OZNACZANIE ZAWARTOŚCI ROBENIDYNY W PRÓBKACH PASZY ZWIERZĘCEJ

Transkrypt

1 OZNACZANIE ZAWARTOŚCI ROBENIDYNY W PRÓBKACH PASZY ZWIERZĘCEJ Opracowali: dr inz. Agata Kot-Wasik dr inŝ. Andrzej Wasik mgr inŝ. Joanna Wilga CEL ĆWICZENIA Celem ćwiczenia jest porównanie czasochłonności i pracochłonności oraz moŝliwości jakie daje uŝycie ekstrakcji pod zwiększonym ciśnieniem i temperaturą, w łaźni ultradźwiękowej oraz aparacie Soxhleta na przykładzie izolacji robenidyny z paszy dla zwierząt.

2 WPROWADZENIE Robenidyna (chlorowodorek 1,3 bis[(4-chlorobenzylideno)amino]guanidyny) jest stosowana w celu zapobiegania i leczenia kokcydiozy - pasoŝytniczej choroby układu pokarmowego wielu zwierząt hodowlanych (kozy, owce, króliki, drób) wywoływanej przez pierwotniaki naleŝące do rzędu Eimeria tenella, E. Necatrix, E. Acervulina, E. Maxima, E. Brunetti, and E. Mivati. Robenidyna wykazuje stosunkowo skuteczność wysoką terapeutyczną, przy niewielkiej toksyczności. Stosuje się ją najczęściej jako dodatek do pasz w ilościach odpowiednio: 3 36 mg/kg oraz 5 66 mg/kg suchej masy w paszy przeznaczonej dla drobiu i królików. Pomimo duŝej popularności tego leku, w literaturze naukowej niewiele jest wzmianek o metodach jego oznaczania [1,2,3]. Metoda dotąd zalecana [4] jest czasochłonna, pracochłonna, zmusza do zuŝywania duŝych ilości rozpuszczalników i jest wieloetapowa. W Katedrze Chemii Analitycznej, Wydziału Chemicznego, Politechniki Gdańskiej opracowano nową metodę oznaczania robenidyny przy wykorzystaniu przyspieszonej ekstrakcji rozpuszczalnikiem oraz wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detekcją DAD-MS. Zaproponowana metoda redukuje czas przygotowania próbek trzykrotnie, ilość niezbędnych etapów do dwóch, zaś ilość zuŝywanego rozpuszczalnika czterokrotnie pozwalając jednocześnie na oznaczanie robenidyny na tak niskim poziomie, jak 3 mg/kg w przypadku stosowania detektora DAD) i.7 mg/kg w przypadku stosowania detektora MS. [1]. G.F. Bories, Analyst, 1, 567, 1975 [2]. M.K. Cody, G.B. Clark, B.O.B. Conway, N.T. Crosby, Analyst 115, 1, 199 [3]. H. Cohen, F. Armstrong, H. Cambell, J.Chromatogr. A, 694, , 1995 [4]. European Communities (Feeding stuffs) (Methods of Analysis) (Amendment) Regulations, 1994

