Aparatura HPLC. Informacje ogólne

Transkrypt

1 Aparatura HPLC Informacje ogólne Obecnie najważniejsze firmy produkujące chromatografy cieczowe oferują aparaty o bardzo zbliżonej konstrukcji podstawowych modułów. Różnice polegają na jakości materiałów, jakości wykonania, zakresu możliwości funkcjonalnych oprogramowania i wygody jego użytkowania, ale także niekiedy zakresu wyposażenia aparatu w detektory różnego typu, a niekiedy także różne są własności użytkowe oferowanych detektorów. Warto zwrócić uwagę, czy producent aparatury legitymuje się certyfikatem systemu zapewnienia jakości w/g normy ISO Najważniejsze moduły chromatografu cieczowego: A) Aparat typu izokratycznego (stały skład eluenta) B) Aparat typu gradientowego (programowanie składu zmian eluenta albo stały skład). Różnica dotyczy tylko modułów 1 i. z rys. 1 (poniżej), tzn. system zasilania kolumny eluentem. Systemy zasilania występują w aparatach różnego typu i różnej ceny w dwóch opcjach: a) z zastosowaniem zaworów proporcjonujących (-4 zawory proporcjonujące) po stronie ssącej pompy opcja tańsza, lecz ma wady, b) z zastosowaniem dwóch do czterech równolegle pracujących pomp o wzajemnie zmienianej wydajności. Znaczenie symboli na rys. 1-3:

2 1, 1, 1, 1 Butelka z eluentem lub składnikiem eluenta (A, B, C, D) albo specjalny pojemnik eluenta z systemem odgazowania eluenta helem. F - filtr cieczy ze spieku porowatego. 0,1 10 ml / min " klasyczna", - Pompa 0,01 1,0 ml / min μkolumnowa ml / min preparatywna 3 (D) - zawór dozujący albo autosampler Ko - kolumna ochronna (5) K - kolumna właściwa separacyjna 4 - komora termostatyczna 6 - detektor lub szeregowo połączone detektory 7 - integrator lub komputerowy system rejestracji i przetwarzania danych oraz sterownik aparatu 8 - mikser (mieszalnik) statyczny lub dynamiczny PK - prekolumna; w celu nasycenia eluenta fazą stacjonarną, dla zabezpieczenia właściwej kolumny przed zdzieraniem fazy stacjonarnej Najważniejsze parametry i informacje na temat modułów składowych aparatury chromatograficznej HPLC. 1. Pompy Najczęściej tłokowe typu ssąco-tłoczącego jednogłowicowe, dwutłokowe: z jednym tłokiem pracującycm jako pompa (zawory ssąco-tłoczące szafir, rubin) i z drugim tłokiem o ruchu przesuniętym w fazie o 180, pracującym z wydajnością ½ (50%) wydajności tłoczenia tłoka czynnego jako antypulsator. Wydajność najczęściej regulowana automatycznie w zakresie 0,1 10 ml/min., ciśnienie do 43Mpa. Bywają też stosowane pompy z dwiema lub trzema głowicami z zaworami ssąco-tłoczącymi i tak napędzame są tłoki, aby wyeliminiwać pulsacje ciśnienia (wydajności) cieczy. Schemat ideowy pompy dwugłowicowej z jednym tłokiem czynnym i jednym tłokiem biernym Schemat ideowy pompy dwugłowicowej z dwoma czynnymi tłokami Inne urządzenia pompujące: pompy strzykawkowe, urządzenia bezpompowe zasilane spręż. Ar lub N (historyczne). Zawór dozujący lub autosampler

