Fourierowska spektroskopia rozproszenia Ramana, FT-RS. Widma FT-RS wykonano na. Analiza widm FT-RS

Transkrypt

1 BADANIA STRUKTUR MOLEKULARNYCH NOCYCEPTYNY I JEJ FRAGMENTÓW TECHNIKAMI SPEKTROSKOPII ROZPROSZENIA RAMANA MARIA KOSIOR 1, EDYTA PODSTAWKA 2, LEONARD M. PRONIEWICZ 1,2 1 Zakład Fizyki Chemicznej, Wydział Chemii Uniwersytetu Jagiellońskiego, ul. Ingardena 3, Kraków, stasiek@chemia.uj.edu.pl i proniewi@chemia.uj.edu.pl 2 Środowiskowe Laboratorium Analiz Fizykochemicznych i Badań Strukturalnych, ul. Ingardena 3, Kraków, podstawk@chemia.uj.edu.pl Hasła do zapamiętania: nocycepyna, OFQ/N; fourierowska spektroskopia rozproszenia Ramana, FT-RS; powierzchniowo wzmocniony efekt Ramana, SERS. Wstęp Neuropeptydy to substancje związane z procesami regulacyjnymi, takimi jak: czynności hormonalne i ruchowe, przekazywanie bodźców czuciowych i bólowych, regulacja temperatury, procesów emocjonalnych, uczenia się i pamięci. Biorą one również udział w procesach związanych z reakcją organizmu na bodźce stresowe wywołując efekt przeciwlękowy i przeciwbólowy. Nocyceptyna OFQ/N (orfanina FQ) jest to 17-aminokwasowy peptyd wyizolowany, w 1995 roku przez dwa niezależne zespoły, z ośrodkowego układu nerwowego [1,2]. Wykazuje ona podobieństwo strukturalne do dynorfin, szczególnie dynorfiny A - naturalnego antagonisty receptorów κ-opioidowych. OFQ/N nie oddziałuje z receptorami opioidowymi, lecz przyłącza się do receptora OP4 (ORL-1, LC132) [3,4]. Odgrywa ona ważną rolę w mechanizmie przewodzenia bólu. Początkowo powoduje znaczne obniżenie progu pobudliwości na bodziec bólowy, a następnie zmienia charakter działania wywołując zmniejszenie intensywności odczuwania bólu (analgezję). Wynika to z faktu, iż enzymatyczna fragmentacja peptydu powoduje powstawanie fragmentów: OFQ/N(1-11) i OFQ/N(1-6) o zmienionej aktywności w porównaniu z OFQ/N [5]. Stwierdzono również wpływ OFQ/N na procesy uzależnienia od leków (np. od morfiny) [6]. Ponadto, jest ona zaangażowana w procesy uczenia się i pamięci, stany emocjonalne, procesy ruchowe, homeostazę, wydzielanie neuroendokrynowe oraz aktywację kanałów K + i inhibicję kanałów Ca 2+ [7-9]. Jakkolwiek fizjologiczna funkcja OFQ/N i jej fragmentów: OFQ/N(1-13), OFQ/N(1-11) i OFQ/N(1-6) otrzymanych w wyniku enzymatycznej lizy została poznana (potencjalne inhibitory i substraty proteinaz i leków peptydowych), tak mechanizm ich działania nie jest jeszcze w pełni wyjaśniony. Co więcej, struktura drugorzędowa tych peptydów i ich ewentualne oddziaływania z jonami metali, które koordynując z ligandem mogą zmieniać jego aktywność, są wciąż przedmiotem badań. Spektroskopia rozproszenia Ramana (RS) jest znakomitą metodą służącą do badań konformacji peptydów, protein oraz innych związków o potencjalnym znaczeniu biologicznym [10]. Dodatkowo, technika powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana (ang. Surface-Enhanced Raman Scattering, SERS) pozwala na wyznaczenie mechanizmu oddziaływania badanych biomolekuł z powierzchnią metalu podczas aktu adsorpcji, jak również określeniu ich orientacji na badanej powierzchni [11]. Dlatego też, w niniejszej pracy użyto metody FT-RS i SERS do wyznaczenia struktur molekularnych: OFQ/N, OFQ/N(1-13), OFQ/N(1-11) i OFQ/N(1-6) oraz sposobu ich adsorpcji na powierzchni koloidalnego srebra. Część eksperymentalna Synteza peptydów. Peptydy: OFQ/N, OFQ/N(1-13), OFQ/N(1-11) i OFQ/N(1-6) zsyntezowano na ziarnach fazy stałej używając odczynników do syntezy typu Fmoc

