BIOLOGICZNE USUWANIE ZWIĄZKÓW AZOTU ZE ŚCIEKÓW ZAWIERAJĄCYCH SULFONAMIDY

WYDZIAŁ CHEMICZNY POLITECHNIKI GDAŃSKIEJ KRÓLEWSKA POLITECHNIKA W SZTOKHOLMIE Anna Makuch BIOLOGICZNE USUWANIE ZWIĄZKÓW AZOTU ZE ŚCIEKÓW ZAWIERAJĄCYCH SULFONAMIDY ROZPRAWA DOKTORSKA Promotorzy: Prof. dr hab. inż. Krystyna Mędrzycka, Politechnika Gdańska Assoc. prof. dr inż. Elżbieta Płaza, Royal Institute of Technology (KTH), Stockholm Sweden Gdańsk 29

Rodzicom, Asi oraz mojemu Tomaszkowi 2

SPIS TREŚCI WYKAZ SKRÓTÓW I SYMBOLI... WSTĘP... CZĘŚĆ LITERATUROWA... 1. BIOLOGICZNE PROCESY USUWANIA AZOTU ZE ŚCIEKÓW... 1.1 Kierunki rozwoju biologicznych metod usuwania azotu ze ścieków... 1.2 Proces nitryfikacji... 1.2.1 Bakterie nitryfikujące... 1.2.2 Wpływ różnych czynników na bakterie procesu nitryfikacji... 1.2.3 Adaptacja osadu czynnego do ścieków zawierających inhibitory procesu... 1.3 Proces Anammox... 1.3.1 Mikroorganizmy procesu Anammox... 1.3.2 Mechanizm procesu Anammox... 1.3.3 Wpływ różnych czynników na proces Anammox... 1.3.4 Zastosowanie procesu Anammox... 1.4 Metody badania aktywności mikroorganizmów osadu czynnego... 1.4.1 Ocena aktywności osadu czynnego z wykorzystaniem testów OUR... 1.4.2 Oznaczanie aktywności drobnoustrojów z wykorzystaniem sztucznych akceptorów... 2. FARMACEUTYKI W ŚRODOWISKU... 2.1 Źródła zanieczyszczeń substancjami farmaceutycznymi... 2.2 Wpływ substancji farmaceutycznych a środowisko naturalne... 2.2.1 Toksyczność... 2.2.2 Wytwarzanie lekooporności... 2.3 Ścieki farmaceutyczne... 2.3.1 Sulfonamidy a oczyszczanie ścieków... 2.3.2 Problem usuwania azotu ze ścieków farmaceutycznych... 2.3.3 Oznaczanie sulfonamidów w wodzie i ściekach... CEL I ZAKRES BADAŃ... CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA... 3. MATERIAŁY I METODYKA BADAWCZA... 3.1 Materiały... 3.1.1 Sulfonamidy... 3.1.2 Ścieki modelowe... 3.1.3 Osad czynny i ciecz nadosadowa... 3.1.4 Kultura Anammox... 3.2 Metodyki badawcze... 3.2.1 Metody analiz chemicznych... 3.2.2 Metody prowadzenia doświadczeń... 3.2.3 Ocena statystyczna wyników eksperymentalnych... 4. BADANIE BIODEGRADACJI SULFONAMIDÓW... 4.1 Badanie podatności sulfonamidów na biodegradację metodą OECD... 4.1.1 Sposób wykonania testu 31 D... 4.1.2 Wyniki i dyskusja... 4.2 Badanie postępu biodegradacji sulfonamidów metodą HPLC... 4.2.1 Sposób wykonania badań HPLC... 4.2.2 Wyniki i dyskusja... 5. BADANIE WPŁYWU SULFONAMIDÓW NA PROCES NITRYFIKACJI... 5.1 Badanie wpływu sulfonamidów na aktywność oddechową mikroorganizmów osadu czynnego 5.1.1 Sposób wykonania testów OUR... 5.1.2 Wykonanie testów OUR dla próbek świeżego osadu czynnego... 5.1.3 Inhibicja aktywności oddechowej mikroorganizmów osadu czynnego w obecności sulfonamidów... 5.2 Badanie wpływu sulfonamidów na aktywność dehydrogenaz osadu czynnego za pomocą testu TTC... 5.2.1 Metodyka badawcza... 5.2.2 Wyniki aktywności dehydrogenaz w obecności sulfonamidów... 5.2.3 Wyznaczenie stopnia toksyczności sulfonamidów... 5.3 Badanie inhibicji nitryfikacji przez sulfonamidy w krótkookresowych testach... 5.3.1 Metodyka badań... 5.3.2 Inhibicja usuwania azotu amonowego... 5 7 9 9 1 16 16 17 21 23 23 24 25 28 29 31 33 36 36 42 42 48 5 5 54 56 6 62 62 62 62 63 63 63 65 65 66 66 68 68 68 7 72 72 74 77 77 77 8 86 9 9 96 97 1 1 12 3