3 - połączenie przewodów w czasie napełniania pętli ( ładowanie ) połączenie przewodów w czasie wprowadzania próby do kolumny Często zawór Rheodyne Rh 715. Pojemności pętli: 0μl " klasyczne" 5μl 1 μl μkolumny 100μl semipreparatywna chromatografia lub oznaczanie śladów substancji 1000μl 3. Kolumny HPLC mikro - kolumny klasyczne kolumny analityczne semipreparatywne średnice d c [mm] 0,5 4 8 długość L c [mm] najczęściej 50 mm wielkość ziaren 3; 5; 10 15; 5 40 sorbenta [um] liczba półek teoretycznych na 1 m wypełnienia kolumny aaaaa ~1 tyś 4. Komora termostatyczna Zakres temperatur : pokojowa do 80 C lepiej : +4 C do 80 C (biochromatografia) Korzystne jest, aby termostatowany był również zawór dozujący. Trzeba też termostatować ciecz doprowadzaną do zaworu dozującego. Uwagi użytkowe: - warto co jakiś czas przepłukać przestrzeń za uszczelką w przypadku użycia bufora jako eluenta. - Pulsacyjna praca pompy może być spowodowana przylepianiem się zaworu ssącego do gniazda oczyścić w acetonie, izopropanolu, wodzie, w detergencie w łaźni ultradźwiękowej. - Ważne, aby wszystkie filtry były drożne - przepłukiwać w przepływie w przeciwnym kierunku niż praca filtra, stosując wibracje ultradźwiękowe. - Filtry mogą być zapychane przez bakterie stosować NaN 3 lub inne substancje bakteriobójcze jako dodatki do eluenta nietrującego dla bakterii. Elucja gradientowa praktyczne problemy stosowania 1. Problem odpowietrzenia cieczy zapobieganie złej pracy pompy, wysokim szumom detektora, utlenianiu katalitycznemu na sorbencie Metody: He, ultradźwięki, próżnia, wrzenie, permeacja gazu przez membranę. Problem interakcji objętości podczas mieszania (urządzenia wysokociśnieniowe)

4 3. Zniekształcenia przebiegu programu w wyniku mieszania cieczy w elementach aparatury (urządzenie z zaworami proporcjonującymi) i możliwość przeciwdziałania skutkom; konieczne określenie zastępczej objętości mieszania i opóźnienia transportowego aparatu 4. Kwestia optymalne objętości miksera 5. Problem interferencji pompa zawory proporcjonujące 6. Zalecenia praktyczne - Odłączyć kolumnę. - określić eksperymentalnie υ o, υ a (test aparatury) - sprawdzić realizację w praktyce linii prostej, gradientu skokowego oraz powtarzalność realizacji w warunkach liniowej odpowiedzi detektora. - zminimalizować zbędne objętości mieszania. - możliwość stosowania desynchronizacji pracy tłoków pompy i zaworów proporcjonujących - 7. Wpływ zanieczyszczeń eluenta na przebieg linii bazowej podczas ślepej próby i możliwość odejmowania tego przebiegu (po przyłączeniu kolumny) 8. Metody oczyszczania rozpuszczalników: H O, CH 3 OH, THF, Hexan patrz Vogel Preparatyka organiczna Detekcja w LC 1. Zasady ogólne

5 - poziom szumów i pojęcie czułości detektora, np AU/FS, tzn. poziom szumów <10-5 Jedn. Absorbancji: Cz=Syg./szum - dryf detektora < 0% skali 100%, np.: 10-4 AU/h - zakres liniowości detektora, np. S i = k C i x, x (0,98; 1,0) - selektywność detektora s=(c /C 1 ) > 10 n ; im bardziej n>1 tym bardziej selektywny detektor t / T - stała czasowa detektora (T) S = S ( e ) 0 1 mv - detektor stężeniowy: S s = C s C i ; ( S s = f(c i ) ); mg / ml mv dm - detektor masowy: S m = C m W C i ; ( S m = f ); mg / S dt. Zestawienie najważniejszych metod detekcji cechy charakterystyczne Typ UV-VIS klasyczny UV-VIS DAD Refraktometr ( RI ) Fluorescencyjny ( FL ) - interferencyjny ~0,8 pg/ml PAH, katecholaminy, leki, płyny fizjol., b. czuły i łatwy w stosowaniu Elektrochemiczny ( EC ) Konduktometryczny Zakres przydatności granica oznaczalności selektywny, substancje aktywne w UV- ~*10-5 Jedn. ~0, ng/ml VIS (00-800nm) Absorb. lub odwrócona detekcja UV, stężeniowy [jedn.absorb] nm fotoelementów b.przydatny uniwersalny (GPC) elucja gradientowa wykluczona selektywny dla substancjji fluoryzujących naturalnie lub odpowiednich pochodnych - kulometryczny (rzadko) - amperometryczny (3 elektrody) Selektywny tylko dla łatwo redukowalnych lub utlen. sub. jonoselektywny ~0,5 ng/ml ~5*10-5 Jedn.Absor. ~0,7 μg/ml ~ 10 7 Jedn. Refr. zakres liniowości uwagi Bardzo szeroki zakres wykorzystania, najważniejszy w HPLC Szczególnie potrzebny podczas doboru warunków rozdzielania, informacje jakościowe Typ - refleksyjny, - odchyleniowy, ~1 pg/ml - b. trudny w stosowaniu, możliwość zatrucia elektrod; b.czuły, ±1, V do 0,% różnicy przewodnictwa substancji 10 5 detekcja jonów w chromatografie jonowym Reakcyjna detekcja selektywny jak fluorescencyjny lub UV-VIS bardzo szerokie zastosowanie. Problem reaktora i rozmycia dodatkowego. Radioaktywność selektywność - do ok. 000 konieczny scyntylator

