Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Katarzyny Pogody zatytułowanej Rola sił mechanicznych generowanych przez macierz zewnątrzkomórkową w rozwoju

Transkrypt

1 dr hab. Robert A. Nowakowski, prof. nadzw. PAN Instytut Chemii Fizycznej PAN Zakład Elektrochemii i Fizykochemii Powierzchni Grupa Badawcza Mikroskopii i Spektroskopii STM/AFM Warszawa Warszawa Kasprzaka 44/52 tel (0) fax: (0) robas@ichf.edu.pl Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Katarzyny Pogody zatytułowanej Rola sił mechanicznych generowanych przez macierz zewnątrzkomórkową w rozwoju raka prostaty wykonanej pod kierunkiem Pani dr hab. Małgorzaty Lekkiej w Instytucie Chemii Jądrowej Polskiej Akademii Nauk w Krakowie Recenzowana rozprawa doktorska mgr Katarzyny Pogody ma charakter doświadczalny i dotyczy badań wpływu bodźców mechanicznych na właściwości adsorpcyjne i fizjologiczne żywych komórek organizmu ludzkiego. Przedmiotem badań były prawidłowe komórki gruczołu krokowego (PZ-HPV-7) oraz komórki rakowe pochodzące z przerzutu raka prostaty do mózgu (Du145) oraz kości (PC-3). Znaczenie podjętych badań w aspekcie ogólnym wiąże się z istotnym wpływem oddziaływań mechanicznych na szereg procesów komórkowych, takich jak preferencyjna adsorpcja i kumulacja komórek na powierzchniach o określonych właściwościach mechanicznych, podział komórkowy oraz migracja komórek w organizmie żywym. Wiedza z zakresu reakcji komórek na sygnały mechaniczne ma podstawowe znaczenie w zrozumieniu szeregu procesów zachodzących w organizmie ludzkim zarówno w stanie zdrowym jak i stanach zmienionych chorobowo. Bardzo aktualnym zagadnieniem są zaburzenia w równowadze mechanicznej komórek, oraz ich odpowiedzi na bodźce zewnętrzne, wywołane zmianami nowotworowymi. Przyjmuje się, iż uzyskane informacje w tym zakresie mogą mieć w przyszłości istotnie znaczenie również kliniczne w tworzeniu nowoczesnych przeciwnowotworowych metod terapeutycznych. Dysertacja Pani mgr Pogody dobrze odpowiada na potrzebę takich badań. Znaczenie podjętych badań w aspekcie szczegółowym dotyczy charakterystyki zmian właściwości mechanicznych i reakcji na bodźce zewnętrzne prawidłowych i zmienionych nowotworowo komórek prostaty. W szczególności interesującym jest porównanie czułości mechanicznej komórek przerzutu raka prostaty do dwóch ośrodków o skrajnie odmiennych właściwościach mechanicznych, jakimi są mózg i kości. Koncepcja badań jest przejrzysta. Doktorantka przygotowała i zastosowała serie podłoży na bazie hydrożeli poliakrylamidowych o zbliżonej topologii i składzie chemicznym, ale