5.3.3 Inhibicja tworzenia azotanów i azotynów... 5.3.4 Ocena wyników inhibicji procesu nitryfikacji... 5.4 Badanie wpływu sulfonamidów na efektywność nitryfikacji podczas długookresowych testów 5.4.1 Sposób prowadzenia badań... 5.4.2 Kontrola parametrów procesu nitryfikacji... 5.4.3 Efektywność procesu nitryfikacji... 5.4.4 Ocena wpływu sulfonamidów na aktywność oddechową aklimatyzowanego osadu czynnego... 5.5 Mikroskopowe badanie osadu czynnego... 5.5.1 Sposób przygotowania próbek... 5.5.2 Wyniki mikroskopowych badań osadu czynnego aklimatyzowanego do obecności SA... 6. BADANIE WPŁYWU SULFONAMIDÓW NA PROCES ANAMMOX... 6.1 Ścieki modelowe użyte do badań... 6.2 Kontrolny proces Anammox bez obecności sulfonamidów... 6.2.1 Sposób wykonania badań... 6.2.2 Wyniki procesu kontrolnego... 6.3 Badanie wpływu sulfonamidów na mikroorganizmy Anammox podczas długookresowej ekspozycji... 6.3.1 Sposób wykonania badań... 6.3.2 Kontrola parametrów procesu Anammox... 6.3.3 Efektywność usuwania azotu w obecności sulfonamidów... 6.4 Testy porcjowe procesu Anammox... 6.4.1 Sposób przeprowadzenia testów... 6.4.2 Wyniki szybkości usuwania azotu w testach porcjowych... 6.5 Badanie aktywności dehydrogenaz kultury Anammox... 6.5.1 Opracowanie metodyki badań dla bakterii Anammox... 6.5.2 Wykonanie testów TTC w obecności sulfonamidów... 6.5.3 Wyznaczenie stopnia toksyczności sulfonamidów... 7. PODSUMOWANIE I WNIOSKI... STRESZCZENIE... LITERATURA... PODZIĘKOWANIA... ZAŁĄCZNIKI... 13 14 16 16 19 11 115 117 117 117 122 122 124 124 125 128 128 13 131 137 137 139 144 144 146 148 15 156 157 171 172 4

WYKAZ SKRÓTÓW I SYMBOLI Acetylo CoA acetylokoenzym A ACN - acetonitryl AD aktywność dehydrogenaz AOB bakterie utleniające azot amonowy (ammonium oxidizing bacteria) APCI jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym (Atmospheric Pressure Chemical Ionisation) ATP adenozynotrifosforan ATU - allilotiomocznik AUR szybkość zużycia azotu amonowego (Ammonia Uptake Rate) BZT 5 Biochemiczne Zapotrzebowane na Tlen CBT test zamkniętej butelki (closed bottle test) CFUs zdolność tworzenia kolonii (colony forming units) ChZT Chemiczne Zapotrzebowanie na Tlen CWO całkowity węgiel organiczny DAD detektor z matrycą fotodiodową (Diode Array Detector) DBP - ftalanu dibutylu DHPS - syntaza dihydropterynianowa DO stężenie tlenu rozpuszczonego (disolved oxygen) EC 5 Effective Concentration, stężenie wywołujące określone efekty u 5% badanych organizmów ESI jonizacja poprzez elektrorozpraszanie (Electrospray Ionization) FAD - dinukleotyd flawo-adeninowy FBR reaktor ze stałym złożem (fixed - bed reactor) GC/MS - metoda chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas GDP guanozynodifosforan GIT test inhibicji wzrostu bakterii (growth inhibition test) GTP guanozynotrifosforan HOA - hydroksylamina HPLC/MS metoda wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej z spektrometrem mas HRT hydrauliczny czas zatrzymania (hydraulic retention time) Ht mikroorganizmy heterotroficzne IC 1 stężenie powodujące 5% inhibicję (zahamowanie) procesu biologicznego INT chlorek 2-p-jodofenylo-3-p-nitrofenylo-5-fenylotetrazoliowy LC/MS metoda chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas LC/MS/MS metoda chromatografii cieczowej sprzężonej z podwójnym spektrometrem mas MBR bioreaktor membranowy (membrane bioreactor) MLSS zawiesina mieszaniny ścieków z osadem czynnym (mixed liquer suspended solids) MS spektrometria masowa NAD dinukleotyd nikotytynamidoadeninowy NADP fosforan nikotynamidowego dinukleotydu Nb bakterie Nitrobacter 5