6 Spektrom. masowy ogromna rozkł/min. uniwersalny i do 0,1 pg/ml 10 7 b. przydatny, kosztowny b.czuły, jakościowy i ilościowy Dyspersja masy i ocena kolumny 1. Dyspersja masy jako efekt niekorzystny lecz nieunikniony ' 1 α 1 k Rs = N ' 1 4 k 1 α + N = L c H. Zjawiska powodujące dyspersję (najważniejsze) a) wewnątrz kolumny ( w warstwie wypełnienia) Profil tłokowy jako warunek podstawowy. H c σ B + A + ( Cm + Cs ) u L u Dyfuzja molekul. Dyfuzja wirowa (mieszanie strumieni) Opory przenoszenia masy w fazie ruchomej (m) i stacjonarnej (s) równanie Van Deemtera b) poza kolumną (poza warstwą wypełnienia) Vi - dozowanie: σ = + τ 1 v σ v ; σ L = S c ; - kapilary łączące σ v 1 4 k d k = L 14 w 1 D m - kuweta detektora i inne przestrzenie mieszające: σ v V M

7 - kieszenie i inne martwe przestrzenie - σ x w v Dm c) niedostateczna dynamika układu detektor rejestrator jako przyczyna pozornej dyspersji σ H =τ w v = H c + H ext + H poz d p 0 3. Oczekiwana sprawności kolumny (j. d c =4mm, w=1-1,5ml/min) d p [μm] N o [1/m] 10 μm 15 0 tyś. 7 μm tyś. 5 μm tyś. 3 μm tyś. 4. Warunki podczas testu kolumny - odtwarzanie warunków testu kolumny - test indywidualny proste substancje łatwo rozdzielające się liniowy zakres izotermy sorbcji mała objętość dozowania (V i < 0μl ), d c =4 mm, L c > 100 mm dobra dynamika układu detektor - rejestratorr 5. Test pełny kolumny winien opisywać: a) sprawność kolumny (N), b) przepuszczalność kolumny (Φ), c) selektywność kolumny (k, α), d) efekty pozakolumnowe ( ) e) asymetria pików (As 0,1 ) 1. Sprawność kolumny obliczanie na podstawie chromatogramu σ v ext

8 Lc H = 5,54 Lc N = H As 0,1 = u L S 1/ l = 5,54 b a c = = t0 Π d c lub l S 4w ε 1/ T Lc H = 16 ε T 0,75 S l μ lub H = Lc (M ) 1. Sprawność teoretyczna B 0, 33 h teor = + A ν + C ν ν H u d p h = ; ν = D d p M B=, A=1, C=0,1 3. Przepuszczalność d p u Lc η Φ = gdzie: K = K ΔP 500 < Φ < 000 najczęściej Test dla efektów pozakolumnowych

9 σ V ext σ cak v σ V extcak ext 1 S1 / ext, 53 w ν t HPLC Inne mechanizmy selektywności SEC/GPC wykluczanie molekularne sito molekularne chromatografia żelowa V e = V m/z + K d (V 0 V m/z ) dve S = - pojemność rozdzielcza kolumny GPC d ln M np.: ε K d V m / z m / z = Vt w k k 1 1 M r p 1/ w 3

