci wglowodorów ropopochodnych (TPH) do wymaganego niskiego poziomu. Wzrost aktywnoci dehydrogenazowej koreluje ze wzrostem całkowitej liczby mikroorganizmów, co dowodzi zwikszenia si aktywnoci biologicznej oczyszczanej gleby i ziemi z testowanych dołów urobkowych. Wprowadzenie etapowego procesu oczyszczania odpadów zdeponowanych w dołach urobkowych z zastarzałych zanieczyszcze ropopochodnych umoliwia stopniowe obnienie ich zawartoci i osignicie dopuszczalnych wartoci okrelonych przez standardy jakoci gleby i ziemi (zgodnie z wymaganiami zawartymi w projekcie rekultywacyjnym). Opracowana metodyka chromatograficznego oznaczania zanieczyszcze ropopochodnych w zastarzałych odpadach wiertniczych umoliwia zidentyfikowanie poszczególnych n-alkanów wchodzcych w skład zanieczyszcze, co pozwala na ocen ich biodegradacji w toku poszczególnych etapów oczyszczania. Ponadto identyfikacja wglowodorów z grupy izoprenoidów (Pr i F), nalecych do zwizków trudno biodegradowalnych, przyczyniła si do przedstawienia stopnia biodegradacji wglowodorów ropopochodnych (n-alkanów) w postaci zmian wartoci wskaników n-c 17 /Pr i n-c 18 /F. Wyniki analiz chromatograficznych pozwalaj na stwierdzenie, e podczas bioremediacji podstawowej odpadu/gleby i ziemi z dołu urobkowego Graby-67 (Pr G-67 BrP), najwyszy stopie biodegradacji zanotowano dla wglowodorów szeregu alifatycznego n-c 9 n-c 17 w granicach: 61,7 65,4%, natomiast dla wglowodorów z zakresu n-c 18 n-c 22 był on nieznacznie niszy i miecił si w przedziale: 48,2 56,2%. Wglowodory cisze, o długoci łacucha wglowego n-c 23 n-c 36, ulegały rozkładowi w znacznie niszym stopniu, gdy obnienie ich zawartoci w wyniku przeprowadzonego procesu bioremediacji podstawowej wyniosło: 13,3 21,7% (rys. 9.13). Redukcja zawartoci wglowodorów niezidentyfikowanych (alkeny, izoparafiny, cykloparafiny itp.) kształtowała si na poziomie 31,2%. 207

205 O zadowalajcej efektywnoci przebiegu procesu biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych podczas etapu bioremediacji podstawowej wiadcz wskaniki stopnia biodegradacji n-c 17 /Pr i n-c 18 /F, które uległy znacznemu zmniejszeniu (tab. 9.14): n-c 17 /Pr obnienie z 12,066 do 5,237 n-c 18 /F obnienie z 5,490 do 2,201. Tabela Porównanie wskaników stopnia biodegradacji n-alkanów n-c 17 /Pr i n-c 18 /F w glebie i ziemi z dołów urobkowych Graby-67 i Graby-12 po kolejnych etapach oczyszczania metod ex-situ Table Comparison in indicators of n-alkane biodegradation degree (n-c 17 /Pr nad n-c 18 /F) after purification stages (soil from Graby-67 and Graby-12 waste pits, ex-situ method) Wskanik biodegradacji n-c 17 /Pr n-c 18 /F Wskanik biodegradacji n-c 17 /Pr n-c 18 /F Graby-67 Pr G-67 Pr G-67 BrP Pr I G-67/1 Pr I G-67/2 Pr II G-67/2 12,066 ± 0,847 5,490 ± 457 5,237 ± 0,321 2,201 ± 0,096 Graby-12 0,764 ± 0,498 0,413 ± 0,189 0,221 ± 0,124 0,213 ± 0,089 0,044 ± 0,003 0,033 ±0,002 Pr G-12 Pr G-12 BrP Pr I G-12/1 Pr I G-12/2 Pr II G-12/2 10,539 ± 0,745 11,561 ± 0,801 4,083 ± 0,302 3,772 ± 0,287 0,543 ± 0,325 1,063 ± 0,098 0,236 ± 0,189 0,299 ± 0,204 0,043 ± 0,003 0,064 ±0,005 Wyniki analiz chromatograficznych wykazały, e podczas inokulacji prowadzonej w okresie 9 tygodni biopreparatem G-67-1 (jedna seria) najszybciej zachodzi biodegradacja wglowodorów alifatycznych o długoci łacucha wglowego n-c 8 n-c 18 na poziomie: 77,1 85,3%. Wglowodory z zakresu n-c 19 n-c 30 równie ulegaj biodegradacji w zadowalajcym stopniu, w granicach: 55,8 65,4%. Wglowodory zawierajce powyej 30 atomów wgla w czsteczce, które nale do zwizków trudno biodegradowalnych, ulegaj rozkładowi na niszym poziomie od 39,2% do 48,2% (rys i rys. 9.14). Zawarto wglowodorów niezidentyfikowanych uległa obnieniu o 58,9%. Etap oczyszczania realizowany z wykorzystaniem biopreparatu G-67-1, prowadzony w warunkach laboratoryjnych w dwóch seriach przez okres 18 tygodni, umoliwił znaczne obnienie zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych, ale nie osignito dopuszczalnych wartoci zanieczyszcze ropopochodnych okrelonych przez standardy jakoci gleby i ziemi dla grupy B, zgodnie z wytycznymi zawartymi w projekcie rekultywacyjnym. Wyniki analiz chromatograficznych wykazały, e biodegradacja wglowodorów alifatycznych o długoci łacucha wglowego n-c 8 n-c 18 wzrosła do poziomu: 85,2 91,2%, natomiast weglowodory cisze (n-c 19 n-c 36 ) uległy redukcji w granicach: 64,4 76,1% (rys ). 208

206 zawarto n-alkanów [mg/kg s.m.] n-c6 n-c7 n-c8 n-c9 n-c10 n-c11 n-c12 n-c13 n-c14 n-c15 n-c16 n-c17 Pr n-c18 F n-c19 n-c20 n-c21 n-c22 n-c23 n-c24 n-c25 n-c26 n-c28 n-c30 hopan n-c32 n-c34 n-c36 Pr G-67 - Próbka po remediacji wstpnej Pr G-67 BrP - Próbka po bioremediacji podstawowej Pr I G Próbka po inokulacji biopreparatem G-67-1 (jedna seria) Rys Porównanie zawartoci zidentyfikowanych n-alkanów w glebie i ziemi z dołu urobkowego Graby-67 po kolejnych etapach oczyszczania w warunkach laboratoryjnych metod ex-situ (liczba powtórze pomiarów n = 8-10, p < 0,05) Fig Identified n-alkane content after consecutive stages of purification (soil from Graby-67) in laboratory conditions, ex-situ method (repetition number n = 8-10, p < 0.05) Wskaniki oceny stopnia biodegradacji dowodz o zadowalajcym przebiegu procesów biologicznego rozkładu n-alkanów (tab. 9.14), gdy uległy one ju widocznemu obnieniu po przeprowadzeniu w okresie 9 tygodni inokulacji biopreparatem G-67-1 (jedna seria): n-c 17 /Pr z 5,237 do 0,764, n-c 18 /F z 2,201 do 0,413, natomiast po przeprowadzeniu drugiej serii inokulacji biopreparatem G-67-1 (18 tygodni) odnotowano dalsze obnienie wskaników : n-c 17 /Pr z 0,764 do 0,221, n-c 18 /F z 0,413 do 0,213. Zmodyfikowanie sporzdzonego na bazie bakterii autochtonicznych biopreparatu G-67-1, poprzez wzbogacenie go o wyizolowane i wytypowane rodzaje grzybów (biopreparat G-67-2), umoliwiło obnienie zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych do wymaganych 209

207 standardów glebowych. Wyniki analiz chromatograficznych wykazały, e biodegradacja zanieczyszcze ropopochodnych po drugiej serii inokulacji realizowanej biopreparatem G-67-2 zachodziła ze znacznie wysz efektywnoci, gdy dla wglowodorów alifatycznych o długoci łacucha wglowego n-c 8 n-c 18 kształtowała si na poziomie: 89,9 96,8%. Wglowodory z zakresu n-c 19 n-c 36 uległy biodegradacji równie w zadowalajcym stopniu w granicach: 79,2 89,5% (rys. 9.15). 250 zawarto n-alkanów [mg/kg s.m.] n-c6 n-c7 n-c8 n-c9 n-c10 n-c11 n-c12 n-c13 n-c14 n-c15 n-c16 n-c17 Pr n-c18 F n-c19 n-c20 n-c21 n-c22 n-c23 n-c24 n-c25 n-c26 n-c28 n-c30 hopan n-c32 n-c34 n-c36 Pr I G Próbka po inokulacji biopreparatem G-67-1 (jedna seria) Pr II G Próbka po inokulacji biopreparatem G-67-1 (dwie serie) Rys Porównanie zmian zawartoci n-alkanów po inokulacji biopreparatem G-67-1 przeprowadzonych w dwóch seriach (liczba powtórze pomiarów n = 8-10, p < 0,05) Fig Comparison in identified n-alkane content after inoculation with G-67-1 biopreparation (soil from Graby-67) two series in laboratory conditions (repetition number n = 8-10, p < 0.05) O celowoci modyfikacji biopreparatu G-67-1 o wytypowane gatunki grzybów (G-67-2) i zastosowanie go podczas drugiej serii inokulacji, wiadczy porównawcze zestawienie wyników analiz chromatograficznych na rys Stwierdzono, wówczas znacznie wysze obnienie zawartoci wglowodorówo dłuszych łacuchach wglowych z zakresu: n-c 17 n-c 36. Ponadto wskaniki oceny stopnia biodegradacji po inokulacji biopreparatem G-67-1 (pierwsza seria) i biopreparatem G-67-2 (druga seria) uległy obnieniu w znacznie wikszym stopniu ni w przypadku inokulacji bioreparatem G-67-1 realizowanej dwóch seriach, gdy wynosiły odpowiednio: n-c 17 /Pr = 0,044, n-c 18 /F = 0,033 (tab. 9.14). 210

208 Na podstawie analiz chromatograficznych stwierdzono, e w toku mikrobiologicznego rozkładu zanieczyszcze ropopochodnych wystpuje znaczny ubytek wglowodorów monoaromatycznych (BTEX) zawarto n-alkanów [mg/kg s.m.] n-c6 n-c7 n-c8 n-c9 n-c10 n-c11 n-c12 n-c13 n-c14 n-c15 n-c16 n-c17 Pr n-c18 F n-c19 n-c20 n-c21 n-c22 n-c23 n-c24 n-c25 n-c26 n-c28 n-c30 hopan Pr I G Próbka po inokulacji biopreparatem G-67-1 (jedna seria) Pr II G Próbka po inakulacji biopreparatem G-67-1 (I seria ) i biopreparatem G-67-2 (II seria) Rys Porównanie zmian zawartoci n-alkanów po inokulacji biopreparatami G-67-1 i G-67-2 (liczba powtórze pomiarów n = 8-10, p < 0,05) Fig Comparison in n-alkane content after inoculation with G-67-1 and G-67-2 biopreparations (repetition number n = 8-10, p < 0.05) W wyniku przeprowadzonego etapu biodegradacji podstawowej obnienie zwizków aromatycznych wynosiło w granicach: 18,9 27,2%, przy czym najwyszy stopie biodegradacji zanotowano dla toluenu i benzenu. Inokulacja biopreparatem G-67-1 (jedna seria w okresie 9 tygodni) spowodowała obnienie zawartoci BTEX w granicach: 42,2 49,7% (dla benzenu 49,2%, dla toluenu 47,2%), natomiast zastosowanie biopreparatu G-67-2 (druga seria) zwikszyło efektywno biodegradacji zwizków monoaromatycznych do poziomu 66,2 84,2%. Najwyszy stopie biodegradacji zanotowano dla toluenu (84,2%) oraz benzenu (79,2%), natomiast rozkład etylobenzenu i ksylenów przebiegał z wolniejszym tempie (rys. 9.21). W wyniku prowadzonego procesu bioremediacji podstawowej odpadu z dołu urobkowego Graby-12 w warunkach laboratoryjnych (metoda ex-situ) nastpiła znaczna redukcja zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych. Analiza chromatograficzna wykazała zrónicowane obnienie zawartoci poszczególnych grup wglowodorów, wchodzcych w skład zanieczyszcze ropopochodnych. 211

209 n-c6 n-c7 n-c8 n-c9 n-c10 n-c11 n-c12 n-c13 n-c14 n-c15 n-c16 n-c17 Pr n-c18 F n-c19 n-c20 n-c21 n-c22 n-c23 n-c24 n-c25 n-c26 n-c28 n-c30 hopan n-c32 n-c34 n-c36 zawarto n-alkanów [mg/kg s.m.] Pr II G Próbka po inokulacji biopreparatem G-67-1 (dwie serie) Pr II G Próbka po inakulacji biopreparatem G-67-1 ( I seria ) i biopreparatem G-67-2 (II seria) Rys Porównanie efektywnoci działania biopreparatu G-67-1 i G-67-2 podczas procesu inokulacji gleby z terenu dołu urobkowego Graby-67 w warunkach laboratoryjnych metod ex-situ (liczba powtórze pomiarów n = 8-10, p < 0,05) Fig Comparison in effectiveness G-67-1 and G-67-2 biopreparations during inoculation process (soil from Graby-67 waste pit) laboratory conditions, ex-situ method, repetition number n=8-10, p<0.05 Uzyskane wyniki analiz wykazuj, e najwysz podatno na biodegradacj posiadaj n-alkany o długoci łacucha n-c 9 n-c 20 w granicach: 50,5 64,9%, natomiast wglowodory n-c 21 n-c 34 ulegaj biodegradacji w znacznie niszym stopniu, od 11,3% do 19,8% (rys. 9.17). Zawarto wglowodorów niezidentyfikowanych uległa obnieniu o 29,8%. Wskaniki stopnia oceny biodegradacji uległy widocznemu zmniejszeniu (tab. 9.14): n-c 17 /Pr z 10,539 do 4,083, n-c 18 /F z 11,561 do 3,772, co dowodzi o zadowalajcej efektywnoci procesu oczyszczania, który umoliwił przeprowadzenie nastpnego, głbszego etapu oczyszczania, poprzez zastosowanie inokulacji biopreparatami mikrobiologicznymi. Inokulacja biopreparatem G-12-1 prowadzona w warunkach laboratoryjnych w okresie (9 tygodni pierwsza seria) przyczyniła si do widocznej redukcji zawartoci n-alkanów o długoci łacucha wglowego n-c 8 n-c 19 na poziomie: 69,7 79,5%, które cechowały si najwysz podatnoci na rozkład mikrobiologiczny. Wglowodory z zakresu n-c 20 n-c

210 ulegały biodegradacji na niszym, lecz wci zadowalajcym poziomie wynoszcym: 51,8 62,1%. Natomiast wglowodory powyej 30 atomów wgla w czsteczce ulegały rozkładowi w granicach: 35,2 45,6%. Obnienie zawartoci wglowodorów niezidentyfikowanych wyniosło 51,2%. Przeprowadzenie drugiej serii inokulacji biopreparatem G-12-1, wskazuje na dalsze obnienie zanieczyszcze ropopochodnych, gdy zanotowano redukcj zawartoci n- alkanów o długoci łacucha wglowego n-c 8 n-c 22 na poziomie: 79,5 86,7%, za wglowodory z zakresu n-c 22 n-c 34 ulegały biodegradacji w granicach: 61,7 71,5% (rys. 9.18). Pomimo, znacznego zmniejszenia si wartoci wskaników okrelajcych stopie biodegradacji do poziomu (tab. 9.14): po inokulacji biopreparatem G-67-1 ( pierwsza seria): n-c 17 /Pr = 0,546, n-c 18 /F = 1,063, po inokulacji biopreparatem G-67-1 ( druga seria) n-c 17 /Pr = 0,236, n-c 18 /F = 0,299, nie uzyskano obnienia zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych po poziomu nieprzkraczajcych dopuszczalnych wartoci okrelonych przez standardy glebowe zawarto n - alkanów [mg/kg s.m.] n-c6 n-c7 n-c8 n-c9 n-c10 n-c11 n-c12 n-c13 n-c14 n-c15 n-c16 n-c17 Pr n-c18 F n-c19 n-c20 n-c21 n-c22 n-c23 n-c24 n-c25 n-c26 n-c28 n-c30 hopan n-c32 n-c34 Pr G-12 - Próbka po remediacji wstpnej Pr G-12 BrP - Próbka po bioremediacji podstawowej Pr I G Próbka po inokulacji biopreparatem G-12-1 (jedna seria) Rys Porównanie zawartoci zidentyfikowanych n-alkanów w glebie i ziemi z dołu urobkowego Graby-12 po kolejnych etapach oczyszczania w warunkach laboratoryjnych metod ex-situ (liczba powtórze pomiarów n = 8-10, p < 0,05) Fig Comparison in identified n-alkane content after consecutive purifying stages (soil from Graby-12) laboratory conditions, ex-situ method (repetition number n = 8-10, p < 0.05) 213

211 Wprowadzenie w drugiej serii inokulacji biopreparatu G-12-2 przyczyniło si osignicia zakładanego celu, tj. obnienia zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych do dopuszczalnych wartoci okrelonych przez standardy glebowe. Jak wykazały wyniki analiz chromatograficznych, zastosowanie biopreparatu wzbogaconego o wybrane gatunki grzybów (G-12-2) zwikszyło dynamik biodegradacji dla wszystkich analizowanych grup wglowodorów (n-alkany oraz BTEX). Najszybciej zachodziła biodegradacja wglowodorów alifatycznych o długoci łacucha wglowego n-c 9 n-c 18 na poziomie: 87,5 95,5% i wglowodorów z zakresu n-c 19 n-c 34 na nieznacznie niszym poziomie: 78,1 86,8% (rys. 9.19, rys. 9.20). Odnotowano równie obnienie zawartoci wglowodorów niezidentyfikowanych o 79,4%. 275 zawarto n-alkanów [mg/kg s.m.] n-c6 n-c7 n-c8 n-c9 n-c10 n-c11 n-c12 n-c13 n-c14 n-c15 n-c16 n-c17 Pr n-c18 F n-c19 n-c20 n-c21 n-c22 n-c23 n-c24 n-c25 n-c26 n-c28 n-c30 hopan n-c32 n-c34 Pr I G Próbka po inokulacji biopreparatem G-12-1 (jedna seria) Pr II G Próbka po inokulacji biopreparatem G-12-1 (dwie serie) Rys Porównanie zmian zawartoci n-alkanów po inokulacji biopreparatem G-12-1 przeprowadzonych w dwóch seriach (liczba powtórze pomiarów n = 8-10, p < 0,05) Fig Comparison in n-alkane content after inoculation with G-12-1 biopreparation (soil from Graby-12) two series in laboratory conditions (repetition number n = 8-10, p < 0.05) O zadowalajcym tempie przebiegu procesu biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych po wprowadzeniu drugiej serii z zastosowaniem biopreparatu G-12-2, wiadcz zmiany wartoci wskaników oceny biodegradacji, które uległy widocznemu obnieniu, w porównaniu z inokulacj prowadzon biopreparatem G-12-1 (po dwie serie) i wyniosły odpowiednio: n-c 17 /Pr = 0,043 i n-c 18 /F = 0,064 (tab. 9.14). O zwikszonej skutecznoci inokulacji i efektywnoci działania biopreparatu G-12-2 wprowadzonego w trakcie inokulacji w drugiej serii w porównaniu z biopreparatem G-12-1, 214

212 wiadcz wyniki analiz chromatograficznych bioderagadowanych zanieczyszcze ropopochodnych, zestawione na rys w postaci w porównaniu stopnia ich obnienia w wyniku działania testowanych biopreparatów w drugiej serii inokulacji n-c8 n-c9 n-c10 n-c11 n-c12 n-c13 n-c14 n-c15 n-c16 n-c17 Pr n-c18 F n-c19 n-c20 n-c21 n-c22 n-c23 n-c24 n-c25 n-c26 n-c28 n-c30 hopan n-c32 n-c34 zawarto n-alkanów [mg/kg s.m.] Pr I G Próbka po inokulacji biopreparatem G-12-1 (jedna seria) Pr II G Próbka po inokulacji biopreparatem G-12-1 (I seria) i biopreparatem G-12-2 (II seria) Rys Porównanie zmian zawartoci n-alkanów po inokulacji biopreparatami G-12-1 i G-12-2 (liczba powtórze pomiarów n = 8-10, p < 0,05) Fig Comparison in n-alkane content after inoculation with G-12-1 and G-12-2 biopreparation (repetition number n = 8-10, p < 0.05) W trakcie mikrobiologicznego rozkładu odnotowano znaczne zmniejszenie zawartoci wglowodorów monoaromatycznych (rys. 9.21). Etap bioremediacji podstawowej nieznacznie obniył poziom zawartoci BTEX, który dla poszczególnych wglowodorów aromatycznych wynosił od 12,8 do 15,8%. Inokulacja biopreparatem G-12-1 (po dwie serie) przyczyniła si do widocznego obnienia zawartoci wglowodorów aromatycznych, ale dopiero wprowadzenie w drugiej serii biopreparatu G-12-2 spowodowało znaczn redukcj zawartoci BTEX: benzenu o 75,8%, etylobenzenu o 70,5%, toluenu o 79,5%, ksylenów o 69,7%. Naley zaznaczy, e nie przeprowadzono oceny biodegradacji poszczególnych wielopiercieniowych wglowodorów aromatycznych (WWA), gdy wystpowały one jedynie w ilociach ladowych, z czego 89,5 90,7% stanowił naftalen. Wobec powyszego analiz stopnia biodegradacji WWA przedstawion w rozdziale 9.5 uznano za wystarczajc. 215

