Chromatografia cieczowa jako technika analityczna i technika otrzymywania substancji -- podstawy i główne g wne zasady stosowania

Transkrypt

1 Z Z czego składa się zieleń pól l i lasów Chromatografia cieczowa jako technika analityczna i technika otrzymywania substancji -- podstawy i główne g wne zasady stosowania Prof. dr hab. inż. Marian Kamiński Najważniejsze informacje wprowadzające - Chromatografia - technika rozdzielania substancji / cząstek w układach ciecz ciało o stałe, albo ciecz - ciecz - Znaczenie rozdzielania - rozdzielić = zidentyfikować,, oznaczyć - Techniki chromatograficzne - LC, GC, SFC // kolumnowe, planarne (TLC) - Mechanizmy fizykochemiczne - NP, RP, IC, AC, HIC, LIHIC, LEC, IEC,... Warunek konieczny rozdzielenia Konkurencja oddziaływa ywań sorpcyjnych o porównywalnych energiach, w układzie: faza stacjonarna faza ruchoma substancje rozdzielane - Zastosowania - składniki roślin, płynp ynów w fizjologicznych, monitoring środowiska, kontrola jakości, kontrola procesów w technologicznych, polidyspersyjność polimerów,..., ale także: rozdzielanie grupowe, przygotowanie próbek do analizy, wyznaczanie parametrów w fizykochemicznych substancji,...

2 Michai chaił Cwiet ( ) 1919) Odkrywca techniki kolumnowej Like light rays in the spectrum, the different components of a pigment mixture, obeying a law, are resolved on the calcium carbonate column and then can be qualitatively and quantitatively determined. I call such a preparation a chromatogram and the corresponding method the chromatographic method.

3

4 Klasyczna technika kolumnowa

5 ELUENT ELUAT, substancje rozdzielane

6 S t R czas retencji M M R t t t k = M R M R t t t t k k = = α 2 5,54 = h R w t N k współczynnik retencji - współczynnik rozdzielenia α N-liczba półek teoretycznych N k k R S + = α α Rs -rozdzielczość pików -zależność teoretyczna t M czas martwy kolumny - retencja substancji niesorbowanej, wnikającej do porów wypełnienia kolumny Informacje niesione z chromatogramem i podstawowe zależności Rs=(t Rn+1 t Rn ) / ½(S n+1 + S n ) -zależność obliczeniowa

7 Kilka podstawowych pojęć Układ chromatograficzny (faza stacjonarna (faza stacjonarna faza ruchoma określone oddziaływania sorpcyjne / mechanizmy separacji) (spowolnienie elucji - względem u ); Retencja substancji (spowolnienie elucji Selektywność rozdzielania (stopień zróżnicowania retencji); Sprawność rozdzielania (miara dyspersji stref substancji); Prędko dkość u [mm/s], natęż ężenie przepływu eluentu w [ml/min] Opór r przepływu ywu w kolumnie ΔP P [MPa[ MPa] ] = 32 u*lc*η / dp 2 Kolumna o długod ugości (Lc), średnicy (dc),, wypełnienie ziarniste (dp,, d, A) / monolityczne (dm,, d, A) Sorbent - ziarnistość ść,, pory wewnątrz trz-ziarnowe ziarnowe i między dzy- ziarnowe, porowatość (ε wz, ε mz, ε T ),, powierzchnia sorpcyjna (A - nawet do 750 m 2 /g) Detekcja i detektory (stęż ężeniowe, masowe); Czułość i liniowość detekcji; Zasady postępowania powania analitycznego (metoda krzywej kalibracyjnej w tym - punktów w ograniczających, cych, wzorca wewnętrznego, dodatku wzorca, normalizacji)

8 Mechanizmy separacji Warunki RP hydrofobowość Warunki NP polarność ść,, polaryzacja, dyspersja, wiązania wodorowe; Warunki IC wymiana jonów Warunki wykluczania (chromatografii żelowej) zróżnicowanie dróg g i czasu dyfuzji składnik adników w próbki Inne: HIC,LILHIC,NP-w,LEC,AC,EC w,lec,ac,ec,...,...