3 CZEŚ ŚĆ Ć DOŚ ŚWIADCZALNA Do ekstrakcji wykorzystywano ekstraktor Dionex ASE 2. Analizy chromatograficzne przeprowadzano z wykorzystaniem chromatografu cieczowego Agilent 11 series LC- DAD-MSD wyposaŝonego w kolumnę LiChrosphere ODS 125mm L. x4. mm ID, 5 m (Merck). Warunki chromatograficzne i detekcji zebrano i przedstawiono w Tabeli I. Tabela I Warunki rozdzielania i detekcji robenidyny. Temperatura 2 C. Przepływ gazu 12 l/min suszącego: iŝ Ciśnienie: 45 psi Faza Izokratycznie, (7% Temperatura gazu 35 C ruchoma: metanol, 3% woda z suszącego: dodatkiem 1 % v/v Napięcie kapilary: 5 V kwasu TFAA. Tryb: SIM, jony monitorowane: 334 and 336 Napięcie fragmentacji: 95 ev Odczynniki Z uwagi na fakt, nie moŝna było dotrzeć do firmy, która sprzedaje robenidynę jako wzorzec, związek ten - celem wykorzystania go jako wzorzec w chromatografii - został wyizolowany z handlowo dostępnego preparatu Robenvit, będącego składnikiem dodawanym do pasz wzbogaconych w robenidynę. Robenidyna została wyizolowana z tego preparatu poprzez ekstrakcje chloroformem i krystalizację, zaś zarówno jak strukturę, jak i jej czystość potwierdzono przy uŝyciu C 13 -NMR oraz analiz HPLC. Kolumna: Przepływ: Warunki rozdzielania mm, 5 µm LiChrosphere ODS (Merck). 1 ml/min DAD: MSD: Jonizacja: Warunki detekcji 317 nm electrorozpylanie (ESI), tryb pozytywny Wszystkie rozpuszczalniki i odczynniki stosowane do ekstrakcji i analiz chromatograficznych były czystości HPLC i zakupione zostały w firmie Merck.

4 Próbki Optymalizacji warunków ekstrakcji dokonano na podstawie izolacji robenidyny z paszy dla królików handlowo dostępnej, która zawierała znaną ilość robenidyny. Badania wykonano takŝe dla pasz przeznaczonych szynszyli i dla kurcząt. Wszystkie pasze przed ekstrakcją mielono i przesiewano. Procedurę analityczną umoŝliwiającą izolację robenidyny z paszy, którą 15g,1mLMeOH,1godzina Wytrząsanie Paszadlazwierząt Sączenie filtrszklany 8g,22mLMeOH,9minut EkstrakcjaASE opracowano, przedstawiono w postaci schematu blokowego na Rysunku 1. Sitamolekularne,typ3A Osuszanie Sączenie filtrszklany Rotator,odparowaniedosucha Oczyszczanie Sitamolekularne,typ3A Osuszanie kolumnaszklana,11gal2o3 kolumnaszklana,1gal2o3 Oczyszczanie AnalizaHPLCKDADKMS 1mLfazyruchomej AnalizaHPLCKDADKMS Odparowanie rozpuszczalnika Rozpuszczanie pozostałości

5 Rysunek 1. Porównanie procedur analitycznych izolacji robenidyny z paszy. LEWA strona - metoda rekomendowana przez EC, PRAWA strona - metoda opracowana w Katedrze Chemii Analitycznej PG. Około 8 g próbki paszy mieszano z c.a. 8 g oczyszczonego piasku kwarcowego, umieszczano w naczyniu do ekstrakcji ASE o pojemności 22 ml i prowadzono ekstrakcje w podwyŝszonej temperaturze i w podwyŝszonym ciśnieniu zakwaszonym metanolem. Ekstrakty zbierano w naczyniu, w którym było sito molekularne (5g). Po około 5 minutach wytrząsania z naczynia pobierano 2 ml ekstraktu, który poddawano oczyszczeniu na kolumience wypełnionej 1 g Al 2 O 3. Robenidynę wymywano przy uŝyciu 1 ml metanolu, który to eluat zbierano do kolby miarowej. Tak uzyskany ekstrakt poddawano analizie HPLC-DAD-MS. Optymalizowano takie parametry ekstrakcji ASE, jak: temperatura, ciśnienie, czas ekstrakcji i rozpuszczalnik do ekstrakcji. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono dla paszy handlowo dostepnej zawierającej robenidyne w ilości 62.7 mg/kg. Do optymalizacji uŝyto programu komputerowego Essential Experimental Design, który jest dostępny na następujacej stronie internetowej: Podjęto próbę iŝ określenia modelu matematycznego opisującego proces ekstrakcji (4 parametry zmienne). Z wyników uzyskanych na podstawie jedenastu eksperymentów (ekstrakcji ASE) wynikało, parametrami wpływającymi na współczynniki odzysku w sposób najbardziej istotny są: temperatura i ciśnienie ekstrakcji. ToteŜ w następnej kolejności optymalizowano temperaturę (Rysunek 2A). Po wybraniu optymalnej temperatury optymalizowano ciśnienie (Rysunek 2B), a potem czas ekstrakcji (Rysunek 2C), po czym sprawdzono wpływ stosowanego rozpuszczalnika do ekstrakcji (Rysunek 2D).

