Lipidomika z wykorzystaniem spektrometrii mas. Elisabete Maciel, Eliana Alves, Pedro Domingues, Rosário Domingues

Transkrypt

1 Lipidomika z wykorzystaniem spektrometrii mas Elisabete Maciel, Eliana Alves, Pedro Domingues, Rosário Domingues

2 LIPIDMIKA Liczba publikacji z dziedziny nauk omicznych (Scopus) 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1,, Genomics Proteomics Lipidomics 1 Liczba publikacji dotyczących badań lipidomicznych

3 Lipidomika - Pełna charakterystyka związków lipidowych oraz ich biologicznych funkcji w powiązaniu z ekspresją białek warunkujących metabolizm lipidów i ich funcje, a także ekspresją genów (wg. ACS Lipids Library) - Analiza profilu lipidowego w warunkach fizologicznych oraz jego zmian w stanach patologicznych Lipidomika Ekstrakcja lipidów Analiza lipidów Analiza szlaków metabolicznych Analiza oddziaływań lipidy-białka

4 Lipidomika Profilowanie lipidomu komórki Lipidy w strukturze błony komórkowej oraz jej dynamika Regulacyjna funkcja lipidów (np. jako cząsteczek sygnałowych) Integracja omik z wzajemnymi oddziaływaniami składników komórki oraz przemianami zachodzącymi w komórce/organizmie

5 Dlaczego lipidy są ważne? Błony komórkowe Funkcja regulująca w komórce przekaźnictwo sygnałowe, hormony, Metabolizm energetyczny/rezerwa energetyczna Zaburzenia metabolizmu lipidów i przekaźnictwa syganłowego z ich udziałem odgrywają kluczową rolę w fizjologii jak również stanach patologicznych

6 % wszystkich fosfolipidów Lipidy błona komórkowa Asymetria błony komórkowej Fosfolipidy (75%) Glikolipidy (5%) PŁYN PZAKMÓRKWY wszystkie fosfolipidy sfingomieliny warstwa zewnątrzplazmatyczna fosfatydylocholiny fosfatydyloetanoloaminy środowisko hydrofobowe fosfatydyloseryny Cholesterol (5%) Białko integralne Białko powierzchniowe CYTPLAZMA warstwa wewnątrzplazmatyczna Struktura błony tratwy lipidowe Białka transbłonowe Białko zakotwiczone przez GPI Prenylowane białko Fosfolipid zaw. nienas. kw. Sfingolipidy tratwa Fosfol. zaw. nas. kw. Cholesterol

7 Profilowanie lipidów w komórce, tkankach i płynach ustrojowych Każdy rodzaj komórek, tkanka oraz płyn ustrojowy posiada swój charakterystyczny profil lipidowy o określonym składzie związków lipidowych Identyfikacja wszystkich lipidów obecnych w komórce - % lipidów zawierających % of total acyl kwasy lipid tłuszczowe content Błona inner Chloroplast Tylakoidy wewnątrzmito mitochondrial plasma Błona Glycerolipids Glicerolipidy chloroplastów thylakoid chondrialna membrane membrane komórkowa MGDG 51% DGDG 26 SQDG 7 PC PS 25 PG 9 PE PI 1 19 CL 2

8 % fosfolipidów w klasie Relatywna zawartość (%) Relatywna zawartość (%) Profilowanie klas fosfolipidów Zawartość Phospholipid fosfolipidów classes w poszczególnych quantification klasach Kardiomiocyty Relative abundance (%) SM PC ** PI ** * PS PE PA Główne Main classes klasy of fosfolipidów phospholipids CL CTL Stress Mózg myszy Komórki raka piersi Relative Percentage (%) 5 CNT 4 * T1DM * -1 LPC SM PC PI PG klasy PL Classes fosfolipidów PE CL Serce (mitochondria) Mięśnie (mitochondria)

9 Profil kwasów tłuszczowych Wpływ rodzaju kwasów tłuszczowych na właściwości błony komórkowej płynna lepka nienasycone łańcuchy węglowodorowe nasycone łańcuchy węglowodorowe

10 Rodzina 1 lub (n-1) Syntaza kwasów tłuszczowych Rodzina 7 lub (n-7) Rodzina 9 lub (n-9) Nasycone kwasy tłuszczowe Rodzina 6 lub (n-6) Dieta Rodzina 3 lub (n-3)

11 Jakie są największe wyzwania w lipidomice?

12 Strukturalna różnorodność lipidów Lipidy Kwasy tłuszczowe Steroidy Triglicerydy Fosfoglicerydy Woski Sfingolipidy Sfingomieliny Glikolipidy Cerebozydy Gangliozydy