2 znacznie różnej sztywności w zakresie od 0,4 do 41 kpa. Główne badania dotyczyły porównawczej obserwacji hodowli trzech wspomnianych linii komórkowych na tych podłożach, w tym szybkości podziału komórkowego, i charakterystyk właściwości geometrycznych (pola powierzchni) i mechanicznych (elastyczności) komórek w funkcji zmian sztywności otoczenia. Na wstępie oceny chciałbym podkreślić interdyscyplinarność tematu przedłożonej rozprawy doktorskiej. Realizacja podjętego planu badań wymagała od Doktorantki zdobycia wiedzy z trzech różnych dziedzin: chemii, umożliwiającej m. in. preparatykę i chemiczną modyfikację podłoży polimerowych o różnych właściwościach elastycznych, biologii w zakresie prowadzenia hodowli i manipulacji żywymi komórkami ludzkimi oraz fizyki dotyczącej wykonywania złożonych pomiarów właściwości mechanicznych pojedynczych obiektów o rozmiarach mikronowych i umiejętności analizy uzyskanych wyników. Podstawową metodą badawczą zastosowaną w pracy jest mikroskopia sił atomowych w funkcji spektroskopii siły. Metoda ta umożliwia prowadzenie lokalnych pomiarów oddziaływań pomiędzy pojedynczymi cząsteczkami ulokowanymi na sondzie mikroskopu i powierzchni badanego obiektu. Z powodu unikalnych możliwości, m.in. nanometrycznej rozdzielczości i czułości pomiarów siły, spektroskopia ta znalazła zastosowanie w badaniu oddziaływań biologicznych (np. typu enzym-substrat) oraz charakterystyki właściwości mechanicznych obiektów biologicznych (np. komórek) w naturalnym lub bliskim do naturalnego środowisku. Należy podkreślić, iż użyta nowoczesna metoda badawcza jest eksperymentalnie złożoną wymagającą pokonania od badacza szeregu czasochłonnych etapów, wśród nich: każdorazowego wyznaczenia i optymalizacji parametrów sondy mikroskopu (w tym współczynnika sprężystości belki), kalibracji układu pomiarowego oraz świadomego stosowania teorii sprężystości w celu poprawnego wnioskowania i wyznaczenia właściwości mechanicznych obiektu. Ponadto, ze względu na lokalność, badania tego typu wymagają, w szczególności w odniesieniu do złożonych obiektów jakimi są komórki, wykonania dużej liczby pomiarów w każdej serii i analizy statystycznej uzyskanych wyników. Równolegle do badań reologicznych Doktorantka zastosowała inne metody pomocnicze w celu chemicznej charakterystyki powierzchni podłoży polimerowych (spektroskopia w podczerwieni) oraz obrazowania komórek na tych podłożach (mikroskopia fluorescencyjna z selektywnych wybarwianiem cytoszkieletu i jądra komórkowego). W tym miejscu chciałbym podkreślić, iż oceniane badania mogły być efektywnie realizowane tylko w ośrodku o dużym doświadczeniu w badaniach właściwości mechanicznych obiektów biologicznych metodą spektroskopii siły 2

3 dysponującym dedykowanym sprzętem mikroskopowym i własnym, specjalistycznym oprogramowaniem. W ocenie recenzenta obie wymienione cechy mówiące o interdyscyplinarności przeprowadzonych badań, jak również o specyfice i złożoności stosowanej metody badawczej są atutami ocenianej pracy doktorskiej i jednocześnie świadczą o ogromie pracy wykonanej przez Doktorantkę w trakcie realizacji badań. Dysertacja zawierająca 116 stron tekstu została podzielona na cztery zasadniczo samodzielne rozdziały, każdy posiadający odrębny wstęp, opis wniosków i wykaz literatury. Pracę kończy rozdział piąty w którym zbiorczo podsumowano uzyskane wyniki. Powyższa struktura pracy nie jest typowa dla rozpraw doktorskich i może stwarzać pewne trudności w całościowej ocenie np. w określeniu sumarycznej liczby różnych odnośników literaturowych. Z drugiej strony praca napisana jest w sposób bardzo przejrzysty, poprawnym językiem, a podział rozdziałów jest intuicyjny. Poza pierwszym rozdziałem który w całości pełni rolę części wstępnej i opisowej rozprawy, w pozostałych trzech rozdziałach Doktorantka opisała wyniki trzech kolejnych etapów podjętych badań dotyczących odpowiednio: preparatyki i charakterystyki podłoży polimerowych, charakterystyki kształtu i elastyczności badanych komórek na powierzchni szkła oraz analogicznych komórek na podłożach polimerowych o różnej sztywności. W rozdziale pierwszym zatytułowanym Wprowadzenie i cel pracy znajdujemy podstawowe informacje dotyczące parametrów ilościowych opisujących właściwości elastyczne materii, wzajemnych relacji pomiędzy tymi parametrami, oraz metod eksperymentalnych stosowanych w pomiarze tych właściwości w przypadku obiektów biologicznych. W dalszej części Doktorantka przybliża nam znaczenie i aspekt biologiczny tematu pracy w szczególności dotyczący mechanizmu odpowiedzi komórek na bodźce mechaniczne i wpływu tych bodźców na rozwój chorób nowotworowych, ze szczególnym uwzględnieniem raka prostaty. Rozdział ten kończy sformułowanie celu podjętych badań. W ocenie recenzenta przedstawione informacje w tej opisowej części dysertacji są poprawne i świadczą o interdyscyplinarnej wiedzy Doktorantki umożliwiającej samodzielne sprecyzowanie i uzasadnienie celu badań, jak również jego realizacje. Rozdział drugi dotyczy preparatyki i charakterystyki żeli poliakrylamidowych o różnych właściwościach elastycznych stosowanych w dalszych etapach jako podłoża do hodowli komórkowych. W pierwszej części rozdziału uzyskujemy informacje na temat syntezy żeli i preparatyki podłoży na bazie tego materiału. Doktorantka przedstawiła też użyte metody badawcze i procedury charakterystyki powierzchni warstw w aspekcie 3

