KATEDRA ROZRODU Z KLINIKĄ ZWIERZĄT GOSPODARSKICH LEK. WET. MONIKA SIKORA

Transkrypt

1 UNIWESYTET PRZYRODNICZY WE WROCŁAWIU WYDZIAŁ MEDYCYNY WETERYNARYJNEJ KATEDRA ROZRODU Z KLINIKĄ ZWIERZĄT GOSPODARSKICH LEK. WET. MONIKA SIKORA OCENA PRZYDATNOŚCI POPŁUCZYN, BADANIA HISTOPATOLOGICZNEGO ENDOMETRIUM ORAZ BIAŁEK OSTREJ FAZY W DIAGNOSTYCE CHORÓB MACICY KLACZY PRACA DOKTORSKA PROMOTOR: DR HAB. ROLAND KOZDROWSKI, PROF. NADZW. Wrocław 2017

2 Pragnę złożyć serdeczne podziękowania wszystkim osobom, dzięki którym mogła powstać niniejsza praca. Szczególne podziękowania kieruję do mojego Promotora, Profesora Rolanda Kozdrowskiego za cenne uwagi i pomoc merytoryczną w tworzeniu tej pracy. Kierownikowi prof. Wojciechowi Niżańskiemu oraz wszystkim pozostałym osobom z Katedry Rozrodu za niepowtarzalną atmosferę tego miejsca. Wszystkim osobom zaangażowanym w badania: dr hab. Marcinowi Nowakowi, prof. nadzw. dr hab. Jarosławowi Królowi oraz prof. Tadeuszowi Stefaniakowi. Dr Jucie Sielhort za zainteresowanie mnie tematem rozrodu koni. Gudmarowi Aubertsson za opiekę podczas mojego pobytu w Islandii i pomoc finansową. Dr hab. Magdalenie Gawron za pomoc w zdobyciu finansowania Grant Plus.

3 Pracę dedykuję moim najbliższym, dziękując im w ten sposób za ich wsparcie i wiarę we mnie. Moim rodzicom, Renacie i Rajnoldowi za nieustanną akceptację moich wyborów. Dzięki Waszej pomocy mogłam się rozwijać. Kochanemu Henrykowi za pomoc na każdym szczeblu tworzenia tej pracy.

4 1. Streszczenie w języku polskim Ocena przydatności popłuczyn, badania histopatologicznego endometrium oraz białek ostrej fazy w diagnostyce chorób macicy klaczy. Materiał do badań został pobrany w Klinice dla Koni, Dyraeleknir Sandholaferja, w Hella, w Islandii w sezonie rozrodczym od maja do sierpnia w 2014 roku. Badania zostały przeprowadzone za zgodą Lokalnej Komisji Etycznej w Islandii (nr ), wydanej 27 lutego 2014 w Selfoss w Islandii. Grupę badaną stanowiły 53 klacze, rasy Kuc Islandzki, w wieku od 3 to 25 lat (12.34 ± 5.72) z podejrzeniem podklinicznego zapalenia macicy. Klacze z grupy badanej zostały zakwalifikowane do badania na podstawie wywiadu, z historią minimum 3 nieudanych kryć lub sztucznych inseminacji nasieniem płodnego ogiera w jednym sezonie rozrodczym lub historią niepłodności w roku poprzednim. Zwierzęta nie były wcześniej leczone na zapalenie macicy, a badaniem ultrasonograficznym została potwierdzona ruja oraz wykluczona obecność płynu zapalnego w macicy. Dodatkowo nie zaobserwowano patologicznych wypływów ze sromu. Badanie oraz pobieranie materiału odbywało się w poskromie, po wcześniejszym przygotowaniu klaczy. Zwierzęta wprowadzano do poskromu i przeprowadzono manualne badanie per rectum, połączone z badaniem ultrasonograficznym (Ge Logiq Book XP, USA) w celu potwierdzenia rui i wykluczenia obecności płynu zapalnego wewnątrz macicy. Oceniono również ułożenie warg sromowych, które u wszystkich klaczy było prawidłowo ukształtowane (80% długości warg sromowych leżało poniżej spojenia łonowego). Następnie ogon został zabandażowany, okolica sromu została umyta roztworem betadyny (Betadine - Polyvidonum iodinatum, MEDA Pharma S.p.A., Milan, Włochy) i przetarta papierowym ręcznikiem. Kolejność pobierania prób była zawsze taka sama. Początkowo wprowadzono do macicy metodą po palcu z zachowaniem zasad higieny sterylną, komercyjnie dostępną wymazówkę 4

