Summary/Samenvatting/Streszczenie
Summary Healthy body cells grow, divide and die. Cancer develops because of out-of-control growth of abnormal cells. Cancer cells continue to grow and divide, while healthy cells would have died already. The last decades, significant advances have been made through both basic and clinical research, which have improved the treatment and quality of live of cancer patients. Nevertheless, cancer remains the second leading cause of death in the US and in the countries of the EU. Over one million people get cancer each year and approximately half of men and one third of women in the US will develop cancer during their lifetimes. The majority of localized cancers are treated by surgery and/or radiotherapy. The first choice of cancer that has spread (metastasized) to other parts of the body is chemotherapy. There are two frequent problems that lead to treatment failure in patients with cancer: the toxic side effects towards healthy cells caused by cytotoxic drugs and insensitivity or resistance of cancer cells to chemotherapy. Lung cancer has the highest mortality of all cancers, with an overall 5- years survival of 15%. The predominant cause of lung cancer is cigarette smoking, which accounts for over 90% of cases of lung cancer. Lung carcinomas are divided into non-small cell lung carcinomas (NSCLCs) and small cell lung carcinomas (SCLCs). NSCLC represents approximately 80% of lung carcinomas. The treatment of advanced or metastatic NSCLCs is platinum-based chemotherapy, usually in combination with taxanes, vincaalkaloids or gemcitabine. However, NSCLC frequently does not respond to first-line chemotherapy, and only 20 to 20% of patients experience a response upon treatment, meaning a significant reduction in the total tumor mass. The resistance to platinum-like drugs, such as cisplatin, is multifactorial and the mechanisms of resistance include increased intracellular detoxification, increased capability to repair cisplatin-induced DNA damage and disregulated programmed cell death (apoptosis). Apoptosis is a physiological, regulated form of eukaryotic cell destruction that is triggered by various physiological and pathological stimuli, including cytokines, hormones and cytotoxic drugs, such as cisplatin. Abnormalities in the regulation of apoptosis can lead to a variety of diseases, 148
Summary/Samenvattig/Streszczenie such as cancer, autoimmunity diseases and degenerative disorders. Under normal circumstances, an abnormal cell goes into apoptosis. In cancer, this self-protection mechanism is insufficiently active. The activation of apoptosis is initiated by two different signal transduction pathways headed by the activation of two different enzymes: caspase-8 (extrinsic route) and caspase-9 (intrinsic route or mitochondriadependent apoptosis). Caspases are enzymes involved in the execution of apoptosis. Inhibition of caspases by certain factors plays an important role in the resistance of tumor cells to chemotherapy. The activation of intrinsic apoptotic pathway is initiated by cellular insults, such as administration of chemotherapeutic drugs, and involves mitochondria-dependent activation of caspase-9 in the apoptosome complex. Once activated, initiator caspase-9 processes and activates effector caspases: caspase-3 and caspase-7. The intrinsic apoptotic pathway is regulated upstream of the mitochondria by so-called Bcl-2 family proteins and downstream of the mitochondria by inhibitors of apoptosis proteins (IAPs). Disruption of the mitochondria-dependent apoptotic pathway may result from altered expression or mutations of Bcl-2 family members, such as Bcl-2, Bcl-xl and Bax. Subsequently, this may leads to the development of drug resistance. Furthermore, downstream of the mitochondria, a lack of Apaf-1, another important protein involved in apoptosis, might be correlated with inhibition of apoptosis. The presence of specific apoptosis inhibitory proteins (IAPs), such as