Technik sorpcji i chromatografii to także techniki przygotowania wsadu do rozdzielania / próbki do analizy

Transkrypt

1 Chromatografia cieczowa jako technika rozdzielania, oczyszczania, otrzymywania czystych substancji / grup substancji, a także analityki technicznej i kontroli jakości -- podstawy HPLC/TLC/PLC prof. dr hab. inż. Marian Kamiński Najważniejsze informacje wprowadzające -Chromatografia -technika rozdzielania substancji / cząstek (np.. lateksu, wirusów, a nawet bakterii) w układach ciecz ciało stałe, albo ciecz -ciecz -Znaczenie rozdzielania -rozdzielić aby zidentyfikować i oznaczyć, albo otrzymać (np. przygotowanie próbki) -Techniki chromatograficzne -LC, GC, SFC / kolumnowe (LC, HPLC), cienkowarstwowe (planarne) (TLC) - Mechanizmy fizykochemiczne - NP, RP, IC, AC, HIC, LIHIC, LEC, IEC,... Warunek konieczny rozdzielenia Konkurencja oddziaływań sorpcyjnych o porównywalnych energiach, w układzie: faza stacjonarna faza ruchoma substancje rozdzielane -Zastosowania składniki produktów, komórek płynów fizjologicznych, monitoring środowiska, kontrola jakości produktów, kontrola procesów technologicznych, polidyspersyjność polimerów,..., ale także: rozdzielanie grupowe, przyg. próbek do analizy, wsadu do rozdzielania wyznaczanie parametrów fizykochemicznych,... Technik sorpcji i chromatografii to także techniki przygotowania wsadu do rozdzielania / próbki do analizy -Technika SPE (RP, NP, SCX, SAX, Affinity) - Technika SPME - Technika chromatografii wykluczania GPC/SEC (żelowej) - Technika elucyjna / czołowa w skali semi-prepratywnej / preparatywnej 1

2 Michaił Cwiet( ) Odkrywca techniki kolumnowej elucyjnej chromatografii cieczowej Like light rays in the spectrum, the different components of a pigment mixture, obeying a law, are resolved on the calcium carbonate column and then can be qualitatively and quantitatively determined. I call such a preparation a chromatogram and the corresponding method the chromatographic method. 2

3 Klasyczna elucyjna technika kolumnowa przygotowanie kolumny i wypełnienia, wypełnienie, kondycjonowanie, dozowanie, eluc detekcja, kolekcja frakcji, re-kondycjonowanie / rozładowanie, wypełnienie Czasem z elucją stopniową 3

4 Widok pasm kilku składników ekstraktu acetonowego trawy przez szklaną ścianę kolumny HPLC typu CN, eluent heksan MTBE - THF; kolejność pasm - od dołu: produkt rozkładu chlorofilu, chlorofil A, carotenoidy-i, chlorofil B, carotenoidy-ii Thin Layer Chromatography Chromatografia cienkowarstwowa (thin layer chromatography(tlc) (planarna) odkryta jako bibułowa 1889 (PC) Najczęściej z wykorzystaniem HPLC kierunek przepływu eluentu od góry do dołu Warunki rozdzielania Kolumna 150x3mm, Separon CN 5 um,eluent: heksan:mtbe:thf=55:8:6,4 (v/v/v), próbka 30 ul ekstraktu acetonowego z trawy, temperatura pokojowa Natężenie przepływu eluentu w=0.8 ml/min 4

5 Oddziaływania -GC / SFC / LC Faza stacjonarna Substancje rozdzielane Faza stacjonarna Składniki eluentu Substancje rozdzielane LC (HPLC, TLC) SFC GC Pojęcia podstawowe Układ chromatograficzny: faza stacjonarna(z reguły stała powierzchnia sorpcyjna, rzadko ciekła inaczej niż w GC) faza ruchoma konkurencyjne oddziaływania na powierzchni sorpcyjnejmiędzy molekułami substancji rozdzielanych i molekułami eluentu, a także - oddziaływania w przestrzeni eluentu Retencja (spowolnienie elucji względem prędkości przepływu eluentu u ); Selektywność (zróżnicowanie retencji); Sprawność (miara dyspersji stref); Prędkość u [mm/s] i natężenie przepływu eluentu w [ml/min] Opór przepływu w kolumnie ΔP [MPa] = u*lc*η/ dp 2 Kolumna o długości (Lc), średnicy (dc), kolumna z wypełnieniem ziarnistym (dp, d, A) / monolityczna (dm, d, A) Sorbent -pory wewnątrz-ziarnowe i między-ziarnowe, porowatość (ε wz, ε mz, ε T ), powierzchnia sorpcyjna (nawet do 750 m 2 /g) 5

