Zestawy i odczynniki do barwienia metod¹ Grama 8820191JAA 2008/06 Polski Gram Stain Kit 1 Nr kat. 212539 Gram Crystal Violet Do ró nicowego barwienia bakterii. Gram Iodine (Stabilizowany) Gram Stain Kit 1 212524 Gram Crystal Violet Do ró nicowego barwienia bakterii. Gram Iodine (Niestabilizowany) Gram Crystal Violet Do barwienia drobnoustrojów za pomoc¹ 4 x 250 ml 212525 ró nicowej metody Grama. 1 x 3,8 L 212526 Gram Iodine (Stabilizowany) Do barwienia drobnoustrojów za pomoc¹ 4 x 250 ml 212542 ró nicowej metody Grama. 1 x 3,8 L 212543 Gram Iodine (Niestabilizowany) Do barwienia drobnoustrojów za pomoc¹ 4 x 250 ml 212529 ró nicowej metody Grama. 1 x 3,8 L 212530 Do barwienia drobnoustrojów za pomoc¹ 4 x 250 ml 212527 ró nicowej metody Grama. 1 x 3,8 L 212528 Do barwienia drobnoustrojów za pomoc¹ 4 x 250 ml 212531 ró nicowej metody Grama. 1 x 3,8 L 212532 Gram Basic Fuchsin Do barwienia drobnoustrojów za pomoc¹ 4 x 250 ml 212544 ró nicowej metody Grama. 1 x 3,8 L 212545 PRZEZNACZENIE Zestaw i odczynniki do barwienia metod¹ Grama stosowane s¹ do barwienia drobnoustrojów z hodowli i próbek za pomoc¹ ró nicowej metody Grama. STRESZCZENIE I OBJAŒNIENIA Barwienie metod¹ Grama zosta³o wynalezione w roku 1884 przez Christiana Grama podczas prób ró nicowania komórek bakteryjnych z zaka onych tkanek. Pomimo e Gram zaobserwowa³ to, co obecnie nazywane jest reakcj¹ Grama, nie dostrzeg³ taksonomicznej wartoœci tej techniki. Barwienie metod¹ Grama stosowane jest do ró nicowania nieuszkodzonych, morfologicznie podobnych bakterii na dwie grupy na podstawie koloru komórki po barwieniu. Ponadto wyraÿne s¹ kszta³t, rozmiar oraz szczegó³y strukturalne komórki. Te wstêpne informacje stanowi¹ wa ne wskazówki odnoœnie do rodzaju obecnych organizmów i sugeruj¹, jakie dodatkowe techniki nale y zastosowaæ do ich scharakteryzowania. Poniewa nieorganiczny jod jest szybko utleniany i traci swoj¹ skutecznoœæ jako substancja trawi¹ca 1, Gram Stain Kit (Nr kat. 212539) ró ni siê od oryginalnego zestawu Grama tym, e zawiera bardziej stabilny zwi¹zek organiczny jodu, L-poliwinylopyrolidono-jod. ZASADY PROCEDURY Procedura barwienia metod¹ Grama 2 obejmuje: Barwienie utrwalonego rozmazu za pomoc¹ fioletu krystalicznego. Zastosowanie jodu jako substancji trawi¹cej. Odbarwienie pierwszego barwnika za pomoc¹ alkoholu/acetonu i zastosowanie barwnika kontrastowego safraniny lub zasadowej fuksyny. Kompleks fiolet krystaliczny-jod tworzy siê w protoplaœcie (nie w œcianie komórki) wszystkich organizmów barwionych za pomoc¹ tej procedury. Organizmy zdolne zachowaæ kompleks barwi¹cy po odbarwieniu klasyfikowane s¹ jako gramdodatnie, natomiast te, które mo na odbarwiæ i zabarwiæ kontrastowo, klasyfikowane s¹ jako gram-ujemne. Po pêkniêciu lub usuniêciu œciany komórkowej protoplast komórek gram-dodatnich (jak równie gram-ujemnych) mo na odbarwiæ i utracona zostanie cecha gram-dodatnia. Dlatego mechanizm barwienia metod¹ Grama wydaje siê zwi¹zany z obecnoœci¹ nienaruszonej œciany komórkowej, dzia³aj¹cej jako bariera chroni¹ca przed odbarwieniem pierwszego barwnika. Zasadniczo œciana komórkowa jest przepuszczalna w sposób nieselektywny. Istnieje teoria, e podczas procedury barwienia metod¹ Grama œciana komórkowa komórek gram-dodatnich ulega odwodnieniu przez alkohol zawarty w odbarwiaczu i traci przepuszczalnoœæ, zatrzymuj¹c pierwotny barwnik. Œciana komórkowa komórek gram-ujemnych ma natomiast wiêksz¹ zawartoœæ lipidów i staje siê bardziej przepuszczalna podczas traktowania alkoholem, co powoduje utratê pierwszego barwnika. Podstawy molekularne barwienia metod¹ Grama nie zosta³y dotychczas okreœlone.
