dr hab. Zofia Modrzejewska Łódź, Wydział Inżynierii Procesowej i Ochrony Środowiska Politechnika Łódzka

Transkrypt

1 dr hab. Zofia Modrzejewska Łódź, Wydział Inżynierii Procesowej i Ochrony Środowiska Politechnika Łódzka Recenzja pracy doktorskiej mgr inż. Igi Wasiak Nanocząstki polisacharydowe, jako nośniki leków - otrzymywanie, separacja, właściwości fizykochemiczne i biologiczne Promotor prof. dr hab. inż. Tomasz Ciach 1. Treść i zakres rozprawy doktorskiej Przedstawiona do oceny praca poświęcona jest otrzymywaniu samoorganizujących się nanocząstek polisacharydowych do zastosowania w terapiach nowotworowych. Tematyka pracy jest nadzwyczaj aktualna i ważna, dobrze wpisuje się w prace poświęcone wytwarzaniu oraz modyfikowaniu celowanych nośników leków, badania z tego zakresu prowadzone są obecnie bardzo intensywnie na całym świecie. Celem pracy było opracowanie uniwersalnego procesu otrzymywania nanocząstek polisacharydowych na drodze zjawiska samoorganizacji w roztworach wodnych. Nanocząstki te wykorzystane będą jako nośniki leków przeciwnowotworowych. Ich zastosowanie pozwoli na ograniczenie efektów ubocznych oraz zwiększy skuteczność terapeutyczną. Badania przedstawione w pracy są badaniami pionierskimi, nie publikowanymi (poza pracami Doktorantki i oczywiście Jej Promotora) w literaturze przedmiotu. Praca podzielona została na dwie części: część literaturową oraz część eksperymentalną. W części teoretycznej Doktorantka przedstawiła wprowadzenie do tematyki chorób nowotworowych (Rozdz.1), opisała nanotechnologie w aspekcie wykorzystania w medycynie, zwłaszcza nanoonkologii i systemie podawania leków (Rozdz. 2) oraz przedstawiła polisacharydy pod kątem samoorganizujących się nanocząstek (Rozdz. 3). W części eksperymentalnej Doktorantka przedstawiła własne podejście, które wykorzystała przy projektowaniu badań (Rozdz.4), umieściła informacje dotyczące zastosowanych polisacharydów: dekstranu, karboksymetylocelulozy i algnianu oraz przedstawiła charakterystykę leków przeciwnowotworowych z grupy antracyklin (Rozdz. 5), opisała sprzęt i oprogramowanie wykorzystane przy opracowywaniu wyników (Rozdz. 6), podała procedury postepowania przy realizacji badań (Rozdz.7), zaprezentowała istotę wytwarzania nanocząstek polisacharydowych metodą samoorganizacji (Rozdz. 8 i 9), przedstawiła wyniki badań oraz szczegółową charakterystykę nanocząstek dekstranowych (Rozdz. 10), opisała wyniki badań nad nanocząstkami z karboksymetylocelulozy z alginianu (Rozdz. 11 i 12), pracę zakończyła dyskusją i posumowaniem (Rozdz. 13) oraz wnioskami, bibliografią i załącznikami. Praca ma dobrą konstrukcję, z zainteresowaniem prowadzi czytelnika przez zagadnienia omawiane i badane w pracy. Cel, zakres oraz teza rozprawy zostały w rozprawie wyraźnie określone i w sposób logiczny i systematyczny przedstawione, co pozwala stwierdzić, że podjęte do realizacji zamiary zostały osiągnięte.