2 (blokowanie wolnego końca łańcucha grupą fluorenylometylokarbonylową) według standardowego protokołu [12]. Syntezę prowadzono z zastosowaniem automatycznego normalnym zebrano w tabeli 2. Przypisanie pasm Ramana i SERS dokonano w oparciu o wcześniejsze dane dla wybranych dipeptydów [11,13] i niskocząsteczkowych białek [14]. syntetyzera peptydów (Advanced ChemTech, Anglia). Otrzymane peptydy oczyszczano na kolumnie preparatywnej typu RP, a czystość kontrolowano przez analizę z użyciem spektrometru masowego z jonizacją electrospray (model Esquire 3000, firmy Brucker). Fourierowska spektroskopia rozproszenia Ramana, FT-RS. Widma FT-RS wykonano na spektrometrze FT-Raman firmy Bio-Rad, model FT 6000, wyposażonym w detektor germanowy chłodzony ciekłym azotem. Do wzbudzenia próbek użyto lasera Nd +3 :YAG (granat itrowo-glinowy domieszkowany jonami Nd +3 ) o linii 1064 nm. Widma rejestrowano w geometrii 180 o przy rozdzielczość 4 cm -1 i liczbie 512 skanów. Spektroskopia powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana, SERS. Roztwory koloidalnego srebra przygotowano według standardowej procedury [11]. Kroplę wodnego roztworu badanych peptydów o stężeniu ~10-5 M dodano do 0.5 ml koloidu srebra. Widma SERS wykonano na trójsiatkowym spektrometrze Ramana NRS-2100 (JASCO, Japonia) wyposażonym w detektor CCD chłodzony ciekłym azotem (model LN-CCD1100, Princeton Instruments). Jako źródła promieniowania użyto lasera Ar-jonowego emitującego linię ciągłą nm (model 2016, Spectra-Physics). Moc promieniowania przy wyjściu z lasera wynosiła 100 mw. Widma rejestrowano przy rozdzielczość 4 cm -1. Dyskusja wyników Tabela 1 podaje strukturę pierwszorzędową nocyceptyny i jej fragmentów: OFQ/N(1-13), OFQ/N(1-11) i OFQ/N(1-6). Widma FT-RS: OFQ/N, OFQ/N(1-13), OFQ/N(1-11) i OFQ/N(1-6) w zakresie częstości od 1750 do 900 cm -1 przedstawiono na rysunku 1. Natomiast na rysunku 2 zaprezentowano widma SERS (w tym samym obszarze częstości) tych peptydów. Częstości obserwowanych pasm wraz z ich proponowanym przypisaniem odpowiednim drganiom Tabela 1. Struktura pierwszorzędowa OFQ/N i jej wybranych fragmentów. Nazwa Sekwencja OFQ/N Phe-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly-Ala-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Ala-Asn-Gln OFQ/N(1-13) Phe-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly-Ala-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg-Lys OFQ/N(1-11) Phe-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly-Ala-Arg-Lys-Ser-Ala OFQ/N(1-6) Phe-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly Analiza widm FT-RS Prezentowane widma FT-RS (Rys. 1) czterech badanych peptydów zdominowane są przez pasma charakterystycznych drgań pierścienia aromatycznego fenyloalaniny (Phe), które obserwowane są przy około 1003, 1032, 1184, 1202, i 1605 cm -1 (Tab. 2). Pasmom tym odpowiadają kolejno drgania: drganie symetryczne oddychające pierścienia fenylowego (ν 12 ), drganie zginające C-H w płaszczyźnie pierścienia fragmentów (ν 18a ), drganie kombinacyjne (drgania rozciągające pierścienia aromatycznego Phe z drganiami zginającymi grup C-H tego pierścienia) (ν 9a ), drganie rozciągające wiązania C-C 6 H 5 (ν 7a ) i dwa drgania rozciągające w płaszczyźnie wiązań C=C w pierścienia aromatycznego (ν 8b i ν 8a ). Dodatkowo, w widmach tych, w obszarze częstości cm -1, występują pasma drgań rozciągających wiązań C-C (ν(c-c)) i C-N (ν(c-n)) (Tab. 2). Częstości tych pasm nie są zbyt czułe na zmiany konformacyjne łańcucha peptydowego, ν(c-c) obserwowane jest przy około 939 cm -1, podczas gdy ν(c-n) pojawia się w widmach Ramana przy około 1100 cm -1. Intensywne, poszerzone pasmo obserwowane przy 1444 cm -1 w widmie FT- RS OFQ/N przypisano do drgań deformacyjnych grup -CH 2 (δ(ch 2 )). Dwa inne, w miarę intensywne pasma występujące przy około 1318 i 1334 cm -1 pochodzą od drgań wahadłowych grup -CH 2 - i -CH