TUCAN or XIAP and to a lesser extent ciap-1 and ciap-2, may cause a blockage of activation of initiator and effector caspases and inhibit druginduced apoptosis, resulting in chemoresistance. The characterization of molecular mechanism(s) underlying the disregulated activation of the intrinsic apoptotic pathway in NSCLC cells, which may provide clues for the development of targeted apoptosis-based therapies, is the subject of this thesis, entitled:. Regulation of mitochondriadependent apoptosis in non-small cell lung cancer cell: implications for cancer therapy. In the introduction of this thesis, Chapter 1, general information is provided concerning lung cancer and the observed resistance to currently used chemotherapeutic regimens. Additionally, the relationship between the regulation of mitochondria-dependent apoptosis and tumorigenesis and chemoresistance are described. Furthermore, an overview of new apoptosis- 149
based therapies is provided. Alterations in mitochondria-dependent apoptosis might be caused by suppression of caspase-9 activation, which might be explained by its direct interaction with inhibitory proteins, such as TUCAN. In Chapter 2, we examined whether the TUCAN/CARDINAL/CARD8 protein blocks caspase-9 activation and thereby abrogates the response of NSCLC cells to DNA-damaging agents such as cisplatin. For this purpose, we tested the binding ability of TUCAN to caspase-9 and downregulated the level of the endogenous TUCAN protein by a new technique, RNA interference (RNAi). Our studies revealed that direct binding of TUCAN to caspase-9 was not detectable in NSCLC cells. Additionally, significant reduction of the level of TUCAN by RNAi did not affect the sensitivity to cisplatin-based chemotherapy. In conclusion, our data support the view that this protein does not play a crucial role as a caspase inhibitor in cancer cells. Since TUCAN has been also involved in the regulation of NF-kB pathway, another important signaling transduction pathway, we examined whether TUCAN might be useful as a marker for the prognosis of NSCLC patients. Thus, in Chapter 3, we determined the expression and localization of TUCAN in a subset of tumor samples derived from patients with advanced NSCLC using immunohistochemistry. We found that exclusive presence of TUCAN in the cytoplasm, but not in the nucleus, of tumor cells correlates with shorter survival of NSCLC patients. This suggests that TUCAN overexpression might be a prognostic factor in NSCLC. In Chapter 4, we investigated whether XIAP, the most potent inhibitor of apoptosis proteins expressed in NSCLC cells, is involved in the suppression of caspase-9-headed apoptosis. We have found that XIAP binds to the active form of caspase-9, but rather did not account for caspase-9 suppression, since downregulation of approximately 60% of total XIAP protein content failed to restore caspase-9 activation. Furthermore, we showed that XIAP binds to processed caspase-3. Nevertheless, we could not enhance caspase-3 activation by downregulation of XIAP expression and did not observe an enhancement of cisplatin-induced apoptosis. Therefore, to finally define the role of XIAP in suppression of apoptosis in NSCLC, we made use of Smac mimic molecules in combination with DNA-damaging agents in NSCLC cells. Smac mimic molecules are based on the endogenous Smac protein that plays a significant role in the promotion of apoptosis. We found that the Smac mimic compound markedly disrupts binding between processed caspase-9 and 150