5 domaciczną (Minitube, Tiefenbach, Niemcy) w celu pobrania materiału komórkowego z endometrium. Następnie przeprowadzono płukanie macicy jednym litrem płynu fizjologicznego o temp. 38 o C za pomocą sterylnego, komercyjnie dostępnego zestawu do płukania macicy (EQUIVET, Kruuse, Dania). Przewód do płukania macicy został manualnie wprowadzony do macicy metodą po palcu z zachowaniem zasad higieny. Jeden litr ciepłego płynu fizjologicznego wprowadzono do macicy, rozprowadzono, a następnie za pomocą siły grawitacji, odzyskano do tego samego worka i oceniono makroskopowe zmiany popłuczyn. Tak pozyskane popłuczyny zostały odstawione na 1 godzinę, a następnie z dna worka za pomocą sterylnej igły i strzykawki pozyskano 50 ml popłuczyn i odwirowano (x400g przez 10 min). Z odwirowanych popłuczyn odlano supernatant, a z osadu pobrano materiał za pomocą sterylnej wymazówki i wykonano rozmaz na sterylnym szkiełku mikroskopowym oraz posiew na podłożach mikrobiologicznych. W następnej kolejności pobrano dwie biopsje endometrium i w tym celu sterylne kleszczyki biopsyjne (Equi-vet, Kruuse, Dania) z zamkniętymi szczękami zostały wprowadzone do macicy metodą po palcu z zachowaniem zasad higieny. Druga ręka osoby pobierającej biopsję została wprowadzona do prostnicy, aby nakierować kleszczyki odpowiednio do lewego i prawego rogu macicznego. Wycinki endometrium pobrano z grzbietowej ściany nasady każdego rogu macicznego: najpierw z lewego, a następnie z prawego i umieszczono w 10% formalinie. Na koniec od każdej klaczy została pobrana krew, a uzyskana po odwirowaniu surowica, została zamrożona i przechowywana w temp. -20 o C. Grupę kontrolną stanowiło 20 klaczy rasy Kuc Islandzki, użytkowanych i utrzymywanych w takich samych warunkach jak klacze z grupy badanej. Wszystkie klacze podczas pobierania prób krwi były w rui, a w badaniu ultrasonograficzny nie miały płynu 5

6 zapalnego w macicy, ani patologicznych wypływów ze sromu. Każda z klaczy z grupy kontrolnej była inseminowana, a następnie godzin po owulacji pobrano od nich krew. Dalszej analizie poddano jedynie te próbki surowicy, które pochodziły od klaczy, u których po 15 dniach od owulacji w badaniu ultrasonograficznym została zdiagnozowana ciąża. Grupa ta służyła do określenia stężenia SAA i Hp u zdrowych i płodnych klaczy. Stężenie SAA i Hp w surowicy niepłodnych klaczy zostało porównane ze stężeniem tych białek we krwi, pobranej od zdrowych klaczy, które podczas pobierania krwi nie były źrebne, ale u których po 15 dniach została zdiagnozowana ciąża. Preparaty cytologiczne, wykonane z wymazówki domacicznej oraz z osadu, uzyskanego z popłuczyn, po wyschnięciu zostały zabarwione barwnikiem Diff Quick (Medion Diagnostics AG, Düdingen, Szwajcaria), a następnie ocenione pod imersją w powiększeniu (1000x). Za każdym razem liczono 300 komórek, a 2 % lub więcej neutrofilów świadczyło o zapaleniu macicy. Następnie z materiału pobranego komercyjną wymazówką domaciczną oraz z osadu z popłuczyn wykonano rozmaz na następujących podłożach mikrobiologicznych: agar z krwią (biomérieux, Francja, z dodatkiem 5 % krwi owczej), MacConkey Agar (biomérieux, Francja) i Sabouraud Dextrose Agar (Oxoid, UK). Podłoża zostały inkubowane w temperaturze 37 C w warunkach tlenowych i po 24 godzinach oceniono wzrost bakterii. Podłoża, na których nie stwierdzono wzrostu były dalej inkubowane i oceniane po 48 i 72 godzinach w celu wykrycia obecności bakterii tlenowych i grzybów. Posiew uznawano jako monokulturę, gdy 90% wzrostu na podłożu należało do jednego gatunku drobnoustroju. Posiew kwalifikowano jako mieszany, gdy wykazano wzrost więcej niż trzech gatunków bakterii i uznawano go za kontaminację, a próbę określano jako negatywną [12,21]. Dalsza ocena mikrobiologiczna została wykonana w Laboratorium Zakładu Mikrobiologii, Katedry Patologii Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu. 6