10 ε 0 = V V t 0 V 0 V t = Π d m / z c L / 4 c ( Vt Vm / z = V + ) ε V w / z i ε i = Vt Rodzaje faz stacjonarnych (ogólnie): - pęczniejące (wymagające przygotowania) uwaga na ΔP - twarde liofilowe hydrofilowe dezaktywacja np. glikol polietylenowy Specyfika wykorzystania GPC dla biopolimerów białka, cukry, wirusy Możliwość łączenia kolumn Stosowane eluenty Eluent toluen THF aceton dwuchlorobenzen DMFA Siła elucyjna w/g Bartona 8,9 9,1 9,9 10,1 1,1 Problemy i zakłócenia, które trzeba brać pod uwagę: - możliwość oddziaływań sorbcyjnych, - pęcznienie i kurczenie się żelu pod wpływem różnych substancji - ściśliwość żelu, - b. wolna dyfuzja makromolekuł, - wzajemne przeszkadzanie molekuł i zatykanie niektórych porów, - polikondensacja makromolekół - i inne Ilościowe oznaczanie rozkładu mas cząsteczkowych metodyka: - kalibracja bezpośrednia problem posiadania wzorców, - kalibracja z wykorzystaniem polimerów polidyspersyjnych, - kalibracja uniwersalna log( [η] M w ) = f( V e ) Problem eliminacji wpływu dyspersji hydrodynamicznej podczas określania f(m w ) - dostępność specjalistycznego oprogramowania, - wyspecjalizowane integratory LLSD

11 Detekcja -: RI, UV, Lepkość, Typy żeli handlowych: Organiczne Nieorganiczne (często modyfikowane) dekstranowe (Sephadex G10-G00, LM-0, LH60, Sephacryl) silikażele (Lichrospher SI , TSK-GEL SW ) agarozowe (Sepharosc, Biogel A, Ultragel A, ) szkła porowate CPG Å akrylowe, metakrylowe (Biogel P, Ultragel ACA, alumina ) polistyrenowe (PS-DVB, TSK G1000-G7000, PORAGEL , Lichrogel PS ) Literatura M.Berek, M.Dressler, M.Kubin, K.Marcinka Chromatografia żelowa, PWN, Warszawa, 1989 Chromatografia jonowymienna IC 1. Typy wymieniaczy jonowych: a) Kationit (kwas) - mocny, np.: - słaby, np.: b) Anionit (zasada) - mocny, np.: - słaby, np.: c) wymieniacze z dodatkowymi oddziaływaniami sorbcyjnymi Szeregi w kierunku malejącej siły elucyjnej przeciwjonu: wymiana kationów: Ba +, Pb +, Sr +, Ca +, Ni +, Cd +, Cu +, Co +, Zn +, Mg +, Mn +, UO +, Te +, Ag +, Cs +, Rb +, K +, NH 4 +, H +, Li + wymiana anionów: cytrynian, siarczan, szczawian, BO 3-3, NO 3 -, PO 4-3, Br -, SCN -, CN -, NO -, Cl -, HCOO -, CH 3 COO -, F -, OH -, ClO -.. Wpływa na retencję: - typ wymieniacza jonowego, - ph fazy ruchomej, - siła jonowa fazy ruchomej,

12 - rodzaj przeciwjonu 3. Reguły ogólne - wzrost siły jonowej przeciwjonu obniża V R, - w przypadku wymiany kationu: wzrost ph obniża retencję; wyjątek: słabe wymieniacze kationów lepiej dysocjujące przy wzroście ph - w przypadku wymiany anionu spadek ph obniża retencję; wyjątek: słabe wymieniacze anionów lepiej dysocjujące przy niższym ph - rodzaj przeciwjonu w/g następujących reguł podwyższa retencję próby: im wyższy ładunek przeciwjonu, im mniejsza średnica przeciwjonu, im łatwiej polaryzowalny przeciwjon Zalecenia praktyczne - wykorzystanie dla separacji najwyżej 5% pojemności, - ph pk s + 1,5 (zasady) lub ph pk s 1,5 - substancje przeciwgrzybowe, przeciwgrzybiczne: NaN 3, kwas kapronowy, CCl 4, fenol, - płukanie tłoka pompy! Detekcja: - przewodnictwo elektr. konieczność stosowania supresji jonów! - odwrotna detekcja UV Alternatywy dla chromatografii jonowymiennej: - chromatografia par jonowych C18, C8, C?? - cofanie dysocjacji słabych kwasów lub zasad?? Przykłądy przeciwjonów?? - kwas p-amini benzoesowy Chromatografia powinowadztwa (affinity chromatography) Etapy: 1) związanie liganda z nośnikiem, ) sorbcja specyficzna cząsteczek P (powinowadztwo) 3) odszczepienie P czynnikiem o silniejszym powinowadztwie, zmiana ph, nadmiarowe stężenie jonów 4) reaktywacja sorbenta Przykłady oznaczanie glukohemoglobiny HbGl metoda kliniczna, przeciwciała z zastosowaniem Anty IgG ligandów proteiny roślinne z zastosowaniem Concanavaliny A i inne.