213 n-c6 n-c7 n-c8 n-c9 n-c10 n-c11 n-c12 n-c13 n-c14 n-c15 n-c16 n-c17 Pr n-c18 F n-c19 n-c20 n-c21 n-c22 n-c23 n-c24 n-c25 n-c26 n-c28 n-c30 hopan n-c32 n-c34 zawarto n - alkanów [mg/kg s.m.] Pr II G Próbka po inokulacji biopreparatem G-12-1 (dwie serie) Pr II G Próbka po inokulacji biopreparatem G-12-1 (I seria) i biopreparatem G-12-2 (II seria) Rys Porównanie efektywnoci działania biopreparatu G-12-1 i G-12-2 podczas procesu inokulacji gleby z terenu dołu urobkowego Graby-12 w warunkach laboratoryjnych metod ex-situ (liczba powtórze pomiarów n = 8-10, p < 0,05) Fig Comparison in effectiveness G-12-1 and G-12-2 biopreparations during inoculation process (soil from Graby-12 waste pit) laboratory conditions, ex-situ method, repetition number n = 8-10, p < 0.05 Przeprowadzona analiza stopnia biodegradacji poszczególnych grup n-alkanów oraz BTEX, ukazuje nieznacznie wysz dynamik przebiegu procesu biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych zawartych w odpadzie z dołu urobkowego Graby-67. Prawdopodobnie zwizane jest to z wysz zawartoci wglowodorów podatnych na mikrobiologiczny rozkład. Wprowadzenie etapowego procesu oczyszczania powodujcego stopniowe obnianie zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych umoliwia efektywne prowadzenie procesu oczyszczania zestarzałych odpadów wiertniczych z dołów urobkowych Graby-12 i Graby-67, cechujcych si wysokim poziomem zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych. Przedstawiona ocena efektywnoci biodegradacji poszczególnych grup wglowodorów wiadczy o efektywnym działaniu opracowanych biopreparatów mikrobiologicznych na bazie mikroorganizmów autochtonicznych i potwierdza słuszno przeprowadzonej modyfikacji ich składu poprzez wzbogacenie o wytypowane rodzaje grzybów (G-12-2 oraz G-67-2), co przyczyniło si do zwikszenia efektywnoci biodegradacji wglowodorów o dłuszych łacuchach wglowych, a przede wszystkim biodegradacji wglowodorów aromatycznych. 216

214 25 12 zawarto BTEX [mg/kg s.m.] GRABY-67 zawarto BETX [mg/kg s.m.] GRABY-12 0 benzen etylobenzen toluen ksyleny 0 benzen toluen etylobenzen ksyleny Pr G-67 Pr I G-67-1 Pr G-67 BrP Pr II G-67-2 Pr G-12 Pr I G-12-1 Pr G-12 BrP Pr II G-12-2 Rys Porównanie zmian zawartoci BTEX po kolejnych etapach oczyszczania dołów urobkowych (Graby-67 i Graby-12)w warunkach laboratoryjnych metod ex-situ (liczba powtórze pomiarów n = 8-10, p < 0,05) Fig Comparison in BTEX content after consecutive purifying stages (soil from waste pits) laboratory conditions, ex-situ method (repetition number n = 8-10, p < 0.05) W celu opracowania uproszczonego matematycznego modelu biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych podczas prowadzenia bada w skali laboratoryjnej (metoda ex-situ), do normalizacji ste analitów (TPH, Σ n-c 8 n-c 22, Σ n-c 23 n-c 36, BTEX) zastosowano biomarker C 30 17(H)21β(H)-hopan, który umoliwiał pełn ocen stopnia biodegradacji wglowodorów ropopochodnych. Zastosowanie biomarkera w badaniach biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych w zestarzałych odpadach pochodzcych z dołów urobkowych pozwoliło na wyeliminowanie błdów analitycznych w oznaczeniach chromatograficznych poszczególnych grup analitów. Znormalizowane wzgldem hopanu wyniki chromatograficznych oznacze zanieczyszcze ropopochodnych wykonywanych w trakcie prowadzenia biodegradacji posłuyły do opracowania matematycznego pierwszorzdowego modelu opisujcego jej przebieg, który został opisany równaniem: 217

215 C/C H = (C/C H ) 0 exp(-kt) (5) gdzie: C koncentracja analitu [mg/kg s.m.], C H koncentracja hopanu [mg/kg s.m.], (C/C H ) 0 znormalizowane stenie analitu w punkcie wyjciowym, k stała biodegradacji pierwszego rzdu [d -1 ], t czas trwania procesu (dni) [d]. Analiza regresji nieliniowej z zastosowaniem równania (5) umoliwiła wyznaczenie stałej biodegradacji pierwszego rzdu (k) oraz współczynnika korelacji (r 2 ) okrelajcego dopasowanie punktów pomiarowych do krzywych teoretycznych procesu biodegradacji: TPH, Σ n-c 8 n-c 22, Σ n-c 23 n-c 36, BTEX. Przeprowadzenie nieliniowej analizy wariancji (ANOWA) metod Tukey a na poziomie ufnoci p < 0,05 umoliwiła eliminacj danych analitycznych (chemicznych i biologicznych) statystycznie nieistotnych. Do statystycznego przetworzenia uzyskanych danych analitycznych zastosowano program Statistica ver.7.1. Obliczone stałe biodegradacji pierwszego rzdu (k) dla procesu biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych (obejmujcego bioremediacj podstawow i inokulacj biopreparatami na bazie bakterii autochtonicznych i grzybów) pozwoliły przeledzi i porówna ze sob kinetyk przebiegu biodegradacji poszczególnych grup zanieczyszcze ropopochodnych w kolejnych etapach procesu oczyszczania na wytypowanych obiektach badawczych (dołach urobkowych). Ponadto na podstawie porównania stałych biodegradacji pierwszego rzdu (k) mona okreli efektywno biopreparatów opracowanych na bazie bakterii autochtonicznych oraz zmodyfikowanych o wyizolowane z oczyszczanych terenów grzyby [Steliga, 2008; Steliga et al., 2008b; Steliga et al., 2009a]. Pomimo, e przetransponowanie wyników bada laboratoryjnych (ex-situ) na warunki przemysłowe stwarza due trudnoci, to przeprowadzone badania oraz opracowany model matematyczny przebiegu procesu biodegradacji pozwalaj na prognozowanie efektywnoci oczyszczania realizowanego w warunkach przemysłowych metod in-situ. Dowodz tego uzyskane wyniki potwierdzajce słuszno i prawidłowo przyjtej koncepcji bada realizowanej na dołach urobkowych, które zostały oczyszczone do standardów glebowych i zgodnie z decyzj o zakoczeniu rekultywacji przekazane do uytkowania jako teren leny. Przy opracowaniu modelu matematycznego biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych zakres bada rozszerzono o zastarzałe odpady (gleba) z dołów urobkowych, na których za- 218

216 koczono proces rekultywacji, tj.: Graby-10, Graby-12, Graby-13, Graby-40, Graby-67. Odpady z wymienionych dołów urobkowych charakteryzowały si wysokim poziomem skaenia substancjami ropopochodnymi, który ograniczał bezporednie zastosowanie metod biologicznych. Z tego wzgldu przeprowadzono remediacj wstpn, polegajc na odzysku zanieczyszcze ropopochodnych poprzez drena melioracyjno-odciekowy. Zabieg ten pozwolił na obnienie zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych do poziomu umoliwiajcego przeprowadzenie kolejnych etapów procesu oczyszczania na wytypowanych do bada dołach urobkowych (rys. 9.22): Graby-13 obnienie zawartoci zanieczyszcze TPH z do mg/kg s.m. Graby-40 obnienie zawartoci zanieczyszcze TPH z do mg/kg s.m. Graby-10 obnienie zawartoci zanieczyszcze TPH z do mg/kg s.m. Graby-12 obnienie zawartoci zanieczyszcze TPH z do mg/kg s.m. Graby-67 obnienie zawartoci zanieczyszcze TPH z do mg/kg s.m. G-12 G-10 G-40 G-67 G-13 dół urobkowy próbka po bioremediacji podstawowej próbka po remediacji wstpnej Zawarto [mg/kg s.m.] zawarto TPH zawarto Σ n-c 8 - n-c 22 zawarto Σ n-c 23 - n-c 36 Rys Porównanie zawartoci TPH, Σ n-c 8 n-c 22, Σ n-c 23 n-c 36 po zabiegu rekultywacji wstpnej i bioremediacji podstawowej Fig Comparison in TPH, Σ n-c 8 n-c 22, Σ n-c 23 n-c 36 content after initial recultivation and basic bioremediation Analiza chemiczna ujednoliconych próbek z poszczególnych dołów urobkowych wykazała, e odczyn wycigu wodnego z gleby kształtuje si na poziomie 6,02 6,21 (odbiegajcym od optymalnego). Ponadto obliczone proporcje substancji biogennych (C:N:P) równie 219

