Metody chromatograficzne. Zaawansowane techniki chromatograficzne cz.2. Chromatografia gazowa. Chromatografia gazowa. Chromatografia gazowa

Transkrypt

1 Metody chromatograficzne Zaawansowane techniki chromatograficzne cz.2 Chromatografia analityczna wykrycie związku oznaczenie ilościowe dodatkowe cechy czynność optyczna parametry fizchem interakcje Chromatografia preparatywna czysta substancja ograniczenia co do fazy ruchomej 4 stycznia 2016 Chromatografia gazowa cieczowa absorpcyjna jonowa wykluczenia (SEC) powinowactwa absorpcyjna normalny układ faz (SiO 2 ) odwrócony układ faz (C 18 ) HILIC badane substancje kolumna chromatograficzna gaz nośny detektory badane substancje lotne odporne na wysoką temperaturę derywatyzacja sililacja alkilacja estryfikacja acylacja 1

2 Derywatyzacja kolumna chromatograficzna kolumna kapilarna (0,1 0,6 mm) nośnik (ziemia okrzemkowa 20 m 2 /g) nośnik pokryty cieczą (Skwalan, Apiezon, poliestry glikoli, siloksany, PEG) 2,6,10,15,19,23-heksametylotetrakozan gaz nośny czystość H, N, He, Ar detektory płomieniowo-jonizacyjny (FID) wychwyt elektronów (ECD) GC-MS Analiza fazy nadpowierzchniowej Chromatografia cieczowa dozowanie gradient i izokrat parametry 2

3 HPLC - ciśnienie kolumna 250 x 4,6 mm, ziarno 5 μm 1400 psi 1 atmosfera 1 bar??? psi 1013 hpa Próbka rozpuszczanie w czym? ile? sączenie dlaczego? jak wprowadzić próbkę? Wprowadzanie próbki Próbka rozpuszczanie w czym? ile? sączenie dlaczego? jak wprowadzić próbkę? strzykawka z odpowiednią igłą 3

4 Przeładowanie objętościowe (Volume overload) Przeładowanie stężeniowe (Concentration overload) Gradient i izokrat Gradient i izokrat izokrat stały skład fazy ruchomej dobór stężenia pompy brak restabilizacji elucja wczesna elucja opóźniona gradient zmienny skład fazy ruchomej zakres zmian pompy stabilizacja kolumny opóźnienie gradientu Gradient i izokrat Gradient wysoko- i niskociśnieniowy 4

5 Faza ruchoma jednorodna - izokrat zmienny skład gradient mieszalność i efekty cieplne ściśliwość dopasowanie do metody detekcji Czystość eluentów HPLC grade CZYSTOŚĆ Przechowywanie wody w naczyniach plastikowych powoduje jej zanieczyszczenie Przechowywanie wody w naczyniach szklanych powoduje jej zanieczyszczenie Dodatki do fazy ruchomej kontrola ph przeciwjony chromatografia par jonowych TFA lotność dodatków Detektory Chromatogram zarejestrowany na dwukanałowym detektorze UV 5

6 Detektor fluorescencyjny Fluorescence detector Wysoka czułość Derywatyzacja próbki (np. chlorkiem dansylu) Detektory UV chromofory wartość odcięcia FL fluorofory derywatyzacja refrakcja izokrat konduktometria ch. jonowa zw. nieorganiczne elektochemiczny redox czystość MS jonizowalność Optical detection Electrical detection Detector Selectivity Sensitivity Merits A wide variety of substances can be detected that absorb light UV/UV-VIS detector 2 3 from 190 to 900 nm. Sensitivity depends strongly on the component. A wide variety of substances can be detected that absorb light Diode array detector from 190 to 900 nm. Sensitivity depends strongly on the 2 3 (DAD, PDA) component. The spectrum can be confirmed for each component. Fluorescence (FL) detector Differential refractive index (RI) detector Evaporative light scattering detector (ELSD) Conductivity detector (CD) Electrochemical detector (ECD) Corona Charged Aerosol Detector (Corona CAD ) Components emitting fluorescence can be detected selectively with high sensitivity. This is often used for pre-column and post-column derivatization. Any component that differs in refractive index from the eluate can be detected, despite its low sensitivity. Cannot be used to perform gradient analysis. This detector atomizes the column eluate, and detects the scattered light of the resulting particulate components. Non- UV-absorbing components are detected with high sensitivity. Ionized components are detected. This detector is used mainly for ion chromatography. Electric currents are detected that are generated by electric oxidation-reduction reactions. Electrically active components are detected with high sensitivity. This detector atomizes the column eluate and electrically detects the resulting particulate components treated with corona discharge. UV-nonabsorbing components can be detected with sensitivity higher than that of ELSD. 4 = Excellent, 3 = Good, 2 = Moderate, 1 = Poor Chromatogram - podstawowe parametry Rozdzielczość (R s ) Resolution 6

7 Sprawność kolumny Współczynnik retencji k (Capacity factor) V 0 - Objętość martwa kolumny (Void volume or dead volume) V 1 - Objętość retencji piku (Retention volume of peak 1) Selektywność (względna retencja a) (Selectivity, Relative retention) Objętość martwa Retencja: Selektywność: Półka teoretyczna: Różne metody obliczania liczby półek teoretycznych Liczba półek teoretycznych (N) jest miarą sprawności kolumny. 7

8 Parametry wpływające na rozdzielczość Parametry wpływające na rozdzielczość Parametry wpływające na rozdzielczość Wpływ ph na rozdzielczość Problemy? Troubleshooting 8

9 9