Summary/Samenvattig/Streszczenie XIAP, although simultaneous exposure of Smac mimic and cisplatin did not restore activation of caspase-9. Interestingly, in combination with cisplatin, the Smac mimic compound was able to increase the amount of caspase-3 activation and coinciding with a strong enhancement of apoptotic cell death in NSCLC cells. Taken together, these data suggest that the combination of Smac mimic molecules with cisplatin might have therapeutic benefits for the treatment of NSCLC. In Chapter 5, we investigated the molecular mechanism of action of a novel proteasome inhibitor, bortezomib versus cisplatin in NSCLC cells. The insufficient release of cytochrome c might be responsible for the mitochondriadependent apoptotic deficiency in these cells when treated with cisplatin. We observed that in contrast to cisplatin, bortezomib promotes a proapoptotic shift in the levels of Bcl-2 family proteins which is followed by abundant release of cytochrome c and Smac/DIABLO. These events were accompanied by significant activation of caspase-9 and enhanced activation of caspase-3. Moreover, we observed a significant increase in apoptotic cell death in cisplatin-resistant lung cancer cell upon bortezomib treatment. In Chapter 6, we performed a first global proteomics analysis of caspase-9-associated proteins. This was a first attempt to identify of potential novel inhibitory proteins, using co-immunoprecipitation and tandem mass spectrometry. We compared the protein complexes that co-immunoprecipitate with inactive caspase-9, present in the cytosol, to proteins bound to active caspase-9 upon recruitment to the apoptosome. The majority of the identified proteins were differentially associated with inactivated caspase-9 (70%) versus activated caspase-9 (30%). Among 39 identified proteins, we distinguished a large group of cytoskeletal proteins that attach to the unprocessed caspase-9. Moreover, procaspase-9 was associated with the EFhand containing protein Swiprosin-1, whose function is still unclear. We observed the cleavage of acetyloserotonin-o-methyltransferase-like protein, suggesting a new caspase-9 target. These data indicates that the caspase-9- associated multimeric complexes are different and their composition depends on the cellular condition. In summary, the work described in this thesis partially explains the molecular mechanism of suppression of mitochondria-dependent activation of apoptosis in NSCLC cells. At the same time, it answers the question how new 151
apoptosis-based therapy is able to restore the ability of lung cancer cells to undergo apoptosis more efficiently. 152
Summary/Samenvattig/Streszczenie Samenvatting Gezonde lichaamscellen groeien, delen en gaan ten gronde. Kanker ontstaat door oncontroleerbare groei van abnormale cellen. Kankercellen blijven doorgaan met groeien en delen terwijl gezonde cellen al zouden zijn overleden. De laaste decennia zijn belangrijke vooruitgangen geboekt middels zowel fundamenteel als klinisch onderzoek, hetgeen geleid heeft tot een verbeterde behandeling en kwaliteit van leven van kankerpatiënten. Desondanks blijft kanker de tweede doodsoorzaak in de Verenigde Staten (VS) en de Europese Unie. Elk jaar krijgt meer dan één miljoen mensen kanker en ongeveer de helft van alle mannen en een derde van alle vrouwen in de VS krijgen kanker tijdens hun leven. Het merendeel van lokale kankers wordt behandeld door middel van chirurgie en/ of bestraling. De eerste keus voor de behandeling van uitgezaaide kanker is chemotherapie. Er zijn twee veelvoorkomende problemen die kunnen leiden tot het falen van een behandeling met chemotherapie, namelijk de bijwerkingen op gezonde cellen en de ongevoeligheid van de kankercellen voor de chemotherapie. Met een vijfjaarsoverleving van 15% heeft longkanker de hoogste mortaliteit. De belangrijkste oorzaak van longkanker is roken, verantwoordelijk voor meer dan 90% van de gevallen van longkanker. Er zijn twee soorten longkanker: niet-kleincellige en kleincellige longkanker. Nietkleincellige longkanker (non-small cell lung cancer; NSCLC) vertegenwoordigt ongeveer 80% van de longcarcinomen. De behandeling van een vergevorderd stadium of van uitgezaaide niet-kleincellige longkanker is platinum-gebaseerde chemotherapie, eventueel in combinatie met andere chemotherapeutica zoals taxanen, vinca-alkaloiden of gemcitabine. Helaas reageert niet-kleincellige lonkanker vaak niet op eerstelijns chemotherapie, en een initiële tumorrespons, dat wil zeggen een belangrijke afname van de totale tumormassa, treedt slechts op in 20 tot 30%. De resistentie voor platinum-achtige geneesmiddelen, zoals cisplatin, is multifactorieel en de mechanismen van resistentie omvatten o.a. verhoogde intracellulaire ontgiftiging, verhoogde capaciteit om cisplatin-geinduceerde DNA schade te repareren en gedereguleerde geprogrammeerde celdood (apoptosis). 153