217 odbiegały od optymalnych, co dowodzi, e procesy mikrobiologiczne s zahamowane i bez korekty iloci tych składników autochtoniczna flora bakteryjna nie zostanie uaktywniona. Analiza mineralogiczna badanych odpadów z wytypowanych dołów urobkowych wykazała wysok zawarto minerałów ilastych o strukturze pczniejcej (smektyt oraz minerał mieszano-pakietowy smektyt/illit) w zakresie 38 85%, dlatego wskazane było przeprowadzenie modyfikacji struktury odpadu poprzez zmieszanie go z czyst ziemi w odpowiednich proporcjach, wyznaczonych indywidualnie dla kadego dołu urobkowego. Proces bioremediacji podstawowej (I etap oczyszczania) prowadzony w warunkach laboratoryjnych (metoda ex-situ) był stymulowany poprzez wzbogacenie zestarzałego odpadu substancjami biogennymi uaktywniajcymi flor bakteryjn oraz stworzenie optymalnych warunków wodnych i temperaturowych. Dobór substancji biogennych jest wanym elementem procesu biodegradacji i został on dokonany na podstawie bada zalenoci pomidzy aktywnoci dehydrogenazow, a proporcjami wprowadzanych substancji biogennych. Optymalne warunki stymulacji procesu biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych dla testowanych dołów urobkowych uzyskano przy rónych proporcjach substancji biogennych C:N:P (100:6:1 oraz 100:3:1). W wyniku przeprowadzonego procesu bioremediacji podstawowej w warunkach laboratoryjnych w okresie 130 dni uzyskano znaczne obnienie zawarto- ci zanieczyszcze ropopochodnych, w granicach: 41,5 53,2% (rys ). Analiza chromatograficzna wykazała, e obnienie zawartoci n-alkanów z zakresu n-c 8 n-c 22, uzyskane w wyniku biodegradacji, kształtowało si na poziomie: 52,3 63,2%, a wglowodorów ciszych (n-c 23 n-c 36 ) mieciło si w przedziale: 9,8 28,1%. Stopie biodegradacji wglowodorów niezidentyfikowanych zawierał si w granicach: 29,1 32,3%. W celu głbszego doczyszczenia terenów testowanych dołów urobkowych do poziomu okrelonego przez standardy glebowe, przeprowadzono II etap oczyszczania oparty na inokulacji biopreparatem sporzdzonym na bazie mikroorganizmów autochtonicznych (I seria) i zmodyfikowanym o wytypowane gatunki grzybów (II seria). Biopreparaty sporzdzono indywidualnie dla kadego dołu urobkowego, na podstawie przeprowadzonych bada mikrobiologicznych w połczeniu z analizami chromatograficznymi zanieczyszcze ropopochodnych. Uzyskano dziki temu biopreparaty o profilu cile dopasowanym do charakteru zanieczyszcze ropopochodnych, wystpujcych na terenie danego dołu urobkowego. Wykonane analizy wskazuj, e podczas inokulacji (II etap oczyszczania) biopreparatami na bazie mikroorganizmów autochtonicznych i grzybów, biodegradacja wglowodorów 220

218 alifatycznych o długoci łacucha n-c 8 n-c 22 zachodzi w granicach: 92,1 95,1%, natomiast wglowodory cisze ulegały biodegradacji w zakresie: 78,6 89,9%. wiadczy to o wysokiej efektywnoci i szerokim spektrum działania biopreparatów sporzdzonych na bazie autochtonicznych bakterii i grzybów. W wyniku przeprowadzonego procesu oczyszczania odpadów z testowanych dołów urobkowych, zawarto zanieczyszcze ropopochodnych uległa obnieniu do poziomu okre- lonego przez standardy glebowe dla grupy B, zgodnie z wytycznymi zawartymi w projekcie rekultywacyjnym (rys. 9.23) G-12 G-10 G-40 dół G-67 urobkowy G próbka po inokulacji biopreparatem (seria I) próbka po inokulacji biopreparatem (seria II) zawarto [mg/kg s.m.] zawarto TPH zawarto Σ n-c 8 - n-c 22 zawarto Σ n-c 23 - n-c 36 Rys Porównanie zawartoci TPH, Σ n-c 8 -n-c 22, Σ n-c 23 -n-c 36 po zabiegach inokulacji biopreparatami na bazie mikroorganizmów autochtonicznych i grzybów Fig Comparison in TPH, n-c 8 n-c 22, Σ n-c 23 n-c 36 content after inoculation with biopreparations based on indigenous microorganisms and fungi Przebieg procesu biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych, obejmujcego bioremediacj podstawow i inokulacj biopreparatami na bazie bakterii autochtonicznych i grzybów, opisano równaniem (5). Poszczególne współczynniki równania (5): k, (C/C H ) 0 oraz współczynniki korelacji dla kolejnych etapów oczyszczania zestawiono w tab i tab Porównanie przebiegu procesu biodegradacji w kolejnych etapach oczyszczania odpadów z do- 221

219 łów urobkowych przedstawiono w formie graficznej dla TPH (rys. 9.24), Σ n-c 8 n-c 22 (rys. 9.25), Σ n-c 23 n-c 36 (rys. 9.26), BTEX (rys. 9.27). Tabela Zestawienie współczynników równania modelu matematycznego biodegradacji TPH i BTEX w kolejnych etapach oczyszczania odpadów z terenów dołów urobkowych (warunki laboratoryjne metoda ex-situ) Table Equation coefficients of mathematical model of TPH and BTEX biodegradation in consecutive stages of waste purification from waste pits area (laboratory conditions, ex-situ method) Dół urobkowy G-13 G-67 G-40 G-10 G-12 Etap oczyszczania Pr G-13 BrP Pr II G-13-1 Pr II G-13-2 Pr G-67 BrP Pr II G-67-1 Pr II G-67-2 Pr G-40 BrP Pr II G-40-1 Pr II G-40-2 Pr G-10 BrP Pr II G-10-1 Pr II G-10-2 Pr G-12 BrP Pr II G-12-1 Pr II G-12-2 TPH BTEX k[d -1 ] (C/C H ) 0 r 2 k[d -1 ] (C/C H ) 0 r 2 0,0068 ± 0,004 0,0177 ± 0,008 0,0240 ± 0,012 0,0055 ± 0,003 0,0150 ± 0,006 0,0228 ± 0,009 0,0062 ± 0,003 0,0164 ± 0,007 0,0219 ± 0,013 0,0059 ± 0,002 0,0172 ± 0,006 0,0198 ± 0,008 0,0058 ± 0,002 0,0189 ± 0,008 0,0216 ± 0, ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 129 0,9617 0,0028 ± 0,002 0,9709 0,0088 0,008 0,9729 0,0132 ± 0,008 0,9711 0,0038 ± 0,002 0,9885 0,0095 ± 0,005 0,9851 0,0151 ± 0,007 0,9816 0,0016 ± 0,001 0,9703 0,0089 ± 0,006 0,9821 0,0121 ± 0,011 0,9751 0,0025 ± 0,001 0,9758 0,0072 ± 0,004 0,9982 0,0138 ± 0,012 0,9905 0,0021 ± 0,001 0,9911 0,0079 ± 0,004 0,9867 0,0115 ± 0,007 5,002 ± 0,548 4,012 ± 0,458 3,844 ± 0,412 6,498 ± 0,621 5,014 ± 0,427 5,712 ± 0,495 7,125 ± 0,698 6,912 ± 0,615 7,325 ± 0,685 9,916 ± 0,852 6,942 ± 0,657 7,315 ± 0,689 3,961 ± 0,325 3,015 ± 0,268 3,314 ± 0,287 0,9559 0,9647 0,9525 0,9613 0,9578 0,9733 0,9606 0,9703 0,9631 0,9735 0,9758 0,9931 0,9962 0,9911 0,9858 Pr G BrP Próbka po bioremediacji podstawowej Pr II G/1 Próbka po inokulacji biopreparatem na bazie mikroorganizmów autochtonicznych (G-13-1, G-67-1, G-40-1, G-10-1, G-12-1) 2 serie Pr II G /2 Próbka po inokulacji biopreparatem na bazie mikroorganizmów autochtonicznych (G-13-1, G-67-1, G-40-1, G-10-1, G-12-1) 1 seria i inokulacji biopreparatem na bazie mikroorganizmów autochtonicznych i grzybów (G-13-2, G-67-2, G-40-2, G-10-2, G-12-2) 1 seria 222

220 Tabela Zestawienie współczynników równania modelu matematycznego biodegradacji Σ n-c 8 n-c 22 i Σ n-c 23 n-c 36 w kolejnych etapach oczyszczania odpadów z terenów dołów urobkowych (warunki laboratoryjne metoda ex-situ) Table Equation coefficients of mathematical model of Σ n-c 8 n-c 22 and Σ n-c 23 n-c 36 biodegradation in consecutive stages of waste purification from waste pits area (laboratory conditions, ex-situ method) Dół urobkowy G-13 G-67 G-40 G-10 G-12 Etap oczyszczania Pr G-13 BrP Pr II G-13-1 Pr II G-13-2 Pr G-67 BrP Pr II G-67-1 Pr II G-67-2 Pr G-40 BrP Pr II G-40-1 Pr II G-40-2 Pr G-10 BrP Pr II G-10-1 Pr II G-10-2 Pr G-12 BrP Pr II G-12-1 Pr II G-12-2 Σ n-c 8 n-c 22 Σ n-c 23 n-c 36 k[d -1 ] (C/C H ) 0 r 2 k[d -1 ] (C/C H ) 0 r 2 0,0090 ± 0,005 0,0197 ±0,008 0,0264 ±0,014 0,0070 ± 0,003 0,0184 ±0,009 0,0259 ± 0,012 0,0083 ± 0,004 0,0195 ±0,009 0,0262 ± 0,014 0,0093 ± 0,005 0,0204 ±0,010 0,0222 ± 0,013 0,0080 ± 0,003 0,0214 ±0,012 0,0278 ±0, ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 154 0,9847 0,0027 ± 0,001 0,9745 0,0112 ±0,0005 0,9791 0,0189 ± 0,012 0,9829 0,0036 ± 0,002 0,9748 0,0127 ±0,007 0,9878 0,0182 ± 0,010 0,9806 0,0039 ± 0,002 0,9687 0,0118 ±0,008 0,9759 0,0173 ± 0,011 0,9870 0,0042 ± 0,003 0,9718 0,0114 ±0,009 0,9905 0,0169 ± 0,011 0,9915 0,0049 ± 0,003 0,9841 0,0134 ±0,007 0,9778 0,0189 ± 0, ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 13 0,9832 0,9714 0,9679 0,9829 0,9701 0,9878 0,9929 0,9712 0,9711 0,9646 0,9704 0,9844 0,9721 0,9704 0,9801 Stałe biodegradacji pierwszego rzdu (k) zanieczyszcze ropopochodnych (TPH) dla I etapu oczyszczania odpadów z testowanych dołów urobkowych (Graby-13, Graby-40, Graby-67, Graby-10, Graby-12) bioremediacji podstawowej kształtowały si na zblionym, niskim poziomie: 0,0055 0,0068 [d -1 ] przy współczynniku korelacji: 0,9617 0,9816 (tab. 9.15, rys. 9.24). Kolejny etap oczyszczania gleby z testowanych dołów urobkowych, obejmujcy inokulacj biopreparatami na bazie bakterii autochtonicznych (G-13-1, G-40-1, G-37-1, G-10-1, G-12-1) w dwóch seriach, przyczynił si do zwikszenia szybkoci biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych (TPH), o czym wiadcz stałe szybkoci biodegradacji, które zawierały si w granicach: 0,0150 0,0189 przy współczynniku korelacji r 2 = 0,9703 0,