9 Kolumna do chromatografii cieczowej - Rurka o bardzo gładkiej g ściance, o średnicy (dc)( dc),, wypełniona sorbentem o przeciętnej (średniej)( wielkości ziaren (dp) i długod ugości warstwy wypełnienia (Lc) kolumny klasyczne, mikropakowane,, kapilarne otwarte,, preparatywne, procesowe; -Wypełnienie powinno być ułożone one równomiernie r w przekroju poprzecznym, zapewniając tłokowy profil przepływu; (u f (dc)) -Wypełnienie ułożone u one w sposób b stabilny, zapewniający brak osiadania złoża; W celu stabilizacji wypełnienia kolumny preparatywnej stosowane sąs takie zabiegi,, jak dynamiczna kompresja osiowa złoża z a (DAC), albo/i kompresja radialna (promieniowa) wypełnienia.

10 Wypełnienie ziarniste kolumny HPLC

11 Wypełnienie monolityczne

12 DYSPERSJA MASY w KOLUMNIE Wiele zjawisk przyczynia się do dyspersji stref rozdzielanych substancji Wzrost dyspersji = spadek sprawności kolumny wzrasta H i spada N Im niższa wartość wysokości równoważnej półce teoretycznej (HETP, H), tym wyższa wartość liczby półek teoretycznych tym wyższa sprawność rozdzielania - także -kolumny

13 Dyspersja stref zjawisko niekorzystne, jednak, nieuniknione Zjawiska powodujące dyspersję - Dyfuzja wirowa (A); - Dyfuzja molekularna (B); - Opory przenoszenia masy (C) 1. w fazie ruchomej (Cm), 2. w fazie stacjonarnej (Cs) Równanie Van Deemter a, H = B/u + A + Cu = B/u + A + (Cm + Cs) u albo bardziej adekwatne dla LC równania wnania: Knox a,, lub Giddings a

14

15 Zależno ności najprostsze, aktualne dla CGC w przypadku HPLC, tylko w przybliżeniu i co do zasady H = A + min BC u opt = B C H = min A+ B C

16 Instrumentalizacja chromatografii aparatura chromatograficzna - Należy y zapewnić: - Stałe (w, u = const), albo zmienne w funkcji czasu, zaprogramowane natęż ężenie przepływu eluentu (u, w = f(t)) )),, o zaprogramowanej stałej (elucja izokratyczna), albo zmiennej w funkcji czasu - zawartości poszczególnych składnik adników eluentu (elucja gradientowa) oraz - stałą (T=const,, warunki izotermiczne), albo zmienną, zaprogramowaną w funkcji czasu (T=f(t gradientu temperatury ) temperaturę separacji. T=f(t), warunki

17 Instrumentalizacja chromatografii aparatura chromatograficzna - Należy y także: - Zapewnić czułą łą,, wystarczająco co uniwersalną,, albo wysoce specyficzną ( oraz, o ile to możliwe) liniową w szerokim zakresie stęż ężeń detekcję obecności ci i zawartości rozdzielanych substancji w eluacie wypływaj ywającym z kolumny, - Celowe jest, dodatkowo,, stosowanie systemu przełą łączania kolumn i zapewnienie możliwo liwości stosowania przepływu zwrotnego w kolumnie chromatograficznej