7 Pobrane wycinki endometrium umieszczono w 10% formalinie i wysłano do Zakładu Patomorfologii i Weterynarii Sądowej, Katedry Patologii Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu, gdzie następnie została wykonana ocena histopatologiczna oraz immunohistochemiczna. Z wycinków endometrium wykonano bloczki parafinowe, które następnie pokrojono na skrawki o grubości 4 μm. Ocenę histopatologiczną przeprowadzono na zabarwionych hematoksyliną i eozyną preparatach mikroskopowych pod powiększeniem (400x). Mikrofotografie badanych wycinków zostały poddane wspomaganej komputerowo analizie obrazu za pomocą komputera wyposażonego w program cell^a software (Olympus Soft Imaging Solution GmbH, Germany) sprzężonego z mikroskopem optycznym Olympus BX53 wyposażonym w cyfrową kamerę model ColorView IIIu (Olympus, Japan). Oceniono napływ neutrofili do nabłonka powierzchniowego oraz warstwy zbitej endometrium oraz zmiany wg skali Kenney i Doig [16]. Obecność 3 lub więcej neutrofili w pięciu polach widzenia pod powiększeniem (400x) świadczyła o zapaleniu [1,24,25]. Ponadto przeprowadzano reakcje immunohistochemiczne (IHC) z użyciem przeciwciał skierowanych przeciwko fibronektynie oraz PTGS-2. Ekspresja fibronektyny została oceniona w zrębie międzykomórkowym, natomiast ekspresja PTGS-2 w nabłonku powierzchniowym oraz w nabłonku gruczołowym. Podczas oceny ekspresji tych białek wyróżniano 3 typy reakcji barwnej: słaba reakcja (1), umiarkowana reakcja (2) i silna reakcja (3), jak również brak reakcji (0). Ocena została przeprowadzona przez dwóch niezależnych histopatologów. Próbki krwi pobrano od wszystkich klaczy godz. po owulacji, a następnie odwirowano surowicę, zamrożono i w suchym lodzie wysłano do Zakładu Immunologii i Prewencji Weterynaryjnej, Katedry Immunologii, Patofizjologii i Prewencji Weterynaryjnej, Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu, gdzie oznaczono stężenie surowiczego amyloidu A oraz haptoglobiny. Stężenia SAA i Hp klaczy z grupy badanej zostały porównane ze stężeniami tych białek w surowicy krwi pobranej od grupy kontrolnej. 7