221 Przeprowadzenie modyfikacji biopreparatów sporzdzonych na bazie mikroorganizmów autochtonicznych, polegajcej na wzbogaceniu ich o wytypowane gatunki grzybów, wyizolowane z gleby pochodzcej z dołów urobkowych, pozwoliło na opracowanie biopreparatów (G-13-2, G-40-2, G-37-2, G-10-2, G-12-2), które zastosowanie w drugiej serii inokulacji. Wpłynło, to dodatnio na szybko biodegradacji TPH, gdy stałe szybkoci biodegradacji uległy zwikszeniu do poziomu: 0,0198 0,0240 przy r 2 = 0,9729 0,9982 (tab. 9.15) C/C H czas [dni] Pr G-13 BrP Pr II G-13-2 Pr G-67 BrP Pr II G-67-2 Pr G-40 BrP Pr II G-40-2 Pr G-10 BrP Pr II G-10-2 Pr G -12 BrP Pr II G-12-2 Rys Porównanie obnienia zawartoci TPH (C/C H ) po normalizacji hopanem po kolejnych etapach biodegradacji odpadu z wytypowanych dołów urobkowych (liczba powtórze pomiarów n = 8-9, p < 0,05) Fig Comparison in hopane normalised TPH content (C/C H ) decrease after consecutive stages of biodegradation of soil from exemplary waste pits (repetition number n = 8-9, p < 0.05) Przedstawione wyniki potwierdzaj słuszno przeprowadzenia modyfikacji opracowanych biopreparatów na bazie bakterii autochtonicznych poprzez wzbogacenie ich o wytypowane gatunki grzybów wyizolowane z oczyszczanych terenów dołów urobkowych. Opracowana metodyka chromatograficznego oznaczania zanieczyszcze ropopochodnych umoliwiła identyfikacj poszczególnych wglowodorów, wchodzcych w skład zanieczyszcze ropopochodnych, co pozwoliło okreli podatno na biodegradacj nastpujcych grup wglowodorów: Σ n-c 8 n-c 22, Σ n-c 23 n-c 36 (tab. 9.16). Stałe biodegradacji pierwszego rzdu (k) dla grupy wglowodorów (Σn-C 8 n-c 22 ) s najwysze, zwłaszcza na etapie oczyszczania polegajcym na inokulacji biopreparatami na bazie bakterii autochtonicznych (I seria) oraz wzbogaconych o grzyby (II seria) i kształtuj si 224

222 na poziomie: 0, [d -1 ] przy r 2 = 0,9759 0,9905. Natomiast podczas etapu bioremediacji podstawowej stałe biodegradacji s znacznie nisze, gdy kształtuj si na poziomie 0,0070 0,0093 [d -1 ] przy r 2 = 0,9806 0,9915 (tab. 9.16, rys. 9.25) Przedstawione wyniki dowodz, e wglowodory z tego zakresu długoci łacucha wglowego stosunkowo łatwo ulegaj biodegradacji. Stałe biodegradacji pierwszego rzdu dla wglowodorów ciszych, o długoci łacucha wglowego z zakresu n-c 23 n-c 36 podczas bioremediacji podstawowej kształtuj si na najniszym poziomie w granicach: 0,0027 0,0042 [d -1 ] przy r 2 = 0,9646 0,9929, co dowodzi niskiej efektywnoci biologicznego rozkładu tej grupy zwizków. Szybko biodegradacji wglowodorów ciszych wzrosła po inokulacji biopreparatem na bazie bakterii autochtonicznych (I seria) oraz wzbogaconym o grzyby (II seria) stałe szybkoci biodegradacji osignły poziom: 0,0169 0,0189 [d -1 ] przy dopasowaniu krzywej wynoszcym r 2 = 0,9679 0,9878. Dowodzi to faktu, e opracowany biopreparat na bazie bakterii autochtonicznych i grzybów cechuje si szerokim spektrum działania, gdy biodegradacji ulegaj równie wglowodory o długich łacuchach wglowych z zakresu n-c 23 n-c 36 (tab. 9.16, rys. 9.26) C/C H czas [dni] Pr G-13 BrP Pr II G-13-2 Pr G-67 BrP Pr II G-67-2 Pr G-40 BrP Pr II G-40-2 BrP Pr II G-10-2 Pr G -12 BrP Pr II G-12-2 Rys Porównanie obnienia zawartoci n-c 8 n-c 22 (C/C H ) po normalizacji hopanem po kolejnych etapach biodegradacji odpadu z wytypowanych dołów urobkowych (liczba powtórze pomiarów n = 8-9, p < 0,05) Fig Comparison in hopane normalised n-c 8 n-c 22 content (C/C H ) decrease after consecutive stages of biodegradation of soil from exemplary waste pits (repetition number n = 8-9, p < 0.05) 225

223 C/C H czas [dni] Pr G-13 BrP Pr II G-13-2 Pr G-67 BrP Pr II G-67-2 Pr G-40 BrP Pr II G-40-2 Pr G-10 BrP Pr II G-10-2 Pr G -12 BrP Pr II G-12-2 Rys Porównanie obnienia zawartoci n-c 23 n-c 36 (C/C H ) po normalizacji hopanem po kolejnych etapach biodegradacji odpadu z wytypowanych dołów urobkowych (liczba powtórze pomiarów n = 8-9, p < 0,05) Fig Comparison in hopane normalised n-c 23 n-c 36 content (C/C H ) decrease after consecutive stages of biodegradation of soil from exemplary waste pits (repetition number n = 8-9, p < 0.05) C/C H czas [dni] Pr G-13 BrP Pr II G-13-2 Pr G-67 BrP Pr II G-67-2 Pr G-40 Pr II G-40-2 Pr G-10 BrP Pr II G-10-2 Pr G-12 BrP Pr G-12-2 Rys Porównanie obnienia zawartoci BTEX (C/C H ) po normalizacji hopanem po kolejnych etapach biodegradacji odpadu z wytypowanych dołów urobkowych (liczba powtórze pomiarów n=8-9, p<0,05) Fig Comparison in hopane normalised BTEX content (C/C H ) decrease after consecutive stages of biodegradation of soil from exemplary waste pits (repetition number n=8-9, p<0.05) 226

224 Biodegradacj wglowodorów monoaromatycznych ( BTEX) podczas bioremediacji podstawowej przebiega na niskim poziomie przy stałych szybkoci biodegradacji wynoszcych: 0,0016 0,0038 [d -1 ] przy r 2 = 0,9559 0,9962. Przeprowadzenie inokulacji biopreparatami na bazie mikroorganizmów autochtonicznych i grzybów ma widoczny wpływ na szybko biodegradacji zwizków aromatycznych ( BTEX), gdy stałe szybkoci biodegradacji zanieczyszcze wzrastaj do poziomu: 0,0115 0,0138 [d -1 ] przy r 2 = 0,9525 0,9931 (tab. 9.15, rys. 9.27). Przedstawione wartoci stałych biodegradacji pierwszego rzdu (k) zanieczyszcze ropopochodnych w poszczególnych etapach oczyszczania zestarzałych odpadów z testowanych dołów urobkowych s zblione do wyników bada przedstawionych w literaturze wiatowej [Namkoong et al., 2002; Søvik et al., 2002; Xu et al., 2003a; Xu et al., 2004a; Viñas et al., 2005; Dickinson et al., 2006]. Opracowany uproszczony model matematyczny biodegradacji zestarzałych zanieczyszcze ropopochodnych jest pomocny przy sterowaniu procesami bioremediacji odpadów wiertniczych w trakcie prowadzenia kolejnych etapów oczyszczania terenów dołów urobkowych. Obliczone stałe biodegradacji pierwszego rzdu pozwalaj na zapoznanie si z dynamik przebiegu kolejnych etapów oczyszczania, okrelenie efektywnoci biopreparatów opracowanych na bazie bakterii autochtonicznych i grzybów. Obrazuj ponadto podatno na biodegradacj poszczególnych grup n-alkanów i BTEX w kolejnych etapach oczyszczania odpadów z zanieczyszcze ropopochodnych na terenach wytypowanych do bada dołów urobkowych. Produkty ropopochodne, które stanowi złoon mieszanin zwizków o zrónicowanych własnociach biologicznych, mog by przyczyn niekorzystnych dla człowieka zmian zachodzcych w ekosystemach. Naley nadmieni, e na drodze przemian chemicznych i mikrobiologicznych mog powstawa metabolity o zrónicowanej lub słabo poznanej aktywnoci biologicznej. Całkowite wyeliminowanie zanieczyszcze ropopochodnych w prowadzonych procesach bioremediacyjnych gleb skaonych substancjami ropopochodnymi jest trudne do osignicia, gdy nawet niewielkie iloci metabolitów mog by niebezpieczne [Kołwzan, 2005]. Ocen skutecznoci stosowanych zabiegów remediacyjnych na dołach urobkowych uzupełniono o monitoring toksykologiczny, którego celem było okrelenie wpływu zanieczyszcze ropopochodnych oraz porednich metabolitów, powstajcych procesach bioreme- 227