13 Rozdzielanie enancjomerów Mechanizmy - prekolumnowe lub wewnątrzkolumnowe tworzenie i separacja diastereoizomerów optycznie czynne dodatki do eluenta - wykorzystanie oddziaływań Π - Π, dipol dipol, -OH - H +, (optycznie czynne fazy stacjonarne) Typy faz stacjonarnych: - kompleksy Cu + aminokwas; rozdzielanie: aminokwasy, dwupeptydy, OH kwasy karboksylowe - polimery helicalne trójacetyloceluloza, poli-triphenyl metyl metakrylan, - β-cyklodextryna związana na SiO, - fazy chiralne typu szczotkowego tzw. fazy Pirkla, np. dinitrobenzoilofenyloglicyna, dinitrobenzoiloleucyna związane jonowo?? związane kowalencyjnie?? - Analiza ilościowa w chromatografii??????? 1. Metoda krzywej kalibracyjnej lub standardu zewnętrznego. Metoda wzorca wewnętrznego Substancja (wzorzec) dodawana do próbki nie może występować w próbce, musi mieć podobne właściwości jak substancja analizowana Zalety metody

14 nie jest konieczne precyzyjne dozowanie, możliwa złożona obróbka próby Wady niekiedy trudno dobrać wzorzec, stężenie wzorca w próbce musi być dokładnie znane 3. Metoda dodatku wzorca ( fortyfikacji ) - jednokrotny dodatek wymuszenie zer zero - dwukrotny dodatek zróżnicowany - pewniejszy Znaczenie symboli nie wyjaśnionych w tekście Aparatura HPLC - średnica wewnętrzna kolumny; - długość wypełnienia w kolumnie; w - natężenie przepływu eluenta objętościowo [ml/min]; d p - wielkość ziaren wypełnienia; X - ułamek objętościowy składnika B w eluencie; t - czas; υ - objętość eluenta, - objętość mieszania; - opóźnienie transportowe [ml], - zastępcza objętość mieszania w elementach chromatografu cieczowego, Δ - amplituda wahań stężenia składnika B w eluencie, C z - czułość detektora; S i, S s, S m, S 0 sygnał detektora, odpowiednio: S i w odpowiedzi na stężenie c i, S s detektora stężeniowego, S m detektora masowego, S 0 pełny sygnał odpoweidzi; d c L c V mix υ 0 υ a C s - czułość detektora stężeniowego; C m - czułość detektora masowego; m - masa substancji wpływającej do detektora; dm/dt - szybkość doprowadzania masy do detektora; UV-VIS - detektor foroabsorbcjometryczny; s - selektywność detektora; R s ½ - stopień rozdzielenia substancji /1 (pików /1); α - retencja względna, k - współczynnik retencji substancji II; N - liczba półek teoretycznych kolumny dla substancji ; d p - średnica ziaren wypełnienia kolumny; H - wysokość wypełnienia równoważna półce teoretycznej (HETP); H c - j.w., ale tylko dla samego wypełnienia (po odjęciu tzw. efektów pozakolumnowych); u - liniowa prędkość przepływu eluenta w kolumnie; σ v, σ L - liczone objętościowo (v) i liniowo (L) wariancje składowe rozkładu stężenia wzdłuż kolumny,