13 Klasy fosfolipidów/glicerolipidów Phospholipids Znane także jako glicerofosfolipidy Cholina Etanoloamina Glicerol Fosfatydylocholina (PC) Fosfatydyloetanoloamina (PE) Fosfatydyloglicerol (PG) Mio inozytol Fosfatydyloinozytol (PI) Seryna Tlenek wodoru Fosfatydyloseryna (PS) Kwas fosfatydylowy (PA)

14 Klasy fosfolipidów/glicerolipidów 16: 18:1 Glycerol P cholina 18:2 18:3 Glycerol P ethanoloamina PC, PE, PS, NPE, PG, CL, PI, PIP, PIP 2, PIP 3, LysoPLs

15 Fosfolipidy / zawartość kwasów tłuszczowych / Phospholipid a właściwości shape błony komórkowej and membranes a lipidy cylindryczne PC dwuwarstwa zew. b wew. AA lipidy stożkowe LPC micelle Fosfolipidy (75%) Glikolipidy (5%) PŁYN PZAKMÓRKWY płynna lepka środowisko hydrofobowe Cholesterol (5%) Białko integralne Białko powierzchniowe CYTPLAZMA nienasycone łańcuchy węglowodorowe nasycone łańcuchy węglowodorowe

16 Biosynteza fosfolipidów kreśla i zmienia specyficzną sygnaturę lipidomu

17 Zmiany w lipidomie Choroby upośledzenie szlaków metabolicznych ksydacyjne modyfikacje lipidów Inne: Dieta żródło różnych lipidów Znaczenie: nowe biomarkery nowe strategie leczenia nowe zastosowania biotechnologiczne

18 Lipidomiczne strategie analityczne w celu określania lipidomu

19 Podejścia lipidomiczne Liposomy Komórki Tkanki Ekstrakcja lipidów Fracjonowanie/rozdzielanie metodami chromatograficznymi: TLC, HPLC lub SPE Analizy wykorzystujące spektrometrię mas Analizy targetowe Analizy nietargetowe

20 Procedura analityczna w lipidomice Lipidomika w oparciu o analizy wykorzystujące spektrometrię mas (MS)

21

22 Ekstrakcja lipidów Ekstrakcja chemiczna przy wykorzystaniu rozpuszczalników organicznych: Metoda Folcha (CHCl 3 :CH 3 H 2:1) Metoda Bligh i Dyer (CHCl 3 :CH 3 H 1:2) inne Zawieszony i rozpuszczony materiał chloroform metanol woda strącone białko cukry sole rozpusz czone lipidy najczęściej metanol i woda najczęściej chloroform

23 Ekstrakcja lipidów Analyzed Matrices Analizowana matryca Extration Metoda ekstrakcji protocols socze lub surowica krwi 39% Tkanka zwierzęca 23% Chloroform/MeH 7% Inne 13% Inne 12% Materiał roślinny 3% Komórki 22% MTBE/MeH 12% DCM/MeH 6% Cajka and Fiehn, Trens in Analytical chemistry, 214

24 Ekstrakcja lipidów Selektywna ekstrakcja lipidów z osocza przy użyciu hybrydowych kolumienek SPE

25 Frakcjonowanie ekstraktu lipidów Ekstrakcja do fazy stałej W celu oddzielenia obojętnych lipidów od polarnych bojętne lipidy (TG) od PL KNDYCJNWANIE WPRWADZENIE PRÓBKI PRZEMYWANIE WYMYWANIE ANALIT ANALIT ZANIECZYSZCZENIA Metody chromatograficzne TLC (Chromatografia cienkowarstwowa) HPLC (Wysokosprawna chromatografia cieczowa) A W celu rozdzielenia klas lipidów/związków lipidowych

26 Rozdzielanie klas fosfolipidów Fosfolipidy można rozdzielić w zależności od ich polarności przy użyciu: TLC HPLC l

27 TLC Chromatografia cienkowarstwowa Różne układy eluentów różne profile TLC CL-Cardiolipiny PA-Kwas fosfatygylowy PE-Fosfatydyloetanolaminy PS-Fosfatydyloseryny PI-Fosphatydyloinozytol PC-Fosfatydylocholiny SM-Sfingomieliny LPC-Lizofosfatydylcholiny

28 2D-TLC Dwa różne układy rozpuszczalników Prof Valerian Kagan lab

29 KNTRLA JAKŚCI Cajka and Fiehn, Trens in Analytical chemistry, 214 HPLC-MS Materiał biologiczny socze, surowica krwi Tkanka zwierzęca lub roślinna, komórki Ekstrakcja Dodatek standardu wewnętrznego Rozdział lipidów Analiza LC-MS Jonizacja Detekcja Rozdział klas lipidów Przetwarzanie danych bróbka danych Identyfikacja i klasyfikacja lipidów Analiza ilościowa