6 (A) 12 (C) ODZYSK [%] ODZYSK [%] Temperatura ekstrakcji [ C] Czas ekstrakcji [min] (B) 12 1 (D) 12 1 ODZYSK [%] ODZYSK [%] Ciśnienie ekstracji [psi] MeOH+AcOH MeOH+HCOOH ACN+AcOH ACN+HCOOH Rysunek 2 Wpływ róŝnych parametrów ekstrakcji ASE na odzysk robenidyny z paszy Wybrane optymalne warunki ekstrakcji ASE robenidyny z paszy przedstawiono w Tabeli II.

7 Tabela II Optymalne warunki ekstrakcji ASE robenidyny z paszy Temperatura ekstrakcji 1 C Ciśnienie ekstrakcji 15 psi (1 psi = kpa) Czas ekstrakcji (statycznej) 3 min Objętość rozpuszczalnika 1 % Czas płukania 6 s Ilość cykli 3 Rozpuszczalnik do ekstrakcji metanol + kwas octowy (1% v/v) Analiza ekstraktów z próbek paszy, precyzja metody i odzysk Trzy róŝne próbki paszy (dla królików, kurcząt i szynszyli) poddawano ekstrakcji dwoma metodami (wg procedury przez nas opracowanej i rekomendowanej przez EC). Na Rysunku 3 porównano otrzymane wyniki, zaś na Rysunku 4 pokazano typowe chromatogramy otrzymane w wyniku analizy HPLC ekstraktów z pasz oraz widmo masowe umoŝliwiające identyfikację robenidyny. ODZYSK [%] liczony w stosunku do zawartości robenidyny deklarowanej pzrez producenta paszy Rysunek metoda rekomendowana przez EC metoda opracowana przez PG 54.7± ± ± ± ± ±1.2 Króliki Szynszyle Kurczęta Rodzaj paszy Porównanie metod pod względem odzysku i precyzji.

8 (A) *MSD1 SPC, time=5.979 of ROBEN\ROBASE5.D API-ES, Pos, Scan, Frag: Cl CH = N NH NH C NH N = CH Robenidine m.w.=334,46 Max: 3588 Cl m/z (B) (C) mau 7 DAD1 A, Sig=317,4 Ref=6,1 (ROBEN\ROBASE5.D) 6.23 DAD1 A, Sig=317,4 Ref=6,1 (ROB-PR\ROB-PR7.D) mau min min Rysunek 4 Widmo masowe robenidyny (A) oraz chromatogramy uzyskane podczas analizy ekstraktu z paszy przygotowanej wg procedury przez nas opracowanej (B) i rekomendowanej przez EC (C). PODSUMOWANIE Opracowano prostą i szybką metodę izolacji i oznaczania robenidyny w paszach zwierzęcych. Dzięki zastosowaniu ekstrakcji ASE metoda - w porównaniu do metody rekomendowanej przez EC - jest szybsza (redukuje czas przygotowania próbek trzykrotnie, a ilość niezbędnych etapów do dwóch) i tańsza (redukuje ilość zuŝywanego rozpuszczalnika czterokrotnie). Precyzja metody jest wysoka ( % w zaleŝności od rodzaju paszy). Dzięki zastosowaniu detektora MS granica detekcji wynosi.7 mg/kg.