2 Przedstawiona do recenzji rozprawa doktorska liczy 204 stron z 41 rysunkami, 23 tabelami, streszczeniem, spisem oznaczeń, wprowadzeniem i spisem literatury (244 pozycje). 2. Ocena merytoryczna rozprawy Recenzowana rozprawa doktorska miała na celu opracowanie oryginalnej metody wytwarzania nanocząstek polisacharydowych. Oparta jest ona zjawisku na samoorganizacji zmodyfikowanego polisacharydu w środowisku wodnym. W tym celu polisacharydy są modyfikowane przez częściowe utlenianie w celu wytworzenia grup aldehydowych wzdłuż łańcucha, do których następnie przyłączane są hydrofobowe grupy (aminy alifatyczne, aminokwasy) stanowiące czynnik zwijający. W wodzie w wyniku oddziaływań hydrofilowo-hydrofobowych formowane są amfifilowe nanocząstki. Zaproponowana metoda pozwala na syntezę nanocząstek w środowisku wodnym, w temperaturze 30 C. Wytworzono nanocząstki z dekstranu, karboksymetylocelulozy i alginianu. Szczegółowy opis dotyczy otrzymywania nanocząstek z dekstranu. Badania nad wytwarzaniem nanocząstek z karboksymetylocelulozy i alginianu miały na celu potwierdzenie uniwersalności metody. Nanocząstki wytwarzane były w procesie wieloetapowym. W pierwszym etapie badań wytypowano metodę utleniania polisacharydów, jako utleniacz badano nadtlenek wodoru H 2 O 2 w obecności katalizatora FePcS i nadjodan sodu, z uwagi na możliwość prowadzenia procesu w temperaturze pokojowej, jako optymalne przyjęto utlenianie nadjodanem. Po utlenieniu prowadzono metodą dializy proces oczyszczania w celu usunięcia pozostałości nieprzereagowanego nadjodanu i produktów ubocznych reakcji utleniania. Syntezę nanocząstek wykonano z dekstranu o masie cząsteczkowej 15, 40, 70 i 500 kda. Zaobserwowano zmniejszenie rozmiaru nanocząstek wraz ze wzrostem masy cząsteczkowej dekstranu. W dalszym etapie zbadano wpływ rodzaju czynnika zwijającego oraz stopnia utleniania i podstawienia grup aldehydowych na morfologię nanocząstek. Zastosowano cztery różne czynniki zwijające: hydroksyloamina, octyloamina, dodecyloamina, benzyloamina; podstawiono od 11 do 100% grup aldehydowych. Średnica nanocząstek zmniejsza się wraz ze wzrostem stopnia utlenienia dekstranu oraz wraz ze wzrostem długości łańcucha aminy alifatycznej. Wraz ze wzrostem podstawienia grup aldehydowych średnica nanocząstek nieznacznie maleje. Najmniejszą średnicę otrzymano dla środka zwijającego - dodecyloaminy 65 nm. Optymalne podstawienie grup aldehydowych wynosiło 33 i 55%. Nanocząstki w środowisku wodnym ulegają agregacji, stąd proponowane jest przechowywanie w stanie suchym. Po suszeniu liofilizacyjnym uzyskano zmianę rozmiaru, która zależy od masy cząsteczkowej dekstranu i ilości czynnika zwijającego. Po opracowaniu sposobu wytwarzania nanocząstek, przystąpiono do wprowadzenia w ich strukturę substancji aktywnych, lek dodawany był przed dodaniem czynnika zwijającego. Jako substancje aktywne zastosowano doksorubicynę oraz daunorubicynę. Nanocząstki z lekiem mają budowę sferyczną, wielonaczyniową, strefy wykazują podwyższoną gęstość elektronową, co może świadczyć o agregacji leku. Średnica ich zwiększa się o około 30 nm.