ODCZYNNIKI Przybli ony sk³ad* na litr Gram Crystal Violet PIERWSZY BARWNIK Fiolet krystaliczny.......................... 3,0 g Izopropanol............................. 50,0 ml Etanol/Metanol.......................... 50,0 ml Woda destylowana...................... 900,0 ml Gram Iodine ŒRODEK TRAWI CY (Roztwór roboczy przygotowywany z Gram Diluent (rozcieñczalnik) oraz Gram Iodine (jod) 100X) Kryszta³ki jodu............................ 3,3 g Jodek potasu.............................. 6,6 g Woda destylowana........................ 1,0 L Stabilized Gram Iodine ŒRODEK TRAWI CY Kompleks poliwinylopyrolidono-jod....... 100,0 g Jodek potasu............................ 19,0 g Woda destylowana........................ 1,0 L ODBARWIACZ Aceton............................... 250,0 ml Izopropanol........................... 750,0 ml BARWNIK KONTRASTOWY Safranina O w proszku (czysty barwnik)..... 4,0 g Etanol/Metanol........................ 200,0 ml Woda destylowana.................... 800,0 ml Gram Basic Fuchsin BARWNIK KONTRASTOWY Fuksyna zasadowa......................... 0,08 g Fenol..................................... 2,6 g Alkohol izopropylowy...................... 4,5 ml Woda destylowana...................... 993,0 ml *Skorygowany i/lub uzupe³niony zgodnie z wymaganiami kryteriów dzia³ania. Ostrze enia i œrodki ostro noœci: Do stosowania w diagnostyce in vitro. W miarê up³ywu czasu w Gram Basic Fuchsin (fuksyna zasadowa) mog¹ wytr¹ciæ siê delikatne precypitaty. Nie wp³ywa to na dzia³anie produktu. Gram Crystal Violet (fiolet krystaliczny): Szkodliwy przy wdychaniu oraz w razie spo ycia. Dra ni¹cy dla oczu, uk³adu oddechowego i skóry. Istnieje ryzyko nieodwracalnych dzia³añ niepo ¹danych. Pojemnik przechowywaæ œciœle zamkniêty. Przechowywaæ z dala od Ÿróde³ zap³onu nie paliæ. Nie wdychaæ gazu / dymu / pary / sprayu. Stosowaæ odpowiednie ubrania ochronne i rêkawiczki. Gram Iodine 100X (jod): Szkodliwy przy wdychaniu, kontakcie ze skór¹ oraz po po³kniêciu. Pojemnik przechowywaæ œciœle zamkniêty. Nie wdychaæ gazu / dymu / pary / sprayu. Unikaæ kontaktu ze skór¹ i oczami. Stosowaæ odpowiednie ubrania ochronne. Stabilized Gram Iodine (stabilizowany jod): Szkodliwy przy kontakcie ze skór¹. Powoduje oparzenia. Dra ni¹cy dla oczu, uk³adu oddechowego i skóry. Pojemnik przechowywaæ œciœle zamkniêty. Nie wdychaæ gazu / dymu / pary / sprayu. Unikaæ kontaktu ze skór¹ i oczami. Stosowaæ odpowiednie ubrania ochronne. (odbarwiacz): Dra ni¹cy dla oczu, uk³adu oddechowego i skóry. Pojemnik przechowywaæ œciœle zamkniêty i w dobrze wentylowanym miejscu. Przechowywaæ z dala od Ÿróde³ zap³onu nie paliæ. Nie wdychaæ gazu / dymu / pary / sprayu. Unikaæ kontaktu ze skór¹ i oczami. (safranina): Szkodliwy przy wdychaniu oraz w razie spo ycia. Dra ni¹cy dla oczu, uk³adu oddechowego i skóry. Pojemnik przechowywaæ œciœle zamkniêty. Przechowywaæ z dala od Ÿróde³ zap³onu nie paliæ. Stosowaæ odpowiednie ubrania ochronne i rêkawiczki. Gram Basic Fuchsin (fuksyna zasadowa): Mo e powodowaæ nowotwory. Mo e powodowaæ dziedziczne uszkodzenia genetyczne. Dra ni¹cy dla oczu. Pojemnik przechowywaæ œciœle zamkniêty. Nie wdychaæ py³u. Unikaæ kontaktu ze skór¹ i oczami. Stosowaæ odpowiednie ubrania ochronne. W razie przedostania siê do oczu natychmiast przemyæ oczy du ¹ iloœci¹ wody i zg³osiæ siê do lekarza. Gram Iodine 100X: Natychmiast zdj¹æ ca³e zanieczyszczone ubranie. Po kontakcie ze skór¹ natychmiast sp³ukaæ du ¹ iloœci¹ wody. W razie wdychania wynieœæ poszkodowanego na œwie e powietrze. Je eli poszkodowany nie oddycha, zastosowaæ sztuczne oddychanie. W razie trudnoœci z oddychaniem podaæ tlen. Zg³osiæ siê do lekarza. W razie po³kniêcia natychmiast zg³osiæ siê do lekarza i pokazaæ opakowanie lub etykietê. Przechowywanie: Po otrzymaniu przechowywaæ w temperaturze 15 30 C. Data przydatnoœci do u ytku dotyczy produktu w nieotwartych butelkach, przechowywanego wed³ug zaleceñ. Nie otwieraæ do chwili u ycia. Tradycyjny roztwór roboczy Gram Iodine nale y zu yæ w ci¹gu 3 miesiêcy od przygotowania, nie przekraczaj¹c daty przydatnoœci do u ytku adnego ze sk³adników. Pogorszenie jakoœci produktu: Po rozpuszczeniu, niestabilizowany Gram Iodine mo e powodowaæ zmiennoœæ w barwieniu metod¹ Grama, je eli w roztworze nie jest ju dostêpna odpowiednia iloœæ jodu. Chroniæ roztwór jodu przed nadmiern¹ ekspozycj¹ na powietrze, œwiat³o i ciep³o, aby sprawdziæ, czy roztwór zapewnia odpowiedni¹ aktywnoœæ trawi¹c¹. POBIERANIE I PRZYGOTOWYWANIE PRÓBEK Nanieœæ badan¹ próbkê na czyst¹ p³ytkê szklan¹ w taki sposób, aby powsta³ cienki jednorodny rozmaz. Zemulgowaæ kolonie z hodowli 18 24 h w soli, aby otrzymaæ odpowiedni¹ gêstoœæ. Poczekaæ, aby rozmaz wysech³ na powietrzu. Utrwaliæ rozmaz na szkie³ku, stosuj¹c jedn¹ z poni szych technik: 1. Utrwaliæ termicznie, przesuwaj¹c szkie³ko 2-3 razy przez s³aby p³omieñ. Przed barwieniem och³odziæ szkie³ko do temperatury pokojowej. UWAGA: Nie przegrzewaæ szkie³ka; nadmierne ogrzanie spowoduje atypowe barwienie. 2. Utrwaliæ szkie³ko metanolem, zanurzaj¹c w metanolu absolutnym na 1 2 min i wyp³ukaæ pod wod¹ z kranu przed barwieniem 3. UWAGA: W celu odpowiedniego utrwalenia przechowywaæ metanol absolutny w br¹zowej butelce zamykanej nakrêtk¹ i uzupe³niaæ roztwór roboczy co dwa tygodnie. 2