8 Wszystkie wyniki zostały poddane analizie statystycznej z wykorzystaniem programu STATISTICA (StatSoft, Kraków, Polska). Do oceny materiału wykorzystano następujące testy diagnostyczne: test Fishera, test niezależności chi-kwadrat oraz określono współczynnik zgodności Kappa (Kappa k) i współczynnik Spermanna. Istotność statystyczna przyjęto dla P<0.05. Określono czułość, swoistość, wartość predykcyjną dodatnią i ujemną. Wyniki zostały opublikowane w formie dwóch artykułów. Część wyników, dotycząca badania mikrobiologicznego, cytologicznego, korelacji stężeń BOF oraz badania histopatologicznego zostały przedstawione w pierwszej publikacji pt. The usefulness of uterine lavage and acute phase protein levels as a diagnostic tool for subclinical endometritis in Icelandic mare. Artykuł ukazał się w Acta Veterinaria Scandinavica. Na podstawie badania histopatologicznego endometrium u 25 klaczy zostało zdiagnozowane zapalenia macicy. Zaobserwowano korelację pomiędzy mętnymi popłuczynami oraz: (1) infiltracją neutrofili do endometrium (P = 0.031), (2) dodatnim wynikiem badania cytologicznego w próbkach uzyskanych za pomocą wymazówek (P = 0.019) i z popłuczyn (P = 0.011), oraz (3) pozytywnymi wynikami badań mikrobiologicznych z próbek uzyskanych z wymazówki (P = 0.001) i z popłuczyn (P = 0.047). Nie stwierdzono związku pomiędzy stężeniem białek ostrej fazy i infiltracją PMN do endometrium, a pozytywnymi wynikami badań cytologicznych i mikrobiologicznych. Niemniej jednak zaobserwowano wyższe stężenie SAA u klaczy, podejrzanych o podkliniczne zapalenie macicy, w porównaniu z klaczami z grupy kontrolnej. Natomiast kolejna część wyników, dotycząca oceny ekspresji fibronektyny i PTGS-2 oraz korelacji z infiltracją PMN (polymorphonuclear cell), jak również ze stopniem zmian endometrium wg skali Kenney i Doig [16] zostały przedstawione w drugim artykule pt. Reliability of histopathological examination and immunohistochemistry of a single biopsy 8

9 for evaluation of endometrial health in Icelandic mares, który ukazał się z Folia Histochemica et Cytobiologica. U dwudziestu sześciu klaczy z grupy badanej (49%) wykazano różnice w stopniu zmian wg skali Kenney i Diog [16] w dwóch wycinkach endometrium (P=0.0015). Zaobserwowano statystycznie istotne różnice w ekspresji fibronektyny w macierzy zewnątrzkomórkowej (P=0.001), jak również w ekspresji PTGS-2 w nabłonku powierzchniowym (P=0.017) w dwóch wycinkach endometrium, pobranych od jednej klaczy. Dodatkowo wykazano statystycznie istotne zależności pomiędzy ekspresją PTGS-2 w nabłonku powierzchniowym oraz fibronektyną w macierzy, a naciekiem PMN do endometrium, jak również stopniem zmian endometrium wg skali Kenney i Doig [16]. Wyniki przedstawione w tej pracy dowodzą, że pojedyncza biopsja endometrium może nie być wystarczająca do zdiagnozowania stanu zdrowia macicy u klaczy rasy Kuc Islandzki. Szczegółowe informacje nt kwalifikacji klaczy do badań, metodyki, analizy statystycznej, jak również podsumowanie wyników znajdują się w publikacjach. 9

10 2. Streszczenie w języku angielskim The usefulness of uterine lavage, histopathological examination and acute phase protein levels as a diagnostic tool for uterine health in mares All samples were collected from Icelandic Horse mares, in estrus, during one breeding season from May to August 2014 in Dýralæknir Sandhólaferja Veterinary Clinic, Hella, Iceland. This study was approved by the Icelandic Food and Veterinary Authority Matvælastofnun in Selfoss on 27 February Reference number of approval , valid until The animals were handled according to good ethical standards. The study group consisted of 53 mares, aged from 3 to 25 (12.34 ± 5.72) years, with a history of infertility. All these mares were suspected for subclinical endometritis. They were qualified for the study based on the following criteria: they had been bred three or more times unsuccessfully in the same breeding season, or had a history of a minimum of one year's reproductive failure. All the mares were in estrus, ultrasound examination of the reproductive tract showed no intrauterine fluid and no discharge from the vagina was observed. All were clinically healthy, they were kept under the same conditions and none was previously treated for endometritis. All mares were examined while restrained in stocks. The sample collections were performed after a complete reproductive assessment of the mares, including evaluation of the external genital tract and manual transrectal palpation as well as ultrasonography examinations (using Ge Logiq Book XP, USA) of the reproductive tract to determine the cycle stage and to exclude intrauterine fluid. During the examination of the external genital tract, in all of these mares 80% of the labia lengths were below the pelvic brim. Afterwards, the tail was bandaged, the vulva and the perineum were cleaned with povidone-iodine (Betadine - Polyvidonum 10