3 Określono również budowę strukturalną, co niewątpliwie jest bardzo ważnym merytorycznym osiągnieciem. Jedna nanocząstka składa się z około 10 zmodyfikowanych łańcuchów dekstranu niezależnie od podstawienia, masy cząsteczkowej dekstranu czy wprowadzonego leku; wyprowadzono z tego wniosek, że nanocząstki powstają z tej samej liczby łańcuchów dekstanowych, różnice w średnicach wynikają z różnej zawartości wody w strukturze nanocząstki wynikające z oddziaływań hydrofobowych czynnika zwijającego. Nanocząstki zawierające substancje lecznicze również w wodnych roztworach ulegają aglomeracji, na proces nie ma wpływu temperatura lecz ich stężenie w roztworze, stąd wskazane jest przechowywanie w stanie suchym po liofilizacji. W celu wyeliminowania niekorzystnych naprężeń występujących w procesie suszenia dodawano kiroprotektant: dekstran, glukozę, sacharozę i laktozę. Najskuteczniejsze, tzn. w najmniejszym stopniu zmieniające strukturę, okazały się dekstran i laktoza. Do zastosowania terapeutycznego należy ponownie uwodnić zliofilizowane nanoczastki. Wyznaczono więc maksymalne stężenie nanoczastek w jakim mogą zostać zawieszone z zachowaniem ich własności stężenie to wynosi 0,3 g/10 ml. Następnie badano stopnień i efektywność związania DL i EE. Otrzymano efektywność wiązania leku ponad 90%, natomiast średni stopień związania wynosi powyżej 4%. W kolejnym etapie wyznaczono profil uwalniania w zależności od ph środowiska (PBS ph 5,5 i 7,4) w temperaturze otoczenia i 37 C. W profilach uwalniania nie zaobserwowano nagłego skoku stężenia substancji uwalnianej, co z punktu widzenia aplikacji chorym jest bardzo korzystne. Po 24h daunorubicyny uwalnia się 41,5% w ph 5,5 oraz 18,4% w ph 7,4, doksorubicyny odpowiednio 18,5% oraz 7,4%. Dokonano również modyfikacji powierzchni nanocząstek poprzez wprowadzenie grup karboksylowych. Z dekstranu zawierającego grupy aldehydowe i karboksylowe wytworzono nanocząstki z doksorubicyną. Modyfikacja nie umożliwiała jednak zmiany potencjału. Nanocząstki wykazywały lekko ujemny potencjał 4 mv, niezależnie od ilości czynnika zwijającego, czy wprowadzonego leku. W celu osiągnięcia aktywnego kierowania nanocząstek do guzów nowotworowych umieszczono na powierzchni nanocząstek kwas foliowy. Nanocząstki z kwasem foliowym posiadają większą średnicę. Nie zaobserwowano większej skuteczności toksycznej, nanocząstki przyspieszają jednak metabolizm, następuje szybszy transport doksorubicyny do jądra komórkowego i interkalacji w DNA. W końcowym etapie przeprowadzono testy in vitro i in vivo. Badania in vitro polegały na określeniu skutecznego stężenia leku, wpływu inkubacji i lokalizacji wewnątrzkomórkowej. Badania in vivo dotyczyły określenia wpływu nanocząstek w różnych układach i narządach. Badania in vitro cytotoksyczność określono na 3 liniach komórkowych L929 i dwóch nowotworowych HeLa HepG2. Nośnik wykazuje niską toksyczność, natomiast nanocząstki podobną do czystego leku, a w niektórych przypadkach nieznacznie lepszą. Najwyższą skuteczność otrzymano dla nanocząstek o stężeniu 10 4 ng/ml. Skuteczność stosowania nanoczastek NanoDox 1-5 wobec linii MES SA/Dx5 opornej na lek doksorubicynę wynosi 42% natomiast samego leku 29%. Na podstawie zdjęć z mikroskopu konfokalnego wyciągnięto wniosek, że nanocząstki są pobierane przez komórki, a uwalnianie leku odbywa się we wnętrzu komórek uwolniona substancja, a nie całe nanocząstki jest transportowana do jadra komórkowego. Otrzymane wyniki badań