Apoptose is een fysiologische vorm van gereguleerde celvernietiging, oftewel geprogrammeerde celdood, welke uitgelokt wordt door een verscheidenheid aan fysiologische en pathologische stimuli, waaronder cytokines, hormonen en celdodende middelen, zoals cisplatin. Afwijkende regulatie van apoptose kan leiden tot verscheidene ziekten zoals kanker, autoimmuun ziekten en degeneratieve ziekten. Onder normale omstandigheden gaat een abnormale cel over tot apoptose, bij kanker is dit zelfbeschermingmechanisme echter onvoldoende actief. Caspases zijn enzymen die een belangrijke rol spelen in het uitvoeren van apoptose. Remming van caspases door bepaalde factoren speelt een belangrijke rol in de ongevoeligheid van tumorcellen voor chemotherapie. Activatie van apoptose wordt uitgelokt door twee verschillende signaaltransductie routes, met activatie van twee enzymen nl. caspase-8 (extrinsieke route) danwel caspase-9 (intrinsieke route of mitochondriaafhankelijke apoptose). De activatie van de intrinsieke apoptotische route wordt uitgelokt door verstoringen van de celintegriteit van buitenaf zoals toediening van chemotherapie, en wordt geïnitieerd via mitochondriaafhankelijke activatie van caspase-9 in het zogenaamde apoptosoom complex. De geactiveerde initiator caspase-9 activeert op zijn beurt effectorcaspases, caspase-3 en caspase-7. De intrinsieke apoptose route wordt, voor het deel dat voorafgaat aan permeabilisatie van de mitochondria, gereguleerd door eiwitten behorend tot de zogenaamde Bcl-2 familie. Na permeabilisatie van de mitochondria spelen eiwitten behorend tot de groep van apoptose remmers (inhibitors of apoptosis; IAPs) een regulerende rol. Verstoring van de mitochondria-afhankelijke apoptotische route kan het resultaat zijn van een veranderde expressie of mutaties van eiwitten behorend tot de Bcl-2 familie, zoals Bcl-2, Bcl-xl and Bax. Dit kan vervolgens leiden tot het ontstaan van resistentie tegen geneesmiddelen. Maar ook afwezigheid van Apaf-1 expressie, een ander eiwit belangrijk in het proces van apoptose, wordt geassocieerd met remming van apoptose. De aanwezigheid van specifieke remmers van apoptose (IAPs), zoals TUCAN, of XIAP en in mindere mate ciap-1 en ciap-2, kan een blokkade opwerpen voor activatie van initiator- en effector-caspases en daarmee leiden tot ongevoeligheid voor chemotherapie. Betere kennis van de regulatiemechanismen van apoptose en de wijze waarop deze kan ontsporen leidt mogelijk tot meer gerichte en effectievere 154
Summary/Samenvattig/Streszczenie antikanker geneesmiddelen. In dit proefschrift, getiteld: Regulatie van mitochondria-afhankelijke apoptose in niet-kleincellige long kankercellen: implicaties voor kankertherapie hebben we ons gericht op karakterisatie van de mitochondria-afhankelijke apoptose in niet-kleincellige longkanker. De inleiding van dit proefschrift, Hoofdstuk 1, geeft enige achtergrondinformatie over longkanker en het probleem van de ongevoeligheid van longkanker voor huidige chemotherapeutische behandelingen. Daarnaast wordt de relatie tussen regulatie van mitochondria-afhankelijke apoptose, het ontstaan van kanker en ongevoeligheid voor chemotherapie beschreven. Ook worden gangbare therapieën en nieuwe, op apoptose-gebaseerde therapieën beschreven. De veranderingen in mitochondria-afhankelijke apoptose zouden veroorzaakt kunnen worden door onderdrukking van caspase-9 activatie. In Hoofdstuk 2 onderzochten wij of het eiwit TUCAN/CARDINAL/CARD8 capase-9 activatie remt en daarmee de