18 SCHEMAT CHROMATOGRAFU CIECZOWEGO etap kondycjonowania kolumny

19 SCHEMAT CHROMATOGRAFU CIECZOWEGO - etap rozdzielania substancji

20 Schemat aparatu pompowego PG D

21 Schemat ideowy opracowanego w PG taniego aparatu HPLC do zastosowań w dydaktyce elucja izokratyczna

22 Schemat ideowy opracowanego w PG taniego aparatu HPLC do zastosowań w dydaktyce elucja gradientowa

23 SYSTEM PRZEŁĄ ŁĄCZANIA KOLUMN I STOSOWANIA PRZEPŁYWU ZWROTNEGO

24 Thin Layer: 1889 Chromatografia planarna cienkowarstwowa (TLC), bibułowa owa (PC)

25 FAZA RUCHOMA

26 k= ( 1/Rf ) - 1 c d c Rf = 3 d b a FAZA RUCHOMA Rf = 1 a d Rf = 2 b d

27 Detekcja Detektory w HPLC / TLC Detektor chromatograficzny przepływowy instrument analityczny o znikomej objęto tości naczyńka pomiarowego; Nie istnieje dotychczas w pełni uniwersalny detektor w LC, stąd d stosuje się wiele różnych; r Znaczenie bardzo dobrej dynamiki oraz liniowości odpowiedzi detektora we współczesnej HPLC; UV ( nm)/ UV-VIS VIS ( nm) i szczególne znaczenie detektora typu DAD (diode( array detector) RID (refractive( index detector) LLSD (laser light scattering detector) FLD (fluorescence( detector) El-D D (electrochemical( detector,, typ amperometryczny) CD (coductometric( detector - supresja jonów w eluentu) LC-MS, LC-MS MS-MS (mas - spectrometry) inne (FTIR, NMR, LC-FID, Radiometryczny, Polarymetryczny, Pomiaru momentu dipolowego,...) Techniki wizualizacji w przypadku TLC oraz technika derywatyzacji post-kolumnowej w przypadku HPLC

28 Nowoczesna detekcja i detektory - UV-DAD DAD,, LC-MS, GC-MS - Pojęcie absorpcji światła, a, prawo absorpcji światła: a: [-lg(i/i o )]= lg(i o /I)= I)=ABS=k * c * l Widmo, jakie informacje niesie widmo? Chromatogram detektora UV-DAD - kilkadziesiąt chromatogramów w jednocześnie nie Najwygodniejsze - odwzorowanie poziomicowe Wnikliwa analiza przebiegu widma umożliwia identyfikację substancji o charakterystycznym przebiegu widma - jednocześnie nie - na podstawie retencji i cech widma Problem widmo własne składnik adników w eluentu

29 Chromatogram Wykres zależno ności stęż ężenia substancji w eluacie wypływaj ywającym z kolumny w funkcji objęto tości elucji, a gdy natęż ężenie przepływu eluentu jest stałe (w, u = const) w funkcji czasu Opis każdego chromatogramu powinien zawierać: - cel badania, dane o próbce, kolumnie, warunkach elucji (składniki adniki i skład eluentu, albo składniki adniki eluentu i program elucji), - zastosowany detektor i warunki detekcji, w tym program długod ugości fali, - nazwy substancji odpowiadających pikom chromatograficznym

30 Zasady opisu chromatogramu HPLC / TLC - Co to jest i co szczególnego przedstawia? (np. Chromatogram rozdzielania składnik adników metanolowego ekstraktu rośliny z gatunku Dionea, otrzymany w warunkach układu faz odwróconych oraz elucji gradientowej z zastosowaniem optymalnego programu ramu elucji, chromatograf MERCK-HITACHI, LaChrom); - Próbka, warunki rozdzielania, warunki detekcji -Próbka:... (np.: ekstrakt metanolowy z suszu liści..., 1g suszu/10 ml MeOH, albo roztwór mieszaniny wzorców w w MeOH o stęż ężeniu każdego składnika ok. 0.5 mg/ml) itd., itp.; - Kolumna i wypełnienie kolumny (np. Lichrocart 125 x 4 mm i.d., Lichrospher RP 18e 5 um); - Eluent / program elucji (np. eluent: MeOH-H2O H2O 80:20 v/v, albo: elucja gradientowa, eluent A: woda dejonizowana % v/v TFA, eluent B: MeOH-AcCN AcCN-THF 45/45 45/10 v/v+0.75% TFA, program elucji: 0 do 5 min - 5% B, 5 do 25 min 5 do 95% B, liniowo, 25 do 33 min 95% B; -Przepływ i ewentualnie ciśnienie (np. 1.5 ml/min, ( MPa)); -Detektor i warunki detekcji (np. detektor UV-VIS VIS typ DAD, L-7450A L MERCK, albo detektor UV-254 nm z kuwetą o czułości ci 0.01 Jedn. Absorb. dla skali 10 mv) ) itp., itd. Piki chromatograficzne: (powinna być informacja o każdym piku, np. 1 beta karoten, 2 1OH- naftalen 3 chlorofil A, 4 karotenoid o nieznanej strukturze, 5, 7-9. substancje nieznane, 6. 1-CH31 Naftalen, itp., itd....) Warunki szczególne i informacje dodatkowe (jeśli dotyczy...). W ten sposób b powinien być opisany każdy chromatogram załą łączony do sprawozdania laborato- ryjnego,, w pracy naukowej, albo raporcie z badań.. Każdy wydruk raportu powinien mieć opis danych, które zawiera, może e to być w częś ęści zrealizowane w formie zastosowania symboli i wyjaśnienia znaczenia symboli. Każdy raport powinien zawierać też informację o wykonawcy badania oraz datę i czas wykonania badania.