4 prowadzące do opisania mechanizmu pobierania leku z nanocząstek uważam za kolejny bardzo istotny rozwiązany problem merytoryczny. Potwierdzeniem skuteczności podawania leku jest zwiększona depozycja w zmianach nowotworowych. Określono LD 50, czyli dawkę przy której połowa populacji umiera po jednorazowym podaniu. Badania prowadzono na myszach szczepu BALB/c preparaty podawano dootrzewnowo i dożylnie. Sprawdzono również efektywność po wielokrotnym podaniu wobec mysiego modelu ludzkiego nowotworu mięsaka macicy z opornością wielolekową. Badania te prowadzono na myszach szczepu Crl:SHO-Prkdc scid Hr hr. Z otrzymanych badań wynika, że nanocząstki nie nadają się do podawania dootrzewnowego (następuje odkładanie się nanocząstek na powierzchni narządów mających styczność z powierzchnią otrzewnową), natomiast stosując podawanie dożylne nanocząstek w porównaniu z czystym lekiem (doksorubicyna) otrzymuje się 2x większą koncentrację leku w guzach, przy 4x mniejszej akumulacji w sercu. Lek w nanonośniku charakteryzuje się niższą toksycznością, co związane jest z mniejszymi skutkami ubocznymi terapii (zmiany masy wątroby i śledziony były znacznie mniejsze niż po podaniu czystego leku). Wytworzono również nanocząstki z karboksymetylocelulozy z użyciem dwóch amin alifatycznych jako czynnika zwijającego heksyloaminy i benzyloaminy oraz modelowej substancji w postaci czerwieni obojętnej oraz nanocząstki alginianowe z zastosowaniem dodecyloaminy jako czynnika zwijającego. Dla nanoczastek z karboksymetylocelulozy trzymano wyniki podobne jak w przypadku nanocząstek z dekstranu. Nanocząstki z alginianu wykazywały znaczne zmiany po procesie liofilizacji i ponownym nawodnieniu. Zrealizowany przez Doktorantkę zakres pracy jest wynikiem jej zainteresowań badawczych i dokonań, jak również twórczym rozwijaniem badań prowadzonych przez Promotora. Po zapoznaniu się z rozprawą, pragnę z satysfakcją stwierdzić, że mgr inż. Iga Wasiak zrealizowała wyznaczone w pracy cele, wykazała się umiejętnością planowania i właściwej realizacji prac badawczych, a przedstawione w części eksperymentalnej wyniki potwierdziły zasadność podjęcia tematyki i stanowią istotny wkład w rozwój badań nad wytwarzaniem nowych nanonośników leków mogących mieć zastosowanie w terapiach antynowotworowych. Praca posiada elementy nowości, jest dobrze przemyślana i napisana poprawnie, bogaty materiał doświadczalny jest opisany w sposób logiczny. Dyskusja jest wyczerpująca, a wyciągnięte wnioski właściwe i trafne. Doceniam również umiejętność krytycznej analizy uzyskanych wyników. Doktorantka udowodniła, że jest doświadczonym, pełnym inicjatywy badaczem. Zdaniem recenzenta, na uwagę zasługuje również fakt, że wyniki badań Doktorantki zostały opublikowane w 4 publikacjach zamieszczonych w czasopismach z tzw. Listy filadelfijskiej. Oceniając aspekty poznawcze rozprawy doktorskiej, za istotne osiągnięcia Doktorantki można uznać: opracowanie oryginalnej metody wytwarzania nowej formy nośników leków - nanocząstek polisacharydowych zawierających doksorubicynę i daunorubicynę, które charakteryzują się możliwością aktywnego kierowania leku do tkanek chorobowo zmienionych, nanocząstki wytworzono pod kątem zastosowania do terapii nowotworowej, z

5 punktu widzenia aplikacyjnego jest to niewątpliwie bardzo istotne osiągnięcie i jak najbardziej uzasadniony kierunek badań, wykorzystanie i sprawne posługiwanie się nowoczesnymi metodami pomiarowymi o zastosowanie techniki Cryo-TEM pozwalającej na obserwacje nanocząstek w stanie uwodnionym, o pomiar potencjału metodą laserowej elektroforezy dopplerowskiej, o wykorzystanie nowoczesnych technik mikroskopowych mikroskopu konfokalnego zastosowanie systemu obrazowania opartego na fluorescencyjnym skanowaniu, określenie metodą atomizacji elektrosprejowej budowy chemicznej nanoczastek dekstranowych (ilość łańcuchów dekstranu w jednej nanocząstce), opisanie na podstawie zdjęć z mikroskopu konfokalnego mechanizmu pobierania leku z nanocząstek. Tak jak w każdej pracy są pewne mało istotne niejasności oraz uchybienia o charakterze edytorskim: 1. Str.48 równanie Noyes &Withney - brakuje współczynnika, uwzgledniającego dyfuzję oraz stosunek powierzchni kontaktu z rozpuszczalnikiem do objętości roztworu, 2. Str.110 co oznacza dwubiegunowe ładowanie dyfuzyjne?, 3. Tab. 18 żywotność komórek HeLa - czym można próbować wytłumaczyć zmniejszenie żywotności dla nanocząstek INanoDox-FA 1-5 skoro dla nanocząstek NanoDox-FA niewiele się zmniejsza, a sam kwas foliowy powoduje wzrost żywotności?, 4. Rys. 23 stężenie E8 (cząstek/ml) zmniejsza się w czasie pod wpływem inkubacji w wodzie? 