respons blokkeert van NSCLC cellen op therapie met DNA-beschadigende middelen zoals cisplatin. Dit werd gedaan door de bindingscapaciteit van TUCAN aan capase-9 te testen en door middel van het afzwakken van eiwitexpressie van endogeen TUCAN middels een nieuwe techniek, RNA interferentie (RNAi). Onze studies lieten echter zien dat er geen directe binding van TUCAN en caspase-9 waarneembaar was in NSCLC cellen. Daarbij toonden wij aan dat verminderde expressie van TUCAN door RNAi niet de gevoeligheid voor cisplatin-gebaseerde chemotherapie verbeterde. Wij concluderen daarom dat dit eiwit niet een cruciale rol speelt als remmer van caspases in kankercellen. Vervolgens, omdat TUCAN ook een rol speelt in de regulatie van de NF-κB route, een andere belangrijke signaaltransductie route, onderzochten wij of de aanwezigheid van TUCAN mogelijk als voorspeller van het klinisch beloop van niet-kleincellige longkanker kan dienen. In Hoofdstuk 3 beschrijven wij de expressie en lokalisatie van TUCAN door middel van immunohistochemische studies in een aantal tumormonsters van patiënten met vergevorderde NSCLC. Wij observeerden dat de exclusieve aanwezigheid van TUCAN in het cytoplasma van tumorcellen, en niet in de kern, correleert met een kortere overlevingsduur van NSCLC patienten. Dit 155
suggereert dat overexpressie van TUCAN mogelijk een prognostische factor is in NSCLC. In Hoofdstuk 4 onderzochten wij of XIAP, de meest krachtige remmer van apoptose (IAP), welke in hoge mate aanwezig is in NSCLC cellen, een rol speelt in de onderdrukking van caspase-9 geleide apoptose. Wij toonden aan dat XIAP weliswaar de actieve vorm van caspase-9 bindt, maar niet verantwoordelijk was voor remming van caspase-9 activatie, aangezien remming van expressie van het XIAP eiwit met 60% niet leidde tot herstel van caspase-9 activatie. Wij toonden vervolgens aan dat XIAP bindt aan caspase-3. De maximale remming van XIAP expressie zoals wij die konden bewerkstelligen, was ontoereikend om caspase-3 activatie te versterken en leidde niet tot toename van cisplatin-geinduceerde apoptose. Een volgende stap om de rol van XIAP in de onderdrukking van apoptose in NSCLC te bepalen, was het gebruik van zogenaamde Smac mimics. Smac mimics zijn gebaseerd op het endogene Smac eiwit, dat een belangrijke rol speelt in het apoptotisch proces. Wij vonden uit dat de Smac mimic die wij gebruikten, de binding tussen caspase-9 en XIAP kon verbreken, alhoewel gelijktijdige blootstelling aan de Smac-mimic en cisplatin niet de geneesmiddel-geïnduceerde activatie van caspase-9 herstelde. Interessant genoeg werd de activatie van caspase-3 versterkt wanneer behandeling met cisplatin werd gecombineerd met de Smac mimic, leidend tot een aanzienlijke toename in apoptotische celdood in NSCLC. Deze resultaten suggereren dat de combinatie van Smac mimic moleculen met cisplatin mogelijk de behandelingsresultaten van NSCLC patienten kunnen verbeteren. In Hoofdstuk 5 onderzochten wij het moleculaire werkingsmechanisme van de nieuwe proteasoomremmer bortezomib in vergelijking met cisplatin in NSCLC cellen. De ontoereikende afgifte van cytochroom c, wederom een belangrijke factor in het apoptotisch proces, is mogelijk verantwoordelijk voor de onderdrukking van mitochondria-afhankelijke apoptose in deze cellen. Wij observeerden dat, in tegenstelling tot cisplatin, bortezomib in staat was een pro-apoptotische verschuiving van de balans tussen pro en anti apoptotische Bcl-2 familie eiwitten te induceren, welke vervolgens tot 156