31 Chromatogram program dł. Fali Funkcja analizy ilościowej ABS-f(t) Widmo -piren Funkcja analizy jakościowej Chromatogram detektora UV-DAD odwzorowanie poziomicowe ABS=f(t, λ) ABS=f(λ)

32 Przykłady zastosowań LC - HPLC TLC - rozdzielanie grupowe i przygotowanie próbek do analizy - rozdzielanie szczegółowe i oznaczanie składnik adników - otrzymywanie substancji - preparatywne / procesowe Biologia, fizjologia, farmakognozja, farmakologia; farmacja, produkcja leków; Biochemia, biologia molekularna, genetyka; Kontrola i zanieczyszczenia żywności Ekologia, monitoring środowiska naturalnego Kontrola jakości surowców w i produktów Kontrola procesowa, w tym,, laboratoryjna Medycyna, weterynaria, analityka kliniczna Biotechnolgia,, przemysł farmaceutyczny

33 Przykład chromatogramu rozdzielania grupowego i identyfikacji produktu naftowego z zastosowaniem detektora UV-VIS/DAD VIS/DAD Setki, a nawet tysiące substancji w każdej grupie

34 Widok pasm kilku składnik adników w ekstraktu acetonowego trawy przez szklaną ścianę kolumny HPLC typu CN, eluent heksan MTBE - THF; kolejność pasm - od dołu: produkt rozkładu chlorofilu, chlorofil A, carotenoidy-i,, chlorofil B, carotenoidy-ii І Ι Ι ν ν kierunek przepływu eluentu od góry g do dołu Warunki rozdzielania Kolumna 150x3mm, Separon CN 5 um,eluent: heksan:mtbe:thf=55:8:6,4 (v/v/v), próbka 30 ul ekstraktu acetonowego z trawy, temperatura pokojowa Natęż ężenie przepływu eluentu w=0.8 ml/min

35 Chromatogram UV-DAD powstały y podczas rozdzielania ekstraktu izolowanego z trawy za pomocą acetonu. Warunki rozdzielania: Kolumna Eurospher CN, 7um; eluent heksan:mtbe:thf=55:8:6,4 (v/v/v)

36 Monitoring środowiska oznaczanie zawartości WWA Kolumna Lichrospher RP mmx4mm 5μm, CH3CN-H2O v/v, 1.5 ml/min, UV-DAD nm; piki: 1-(?), 2-benzen, 3- naftalen, 4-acenaften, 5-fenantren, 6-piren, 7-benzo (α) piren.

37 Metody kalibracji - Metoda krzywej kalibracyjnej (external standard) -Metoda wzorca wewnętrznego trznego (internal standard) - Metoda normalizacji (Normalization) -- uproszczona (simplified), -- ze współczynnikami kalibarcyjnymi (correction factors) -Metoda dodatku wzorca (standard addition) - co najmniej dwa rozdzielania