Ns bakterie Nitrosomonas NOB bakterie utleniające azotyny (nitrite oxidizing bacteria) NOEC stężenie efektywne niepowodujące widocznych zmian u badanych organizmów NUR szybkość zużycia azotanów (Nitrate Uptake Rate) OUR szybkość poboru tlenu (Oxygen Uptake Rate) OUR szybkość zużycia tlenu (Oxygen Uptake Rate) OUR Ht - szybkość poboru tlenu przez mikroorganizmy heterotroficzne OUR Nb - szybkość poboru tlenu przez bakterie Nitrobacter OUR Ns szybkość poboru tlenu przez bakterie Nitrosomonas OURcałk. szybkość poboru tlenu przez mikroorganizmy osadu czynnego OURnitryf. szybkość poboru tlenu przez bakterie nitryfikujące PABA kwas 4 aminobenzoesowy PHM polihydroksymaślan pk a ujemny logarytm dziesiętny ze stałej dysocjacji kwasu pk b ujemny logarytm dziesiętny ze stałej dysocjacji zasady ppb liczba cząsteczek związku chemicznego przypadająca na 1 miliard cząsteczek rozpuszczalnika ppt liczba cząsteczek związku chemicznego przypadająca na 1 trylion cząsteczek rozpuszczalnika PRR test uwalniania i poboru fosforu przez biomasę osadu (Phosphorus Release Rate) psfc APCI MS chromatografia cieczowa z fazą ruchomą w stanie nadkrytycznym połączona z jonizacją chemiczną pod ciśnieniem atmosferycznym i spektrometrią masową psfc kolumna chromatograficzna wypełniona cieczą w stanie nadkrytycznym p-tsa para - toluenosulfonamid RTPF spektrofluorometria z fotochemicznym wzbudzeniem fluorescencji w temperaturze pokojowej (Spectrofluorimtry and room temperature photochemically induced fluorescencje) RWO rozpuszczony węgiel organiczny SA sulfanilamid SBR wsadowy reaktor sekwencyjny (Sequenncing Batch Reaktor) SCM sulfacetamid SIR aktywność oddechowa indukowana pod wpływem substratu (substrate - induced respiration) smo stężenie suchej masy organicznej (Volatile Suspended Solids) SPE ekstrakcja do fazy stałej (Solid Phase Ekstraction) SRM monitoring wybranych reakcji (selected reaction monitoring) SS ilość zawiesin ogólnych (Suspended Solids) ST stopień toksyczności ST max. - maksymalny stopień toksyczności TB - tolbutamid TKN całkowity azot Kjeldahla TF trifenyloformazan TFA - kwas trifluoroctowy TTC chlorek trifenylotetrazoliowy TZT teoretyczne zapotrzebowanie na tlen 6