15 L - droga elucji; C, B, A, C m, C s, - stałe dla konkretnej kolumny i równania; Vi - objętość dozowania; S c - powierzchnia przekroju poprzecznego wypełnienia kolumny; L k - długość kapilary; d k - średnica kapilary; w - natężenie przepływu eluenta; D m - współczynnik dyfuzji molekularnej w eluencie V m - objętość mieszania; X - wymiar znamienny kolory; τ - stała czasowa detektora (0,63 amplitudy So osiągane jest po czasie τ) H ext - wysokość równoważna półce teoretycznej od efektów pozakolumnowego rozmycia; H prz - wysokość równoważna półce teoretycznej od złej dynamiki detektora; N 0 - liczba półek teoretycznych kolumny w przeliczeniu na 1 m długości wypełnienia; d c - średnica wypełnienia kolumny; Φ - przepuszczalność właściwa kolumny, A s0,1 - współczynnik asymetrii piku w 0,1 wysokości; S 1/ - szerokość piku w ½ wysokości; S - szerokość piku przy podstawie; l - odległość mierzona na chromatogramie (w warunkach elucji izokratycznej i stałego natężenie przepływu eluenta); μ - drugi moment centralny piku jako krzywej rozkładu; M 1 - pierwszy moment zwykły piku jako krzywej rozkładu (położenie środka ciężkości); to - czas retencji substancji niesorbowanej; h - tzw. zredukowana wysokość półki teoretycznej; h teor - wartość h otrzymana z równania Knoxa; ν - zredukowana prędkość przepływu eluenta; η - lepkość dynamiczna eluenta; K - przepuszczalność kolumny; H ext - udział efektów pozakolumnowych w H; σ - objętościowo liczona wariancja rozmycia pozakolumnowego stref substancji; v ext S 1/ ext - udział rozmycia pozakolumnowgo w wartości kwadratu szerokości piku w połowie wysokości; F c - pole przekroju poprzecznego wypełnienia kolumny; υ t - szybkość przesuwu papieru rejestratora; L c - długość wypełnienia w kolumnie; a, b - część szerokości piku w 0,1 wysokości (patrz szkic); V R - objętośći retencji HPLC Inne mechanizmy selektywności Chromatografia żelowa (GPC/SEC) V e V m/ V 0 - objętość elucji (do maksimum albo do środka ciężkości piku - objętość międzyziarnowa wypełnienia; - objętość martwa kolumny (objętość przebicia przez substancję o niskiej masie cząsteczkowej wnikającej we wszystkie pory ziaren wypełnienia); M w - średnia masa cząsteczkowa polimeru (wagowo); k, k 1, A, B stałe;

16 r p ε 0 ε m/z ε i V w/z V t L c d c - średni promień porów wypełnienia w ziarnach; - porowatość całkowita kolumny; - porowatość międzyziarnowa wypełnienia; - porowatość wewnętrzna ziaren sorbenta; - objętość porów wewnątrz ziaren sorbenta; - objętość pustej (niewypełnionej) kolumny; - długość wypełnienia kolumny; - średnica wypełnienia w kolumnie średnica kolumny; M min, M max odpowiednio: minimalna i maksymalna masa cząsteczkowa substancji podlegających efektowi sita molekularnego w danej kolumnie; M śr - średnia masa cząsteczkowa polimeru; η - lepkość; [η] - lepkość graniczna (roztworu nieskończenie rozcieńczonego polimeru); P - pole pod częścią krzywej rozkładu stężenia (piku); LLSD - detektor laserowy światła rozproszonego; THF - tetrahudrofuran; DMFA - di-metyloformamid; Chromatografia jonowymienna P r - cząsteczki substancji rozdzielanych albo ich stężenie; B - przeciwjon; pks - pk kwasu lub zasady Analiza ilościowa w chromatografii A i - powierzchnia piku i ; h i - wysokość piku i ; C i - stężenie substancji i ; m i - masa substancji i ; A wz - powierzchnia piku wzorca wewnętrznego; m wz - masa wzorca; Δm 1/ - masa dodatku wzorca; m x - masa substancji oznaczanej; C x - stężenie substancji oznaczanej; a 3, a, a 1, a 0 współczynniki wielomianu;