4 składu chemicznego (spektroskopia w podczerwieni), topologii (mikroskopia AFM) oraz właściwości elastycznych (spektroskopia siły oraz pomiary z użyciem rotametru rotacyjnego). Wyniki prac eksperymentalnych opisane w dalszej części rozdziału ewidentnie potwierdziły umiejętność Doktorantki preparatyki polimeru o różnym stopniu usieciowania i tym samym kontroli jego sztywności. Było to możliwe poprzez zmianę stężenia akrylamidu w procesie polimeryzacji przy stałym stężeniu czynnika sieciującego. W konsekwencji Doktorantka uzyskała serię analogicznych chemicznie podłoży o różnym współczynniku sprężystości w zakresie od 0,4 do 41 kpa. Jednocześnie obrazowanie powierzchni warstw dehydratowanych przy użyciu mikroskopii AFM nie wykazały istotnych różnic w topologii powierzchni warstw o różnej elastyczności. Kolejne dwa rozdziały dotyczą badań trzech linii komórek prostaty: prawidłowej linii PZ-HPV-7 i dwóch linii komórek rakowych pochodzących z przerzutu raka prostaty do mózgu (Du145) oraz kości (PC-3). Oba typy komórek rakowych charakteryzuje inny, odpowiednio umiarkowany i wysoki stopień agresji. W rozdziale trzecim opisano wyniki badań komórek w hodowli standardowej na szkle. Rozdział ten rozpoczyna szczegółowy opis hodowli komórkowej. Następnie Doktorantka przedstawiła stosowane metody i procedury pomiarowe zastosowane do wyznaczenia geometrii komórek na badanym podłożu i szybkości podziału komórkowego (mikroskopia fluorescencyjna) oraz ich właściwości mechanicznych (spektroskopia siły). Należy podkreślić, iż wszystkie pomiary wykonywane były na żywych komórkach przebywających w odpowiednim dla danej linii medium hodowlanym. Badania komórek w standardowej hodowli na szkle wykazały istotne zmiany w zależności od linii komórkowej. Komórki prawidłowe PZ-HPV-7 charakteryzuje dużo większe pole powierzchni niż komórki rakowe. Z kolei komórki rakowe różni ich kształt: sferyczny komórek linii Du145 i wysoce anizotropowy komórek PC-3. Różnice widoczne są również w tempie podziału z typowym, dużo krótszym czasem podwojenia populacji komórek rakowych w porównaniu do komórek prawidłowych. Pomiar właściwości mechanicznych wykazał różnice w elastyczności komórek. Największe wartości modułu Younga otrzymano dla komórek prawidłowych, niższe dla komórek rakowych o wysokiej agresji (przerzut do kości, PC-3) i najniższe dla komórek rakowych o średniej agresji (przerzut do mózgu, Du145). Relacja ta jest jakościowo zgodna z wcześniejszymi doniesieniami literaturowymi innych autorów potwierdzając poprawność przyjętej procedury pomiarowej. W rozdziale czwartym Doktorantka opisała główną część badań. Dotyczyły one analogicznych trzech linii komórkowych hodowanych na serii podłoży polimerowych o różnej twardości. Na wstępie należy zwrócić uwagę na istotny etap preparatyki jakim była 4