3 1003 struktura typu β daje pasmo amidu I powyżej 1680 cm -1 i intensywne pasmo amidu III w zakresie częstości cm Przesuniecie ramanowskie [cm-1] Rys. 1. Widma FT-RS OFQ/N(1-6) (A), OFQ/N(1-11) (B), OFQ/N(1-13) (C) i OFQ/N (D) w zakresie częstości od 1750 do 900 cm -1. Strukturę przestrzenną wiązania peptydowego, CO-NH-, można scharakteryzować w oparciu o tzw. pasma amidowe nazwane odpowiednio: A, B i I-VII. Spośród tych drgań, najbardziej charakterystyczne w widmach Ramana do określenia struktury drugorzędowej peptydów i białek są drgania amidu I (ν(c=o)+δ(nh)) i amidu III (ν(cn)+δ(nh)+ν(c=o)) [15]. Często ze względu na złożoność struktury drugorzędowej widma Ramana peptydów i białek wykazują kilka składowych drgań amidowych. Analiza ich częstości i intensywności pozwala na scharakteryzowanie różnych konformacji łańcucha polipeptydowego [16]. Zazwyczaj, strukturze α-helikalnej odpowiadają niskiej intensywności pasma amidów I i III obserwowane w zakresach, odpowiednio, cm A B C D i cm -1. Struktura nieregularna (nieuporządkowana) charakteryzuje się pasmem amidu I występującym przy około cm -1 i poszerzonym pasmem amidu III przy cm -1. Natomiast, Tabela 2. Częstości obserwowanych pasm w widmach FT-RS i SERS OFQ/N, OFQ/N(1- cm -1 13), OFQ/N(1-11) i OFQ/N(1-6) wraz z ich proponowanym przypisaniem odpowiednim drganiom. Częstość (cm -1 ) OFQ/N OFQ/N(1-13) OFQ/N(1-11) OFQ/N(1-6) Przypisanie FT-RS SERS FT-RS SERS FT-RS SERS FT-RS SERS Amid I (nieregularna) Amid I (α-helisa) Phe (ν 8a ) Phe (ν 8b ) ν as (COO - ) Amid II δ(ch 2 ) ν s (COO - ) ν(c α -NH 2 ) lub/i δ(ch) ω(ch 2 /CH 3 ) Amid III (α-helisa) lub/i δ(cc α H) Amid III (nieregularna) 1240 Amid III (β-kartka) Phe (ν 7a ) Phe (ν 9a ) ν(c α -N) ν(c α -N) lub/i Phe (ν 9a ) ν(c-n) τ(nh 2 ) ν(c-c) Phe (ν 18a ) Phe (ν 12 ) ν(c-c) ν(c-coo - ) W widmie FT-RS OFQ/N (Rys. 1) obserwowane są szerokie pasma przy 1659 i 1278 odpowiadające drganiom amidu I i III. Położenie tych pasm sugeruje, iż OFQ/N przyjmuje głównie konformację α-helisy, jakkolwiek przy obliczeniu II-pochodnej widoczny jest udział zarówno struktury nieuporządkowanej, jak i pofałdowanej typu β. Natomiast, w

4 widmach OFQ/N(1-13), OFQ/N(1-11) i OFQ/N(1-6) pasmo amidu I obserwowane jest, odpowiednio, przy 1671, 1672 i 1674 cm -1, co jednoznacznie wskazuje na dominację powierzchni srebra, albo oddziałuje z powierzchnią srebra przyjmując względem niej prawie prostopadłe ułożenie. Dodatkowo, tylko w widmie SERS OFQ/N(1-13) obserwowane są konformacji nieregularnej łańcucha peptydowego. Wynika zatem, iż im krótszy łańcuch pasma drgań pierścienia Phe przy 1031 i 1601 cm -1 (drgania ν 18a i ν 8a ). Pasma przy polipeptydowy, tym większa jego tendencja do przyjmowania struktury nieuporządkowanej. Jednakże w wypadku OFQ/N(1-13) obserwuje się trzy pasma amidu III przy 1279, 1252 i 1240 cm -1, które odpowiadają, odpowiednio, strukturze α-helikalnej, nieregularnej i pofałdowanej typu β. Jakkolwiek struktury α i β stanowią jedynie niewielką część IIrzędowej struktury tego peptydu. Analiza widm SERS Peptydy i białka adsorbują się lub oddziałują z powierzchnią koloidalnego srebra poprzez aminokwasy, które tworzą z powierzchnią metalicznego srebra π-elektronowe około cm -1 i cm -1 przypisano odpowiednio drganiu rozciągającemu