225 diacyjnych na biocenoz glebow w oparciu o przeprowadzone biologiczne testy toksyczno- ci, fitotoksycznoci i genotoksycznoci. Zastosowanie ywych organizmów, jako bioindykatorów nalecych do rónych grup taksonomicznych (bakterie, skorupiaki i roliny wysze), reprezentujcych wszystkie grupy troficzne: producentów, konsumentów i reducentów, pozwala na kompleksow ocen stanu badanego rodowiska glebowego. Uzyskane wyniki pozwol na przeledzenie zmian własnoci toksycznych (w tym metabolitów) w trakcie prowadzenia procesu oczyszczania gleby i ziemi z dołów urobkowych oraz na stwierdzenie przywrócenia rekultywowanych terenów do uytkowania lenego. Silne skaenie substancjami ropopochodnymi odpadów z testowanych dołów urobkowych Graby-67 i Graby-12 powoduje zmian warunków geotechnicznych i powietrzno-wodnych w glebie oraz działa toksycznie na roliny, które jako producenci odgrywaj wan rol w strukturze poszczególnych ekosystemów. Rola ta polega na wykorzystywaniu energii słonecznej lub chemicznej do przetwarzania substratów mineralnych w materi organiczn. Testy fitotoksycznoci z wykorzystaniem testu Phytotoxkit TM zastosowano w celu przebadania toksycznoci gleby w poszczególnych etapach oczyszczania dołów urobkowych Graby-67 i Graby-12. Testy wykazały znaczne rónice pomidzy badanymi próbkami oraz gatunkami rolin stosowanymi w testach (tab. 9.17). Ujednolicone próbki pobrane z pryzm, na których prowadzono proces biodegradacji zanieczyszcze w odpadach pochodzcych z testowanych dołów urobkowych, róniły si zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych. Zawarto zanieczyszcze ulegała stopniowo obnieniu w toku prowadzonego procesu, ale istnieje moliwo powstawania w trakcie przebiegu procesów biologicznych toksycznych metabolitów. Badane próbki gleby z dołów urobkowych (Graby-67 i Graby-12) przed rozpoczciem procesu oczyszczania były najbardziej toksyczne w stosunku do rzeuchy powodowały zahamowanie wzrostu korzenia w granicach 95,6 97,5%, co koreluje z wartoci zanieczyszcze ropopochodnych w testowanych próbkach. Drugi testowany parametr, % wykiełkowanych nasion, kształtował si na niskim poziomie wynoszc dla gleby z dołu urobkowego Graby-67 13,3%, a dla Graby 12 26,3%. Pomimo znacznego obnienia zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych w kolejnych etapach oczyszczania w warunkach laboratoryjnych (bioremediacja podstawowa i inokulacja biopreparatem na bazie bakterii autochtonicznych I seria) zahamowanie wzrostu 228

226 rzeuchy nadal było wysokie i wynosiło dla dołu Graby-67 55,6%, a dla Graby-12 40,1%, co moe wskazywa, e rzeucha jest bardzo wraliwa na obecne w glebie metabolity i wglowodory ropopochodne, które nie uległy biodegradacji. Tabela Zestawienie wyników testu Phytotoxkit TM przeprowadzonego na próbkach gleby i ziemi z dołów urobkowych Graby-67 i Graby-12 (badania laboratoryjne metoda ex-situ) Table Results of Phytotoxkit TM tests led on soil and ground samples from Graby-67 and Graby-12 waste pits laboratory conditions, ex-situ method Badany parametr Stosowane roliny Rzeucha (Lepidium Sativum) 3 powtórzenia Gorczyca (Sinapis alba) 3 powtórzenia Sorgo (Sorghum saccharatum) 3 powtórzenia PrK 1* 2* 3* PrK 1* 2* 3* PrK 1* 2* 3* Graby-67 Kiełkowanie [%] ,3 53,8 96, ,3 93,3 96,6 96,6 56,7 83,3 96,6 rednia długo korzenia [mm] 52,4 1,2 23,4 41,4 39,7 14,3 28,6 43,8 63,7 16,3 37,2 49,3 Maksymalna dł. korzenia [mm] Minimalna długo korzenia [mm] Zahamowanie wzrostu [%] Współczynnik zmiennoci [%] 61,8 3,1 20,4 41,2 51,2 39,7 42,5 53,7 90,5 37,5 62,4 85,2 22,8 0,7 13,9 14,8 17,8 8,2 9,7 18,5 10,5 2,1 6,3 8,5 97,5 55,6 20,6 63,9 28,7-9,3 74,4 41,6 22,6 29,5 51,2 42,9 35,4 37,6 42,8 39,5 32,5 42,1 53,4 47,2 24,3 Graby-12 Kiełkowanie [%] 97,6 26,3 66,6 96, ,0 93,3 96, ,2 96,9 96,9 rednia długo korzenia [mm] Maksymalna dł. korzenia [mm] Minimalna długo korzenia [mm] Zahamowanie wzrostu [%] Współczynnik zmiennoci [%] 43,5 1,89 25,8 36,7 38,7 16,8 27,4 46,8 62,7 24,7 45,7 54,7 68,2 25,8 40,7 58,9 50,7 40,7 31,8 69,8 89,4 41,4 69,4 79,8 21,9 10,5 14,5 19,8 18,4 7,6 10,8 29,7 12,7 7,2 14,7 19,7 95,6 40,1 16,1 56,5 29,7-20,9 60,1 27,1 11,7 31,5 44,8 38,4 35,9 38,7 48,4 45,8 32,7 52,7 59,4 49,7 41,8 Oznaczenia próbek: PrK Próbka kontrolna 1* ujednolicona próbka gleby i ziemi pobrana przed rozpoczciem prac bioremediacyjnych z dołu urobkowego (Graby-67 obszar BR i Graby-12 obszar III) 2* ujednolicona próbka gleby z dołu urobkowego (Graby-67, Graby-12) pobrana z pryzmy w trakcie procesu oczyszczania metod ex-situ (po inokulacji biopreparatem na bazie mikroorganizmów autochtonicznych I seria) 3* ujednolicona próbka gleby po zakoczeniu procesu oczyszczania z zanieczyszcze ropopochodnych metod ex-situ w warunkach półtechnicznych (po okresie 36 tygodni oczyszczania) 229

227 Zakoczenie prac bioremediacyjnych prowadzonych przez okres 36 tygodni w warunkach laboratoryjnych wskazuje na osignicie zadowalajcych efektów, gdy procent nasion wykiełkowanych na próbkach oczyszczonej gleby z dołów urobkowych wzrósł do poziomu 96,6 96,9%, a zahamowanie wzrostu korzenia osignło: 16,1 20,9% (tab. 9.17). Znacznie mniej wraliwe na zanieczyszczenia zawarte w glebie i ziemi z testowanych dołów urobkowych okazały si gorczyca i sorgo. W przypadku gorczycy, która wykazywała najwiksz odporno na zanieczyszczenia, procent wykiełkowanych nasion dla analizowanych próbek (surowe odpady) był wysoki i wynosił: 83,3 90,0%. Zahamowanie wzrostu korzenia w próbkach surowych z poszczególnych dołów urobkowych kształtowało si na poziomie: 56,5 63,9%. W trakcie prowadzenia bioremediacji w warunkach laboratoryjnych uległo znacznemu obnieniu do poziomu: 28,7 29,7%, a po zakoczeniu prac bioremediacyjnych, prowadzonych przez 36 tygodni %, zahamowania wzrostu gorczycy zawierał si w przedziale od 9,3 do 20,9% (znak oznacza wikszy przyrost ni w próbce kontrolnej). W przypadku sorgo dla gleby surowej procent wykiełkowanych nasion wahał si w granicach: 56,7 79,2% w stosunku do próbki kontrolnej. W toku bioremediacji procent ten wynosił: 83,3 96,9%, a zahamowanie wzrostu korzenia zawierało si w granicach: 47,2 27,1%. Zahamowanie wzrostu korzenia po zakoczeniu prac bioremediacyjnych (obejmujcych przeprowadzenie dwóch serii inokulacji z wykorzystaniem biopreparatów na bazie bakterii autochtonicznych oraz biopreparatów wzbogaconych o grzyby) wynosiło dla dołu urobkowego Graby-67 24,3%, natomiast dla dołu Graby-12 11,7%. Stosunkowo wysoki stopie zahamowania wzrostu korzenia testowanych rolin w trakcie procesu bioremediacji, po przeprowadzonych pocztkowych etapach biologicznego oczyszczania, moe wskazywa na obecno metabolitów, które powstawały podczas biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych. Uzyskane wyniki bada po zakoczeniu procesu bioremediacyjnego na próbkach z wytypowanych do bada dołów urobkowych w warunkach laboratoryjnych dowiodły, e metabolity i wglowodory ropopochodne uległy rozkładowi na zadowalajcym poziomie, gdy gleba i ziemia z testowanych dołów urobkowych jest nietoksyczna. Przedstawione badania wskazuj na nieznacznie nisz toksyczno zanieczyszcze pochodzcych z dołu urobkowego Graby-12, w porównaniu z dołem urobkowym Graby-67, zarówno w próbkach gleby surowej, jak i w toku bioremediacji. 230

228 Badania toksycznoci dla organizmów reprezentujcych poziom troficzny konsumentów przeprowadzono z wykorzystaniem testu Ostracodtoxkit F TM. Test toksycznoci chronicznej Ostracodtoxkit F TM, oparty na biowskanikach skorupiakach Heterocypris incongruens, przeprowadza si w cigu 6 dni i pozwala on na okrelenie miertelnoci i hamowania wzrostu skorupiaków. Naley on do testów, za pomoc których mona wstpnie okreli toksyczno gleby. W przypadku próbek (odpad surowy) z dołów urobkowych Graby-67 i Graby-12, miertelno bioindykatorów zawiera si w granicach: 58,3 61,6%, co dowodzi wysokiej toksycznoci (tab. 9.18). Tabela Zestawienie wyników testu Ostracodtoxkit F TM przeprowadzonego na próbkach odpadów z dołów urobkowych Graby-67 i Graby-12 (badania laboratoryjne, metoda ex-situ), liczba powtórze n = 6 Table Results of Ostracodtoxkit F TM tests led on soil and ground samples from Graby-67 and Graby-12 waste pits laboratory conditions, ex-situ method (repetition number n = 6) Badany parametr Graby-67 Graby-12 PrK 1* 2* 3* PrK 1* 2* 3* miertelno rednia miertelno [%] 10,0 61,6 38,1 25,0 10,0 58,3 35,6 23,3 Współczynnik zmiennoci redniej miertelnoci [%] 2,25 3,75 4,96 2,32 3,95 4,76 Zahamowanie wzrostu rednia wyjciowa długo organizmów [m] redni przyrost długoci organizmów ΔL [m] rednia hamowania wzrostu [%] X X X 30,8 4,9 X 26,6 4,6 W trakcie prowadzonego procesu oczyszczania w warunkach laboratoryjnych (bioremediacja podstawowa i inokulacja biopreparatem na bazie bakterii autochtonicznych i grzybów) miertelno organizmów testowych uległa zmniejszeniu (Graby-67 38,1%, Graby-12 35,6%), a zahamowanie wzrostu wynosiło: 26,6 30,8%. Wskazuje to na istotny efekt toksycznoci pomimo obnienia stopnia skaenia, co moe wskazywa na obecno metabolitów powstałych w wyniku biodegradacji wglowodorów ropopochodnych. Badania przeprowadzone na ujednoliconych próbkach gleby po zakoczeniu procesu oczyszczania w warunkach laboratoryjnych, wykazały zmniejszenie stopnia miertelnoci organizmów do poziomu: 23,3 25,0%, zblionego do stopnia miertelnoci okrelonego dla próbki kontrolnej. Drugi badany parametr, zahamowanie wzrostu, kształtował si na niskim poziomie:4,0 4,6%, co wskazuje na zadowalajcy poziom oczyszczenia badanych odpadów. 231