11 iodinatum, MEDA Pharma S.p.A., Milan, Italy) and dried with a paper towel and samples were always collected in the same order: swab, lavage and biopsies. First, for cytological and bacteriological examinations, material from the uterus was collected using a double-guarded uterine cotton swab (CS; Minitube, Tiefenbach, Germany). The cotton swab was inserted into the uterus by manually passing it through the cervix. Then, uterine lavage (UL) was performed using a commercial sterile uterus flushing tube (EQUIVET Uterine Flushing Tube Sterile; Kruuse, Denmark). The sterile catheter for UL was manually passed into the uterus and 1 L of sterile physiological saline warmed to 38ºC was infused from a bag into the uterus. The fluid was allowed to become distributed within the uterus and then collected into the same bag by gravity flow. The clarity of the recovered fluid was recorded and the bag was hung for sedimentation by gravity for at least 1 h. Then, 50 ml of efflux was aspirated from the bottom of the bag by puncturing it with a sterile needle into a 50 ml tube and centrifuged at x400g for 10 minutes. The supernatant was decanted and the sediment was used for cytological and bacteriological examinations. After lavage, two endometrial biopsies (EB) were taken from the dorsal wall of the base of each uterine horn (left and right). The biopsies were collected using a sterilized biopsy punch (Equi-Vet, Kruuse, Denmark) that was manually passed through the cervix and then directed into the left and right horns with a finger and through rectal manipulation with the other hand. The biopsies were always taken in the same order: first from the left and then from the right horn. The endometrial biopsies were immediately fixed in 10 % formalin. Blood samples were collected once from 12 to 24 h after ovulation. After centrifugation, the. serum was stored at -20 C. The control group comprised 20 fertile mares of the Icelandic Horse breed, which became pregnant after insemination or natural covering. All these mares were clinically healthy, kept under the same conditions and had no history of infertility. In this group, blood samples were 11

12 collected to determine the concentrations of SAA and Hp in healthy, fertile mares which subsequently became pregnant after insemination. All of the mares were in estrus, with no intrauterine fluid observed in the ultrasound examination and no discharge from the vagina. Blood samples were collected 12 to 24 hours after ovulation. Fifteen days after ovulation, a pregnancy check was performed with ultrasound. From the material collected, only plasma samples which came from mares diagnosed positively for pregnancy were used for the determination of SAA and Hp. The concentrations of SAA and Hp taken from 53 barren mares were compared with their levels in 20 non-pregnant mares that later conceived. This comparison was used to investigate differences in the concentrations of APP in barren mares and in healthy, fertile mares that achieved pregnancy at the first attempt. Cytological smears were performed on cellular material collected using cotton swabs and from a sterile swab that was placed into the sediment obtained from uterine flushing. The swabs were rolled onto a sterile microscope glass and air-dried. The smears were stained using Diff- Quick stain (Medion Diagnostics AG, Duedinden, Switzerland) and examined with light microscopy under oil immersion (1000x magnification) for the presence of polymorphonuclear cell (PMN). We counted 300 cells in each sample. When PMN cells represented more than 2% of all cells in the sample, it was considered positive for endometritis. Next, the same samples that had been used for cytology were placed on blood agar (biomérieux, France, supplemented with 5% defibrinated sheep blood), MacConkey Agar (biomérieux) and Sabouraud Dextrose Agar (Oxoid, UK) for microbiological examination. The media were incubated aerobically at 37 C for 24 h and the growth of microorganisms was recorded. Negative plates were further incubated and re-examined after 48 and 72 h for the presence of bacteria and yeasts. Then the plates were stored in a refrigerator and sent chilled to the Department of Pathology at the Wroclaw University of Environmental and Life Sciences, Poland, where microbiological examination was conducted. If more than 90% of the colonies on 12