6 Mechanizmy retencji i selektywności rozdzielania GPC / SEC (wykluczania, żelowa ) - zróżnicowanie czasu i dróg dyfuzji RP hydrofobowość (głównie) NP polarność, polaryzacja, dyspersja, wiązania wodorowe; IC wymiana jonów Inne: HIC,LIHIC,LLC,LEC,AC,EC,... Sorbenty, kolumny do wysokosprawnej chromatografii cieczowej / sorpcji desorpcji wypełnienie ziarniste / monolityczne - -Rurka o bardzo gładkiej ściance, o średnicy (dc) dc),, wypełniona sorbentem o jak najmniejszej przeciętnej (średniej) wielkości ziaren (dp) i korzystnie, niewielkiej polidyspersyjności rozkładu wielkości ziaren (Δdp), o długości warstwy wypełnienia (Lc); -Wypełnienie ułożone równomiernie w przekroju poprzecznym, zapewniające tzw. tłokowy profil przepływu eluentu w kolumnie (u f (dc)); -Wypełnienie ułożone w sposób stabilny, zapewniający brak osiadania złoża; W celu stabilizacji wypełnienia kolumny preparatywnej stosowane są takie zabiegi, jak dynamiczna kompresja aksjalna (osiowa) złoża (DAC), albo/i kompresja radialna (promieniowa) wypełnienia. 6

7 Wypełnienie ziarniste kolumny HPLC / warstwa porowata płytki TLC 7

8 ELUENT ELUAT, substancje rozdzielane 8

9 Technika czołowa Eluent ze składnikami rozdzielanymi wprowadza się do kolumny w roztworze ; Schemat przebiegu analizy czołowej Najsłabiej sorbowane składniki wypływają z kolumny jako pierwsze; Są jedynym składnikiem / składnikami otrzymywanym / otrzymywanymi w czystej postaci (po rozdzieleniu z eluentem) 9

10 Chromatogram analizy czołowej Technika rugowania (displacement) Składnik rugujący substancje (displacer) jest komponentem roztworu wsadu (próbki) dozowanej do kolumny w trybie elucyjnym; Powinien być w znacznym stężeniu i łatwy do usunięcia z eluetu; Najsłabiej sorbowane składniki są eluowane / rozdzielane w trybie elucyjnymprzed rugującym składnikiem dozowanej mieszaniny; Zastosowanie wystarczająco sprawnej kolumny (dostatecznie długiej o dostatecznie małych ziarnach wypełnienia)umożliwia rozdzielanie wszystkich składników dozowanej do kolumny mieszaniny; 10

11 C Technika elucyjna najczęściej prawie wyłącznie wykorzystywana w praktyce W technice tej, składniki mieszaniny rozdzielanej są wprowadzane do kolumny / na płytkę TLC w postaci wąskiego lub pasma punktowo (najkorzystniej w roztworze eluentu)i poruszają się wzdłuż kolumny, z szybkością określoną przez ich retencją (energię swobodną powinowactwa do powierzchni sorpcyjnej ΔG) oraz przez prędkość przepływu eluentu (u); Jeżeli różnice energii sorpcji składników rozdzielanych są znaczne, albo kolumna jest dostatecznie długa, możliwe jest całkowite rozdzielenie wszystkich składników mieszaniny wprowadzonej do kolumny / na płytkę TLC; Często, zwłaszcza dla rozdzielania mieszanin o złożonym składzie należy stosować tzw. elucję gradientową, tzn. programowane zmiany siły elucyjnej eluentu w f. czasu rozdzielania: Eluent, podawany w sposób ciągły do kolumny, wypływa z w mieszaninie z poszczególnymi składnikami rozdzielonymi i dla ich wydzielenia musi zostać od nich oddzielony (np. na drodze odparowania, liofilizacji, często po uprzednim wzbogaceniu frakcji eluatu w rozdzielane składniki Składnik rugujący (D) silniej oddziałuje z fazą stacjonarną niż składniki (B i A), asłabiej niż C 11