Summary/Samenvattig/Streszczenie uitdrukking kwam in een evidente inductie van de afgifte van cytochroom c en Smac/DIABLO. Deze gebeurtenissen vielen samen met een aanzienlijke mate van activatie van caspase-9 en caspase-3. Daarbij observeerden wij een belangrijke toename van apoptotische celdood van cisplatin-resistente longkankercellen na bortezomib behandeling. In Hoofdstuk 6 beschrijven wij de uitvoering van een eerste globale zogenaamde proteomics analyse van met caspase-9 geassocieerde eiwitten als een eerste stap ter identificatie van nieuwe remmende eiwitten van caspase-9, door middel van co-immunoprecipitatie en tandem massa spectrometrie. Wij vergeleken eiwitcomplexen die co-immunoprecipiteerden met niet-geactiveerd caspase-9, aanwezig in het cytosol, met eiwitten die gebonden waren aan het geactiveerde caspase-9 na werving in het apoptosoom. Het merendeel van de geïdentificeerde eiwitten was differentieel geassocieerd met caspase-9, in de niet-geactiveerde vorm (70%) en in de geactiveerde vorm (30%). Te midden van 39 geïdentificeerde eiwitten konden wij een grote groep van cytoskelet eiwitten onderscheiden die binden aan het onverwerkte caspase-9. Daarnaast was procaspase-9 geassocieerd met het eiwit Swiprosin-1, waarvan de functie nog onduidelijk is. Bovendien identificeerden wij klieving van acetyloserotonin-o-methyltransferase-like eiwit, een nieuw substraat van caspase-9. Deze bevindingen tonen aan dat met caspase-9 geassocieerde multimere complexen verschillend zijn en dat hun samenstelling afhangt van de conditie waarin de cel zich bevindt. Samenvattend verklaart het werk wat beschreven wordt in dit proefschrift ten dele het moleculaire mechanisme van onderdrukking van activatie van mitochondria-afhankelijke apoptose in NSCLC cellen. Tegelijkertijd beantwoordt het de vraag hoe nieuwe op apoptose-gerichte therapieën wellicht het vermogen van longkankercellen om meer efficiënt apoptose te ondergaan kan herstellen. 157
Streszczenie Zdrowe komórki ludzkiego organizmu rosną, dzielą się i umierają. JednakŜe, kiedy informacja genetyczna normalnych komórek ulegnie uszkodzeniu, to przekształcają się one w komórki rakowe (nowotworowe). Komórki rakowe rosną i dzielą się stale, i nie umierają. Tak więc, rak (nowotwór) rozwija się z powodu niekontrolowanego rozrostu komórek nowotworowych. Pomimo, Ŝe w ostatnich dekadach dokonano znacznych postępów w badaniach naukowych i klinicznych w zakresie onkologii i znacznie ulepszono metody leczenia raka i jakość Ŝycia pacjentów z chorobą nowotworową, to nadal rak znajduje się na drugim miejscu w kategorii chorób, które najczęściej prowadzą do śmierci. Szacuje się, Ŝe w przybliŝeniu co drugi męŝczyzna i co trzecia kobieta zachoruje na raka w ciagu swojego Ŝycia. Większość nowotworów, tzw. zlokalizowanych jest leczona operacyjnie lub z uŝyciem radioterapii, ale w przypadku nowotworów w zaawansowanym stadium, które uległy metastazie, czyli rozsiały się juŝ do innych części organizmu, leczeniem pierwszego wyboru jest chemioterapia. Jednak, działanie uboczne leków przeciwnowotworowych objawiające się wysoką toksycznością w stosunku do zdrowych komórek i szybko rozwijają się lekooporność, nadal stanowią powaŝny kliniczny problem, który wręcz uniemoŝliwia skuteczną terapię przeciw-nowotworową. Rak płuc jest zabójcą numer jeden wśród wszystkich nowotworów na świecie, i 5-cioletni okres przeŝywalności wynosi około 15%.Główną przyczyną raka płuc (90% przypadków) jest palenie papierosów. Ze względu na kryteria morfologiczne, raka płuc dzieli się na dwa rodzaje, tzw. nie-małe komórki raka płuc i małe komórki raka płuc. Nie-małe komórki raka płuc stanowił około 80% wszystkich rodzajów raka płuc i leczenie tego rodzaju nowotworu w zaawansowanym (metastatycznym) stadium wymaga zastosowania chemioterapii z uŝyciem związków platyny (cysplatyny). Jednak, ze wzgledu na wysoką lekooporność komórek nowotowrowych, wydajność chemioterapii wynosi tylko 20-30%. Lekooporność na cysplatyne jest spowodowana: zmniejszeniem akumulacji leku w komórce nowotworowej, zwiekszeniem aktywności wewnątrzkomórkowego systemu detoksyfikacji i zwiekszeniem zdolności naprawy uszkodzeń informacji genetycznej, która była powodowana przez cysplatyne. Ponadto, wykazano, ze zaburzenia w apoptozie 158