30 A off -linetlc-ms Ekstrakcja Lipid Extraction lipidów Analiza MS Analysis MS R P H - + NH R PE R P H - + NH R m/z PI H H H m/z R P 1 HH R - 2 H PI H H H R P 1 HH R - 2 H A B B % % PE m/z m/z PS H - R P 1 + NH R H PS - C C % % B % % m/z m/z PS H C - R P NH R H PS H - R P 1 + NH R H C A R P H - + NH R on-line HPLC-MS m/z MS Analysis 1 PI H H Analiza MS H m/z R P 1 B HH R - 2 H 1 PI H H H HH % m/z m/z D D % % % % 1 % PG H R P 1 PG H R H - H R 2 P 1 H R H m/z m/z PE R R 2 H P -

31 ANALIZA DANYCH MS: Jony powstające w wyniku procesu jonizacji lipidów Klasa lipidów Tryb pozytywny Tryb negatywny Kwasy tłuszczowe

32 Wysokorozdzielcza spektrometria mas (HRMS) Duża dokładność pomiaru masy wykorzystywana do: ustalania masy cząsteczkowej wyznaczania wzoru sumarycznego i składu elementarnego ustalania struktury molekularnej rozróżniania jonów molekularnych związków izobarycznych (o tej samej wartości stosunku m/z lecz różnym wzorze sumarycznym i strukturze molekularnej) Cold Spring Harb Perspect Biol. 211 Sep; 3(9): a4614. doi: 1.111/cshperspect.a4614

33 Tandemowa spektrometria mas (MS/MS) analiza danych Fragmentacja: Izolacja wybranych jonów w trybie MS Wytworzenie jonów pochodnych w trybie MS/MS Informacja na temat budowy strukturalnej MS Spectrum MS/MS Spectrum Mieszanina związków w trybie MS Izolacja jonów do trybu MS/MS (M+H + ) Jony precursora Jony pochodne Interpretacja widm MS/MS jest jak układanie puzzli Pozwalają uzyskać informacje na temat budowy strukturalnej związków wyjściowych.

34 Tandemowa spektrometria mas (MS/MS) Glycerophospholipids

35 Glicerofosfolipidy lub fosfolipidy (PL) Wymagane informacje dla potwierdzenia struktury: - identyfiakcja polarnej głowy - identyfikacja kwasów tłuszczowych Reszta kwasu tłuszczowego P R 1 H Reszta kwasu tłuszczowego R 2 R 1 oraz R 2 grupy alkilowe w pozycji sn-1 i sn-2 H H H Polarna głowa H N + H NH 2 H H H H Cholina Etanolamina Inozytol Fragmentacja zależy od: - rodzaju jonu prekursora - energii kolizji - innych czynników NH 2 H H H Seryna Glicerol -H Wodór

36 Fosfatydylocholiny MS/MS [M+H] x36 PC 16:/18:1 R -R 2 CH -R 1 CH [M+H] + R % % x [MH]+ m/z 76 N + CH H 3 C P H H 3 C m/z R 1 C H 2 H 3 C [MH-R 2 CH] + m/z 478 H 3 C N + CH 3 P H R 2 H 3 C H 3 C H 3 C [MH-R 1 CH] + m/z 54 H 3 C N + CH 3 P H H 3 C H 3 C H N + CH 3 P m/z 184 H Widmo MS/MS - m/z utrata cząsteczki kwasu tłuszczowego

37 Fosfatydyletanolaminy PE Tryb jonizacji pozytywnej [M+H] + R R Tryb jonizacji negatywnej [M-H] H + H + Na + ESI-MS/MS [M+H] + Utrata charakterystycznego fragmentu o masie141 Da PE 16:/18:1-141Da utrata RCH i RC= 1 x (R 1 =C + i R 2 =C + ) % R 2 C [M+H] m/z

38 Fosfatydyletanolaminy MS/MS ESI-MS/MS [M-H] - Widmo MS/MS w trybie negatywnej jonizacji R 1 C- R 2 C- [M-H] - [M-H] - jon R 1 C - jon R 2 C - R 1 C - - R 2 C -

39 Fosfatidyloseryny PS ESI-MS/MS [M+H] + PPS. 3-Mar-21 9:49:39 R-RK PLPS MS (.82) Da Sm (SG, 5x3.); Cm (15:113) e3 R R -185 Da % [M+H] m/z -87 Da MS/MS [M+H] + utrata charakterystycznego fragmentu o masie 185 Da ESI-MS/MS jonu [M-H]- utrata fragmentu o masie 87 Da jon R 1 C - ion jon R 2 C - ion Relative Abundance RK-PLPS neg # RT: AV: 127 NL: 3.94E5 T: ITMS - c ESI Full ESI-MS/MS ms @17. [M-H] [ ] - PPS x R 1 C R 2 C Da m/z 758.2