229 Reducenci, do których nale bakterie i grzyby saprofityczne, s wanym ogniwem zamykajcym obieg pierwiastków w ekosystemach. Drobnoustroje te wykorzystuj, w charakterze substratu pokarmowego, odpadowe substancje organiczne, w tym równie substancje ropopochodne wprowadzane do gleby. Wprowadzony na rynek w ostatnich latach system Microtox Solid Phase Test (test fazy stałej) umoliwia bezporedni kontakt bakterii luminescencyjnych z próbk gleby. Dziki temu istnieje moliwo wykrycia nie tylko substancji toksycznych rozpuszczalnych w wodzie, ale równie zwizków lipidowych i słabo rozpuszczalnych w wodzie [Araujo et al., 2005]. Wykonane wstpne badania skriningowe pozwoliły na wytypowanie próbek charakteryzujcych si istotnym efektem toksycznoci (poziom obnienia luminescencji powyej 50%) (rys. 9.28), a nastpnie wykonano testy z rozcieczeniami, które pozwoliły na okrelenie EC 50 tab. 9.19). Próbki surowej gleby z dołów urobkowych Graby- 67 (obszar CR) i Graby-12 (obszar III) charakteryzowały si wysok toksycznoci, szczególnie dla próbki z obszaru CR o najwyszym stopniu skaenia. Zanieczyszczenia zawarte w testowanych próbkach (wycig wodny odpadu z dołu urobkowego) spowodowały ponad 50% inhibicj luminescencji w zakresie: 64,2 74,3%. inhibicja luminescencji [%] ,2 74,5 51,2 18,3 64,2 42,1 16,2 PrK Graby-67 Graby-12 1* 2* 3* Rys Wpływ wycigów z próbek gleby z dołów urobkowych Graby-67 i Graby-12 na inhibicj luminescencji Fig The influence of Graby-67 and Graby-12 soil samples extracts on inhibition in luminescence 232

230 Tabela Wartoci stenia efektywnego powodujcego hamowanie luminescencji uzyskane dla wycigów wodnych odpadów pobranych dołów urobkowych: Graby-67 i Graby-12 (badania laboratoryjne metoda ex-situ) Table Quantities of effective concentration causing luminescence inhibition for Graby-67 and Graby-12 soils laboratory conditions, ex-situ method Parametr EC 50 [mg odpadu/dcm 3 ] Graby 67 (3 powtórzenia) Graby 12 (3 powtórzenia) 1* 2* 3* 1* 2* 3* B.T B.T. TU 22,2 5,15-19,6 4,51 - Wykonane testy z rozcieczeniami wykazały, e wartoci stenia efektywnego (EC 50 ) powodujcego 50% hamowanie luminescencji, uzyskane dla wycigów wodnych z testowanych odpadów surowych, wskazuj na toksyczno odpadów z wytypowanych do oczyszczania dołów urobkowych Graby-67 i Graby-12 (tab. 9.19). Wartoci (EC 50 ) przeliczono na jednostki toksycznoci (TU = 22,1 19,8), które wg skali toksycznoci próbek rodowiskowych (gleby) w tecie Microtox SPT opracowanej przez Sawickiego i współpracowników [2007], dowodz o istotnym efekcie toksycznym testowanych odpadów z dołów urobkowych Graby-67 i Graby-12. Wykonana analiza toksycznoci prób gleb pobranych w trakcie procesu bioremediacji prowadzonego w warunkach laboratoryjnych (metoda ex-situ) wskazuje na obnienie stopnia toksycznoci do poziomu (TU = 5,19 4,51), co sugeruje, e odnotowana toksyczno moe by wywołana przez metabolity, powstajce w toku mikrobiologicznego rozkładu zanieczyszcze ropopochodnych lub przez wglowodory trudno biodegradowalne. Ujednolicone próbki gleby i ziemi po zakoczeniu procesu biodegradacji, oczyszczane w warunkach laboratoryjnych nie hamowały luminescencji bakterii Vibro fischeri w stopniu wskazujcym na obecno zwizków toksycznych brak wic moliwoci wyznaczenia wartoci EC 50. Na podstawie przeprowadzonych testów toksycznoci Microtox SPT z wykorzystaniem jako wskaników bakterii Vibro fischeri mona stwierdzi, e gleby po zakoczeniu procesu oczyszczania w warunkach laboratoryjnych s nietoksyczne. Rozwój technik biologicznych umoliwił opracowanie i wdroenie do praktyki laboratoryjnej testów toksykologicznych skutecznych, wiarygodnych i łatwych do przeprowadzenia nawet 233

231 w zwykłych laboratoriach chemicznych. Testy te pozwalaj na ocen zagroenia wynikajc z obecnoci w rodowisku zwizków o potencjalnych własnociach mutagennych i rakotwórczych. W tym celu wykorzystano test (bazujcy na powszechnie znanej metodzie Ames a) Muta Chromoplate TM firmy Environmental BioDetection Products Inc. (Ontario, Kanada), który wykonuje si na podłou płynnym stosujc płytki studzienkowe (tzw. test fluktuacji). Badaniom bioindykacyjnym poddano gleb surow i po procesie bioremediacji w warunkach laboratoryjnych (metoda ex-situ) wykorzystujc standardowe szczepy TA-98 i TA-100, wykazujce wraliwo na działanie mutagenów WWA oraz pochodnych nitrowych, aminowych i hydroksyaminowych. Zanieczyszczenia zawarte w próbkach surowych oraz pobranych z pryzmy po procesie oczyszczania poddano ekstrakcji dichlorometanem, a nastpnie (po odparowaniu rozpuszczalnika) rozpuszczono w dimetylosulfotlenku (DMSO). Wyniki bada zilustrowano na rys i 9.31 (próbki odpadów surowych z dołów urobkowych Graby-67 i Graby-12) oraz rys i 9.32 (próbki gleby z pryzm po zakoczeniu procesu oczyszczania) w postaci zalenoci liczby rewertantów szczepów testowych, jakie pojawiły si na podłou bez histydyny na skutek kontaktu z badanymi zanieczyszczeniami ropopochodnymi wyekstrahowanymi z badanych odpadów. 20 TA 100 -S9 20 TA 100 +S9 liczba rewertantów licaba rewertantów stnie zanieczyszcze [µg/ml] stnie zanieczyszcze [µg/ml] Rys Wpływ zanieczyszcze ropopochodnych na liczb rewertantów indukowanych odpad surowy z dołu urobkowego Graby-67 (liczba powtórze n = 3, p < 0,05) Fig Influence of petroleum pollutants to revertants number crude waste from Graby-67 waste pit (repetition number n = 3, p < 0.05) 234

232 10 TA 100 -S9 10 TA 100 +S9 liczba rewertantów liczba rewertantów stenie zanieczyszcze [µg/ml] stenie zanieczyszcze [µg/ml] Rys Wpływ zanieczyszcze ropopochodnych na liczb rewertantów indukowanych gleba po procesie oczyszczania z dołu urobkowego Graby-67 (liczba powtórze n = 3, p < 0,05) Fig Influence of petroleum pollutants on revertants number post purification soil from Graby-67 waste pit (repetition number n = 3, p < 0.05) TA 100 -S9 TA 100 +S liczba rewertantów liczba rewertantów stenie zanieczyszcze [µg/ml] stenie zanieczyszcze [µg/ml] Rys Wpływ zanieczyszcze ropopochodnych na liczb rewertantów indukowanych odpad surowy z dołu urobkowego Graby-12 (liczba powtórze n = 3, p < 0,05) Fig Influence of petroleum pollutants to revertants number crude waste from Graby-12 waste pit (repetition number n = 3, p < 0.05) Do oblicze i graficznej ilustracji wykorzystano program producenta testu Ames a. Próbki mutagenne oznaczono gwiazdk. Zanieczyszczenia wyekstrahowane przy zastosowaniu rozpuszczalników organicznych z próbek gleby surowej z obu dołów urobkowych wpłynły na statystycznie istotne zwikszenie liczby szczepu testowego TA-100 (p < 0,05), natomiast dla szczepu TA-98 nie uzyskano pozytywnej odpowiedzi (brak wzrostu liczby rewertantów). Zastosowanie aktywatora frakcji mikrosomalnej S9 z wtroby szczura nieznacznie wpłynło na zwikszenie liczb mutacji powrotnych. Wskanik mutagennoci stosunek liczby rewentantów szczepów testowych, które pojawiły si na podłou bez histydyny, w wyniku kontaktu szczepów testowych z zanieczysz- 235

233 czeniami pochodzcymi z ekstraktów testowanych odpadów do liczby rewertantów spontanicznych, przy którym próbki surowe uznawano za mutagenne dla dołu urobkowego Graby- 67 wynosił: 3,10 4,13, natomiast dla Graby-12 miecił si w przedziale: 3,33 4,67 (nieznacznie wyszy, co koreluje z wysz zawartoci WWA w odpadzie z dołu Graby-12). Ekstrakty z próbek gleby po procesie oczyszczania w warunkach laboratoryjnych zarówno dla dołu urobkowego Graby-67, jak i Graby-12 nie wykazywały cech mutagennych (rys. 9.30, rys. 9.32). Wskaniki mutagennoci kształtowały si na nastpujcych poziomach: dla próbki po procesie oczyszczania z dołu Graby-67 w zakresie: 0,74 1,01, natomiast dla próbki oczyszczonej z dołu urobkowego Graby-12 w granicach: 0,78 1, TA 100 -S9 10 TA 100 +S9 liczba rewertantów liczba rewertantów stenie zanieczyszcze [µg/ml] stenie zanieczyszcze [µg/ml] Rys Wpływ zanieczyszcze ropopochodnych na liczb rewertantów indukowanych gleba po procesie oczyszczania z dołu urobkowego Graby-12 (liczba powtórze n = 3, p < 0,05) Fig Influence of petroleum pollutants to revertants number post purification soil from Graby-12 waste pit (repetition number n = 3, p < 0.05) Wyniki bada wskazuj na widoczn redukcj mutagennoci odpadów po przeprowadzonych procesach bioremediacyjnych w skali półtechnicznej (metoda ex-situ). Wyniki analiz fizyko-chemicznych i toksykologicznych odcieków z pryzm w trakcie prowadzonego procesu oczyszczania w warunkach laboratoryjnych (metoda ex-situ) dla odpadów z dołu urobkowego Graby-67 i Graby-12 zestawiono w tabeli Pocztkowo poziom zanieczyszcze w odciekach pochodzcych z odpadów przed bioremediacj był wysoki. Ponadto charakteryzowały si one znaczn toksycznoci, która jedynie nieznacznie ulegała zmniejszeniu w trakcie bioremediacji. Wysoki poziom toksycznoci odcieków moe wiadczy o obecnoci szkodliwych metabolitów porednich, pochodzcych z rozkładu zanieczyszcze ropopochodnych. Po zakoczeniu bioremediacji, jak wskazuj 236