asymetrycznemu C-C α -N (ν as (C-C α -N)) i drganiu złożonemu ν(c α -NH 2 )+δ(ch), co wskazuje, iż grupa końcowa C-NH 2 jest zaangażowana w procesie adsorpcji na koloidalnym srebrze. Wniosek ten jest potwierdzony przez obecność pasma w zakresie cm -1, które zostało przypisane drganiu kołyszącemu τ(nh 2 ). Należy podkreślić, iż w tych warunkach pomiaru (ph 8.3) nie jest możliwe tworzenie się grupy NH + 3, która również może oddziaływać z powierzchnią koloidu. Natomiast pasma obserwowane przy cm -1 i cm -1 związane z drganiami, odpowiednio, deformacyjnymi grup -CH 2 - (δ(ch 2 ) i kompleksy (fenyloalanina (Phe), histydyna (His), tryptofan (Trp) i tyrozyna (Tyr)) lub δ- kompleksy (aminokwasy zawierające niesparowaną parę elektronów, np. His i Trp). Zasadowe aminokwasy, lizyna (Lys) i arginina (Arg) również oddziałują z powierzchnią srebra, lecz wyłącznie w wysokich ph. Natomiast, kwas asparaginowy (Asp) i glutaminowy (Glu), czy C-końcowa grupa łańcucha polipeptydowego oddziałują z metalicznym srebrem jedynie po deprotonacji grupy karboksylowej. W warunkach zasadowego ph, a zatem w warunkach przeprowadzonego eksperymentu należy spodziewać się udziału grupy molekularnej COO - w oddziaływaniu z powierzchnią metalicznego srebra. Prezentowane widma SERS OFQ/N i jej OFQ/N(1-13), OFQ/N(1-11) i OFQ/N(1-6) A B C D fragmentów (Rys. 2) podobnie, jak ich widma FT-RS, zawierają pasma charakterystycznych drgań pierścienia fenylowego: ν 12, ν 9a, ν 7a i ν 8b, które obserwowane są, odpowiednio, przy około 998, 1172, 1218 i 1585 cm -1. Niska intensywność tych pasm, szczególnie pasma drgania ν 12 wskazuje, iż pierścień fenylowy albo znajduje się w pewnej odległości od Przesuniecie ramanowskie [cm-1] Rys. 2. Widma SERS OFQ/N(1-6) (A), OFQ/N(1-11) (B), OFQ/N(1-13) (C) i FQ/N (D) zaadsorbowanych na powierzchni koloidalnego srebra w zakresie częstości od 1750 do 900 cm

5 wahadłowymi grup -CH 2 - i CH 3 (ω(ch 2 /CH 3 )), wskazują, iż łańcuchy badanych peptydów układają się równolegle do powierzchni srebra. W widmach SERS wszystkich czterech omawianych peptydów (Rys. 2), w zakresie częstości cm -1, obserwowane są niskiej intensywności pasma drgań symetrycznych grupy karbonylowej (ν s (CCO - )). Pojawienie się tych pasm w widmach SERS świadczy o oddziaływaniu zdeprotonowanej C-końcowej grupy z powierzchnią koloidalnego srebra. Potwierdzeniem faktu, iż zdeprotonowana grupa karboksylowa wiąże się do powierzchni koloidu jest obecność pasm przy 1565 i 932 cm -1. Pasma te przypisane są odpowiednio drganiom rozciągającym asymetrycznym grupy karbonylowej (ν as (CCO - )) i rozciągającym wiązań C-COO - (ν(c-cco - )). Pasma drgań amidu I w widmach SERS obserwowane są przy około 1625 cm -1, a drgań amidu III w zakresie częstości cm -1. Pochodzą one przede wszystkim od drgań struktury α-helikalnej. Potwierdza to nasze wcześniejsze badania, iż peptydy i białka najchętniej adsorbują się na powierzchni srebrnego koloidu poprzez fragmenty o strukturze α- helisy [14]. Dodatkowo, w widmach SERS obserwowane są pasma amidu II, który jest charakterystyczny dla widm absorpcyjnych w podczerwieni (widm IR). Pasma te występują przy około cm -1 i są także charakterystyczne dla struktury α. Podsumowanie Badania przy wykorzystaniu spektroskopii FT-RS czterech peptydów wykazały, iż tylko OFQ/N przyjmuje konformację α-helisy. Natomiast jej OFQ/N(1-13), OFQ/N(1-11) i OFQ/N(1-6) fragmenty przyjmują głównie strukturę nieuporządkowaną. Dodatkowo, badania techniką SERS pokazały, iż grupy C-końcowe łańcucha polipeptydowego, NH 2 (Nkońcowa, Arg, Lys, Asn