40 Fosphatydyloglicerol- PG Widmo ESI-MS/MS w trybie jonizacji negatywnej R-D-TLC-DC-CNT-PG-294MS (.674) Cm (58:14) % R 1 C - R 2 C [M-H] m/z v R 1 C - R R - R 2 C - H m/z 171

41 Fosphatydyloinozytol -PI ESI-MS/MS of M-H] - 16:/18:1-PI R-GPIL-IBMC-1MS835 R 2 C - 82 (1.266) R R TF MSMS 835.5ES H + % 223. R 1 C m/z R 1 C - [M-H] - R R - H P - R 2 C - H H m/z 241 H

42 Klasyfikacja fosfolipidów (MS/MS) Klasa fosfolipidów Wykrywane jony Tryb pozytywny Tryb negatywny Fosfatydylocholiny (PC) [M+H] + PIS m/z Fosfatydyloetanoloaminy (PE) [M+H] + [M-H] - NLS 141 Da - Fosfatydyloseryny (PS) [M+H] + [M-H] - NLS 185 Da NLS 87 Da Fosfatydyloglicerole (PG) [M-H] - - NLS 74 Da Fosfatydyloinosytole (PI) [M-H] - - PIS m/z 241 Kardiolipiny (CL) [M-H] - [M2H] 2- Sfingomieliny (SM) [M+H] + PIS m/z Informacje dotyczące reszt kwasów tłuszczowych Tryb jonizacji pozytywnej utrata RCH i R=C= Tryb jonizacji negatywnej wytworzenie anionu karboksylowego RC -

43 ietargetowa analiza lipdomiczna PG/PI PE PC TIC 2 PS Time (min) PC Relative Abundance Relative Abundance LPC m/z 8 Relative Abundance Bioinformatyczne narzędzia: Mzmine Compound Discover Lipidizer LipidBlast inne Relative Abundance MS m/z RT: MS/MS SM: 9B LPC Time (min) Time RT: 16.3 HT2 # RT: AV: 26 NL: 8.26E7 AA: T: FTMS + p ESI Full ms [2.-16.] 1 MS m/z: TIC Tryb jonizacji pozytywneje PC PE Relative Abundance m/z SM RIC NL Bas 48 7 p E [2 oxh Time (min)

44 Targetowa analiza lipidomiczna Lipidomika Shotgun Klasa fosfolipidów Tryb pozytywny Fosfatydylocholiny (PC) PIS m/z Fosfatydyloetanoloaminy (PE) NLS 141 Da - Tryb negatywny Fosfatydyloseryny (PS) NLS 185 Da NLS 87 Da Fosfatydyloglicerole (PG) - NLS 74 Da Fosfatydyloinosytole (PI) - PIS m/z 241 Kardiolipiny (CL) Sfingomieliny (SM) PIS m/z źródło jonizacji Izolacja m/z Skanowanie jonów pierwotnych Skanowanie Skanowanie Skanowanie Monitorowanie wybranych reakcji fragmentacji (SRM) Izolacja m/z MS1 (analizator mas) Skanowanie jonów wtórnych Utrata obojętnej cząsteczki Cela kolizyjna (CID) Skanowanie Izolacja m/z Izolacja m/z MS2 (analizator mas) Fragmentacja wyizolowanego jonu prekursora Jony prekursorów dla wybranego jonu potomnego Jony po utracie określonej cząsteczki neutralnej Jony specyficznej pary prekursor/ fragment detektor

45 Analiza ilościowa przy użyciu LC-MS Standard wewnętrzny di-c14 di-c17 di-c15 Przed ekstrakcją Przed analizą MS Potencjalne straty analitu podczas ekstrakcji PL Species Internal Standard Chromatogram wybranych jonów Standard wewnętrzny Analit dpowiedź ilościowa jest inna zależnie od rodzaju związku lipidowego Inny standard wewnętrzny dla każdej klasy lipidów Normalizacja sygnału poszczególnych związków lipidowych do sygnału standardu wewnętrznego odpowiedniej klasy lipidów

46 Ten projekt został sfinansowany przy wsparciu Unii Europejskiej. Niniejsza prezentacja odzwierciedla jedynie poglądy autorów, a Komisja nie ponosi odpowiedzialności za jakiekolwiek wykorzystanie informacji zawartych w tej prezentacji