13 a given plate were identical, they were considered as a positive and pure culture. Mixed cultures of three or more microorganisms were regarded as contaminations and recorded as a negative growth result. Non-pathogenic bacteria were recorded only if isolated in pure culture. Formalin-fixed biopsies were sent to the Department of Pathology at the Wroclaw University of Environmental and Life Sciences, Poland, cut into 4 µm sections and stained with eosin and hematoxylin. Evaluation was performed under light microscopy for infiltration by PMN of the endometrial luminal epithelium and the stratum compactum. Samples were considered positive for acute endometritis if three or more PMN per five fields (400x magnification, BX53 optical microscope Olympus, Tokyo, Japan) were found in at least one of the biopsies. Microphotographs of all the tissues studied were subjected to a computer-assisted image analysis via a computer coupled to a BX53 optical microscope (Olympus, Tokyo, Japan). The setup had the ability to both record images and analyze them digitally. The measurements were carried out using Cell A software (Olympus Soft Imaging Solution GmbH, Munster, Germany). Next, the same biopsies were also used to evaluate the intensity of PTGS-2 and fibronectin immunohistochemical staining. The expression of fibronectin was evaluated in stroma and the expression of PTGS-2 was evaluated in the surface and in the glandular epithelium. The relative staining intensity for immunoreactive fibronectin and PTGS-2 protein expression was assessed visually in endometrial biopsies (n = 2 per animal) from each mare by two independent observers. Intensity of immunohistochemical labeling was quantified using a subjective score, i.e. (0) no staining, (1) weak staining, (2) moderate staining or (3) strong staining, and an overall score was generated by averaging the scores provided by each researcher. Blood samples were collected once from 12 to 24 h after ovulation and the serum was stored in a freezer and sent on dry ice to the Department of Immunology, Pathophysiology and 13

14 Veterinary Preventive Medicine at the Wroclaw University of Environmental and Life Sciences in Poland, where the concentration of APP was determined. Statistical analyses were performed using STATISTICA (StatSoft, Krakow, Poland). The following tests were used for statistical analysis: Fisher exact test, the chi-square test (NW) and Spearman test. Moreover, the Cohen s coefficient (k) was calculated,. The significance level was set at P<0.05. We calculated sensitivity, specificity, the positive predictive value and the negative predictive value. The results were published in two articles. The first part of the results, about microbiological examination, cytology, APP correlation, as well as histopathology were presented in the first article The usefulness of uterine lavage and acute phase protein levels as a diagnostic tool for subclinical endometritis in Icelandic mares, published in Acta Veterinaria Scandinavica. Twenty-five mares were classified as positive for endometritis based on endometrial biopsy used as the gold standard. We observed a correlation between cloudy efflux and 1) PMN infiltration of the endometrium (P=0.031), 2) positive cytology in samples obtained by cotton swabs (P=0.019) and uterine lavage (P=0.011), and 3) positive microbiology from samples obtained by cotton swabs (P=0.001) and uterine lavage (P=0.047). We found no statistically significant relationship between the concentration of acute phase proteins and infiltration of the endometrium by PMN, or with positive results of cytological and microbiological examinations. However, we observed higher concentration of SAA in blood samples taken from subfertile mares, and then taken from fertile mares. The other part of the study, about the expression of fibronectin and PTGS-2, and the correlation between PMN infiltration, as well as the score according to Kenney and Diog [16] classification were presented in Reliability of histopathological examination and 14

15 immunohistochemistry of a single biopsy for evaluation of endometrial health in Icelandic mares, published in Folia Histochemica et Cytobiologica. In our study, twenty-six of 53 mares (49%) showed differences in the biopsy score between the left and the right uterine horns (P = 0.002). There were statistically significant differences in fibronectin expression (P = 0.001) as well as in PTGS-2 expression in the superficial epithelium (P = 0.017). Moreover, we observed statistically significant correlation between the PTGS-2 expression in the superficial epithelium, as well as the fibronectin expression in the stroma and the degree of the endometrium in the Kenney and Doig [16] grading system. The results between two endometrial biopsies obtained from individual mares demonstrated that a single biopsy could be insufficient for diagnosing uterine health status in Icelandic mares. A summary of the mare s classification to the study, methodology, statistical analyses as well as the detailed results are included in the published studies.