lub/i Gln) i CH 3 (Thr, Ala lub/i Leu) oraz pierścień aromatyczny powierzchnia. Co więcej, z analizy intensywności pasma drgania ν 12 wynika, iż pierścień Phe przyjmuje prawie prostopadłe ułożenie względem powierzchni srebra. Dodatkowo, wszystkie badane związki wiążą się do powierzchni srebra przez zdeprotonowaną grupę karboksylową. Literatura [1.] Reinscheid R.K., Nothecher H.P., Bourson A., Henningen R.A., Bunzow J.R., Grandy D.K., Langen H., Mousma F., Civelli O. (1995) Orphanin FQ: A Neuropeptide That Activates an Opioidlike G Protein-Coupled Receptor, Science, 270, [2.] Meunier J.-C., Mollereau J.C., Toll L., Snaudeau C., Moisand Ch., Alvinerie P., Butour J- C., Guillenat J.C., Ferrara P., Monsarrat B., Mazarguil H., Vassart G., Parmetier M., Constentin J. (1995) Isolation and structure of the endogenous agonist of opioid receptorlike ORL1 receptor, Nature, 377, [3.] Salvadori S., Guerrini R., Calo G., Regoli D. (1999) Structure activity studies on nociceptin/orphanin FQ: from full agonist, to partial agonist, to pure antagonist, Il Farmaco, 54, [4.] Barlocco D., Cignarella G., Giardina G.A.M., Toma L. (2000) The opioid-receptor-like 1 (ORL-1) as a potential target for new analgesics, Eur. J. Med. Chem, 35, [5.] Kotlińska J., Suder P., Ściubisz A., Łęgowska A., Eilmes J., Rolka K., Silberring J. (2001) C-Terminal Glycine is Crucial for Hyperalgesic Activity of Nociceptin/Orphanin FQ-(1-6), Eur. J. Pharmacol., 419, [6.] Kotlińska J., Suder P., Łegowska A., Rolka K., Silberring J. (2000) Orphanin FQ/Nociceptin Inhibits Morphine Withdrowal, Life Sci, 66, [7.] Meunier J.-C. (1997) Nociceptin/orphanin FQ and the opioid receptor-like ORL1 receptor, Eur. J. Pharmacol., 340, fenloalaniny są w bliskim sąsiedztwie powierzchni koloidalnego srebra lub oddziałują z jego

6 [8.] Butour J.-L., Moisand Ch., Mazarguil H., Mollereau C., Meunier J.-C. (1997) Recognition and activation of the opioid receptor-like ORL1 receptor by nociceptin analogs and opioids, Eur. J. Pharmacol., 321, [9.] Suder P., Kotlińska J., Smoluch M.T., Sallberg M., Silberring J. (1999) Metabolic fate of nociceptin/orphanin FQ in the rat spinal cord and biological activity of its released fragment, Peptides, 20, [10.] Colaianni S.E.M., Aubard J., Hansen S.H., Nielsen O.F. (1995) Raman spectroscopic studies of some biochemically relevant molecules, Vib. Spectrosc., 9, [11.] Podstawka E., Ozaki Y., Proniewicz L.M. (2004) Part I: Surface enhanced Raman spectroscopy investigation of amino acids and their homodipeptides adsorbed on colloidal silver, Appl. Spectrosc., 58, [12.] Sällberg M., Ruden U., Magnius L.O., Norrby E., Wahren B. (1991) Rapid "tea-bag" peptide synthesis using 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) protected amino acids applied for antigenic mapping of viral proteins, Immunol. Lett., 30, [13.] Podstawka E., Ozaki Y., Proniewicz L.M. (2004) Part II: Surface enhanced Raman spectroscopy investigation of heterodipeptides containing methionine adsorbed on colloidal silver, Appl. Spectrosc., 58, [14.] Podstawka E., Ozaki Y., Proniewicz L.M. (2004) Adsorption of S-S containing proteins on a colloidal silver surface studied by surface enhanced Raman spectroscopy, Appl. Spectrosc., 58, w druku. [15.] Schweitzer-Stenner R. (2002) Dihedral Angles of Tripeptides in Solution Directly Determined by Polarized Raman and FTIR Spectroscopy, Biophys. J., 83, [16.] Haris P.I., Severcan F. (1999) FTIR spectroscopic characterization of protein structure in aqueous and non-aqueous media, J. Mol. Catal. B, 7,