Summary/Samenvattig/Streszczenie (programowanej śmierci komórki) odgrywają duŝe znaczenie w tworzeniu oporności komórek nowotworowych na cysplatynę. Apoptoza jest fizjologicznie regulowaną formą destrukcji komórki eukariotycznej, która jest wywoływana przez liczne fizjologiczne i patologiczne czynniki, tj. cytokiny, hormony lub leki przeciwnowotworowe (cisplatyna). Zaburzenia w apoptozie są przyczyną róŝnych procesów chorobowych, jak rak, choroby immunologiczne czy degeneracyjne. Rak powstaje w wyniku nagromadzenia komórek nowotworowych, spowodowaną zaburzeniami w apoptozie a tym samym ich niewydajną eliminacją. Programowana śmierć komórki jest aktywowana na dwa sposoby, poprzez kaspasę-8 lub kaspaseę-9. Uaktywnianie wewnetrznego szlaku apoptozy, zaleŝnego od mitochondrium wymaga aktywacji kaspazy-9, która następuje po jej rekrutacji do apoptosomu. Kaspaza-9 raz uaktywniona wywołuje aktywacje kaspaz wykonawczych, tj. kaspazy 3-ciej i 7-mej i śmierć komórki. Wewnętrzny szlak apoptozy jest regulowany na poziomie powyŝej i poniŝej mitochondrium przez odpowiednie białka naleŝące do rodziny Bcl-2 lub inhibitory apoptozy. Zaburzenia tego szlaku wynikają z niewłaściwego uwalniania cytochromu c z mitochondrium, który wynika z wadliwej ekspresji lub mutacji białek takich jak: Bcl-2, Bcl-xl czy Bax. Zaburzenia poniŝej mitochondrium, są powodowane brakiem białek budujących megastrukturę komórkową, na której jest aktywowana kaspaza-9, czyli apoptosom lub wynikają z obecności białek inhibitorowych, tj. TUCAN, XIAP, ciap-1 i ciap-2, które wiąŝą się z kaspazami i blokują ich aktywacje. W związku z powyŝszym, w tej rozprawie doktorskiej opisano wyniki badań, które miały na celu zcharakteryzowanie molekularnych mechanizmów powodujących zaburzenia w aktywacji wewnetrznego mitochondrialnego szlaku apoptozy w nie-małych komórkach raka płuc i określić ich wpływ na wysoką lekooporność w tym rodzju nowotworu. Ta praca doktorska jest zatytułowana następująco: Regulacja apoptozy zaleŝnej o mitochondrium w nie-małych komórkach raka płuc: zastosowanie w terapii nowotowrowej. We wstępie tej pracy, Rozdział 1, dostarczono ogólnych informacji na temat raka płuc i lekooporności w stosunku do bieŝąco stosowanych metod leczenia. Dodatkowo, opisano relacje pomiędzy regulacją wewnętrznego szlaku apoptozy i genezy nowotworu oraz lekooporności. Ponadto, opisano konwencjonalne i docelowe, oparte na apoptozie metody terapii nowotworów. 159
Zaburzenia w apoptozie zaleŝnej od mitochondrium mogą być spowodowane wstrzymaniem aktywacji kaspazy-9, która wynika z bezpośredniego oddziaływania z białkiem inhibitorowym, tj. TUCAN-em. Jak opisano w Rozdziale 2, zbadaliśmy czy białko TUCAN/CARDINAL/CARB8 blokuje kaspaze-9 i czy przez to reguluje negatywnie odpowiedź komórek raka płuc na stosowane leczenie przeciw-nowotworowe z uŝyciem cysplatyny. W związku z tym, testowaliśmy zdolność wzajemnego wiązania się tych dwóch białek oraz badaliśmy czy redukcja tego białka przy uŝyciu interferencji RNA uwraŝliwi te komórki na stosowany lek. Nasze badania wykazały brak oddziaływań pomiędzy tymi białkami i dodatkowo znacząca redukcja białka TUCAN nie przywróciła wraŝliwości komórek rakowych na cysplatyne. Podsumowując, pokazaliśmy, ze białko TUCAN nie odgrywa znaczącej roli w blokowaniu kaspazy-9 w nie-małych komórkach raka płuc. Białko TUCAN jest zaangaŝowane w regulację apoptozy na poziomie kaspazy-9, ale takŝe szlaku NF-kB, który takŝe reguluje apoptozę. Dlatego uwaŝaliśmy, Ŝe warto przetestować czy TUCAN moŝe być uŝyteczny jako marker nowotworowy. Tak więc, w Rozdziale 3, określiliśmy ekspresje i lokalizacje tego białka przy uŝyciu metod barwienia histoptologicznego, wykorzystując tkanki guza pochodzące od pacjentów z zaawansowanym rakiem płuc. ZauwaŜyliśmy, Ŝe obecność tego białka wyłącznie w cytoplazmie, a nie w jądrze komórkwym, koreluje z krótszym okresem przeŝywalności pacjentów. Te dane sugerują, Ŝe ekspresja białka TUCAN moŝe być czynnikiem prognostycznym u pacjentow z rakiem płuc. W Rozdziale 4, badaliśmy czy inny najskuteczniejszy inhibitor apoptozy, XIAP, który jest równieŝ obecny w komórkach raka