WSTĘP Powszechnie wiadomo jak ważnym zagadnieniem jest usuwanie ze ścieków związków biogennych, tj. związków azotu i fosforu, gdyż po wprowadzeniu ich do środowiska mogą one spowodować negatywne efekty, głównie związane z eutrofizacją wód powierzchniowych ale i z zanieczyszczeniem wód podziemnych. Konieczność eliminowania tych związków ze ścieków narzucają obowiązujące uregulowania prawne, który coraz bardziej zaostrzają m.in. dopuszczalne stężenia azotu w ściekach zrzucanych do odbiorników. Usuwanie związków azotu ze ścieków prowadzi się przede wszystkim metodami biologicznymi, wykorzystującymi procesy nitryfikacji i denitryfikacji. Jednakże mikroorganizmy tych procesów są wrażliwe na działanie rozmaitych czynników inhibitujących. Bakterie nitryfikujące są bardziej wrażliwe na substancje toksyczne niż inne bakterie biorące udział w procesie oczyszczania ścieków. Do związków mogących inhibitować proces utleniania azotu amonowego do azotanów można zaliczyć farmaceutyki, będące w większości, zgodnie z przeznaczeniem, substancjami biobójczymi. Głównym źródłem farmaceutyków w ściekach są gospodarstwa domowe i szpitale, a także jednostki diagnostyczne a także farmy zwierząt hodowlanych, gdzie profilaktycznie podaje się w paszy antybiotyki, aby uchronić zwierzęta hodowlane przed ewentualnymi infekcjami. Ścieki zawierające różnego typu farmaceutyki są generowane także w zakładach farmaceutycznych. Na polskim rynku farmaceutycznym jest 274 producentów, z czego większość to małe i bardzo małe zakłady wytwórcze i przetwórcze. Działa 1 dużych zakładów wytwarzających leki syntetyczne oraz 1 zakładów produkujących leki w oparciu o środki naturalne [Kot-Wasik et al., 23]. W ostatnich latach znacznie wzrosło zainteresowanie naukowców problemem pozostałości środków farmaceutycznych w ściekach i poszczególnych elementach środowiska. Pozostałości leków i ich metabolitów, wydalane przez organizmy żywe trafiają do systemów kanalizacyjnych a następnie do oczyszczalni ścieków. Podczas oczyszczania ścieków farmaceutyki nie są w pełni z nich usuwane, gdyż często są trudno biodegradowalne. Tak więc z oczyszczonymi ściekami trafiają do wód powierzchniowych i gruntu, gdzie ze względu na swoje właściwości nie są eliminowane w procesach samooczyszczania, a raczej kumulują się w tkankach organizmów wyższych, przez co mogą stanowić bezpośrednie zagrożenie dla ich zdrowia i życia. Ponadto, powodują wytwarzanie się szczepów drobnoustrojów opornych na ich działanie, co stanowi ogromny problem dla zwalczania chorób o podłożu mikrobiologicznym. Tak więc skuteczne usuwanie farmaceutyków ze ścieków jest bardzo ważne, ale zagadnienie to nie jest przedmiotem niniejszej pracy. Jak już wspomniano, innym, nie mniej ważnym aspektem jest szkodliwy wpływ farmaceutyków na procesy biologicznego oczyszczania ścieków, gdzie ograniczają one usuwanie innych szkodliwych substancji. Niektóre ścieki pochodzące z przemysłu farmaceutycznego 7

charakteryzują się podwyższoną zawartością związków azotu, a przy tym zawierają także substancje farmaceutyczne, mogące negatywnie wpływać na proces nitryfikacji. Udokumentowanym przykładem jest między innymi zaburzenie procesu biologicznego usuwania azotu na skutek obecności sulfonamidów w ściekach jednego z zakładów farmaceutycznych w Polsce. Problem ten stał się inspiracją do wyboru tematyki badawczej niniejszej rozprawy doktorskiej, której celem stało się określenie wpływu sulfonamidów na procesy usuwania związków azotu. W klasycznym systemie usuwania azotu metodą osadu czynnego w zakładowej oczyszczalni nie uzyskiwano satysfakcjonujących wyników, prawdopodobnie z powodu obecności sulfonamidów, ale także ze względu na wysokie początkowe stężenie azotu amonowego w ściekach. To stało się powodem rozważenia także możliwości wykorzystania nowatorskiej metody biologicznego oczyszczania ścieków w procesie Anammox, do ścieków zawierających sulfonamidy. Proces ten znalazł zastosowanie do usuwania związków azotu ze ścieków charakteryzujących się wysokim ich stężeniem. Mógłby być wykorzystany do oczyszczania wielu rodzajów ścieków przemysłowych zawierających azot, jednak wymaga to przeprowadzenia szerszych badań. Powyższe względy spowodowały, że w niniejszej pracy zajęto się problemem usuwania azotu ze ścieków zawierających sulfonamidy. 8