234 wyniki testów toksykologicznych bezporedniego kontaktu (Microtox, Ostracodtoxkit F TM ), odcieki nie były toksyczne. Analiza fizyko-chemiczna odcieków z pryzm po zakoczeniu bioremediacji wykazuje dobr ich jako w niewielkim stopniu przekroczona została jedynie zawarto ChZT (Cr) i zawiesin. Tabela Wyniki analizy fizyko-chemicznej odcieków z pryzmy odpadu z dołów urobkowych Graby-67 i Graby-12 (warunki laboratoryjne, metoda ex-situ) Table Results of physico-chemical analysis of effluent from prisms of Graby-67 and Graby-12 soils (laboratory conditions, ex-situ method) Odciek z pryzmy Oznaczenia Jednostki Graby-67 Graby-12 A* B* C* A* B* C* ph 6,9 7,5 7,2 6,8 7,2 7,5 Przewodnictwo S/cm ChZT Cr mg O 2 /dcm BZT 5 mg O 2 /dcm OWO mg/dcm 3 75,7 44,7 11,5 62,4 30,8 9,5 TPH mg/dcm , ,2 BTEX mg/dcm 3 1,98 0,95 0,09 1,54 0,74 0,05 WWA mg/dcm 3 0,025 0,018 0,002 0,032 0,021 0,001 Azot ogólny mg/dcm 3 8,8 10,7 6,4 5,4 12,4 4,4 Azot amonowy mg/dcm 3 0,95 1,25 0,85 1,23 2,41 0,59 Azot azotanowy mg/dcm 3 0,15 0,35 0,052 0,08 0,25 0,02 Fosfor ogólny mg/dcm 3 0,28 0,38 0,05 0,31 0,45 0,06 Fosforany mg/dcm 3 0,11 0,05 0,02 0,09 0,02 n.s. Chlorki mg/dcm Oznaczenia toksykologiczne Microtox TU 11,5 5,98 B.T. 10,5 5,47 B.T. Ostracodtoxkit F (Zahamowanie wzrostu) A* - przed bioremediacj B* - w toku bioremediacji C* - po bioremediacji B.T. - brak toksycznoci % 35,4 19,7 2,1 30,5 16,8 1,9 237

235 Zanieczyszczone substancjami ropopochodnymi odpady stanowi pokany i stale rosncy udział w degradacji biologicznie czynnej powierzchni ziemi. Nale do nich równie odpady wiertnicze zdeponowane w starych dołach urobkowych, które przesycone rop naftow nawet po upływie kilkudziesiciu lat nie odzyskały, swojej aktywnoci biologicznej bez właciwie przeprowadzonej rekultywacji. Przeprowadzenie odpowiednich interdyscyplinarnych bada laboratoryjnych i terenowych rodowiska gruntowo-wodnego pozwoliło na opracowanie optymalnej metody oczyszczania odpadów z dołów urobkowych, charakteryzujcych si bardzo wysokimi zawartociami substancji ropopochodnych, przykładowo dla dołu urobkowego Graby-67 zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych zawieraj si w granicach: mg/kg s.m., natomiast dla dołu urobkowego Graby-12 mieszcz, si w zakresie od do mg/kg s.m. Tak wysoka zawarto zanieczyszcze uniemoliwia przeprowadzenie prac remediacyjnych opartych bezporednio na metodach biologicznych. Z tego wzgldu opracowano etapow technologi oczyszczania odpadów wiertniczych, która pozwala na stopniowe obnianie poziomu zanieczyszcze ropopochodnych i wprowadzanie kolejnych etapów majcych na celu głbsze doczyszczenie odpadu. Blokowy schemat etapowej technologii oczyszczania odpadów pochodzcych ze starych dołów urobkowych przedstawiono na rys Przed rozpoczciem prac remediacyjnych na danym dole urobkowym przeprowadza si pełn ocen stanu zgromadzonego odpadu wiertniczego wykonujc: analizy fizyko-chemiczne, analizy chromatograficzne składu zanieczyszcze ropopochodnych, analizy mikrobiologiczne, mineralogiczne i toksykologiczne. Uzyskane wyniki analiz pozwalaj na podjcie decyzji, czy badany odpad mona zakwalifikowa do grupy odpadów o kodzie ex * gleba i ziemia zanieczyszczona substancjami ropopochodnymi. Wówczas, po uzyskaniu decyzji administracyjno-prawnej zezwalajcej na unieszkodliwianie i odzysk zanieczyszcze ropopochodnych na 238

236 terenie danego dołu urobkowego (rozdział 3, rys. 3.4) i po zatwierdzeniu projektu rekultywacyjnego mona, przystpi do prowadzenia prac remediacyjnych. W zalenoci od charakteru oczyszczanego dołu urobkowego naley przeprowadzi osuszanie terenu (usunicie wód nasadowych skaonych substancjami ropopochodnymi), a nastpnie po rozpoznaniu rozkładu zanieczyszcze ropopochodnych przystpi do I etapu oczyszczania, obejmujcego wstpn remediacj realizowan poprzez drena melioracyjnoodciekowy. Etap ten pozwala na znaczne obnienie poziomu skaenia substancjami ropopochodnymi do mg/kg s.m. (w próbkach ujednoliconych). W celu opracowania wytycznych prowadzenia dalszych prac bioremediacyjnych na terenie dołu urobkowego wskazane jest przeprowadzenie bada w skali półtechnicznej (laboratoryjnej) metod ex-situ. Pozwalaj one na okrelenie wytycznych dla kolejnych etapów oczyszczania, tj.: modyfikacji struktury gleby/odpadu, bioremediacji podstawowej stymulowanej przez wzbogacenie rodowiska glebowowodnego w substancje biogenne i stworzenie optymalnych warunków wodnych i temperaturowych, bioaugmentacji (inokulacji) wstpnie oczyszczonego terenu biopreparatami, sporzdzonymi na bazie bakterii autochtonicznych i grzybów. Przeprowadzone badania miały na celu okrelenie proporcji zmieszania odpadu z czyst ziemi w celu modyfikacji jego struktury i dobór właciwych stosunków C:N:P dla poszczególnych obszarów oczyszczanego dołu urobkowego. Monitorowanie przebiegu kolejnych etapów procesu oczyszczania umoliwia okrelenie efektywnoci poszczególnych etapów procesu oczyszczania oraz ustalenie przyblionych ram czasowych poszczególnych etapów. Prowadzone badania mikrobiologiczne miały na celu opracowanie preparatu biologicznego na bazie mikroorganizmów autochtonicznych, którego efektywno biodegradacji zanieczyszcze ropopochodnych testowano w skali półtechnicznej (metoda ex-situ, badania na pryzmach). Badania te s pomocne przy podejmowaniu decyzji o ewentualnej modyfikacji biopreparatu o wytypowane gatunki grzybów, mogcych zwikszy zdolno biodegradacji poprzez zastosowanie go w kocowej fazie oczyszczania. W skali laboratoryjnej realizujc kolejne etapy oczyszczania tj. bioremediacj podstawow, inokulacj biopreparatem na bazie bakterii autochtonicznych oraz inokulacj biopreparatem wzbogaconym o wytypowane rodzaje grzybów uzyskano obni- enie zawartoci zanieczyszcze ropopochodnych do poziomu nieprzekraczajcego obowizujcych standardów jakoci gleby i ziemi. 239

237 I rok oczyszczania in-situ Wstpne osuszenie terenu dołu urobkowego Remediacja wstpna drena melioracyjno-odciekowy Analizy - fizyko-chemiczne, - chromatograficzne, - mikrobiologiczne, - mineralogiczne - toksykologiczne Zakwalifikowanie odpadu do kategorii ex * Sporzdzenie wniosku i uzyskanie decyzji zezwalajcej na odzysk i unieszkodliwianie metod in-situ oraz zatwierdzenie projektu rekultywacyjnego Badania półtechniczne (metoda ex-situ) Badania laboratoryjne (metoda ex-situ) Badania modyfikacji struktury odpadu Okrelenie parametrów modyfikacji struktury odpadu II rok oczyszczania in-situ Modyfikacja struktury gleby i ziemi Bioremediacja podstawowa Inokulacja biopreparatem na bazie bakterii autochtonicznych: Seria I Inokulacja biopreparatem na bazie bakterii autochtonicznych: Seria II Badania bioremediacji podstawowej Badania inokulacji biopreparatem na bazie bakterii autochtonicznych okrelenie efektywnoci Okrelenie dawek wapna nawozowego Okrelenie dawek substancji biogennych Opracowanie biopreparatu na bazie bakterii autochtonicznych okrelenie efektywnoci Bioremediacja podstawowa III rok oczyszczania in-situ Inokulacja biopreparatem na bazie bakterii autochtonicznych I seria Inokulacja biopreparatem na bazie bakterii autochtonicznych wzbogaconym o wytypowane gatunki grzybów II seria Badania inokulacji biopreparatem na bazie bakterii autochtonicznych i grzybów okrelenie efektywnoci Kocowa kontrola efektywnoci oczyszczania wykonanie analiz: fizyko-chemicznych, chromatograficznych, mikrobiologicznych i toksykologicznych Opracowanie biopreparatu na bazie bakterii autochtonicznych i grzybów okrelenie efektywnoci Rys Blokowy schemat etapowej technologii oczyszczania odpadów wiertniczych z zanieczyszcze ropopochodnych Fig Block scheme of stage technology of waste purification Decyzja o zakoczeniu rekultywacji i przekazanie terenu do uytkowania lenego 240