9 SPOSÓB PRZYGOTOWANIA PRÓBKI PASZY ZWIERZĘCEJ DO IZOLACJI ROBENIDYNY Z WYKORZYSTANIEM PRZYSPIESZONEJ EKSTRAKCJI ROZPUSZCZALNIKIEM (ASE) Około 8 g próbki paszy (wcześniej zmielonej i przesianej) zmieszać z c.a. 8 g oczyszczonego piasku kwarcowego. Całość umieścić w naczyniu do ekstrakcji ASE o pojemności 22 ml i przeprowadzić ekstrakcję w podwyŝszonej temperaturze i w podwyŝszonym ciśnieniu zakwaszonym metanolem. Ekstrakty zbierać w naczyniu, w którym umieszczone jest sito molekularne (5g). Po około 5 minutach wytrząsania z naczynia pobierać 2 ml ekstraktu, który naleŝy poddać oczyszczeniu na kolumience wypełnionej 1 g Al 2 O 3. Robenidynę wymywa się przy uŝyciu 1 ml metanolu, który to eluat zbiera się do kolby miarowej. Tak uzyskany ekstrakt moŝna poddać analizie chromatograficznej HPLC-DAD-MS.

10 SPOSÓB PRZYGOTOWANIA PRÓBKI PASZY ZWIERZĘCEJ DO IZOLACJI ROBENIDYNY Z WYKORZYSTANIEM EKSTRAKCJI WSPOMAGANEJ ULTARDŹWIĘKAMI (UAE) Około 1-2 g próbki paszy (wcześniej zmielonej i przesianej) zmieszać z c.a. 1-2 g oczyszczonego piasku kwarcowego. Całość umieścić w naczyniu szklanym z płaskim dnem o pojemności kilka ml (preferowane jest naczynie wysokie i wąskie) i przeprowadzić ekstrakcję w łaźni ultradzwiękowej z uŝyciem 2-4 ml zakwaszonego metanolu. Po ekstrakcji ekstrakt przesączyć lub zdekantować (pobierając wówczas 7-8% esktraktu). Ekstrakt przenieść do naczynia, w którym umieszczone jest sito molekularne (1g). Po około 5 minutach wytrząsania z naczynia pobierać 2 ml ekstraktu, który naleŝy poddać oczyszczeniu na kolumience wypełnionej 1 g Al 2 O 3. Robenidynę wymywa się przy uŝyciu 1 ml metanolu, który to eluat zbiera się do kolby miarowej. Tak uzyskany ekstrakt moŝna poddać analizie chromatograficznej HPLC-DAD-MS.

11 SPOSÓB PRZYGOTOWANIA PRÓBKI PASZY ZWIERZĘCEJ DO IZOLACJI ROBENIDYNY Z WYKORZYSTANIEM EKSTRAKCJI W APARACIE SOXHLETA Około 1-2 g próbki paszy (wcześniej zmielonej i przesianej) zmieszać z c.a. 1-2 g oczyszczonego piasku kwarcowego. Całość umieścić tą w gilzie papierowej, a w aparacie Soxhleta. Do kolby kulistej wlać zakwaszony metanol i ekstrakcję przeprowadzić ogrzewając kolbę z rozpuszczalnikiem. Po ekstrakcji ekstrakt ochłodzić i przesączyć (jeśli jest to konieczne). Usunąć nadmiar rozpuszczalnika stosując odparowywacz obrotowy, a pozostałość (ok. 5 ml) przenieść do naczynia, w którym umieszczone jest sito molekularne (1g). Po około 5 minutach wytrząsania z naczynia pobierać 2 ml ekstraktu, który naleŝy poddać oczyszczeniu na kolumience wypełnionej 1 g Al 2 O 3. Robenidynę wymywa się przy uŝyciu 1 ml metanolu, który to eluat zbiera się do kolby miarowej. Tak uzyskany ekstrakt moŝna poddać analizie chromatograficznej HPLC-DAD-MS.