12 Chromatogram analizy elucyjnej Technika elucyjna, substancja B sjest silniej sorbowana niż substancja A 12

13 DYSPERSJA MASY Wiele zjawisk przyczynia się do dyspersji stref rozdzielanych substancji Wzrost dyspersji = spadek sprawności kolumny wzrasta H i spada N Im niższa wartość wysokości równoważnej półce teoretycznej (HETP, H), tym wyższa wartość liczby półek teoretycznych tym wyższa sprawność rozdzielania - także - kolumny 13

14 Zależności najprostsze, aktualne dla CGC w przypadku HPLC aktualne co do zasady H = A+ min u opt = B C BC Dyspersja stref zjawisko niekorzystne, jednak, nieuniknione H min = A+ B C Zjawiska powodujące dyspersję - Dyfuzja wirowa (A); - Dyfuzja molekularna (B); - Opory przenoszenia masy (C) 1. w fazie ruchomej (Cm), 2. w fazie stacjonarnej (Cs) Równanie Van Deemter a, H = B/u + A + Cu = B/u + A + (Cm + Cs) u Bardziej adekwatne dla LC jest równanie Knox a: 14

15 Dyspersja stref zjawisko niekorzystne, jednak, nieuniknione u - liniowa prędkość fazy ruchomej Zjawiska powodujące dyspersję - Dyfuzja wirowa (A); - Dyfuzja molekularna (B); - Opory przenoszenia masy (C) 1. w fazie ruchomej (Cm), 2. w fazie stacjonarnej (Cs) Równanie Van Deemter a, H = B/u + A + Cu C = (Cm + Cs) u bardziej adekwatne dla LC równania: Knox a: h = B/v + A v Cv B=0.5; A=2 (1); C=0.1 (0.05) h=h/dp v=udp/dm ν - tzw. zredukowana prędkość przepływu eluentu (Pe) [1] D M współczynnik dyfuzji molekularnej substancji rozdzielanej w eluencie [m 2 /sek] d p średnica ziaren wypełnienia kolumny; wielkość ziaren wypełnienia kolumny [m] Modification of the van Deemter Equation: the Giddings Equation Giddings realized that the eddy diffusion and resistance to mass transfer in the mobile phase must be treated dependently: 5 1 B H = + + Csu + Cmu + H 1 i= u A Cu 1 e 15

16 H N = = L C S ( 5,54 l L H C = 1 / 2 5,54( ) l S 2 1/ 2 ) 2 H= Lc (µ 2 / (M 1 ) 2 ) N= Lc/H = (µ 2 / (M 1 ) 2 ) -1 u As 0,1 = = L t b a C 0 16

17 Opór przepływu w kolumnie wypełnionej wypełnieniem ziarnistym V o = V c ε t u = w / (Fc ε t ) Φ = (dp) 2 / K obliczana na podstawie wartości przepuszczalności K K = u Lcη η / P 17

18 Informacje niesione z chromatogramem i podstawowe zależności Rs -rozdzielczość pików -zależność teoretyczna R S 1 α 1 k2 = 4 α k N 2 t R czas retencji t M czas martwy kolumny retencja substancji niesorbowanej, wnikającej do porów wypełnienia kolumny k współczynnik retencji t R tm k = tm -współczynnik rozdzielenia k2 tr2 tm α = = k1 tr 1 tm N-liczba półek teoretycznych 5 t R,54 N = wh Rs=(t Rn+1 t Rn )/ ½(S n+1 + S n ) - zależność obliczeniowa 2 (Rs) R-rozdzielczośćpików zależność teoretyczna Wpływa : R S = 1 4 α 1 k2 α k selektywność współczynnik retencji sprawność rodzaj fazy stacjonarnej, skład fazy ruchomej, temperatura, ph, dodatek do eluentu substancji solwatujących / tworzących pary jonowe N moc / siła elucyjna zastosowanego eluentu, w RP także: ph - dodatki cofające dysocjację elektrolityczną, dodatki solwatujące, zwłaszcza, jeśli zmieniają hydrofobowość 2 średnica ziaren wypełnienia, prędkość przepływu eluentu i w mniejszym stopniu, ale nie bez znaczenia - lepkość fazy ruchomej oraz współczynnik dyfuzji, a więc, także temperatura 18

19 k opt = (7.0) 19

20 Thin LayerChromatography chromatografia cienkowarstwowa (planarna) -- technika, pojęcia, wizualizacja / detekcja, zastosowania 20

21 k= ( 1/Rf ) -1 FAZA RUCHOMA d c b a FAZA RUCHOMA Rf = 3 Rf = 1 c d a d Rf = 2 b d 21