5. Str. 159 czy jest znana dawka LD 50 dla doksorubicyny podanej dożylnie w pracy porównuje się LD 50 dla doksorubicyny podanej dootrzewnowo?, 6. Str. 160 w mniejszej dawce 5 mg/kg otrzymano wyższą toksyczność niż a w dawce terapeutycznej 7,5 mg/kg, 7. Czym kierowano się przy wyborze do formowania nanocząstek z karboksymetylocelulozy jako środka zwijającego heksyloaminy i benzyloaminy; dlaczego nie wybrano tej którą stosowano dla nanocząstek z dekstranu?. Dodecyloamina dawała najmniejsze cząstki dla dekstranu i ją tez zastosowano do wytwarzania nanocząstek alginianowych. 1. Str. 86 komórki zwirowane, 2. Str.87 niezbyt jasne stabilizację zasady Schiffa zapewnia zastosowanie dużych i złożonych molekuł czynnika zwijającego czy substancji aktywnej lub możliwość przeprowadzenia drugiego etapu reakcji do wytworzenia iminy, 3. Str.90 wpływ stopnia utleniania jest również widoczny na temperaturę zeszklenia według dynamiczno-mechanicznej analizy termicznej, 4. Str.91 poreakcyjny roztwór polisacharydu przenoszono do membrany dializacyjnej; 5. Str. 98 rozdział nie istnieje, 6. Str. 122 procedura opisana w rozdziale nie istnieje, 7. Str. 124 badanie cytotoksyczności zgodnie z protokołem - rozdział 4.3 nie istnieje,

6 8. Rys. 17 inne kolory na rys. b i c dla hekslo i octyloaminy mogą wprowadzić czytelnika na pierwszy rzut oka w błąd, 9. W celu łatwiejszego czytania tekstu można byłoby dodać przy skrótach w pierwszym powołaniu pełną nazwę (nadmieniam, że pełne nazwy są w spisie oznaczeń) np. a. str. 107 stopień związania DL i efektywność związania EE b. str.111 układ siateczkowo śródbłonkowy RES, c. str ,,6-diamidyno-2-fenyloindol DAPI d. str. 114 chlorowodorek 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu EDC Uwagi przedstawione powyżej, poczynione z obowiązku recenzenta, nie umniejszają wartości poznawczej rozprawy. Na podkreślenie zasługuje fakt, że Doktorantka dobrze opanowała metodykę badawczą, posługiwała się różnorodnymi technikami analitycznymi (FTIR, mikroskop konfokalny, fluorescencyjny). Na wyróżnienie zasługują również samodzielnie wykonane badania biologiczne. 3. Wniosek końcowy Praca nie budzi zastrzeżeń zarówno pod względem formalnym, jaki i merytorycznym. Została sformułowana poprawnie i wnosi wiele elementów nowości naukowej. Analiza danych doświadczalnych jest prawidłowa. Uzyskane wyniki poszerzają wiedzę na temat metod wytwarzania samoorganizujących się nanocząstek. Opracowanie stanowi oryginalny i samodzielny dorobek autorki. Badania prowadzone przez Doktorantkę potwierdzają unikalny charakter otrzymanych nośników związany z ograniczeniem skutków ubocznych leku zamkniętego w nanonośniku i zwiększeniem skuteczności terapeutycznej; w związku z tym predysponują do dalszych badań klinicznych. Z tego względu przedstawiona rozprawa zasługuje na szczególne zainteresowanie i wysoką ocenę. Stwierdzam, że rozprawa doktorska mgr inż. Igi Wasiak spełnia wymagania formalne w odniesieniu do pracy doktorskiej, odpowiada wymogom ustawy o tytule i stopniach naukowych z dnia 14 marca 2003 (Dz. Ustaw nr 65 poz., 595 wraz z późniejszymi zmianami). Zwracam się, zatem do Rady Naukowej Wydziału Inżynierii Chemicznej i Procesowej Politechniki Warszawskiej o przyjęcie pracy oraz dopuszczenie p. mgr inż. Igi Wasiak do dalszych etapów postępowania przewidzianego w przewodzie doktorskim. Biorąc pod uwagę dorobek Doktorantki oraz potencjał aplikacyjny otrzymanej oryginalnej formy nowego nanonośnika leku wnoszę o wyróżnienie pracy.