5 dodatkowa modyfikacja chemiczna podłoży w celu zwiększenia przylegania i wzrostu badanych komórek. Metody i procedura pomiarów były analogiczne do stosowanych w poprzednio wykonanych badaniach komórek w hodowli standardowej. Istotne nowe wyniki otrzymane przez Doktorantkę dotyczyły analizy wpływu elastyczności podłoża na kształt komórek, szybkość ich wzrostu i właściwości mechaniczne. W tym celu Doktorantka zdefiniowała dwa parametry SR i AR opisujące czułość zmian odpowiednio: właściwości elastycznych i pola powierzchni komórek w funkcji sztywności podłoża. Otrzymane wyniki pokazały, iż właściwości elastyczne komórek rakowych o wysokiej agresji (przerzut do kości, PC-3) są najbardziej czułe na zmianę twardości otoczenia. Powyższa zależność jest mniejsza dla komórek prawidłowych i najmniejsza dla komórek rakowych o średniej agresji (przerzut do mózgu, Du145). Wartym podkreślenia jest fakt, iż niezależnie od linii komórkowej, największe zmiany właściwości elastycznych rejestrowane są w powierzchniowych warstwach cytoszkieletu. Z kolei najbardziej czułe na zmianę kształtu i pole powierzchni w zależności od sztywności podłoża są komórki prawidłowe PZ-HPV-7. Interesujące obserwacje dotyczą również zmian szybkości podziału komórkowego. Niezależnie od typu komórki dzielą się one wolniej na podłożach o małej sztywności. Godnym podkreślenia jest wniosek dotyczący obserwowanej dla komórek prawidłowych silnej korelacji czasu podwojenia populacji i pola powierzchni komórki. Istotne zwiększenie szybkości podziału jest obserwowane dla tego typu komórek po osiągnięciu granicznego pola powierzchni. Praca napisana jest przejrzyście, poprawnym językiem, jednak Autorka nie ustrzegła się kilku pomyłek, np.: 1. Właściwym jest użycie terminu właściwości mechaniczne (chemiczne), a nie własności mechaniczne (chemiczne). 2. Chyba występuje rozbieżność w wzajemnej relacji wartości modułu Younga wyznaczonych dla trzech typów komórek we wniosku iv. (str. 82) i opisem wyników (str. 78). Uwagi, które nasuwają się po przeczytaniu ocenianej pracy nie mają charakteru krytycznego, ale są wynikiem zainteresowania uzyskanymi wynikami oraz chęci lepszego zrozumienia. 1. Doktorantka podaje zależności wyznaczonego modułu Younga od głębokości indentacji z zakresu nm. Otrzymane różnice wartości mierzonego parametru wiąże się z właściwościami płytszych i głębszych warstw cytoszkieletu 5

6 oraz zmianą pola kontaktu ostrza z powierzchnią. Doktorantka nie prezentuje zdjęć 3D (np. z AFM) z możliwością określenia grubości komórek na powierzchni. Powstaje więc pytanie o stosunek głębokości indentacji do grubości warstwy i wpływ właściwości elastycznych innych wewnętrznych organelli komórkowych lub samej powierzchni podłoża na powyższy pomiar. 2. Wyniki wskazują na zbliżone zmiany pola powierzchni dwóch typów komórek rakowych, jak również podobne charakterystyki czasu podwojenia populacji w funkcji sztywności podłoża. Interesującym jest więc pytanie o czynniki wpływające na preferencyjną lokalizacje tych dwóch typów komórek w ośrodkach o tak odmiennych właściwościach elastycznych. 3. W odniesieniu do uzyskanych wyników, jak również ich dyskusji wydaje się zasadnym rozszerzenie badań na obrazowanie powierzchni z dużą rozdzielczością przy użyciu mikroskopu AFM lub ewentualnie mikroskopii fluorescencyjnej. Badania te mogą umożliwić korelacje różnic w topologii powierzchni, ewentualnie organizacji cytoszkieletu, komórek prawidłowych i zmienionych chorobowo z uzyskanymi różnicami w ich właściwościach elastycznych. Czy Doktorantka planuje rozszerzyć badania w tym kierunku, a może próbowała wykonywać już obrazy komórek z większą rozdzielczością? Podsumowując należy stwierdzić, iż Doktorantka opracowała metodykę pomiarów, która umożliwia badanie wpływu sztywności podłoża (ośrodka) na rozwój komórek i zmianę ich właściwości mechanicznych. Przeprowadzone porównawcze badania w odniesieniu do prawidłowych i rakowych komórek prostaty potwierdziły słuszność przyjętej koncepcji. Wszystkie opisane prace eksperymentalne zostały przeprowadzone w sposób poprawny i rzetelny. Moja ocena rozprawy jest zatem wysoka. Stwierdzam, że recenzowana praca doktorska mgr Katarzyny Pogody spełnia ustawowe wymagania (art.13, Dz.U. Nr 65 poz 595 z dnia 14 marca 2003 r. z późniejszymi zmianami) i wnioskuję o dopuszczenie Doktorantki do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Warszawa, dn. 26 wrzesień 2015 r. 6