PROCEDURA Przygotowanie odczynnika Przygotowaæ tradycyjny roztwór roboczy jodu Grama, dodaj¹c ca³¹ 2,5 ml ampu³kê Gram Iodine 100X do 250 ml Gram Diluent lub ca³¹ fiolkê 40 ml Gram Iodine 100X do 3,8 L Gram Diluent; dok³adnie wymieszaæ. Materia³y dostarczone: Gram Crystal Violet, Gram Iodine lub Stabilized Gram Iodine, i lub Gram Basic Fuchsin. Materia³y wymagane, ale niedostarczane: Szkie³ka mikroskopowe, palnik Bunsena lub metanol, eza bakteriologiczna, waciki, bibu³a, mikroskop z obiektywem immersyjnym oraz szkie³ko Grama. Procedura testowa: 1. Zanurzyæ utrwalony rozmaz w pierwszym barwniku (Gram Crystal Violet) i barwiæ przez 1 min. 2. Usun¹æ pierwszy barwnik, delikatnie przep³ukuj¹c zimn¹ wod¹ z kranu. 3. Zanurzyæ szkie³ko w œrodku trawi¹cym (Gram Iodine lub Stabilized Gram Iodine) i moczyæ przez 1 min. 4. Usun¹æ œrodek trawi¹cy, delikatnie przep³ukuj¹c zimn¹ wod¹ z kranu. 5. Odbarwiaæ (), dopóki rozpuszczalnik sp³ywaj¹cy ze szkie³ka nie bêdzie bezbarwny (3 60 s). 6. Przep³ukaæ szkie³ko delikatnie zimn¹ wod¹ z kranu. 7. Zanurzyæ szkie³ko w barwniku kontrastowym ( lub Gram Basic Fuchsin) i barwiæ przez 30-60 s. 8. Przep³ukaæ szkie³ko zimn¹ wod¹ z kranu. 9. Osuszyæ bibu³¹ lub papierowym rêcznikiem lub pozostawiæ do wyschniêcia na powietrzu. 10. Oceniæ rozmaz w mikroskopie z obiektywem immersyjnym. Kontrola jakoœci przez u ytkownika Nale y postêpowaæ zgodnie z obowi¹zuj¹cymi wymaganiami kontroli jakoœci, wynikaj¹cymi z przepisów lokalnych, krajowych lub federalnych, wymogami akredytacji oraz standardowymi procedurami kontroli jakoœci w danym laboratorium. Zaleca siê, aby u ytkownik stosowa³ siê do odpowiednich wytycznych CLSI (dawniej NCCLS) i przepisów CLIA, dotycz¹cych sposobów kontroli jakoœci. Przeprowadzaæ barwienie kontrolne, stosuj¹c BBL Gram Slide (Nr kat. 231401) lub 18 24 h hodowle znanych drobnoustrojów gram-dodatnich i gram-ujemnych. Zalecane jest zastosowanie nastêpuj¹cych szczepów kontrolnych: Drobnoustroje ATCC Oczekiwane wyniki Staphylococcus aureus 25923 gram-dodatni ziarniak Escherichia coli 25922 gram-ujemna pa³ka OGRANICZENIA PROCEDURY Barwienie metod¹ Grama daje wy³¹cznie wstêpn¹ informacjê odnoœnie do identyfikacji, nie zastêpuje natomiast szczegó³owych badañ hodowli próbki. Wyniki barwienia metod¹ Grama nale y potwierdziæ za pomoc¹ dodatkowych procedur, takich jak bezpoœredni test antygenowy lub hodowla na pod³o ach. Wczeœniejsze leczenie antybiotykami mo e powodowaæ, e drobnoustroje gram-dodatnie wydaj¹ siê gram-ujemne. W celu uzyskania najlepszych wyników zaleca siê stosowanie hodowli 18 24 h, poniewa œwie e komórki wykazuj¹ wiêksze powinowactwo do wiêkszoœci barwników ni komórki stare. Dotyczy to szczególnie wielu bakterii tworz¹cych spory, które s¹ silnie gram-dodatnie