płuc jest zaangaŝowany w hamowanie aktywacji kaspazy-9. Zaobserwowaliśmy, Ŝe XIAP wiąŝe się z aktywną kaspaza-9, ale raczej nieodpowiada za hamowanie jej aktywacji, poniewaŝ redukcja białka XIAP około 60 %, nie była w stanie przywrócić aktywności kaspazy-9. Jednocześnie, zauwaŝyliśmy, ze białko XIAP wiąŝe się z efektorową kaspaza-3, ale równieŝ nie redukcja białka XIAP nie była wystarczająca by wzmocnić aktywację kaspazy-3. W związku z tym, chcieliśmy definitywnie odpowiedzieć na pytanie czy białko XIAP jest zaangaŝowane w hamowanie apoptozy zaleŝnej od mitochondrium i dlatego uŝyliśmy chemicznie syntezowanej cząsteczki Smac, która naśladuje endogenne białko Smac/DIABLO, razem z lekiem uszkadzającym informacje genetyczną, tj. cysplatyna. Białko Smac/DIABLO wiąŝe się z białkami 160
Summary/Samenvattig/Streszczenie inhibitorowymi apoptozy, np. z białkiem XIAP i przez to niweluje hamujący efekt białka XIAP na kaspazy. Nasze badania wykazały, Ŝe syntetyczne cząsteczki Smac są wstanie rozerwać wiązanie pomiędzy białkiem XIAP a kaspaza-9, ale jednoczesna ekspozycja komórek rakowych na cysplatyne i cząsteczki Smac nie była w stanie przywrócić aktywności kaspazy-9. Interesujące okazało się, Ŝe tego rodzaju łączona terapia wzmocniła znacznie aktywacje efektorowej kaspazy-3 i spowodowała wzrost apoptycznej śmierci komórek rakowych. Biorąc pod uwagę wszystkie dane, wnioskujemy, Ŝe połączenie syntetycznych cząsteczek Smacz cysplatyna moŝe przynieść terapeutyczne efekty w leczeniu tego nowotworu. W Rozdziale 5, badaliśmy molekularny mechanizm akcji nowego inhibitora proteasomu, tj., bortezomibu w porównaniu do cysplatyny w komórkach raka płuc. Skoro niewydajne uwalnianie cytochromu c z mitochondrium moŝe powodować upośledzenie aktywności wewnętrznego szlaku apoptozy, badaliśmy czy to jest istota problemu w nie-małych komórkach raka płuc. Zaobserwowaliśmy, Ŝe w porównaniu do cysplatyny, bortezomib indukował proapoptyczny ruch na poziomie białek Bcl-2, który prowadził do masywnego uwalniania sie cytochromu c i białka Smac/DIABLO z mitochondrium. Te wydarzenia współistniały z aktywacją kaspazy-9 i znaczącym wzrostem aktywacji kaspazy-3. Ponadto, zaobserwowaliśmy znaczący wzrost apoptycznej smierci komórek raka płuc po zastosowaniu bortezomibu w stosunku do cysplatyny. Z naszych obserwacji wynika, Ŝe bortezomib jest wstanie ominąć blokadę kaspazy-9-tej poprzez indukowanie obfitego uwalniania cytochromu c z mitochondrium. Ostatni Rozdzial 6, opisuje pierwszą globalną analizę białek proteomics, które występują w kompleksie z kaspaza-9. To jest pierwszy krok w kierunku identyfikacji potencjalnych, nowych białek inhibitorowych, które blokują kaspaze-9 w nie-małych komórkach raka płuc. Porównaliśmy kompleksy białkowe, które uległy immunoprcypitacji z nieaktywną i aktywną kaspaza-9 na podstawie analizy masy peptydow przy uŝyciu spektrofotometru MALDI-TOF/TOF. Większość zidentyfikowanych białek była zasocjowana z nieaktywną kaspaza-9-ta (70%) versus aktywna kaspaza-9-ta (30%). W grupie 39-ciu białek wyróŝniliśmy duŝą grupę białek cytoszkieletowych, które wiązały się z nieaktywną kaspaza-9. Dodatkowo, w kompleksie z kaspaza-9 ta znaleźliśmy białko, zwane Swiprosin-1, którego funkcja nadal nie jest znana. Zidentyfikowaliśmy równieŝ białko enzymatyczne podobne do 161
acetyloserotonin-o-methylotransferazy, które uległo procesowaniu, gdy było obecne w kompleksie z aktywną kaspaza-9-ta. Razem, te dane informują o tym, Ŝe kompleksy białkowe zainicjowane z kaspaza-9-ta sa róŝne i kompozycja tych kompleksow zaleŝy od warunków jakie panują w komórce. Podsumowując, praca opisana w tej rozprawie doktorskiej dostarcza informacji na temat mechanizmów, poprzez które apoptoza zaleŝna od mitochondrium jest hamowana w komórkach raka płuc. Jednocześnie dostarcza odpowiedzi w jaki sposób docelowa, oparta na apoptozie terapia przeciwnowotworowa jest wstanie przywrócić zdolność komórki rakowej płuc, aby ta uległa apoptozie bardziej efektywnie. 162