w œwie ych hodowlach, a póÿniej staj¹ siê gram-zmienne lub gram-ujemne. Reakcja barwienia metod¹ Grama ulega zmianie w razie fizycznego zniszczenia œciany komórki bakteryjnej lub protoplastu. Œciany komórkowe bakterii gram-dodatnich tworz¹ barierê, która zapobiega wyciekaniu kompleksu barwnika z cytoplazmy. Œciany komórkowe bakterii gram-ujemnych zawieraj¹ lipidy rozpuszczalne w rozpuszczalnikach organicznych, które pozwalaj¹ na odbarwienie cytoplazmy. Dlatego drobnoustrój, który zostanie fizycznie zniszczony przez nadmierne ogrzewanie, nie bêdzie w odpowiedni sposób reagowa³ z barwnikiem Grama. W celu uzyskania prawid³owych wyników nale y dok³adnie przestrzegaæ procedury i kryteriów interpretacyjnych. Dok³adnoœæ zale y od wyszkolenia i umiejêtnoœci mikrobiologa 2. Na wyniki barwienia metod¹ Grama, w tym równie na morfologiê drobnoustrojów, mo e wp³ywaæ wiek izolatu, bakterie zawieraj¹ce system enzymów autolitycznych, hodowle przeniesione z pod³o a zawieraj¹cego antybiotyk, jak równie próbki pobrane od pacjentów leczonych antybiotykami 4. Materia³ t³a i artefakty mog¹ równie utrudniaæ interpretacjê. Wytr¹cony barwnik gram-dodatni wygl¹da zazwyczaj jak nieregularne kszta³ty ziarniakowe lub jak wzory przypominaj¹ce strzêpki grzyba 4. OCZEKIWANE WYNIKI I CHARAKTERYSTYKA DZIA ANIA 1-4 Reakcja Wykorzystuj¹ca Wykorzystuj¹ca Gram Basic Fuchsin Gram-dodatnie Komórki fioletowoczarne Komórki jasnofioletowe do fioletowoczarnych Gram-ujemne Komórki ró owe do czerwonych Komórki jasnoró owe do purpurowych PIŒMIENNICTWO 1. Magee, C.M., G. Rodenheaver, M.T. Edgerton, and R.F. Edlich. 1975. A more reliable Gram staining technique for diagnosis of surgical infections. Am. J. Surg. 130:341-346. 2. Kruczak-Filipov, P., and R.G. Shively. 1994. Gram stain procedures, p. 1.5.1-1.5.18. In H.D. Isenberg (ed.), Clinical microbiology procedures handbook, vol.1. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 3. Mangels, J.I., M.E. Cox, and L.H. Lindley. 1984. Methanol fixation. An alternative to heat-fixation of smear. Diag. Microbiol. Infect. Dis. 2:129-137. 4. Chapin, K. 1995. Clinical microscopy, p. 33-51, In P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover and R.H. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 6th ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C. 3
4
Becton, Dickinson and Company 7 Loveton Circle Sparks, Maryland 21152 USA 800-638-8663 BENEX Limited Bay K 1a/d, Shannon Industrial Estate Shannon, County Clare, Ireland Tel: 353-61-47-29-20 Fax: 353-61-47-25-46 ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection. BD, BD Logo and BBL are trademarks of Becton, Dickinson and Company. 2008 BD.