CZĘŚĆ LITERATUROWA 1 Biologiczne procesy usuwania azotu ze ścieków Ścieki odprowadzane do środowiska muszą być pozbawione zanieczyszczeń zawierających związki azotu, niekorzystnie wpływające na ekosystemy wodne. Stosowane w oczyszczalniach ścieków biologiczne usuwanie związków azotu ze ścieków polega na zwiększeniu intensywności tych samych procesów, które występują w naturalnych ekosystemach. Podczas oczyszczania ścieków występujące w nich związki azotowe przechodzą szereg przemian biochemicznych. istnieje wiele metod usuwania azotu, które są złożone i zależne od wielu czynników [Szewczyk, 25; Khin i Annachhatre, 24; Schmidt et al., 23]. Dopływające do oczyszczalni ścieki zawierają azot, występujący zarówno w związkach organicznych, jak i w nieorganicznych. Azot zawarty w związkach organicznych ulega przemianie do formy amonowej już nawet podczas transportu ścieków do oczyszczalni, a proces ten nosi nazwę amonifikacji. Część tej formy azotu jest wykorzystywana do budowy nowych komórek mikroorganizmów rozkładających zanieczyszczenia, jednak większość azotu jest usuwana ze ścieków w postaci azotu gazowego. Rysunek 1 przedstawia możliwe ścieżki przemian różnych form azotu [Płaza et al., 23]. Wszystkie ścieżki (za wyjątkiem ścieżki 2 ) zachodzą z udziałem mikroorganizmów, toteż możliwe jest modyfikowanie technologii biologicznego usuwania azotu. NO3 - NH3 Związki organiczne zawierające azot 5 6 NO2 - NO2-2 3 8 7 4 8 N 2 NH4 + 8 1 Białka Rys. 1 Ścieżki przemian różnych form azotu (l-amonifikacja, 2-stripping, 3-asymilacja, 4-częściowa nitryfikacja [NH 4 + w NO 2 - ], 5-częściowa nitryfikacja [NO 2 - w NO 3 - ], 6-częściowa denitryfikacja [NO 3 - w NO 2 - ], 7- częściowa denitryfikacja [NO 2 - w N 2 ], 8-Anammox) [Płaza et al., 23] 9

1.1 Kierunki rozwoju biologicznych metod usuwania azotu ze ścieków Konwencjonalny sposób usuwania związków azotu ze ścieków prowadzony jest w układach biologicznych opartych o technologie procesów nitryfikacji oraz denitryfikacji [Dymaczewski i Sozański, 1995]. Procesy te wydają się jednak wciąż nie w pełni satysfakcjonujące. Wymagają one znacznego nakładu energii na proces napowietrzania podczas nitryfikacji oraz dostarczania zewnętrznego źródła węgla dla bakterii denitryfikujących. Dodatkowo, normy prawne określające maksymalne, dopuszczalne stężenia azotu i fosforu w ściekach zrzucanych do odbiorników są coraz bardziej zaostrzane. Z tego powodu poszukiwane są nowe rozwiązania. Poniżej zostaną opisane najważniejsze ze stosowanych lub dopiero badanych procesów. Nitryfikacja jest dwustopniowym procesem utleniania jonów amonowych do azotanów (V) poprzez azotany (III), prowadzonym przez grupę bakterii chemolitotroficznych, jakimi są bakterie nitryfikujące (dla ułatwienia, w tekście pracy będą stosowane terminy: azotany i azotyny). Podczas pierwszego etapu bakterie rodzaju Nitrosomonas przeprowadzają jony amonowe w azotyny, które w drugim etapie utleniane są do azotanów przez bakterie grupy Nitrobacter (rys.1 proces 4+5) [Bothe et al., 2]. Efektywną metodą usuwania azotanów jest biologiczna denitryfikacja (rys. 1 proces 6+7). Jest procesem beztlenowym, w którym fakultatywne mikroorganizmy beztlenowe z rodzaju Pseudomonas np. Pseudomonas denitrificans wykorzystują tlen zawarty w azotanach lub azotynach do respiracji, a związki organiczne, znajdujące się w ściekach, jako substancje odżywcze. Azot azotanowy/azotynowy jest akceptorem elektronów i jest redukowany przez reduktazy, odpowiednio azotanową/azotynową do wolnego azotu. Zauważono, że denitryfikacja przebiega bez zakłóceń, jeżeli stosunek ChZT/N jest większy niż 4 g ChZT/ g NO 3 -N [Dymaczewski et al., 1995; Trela, 2]. W przeciwnym razie istnieje konieczność doprowadzenia związków organicznych (denitryfikacja z zewnętrznym źródłem węgla) jak metanol czy kwas octowy. Ze względu na koszty ten sposób prowadzenia procesu stosuje się tylko w szczególnych przypadkach [Verstraete i Philips, 1998; Bothe et al., 2]. Niestety, jak wspomniano, klasyczna technologia usuwania związków azotowych nie zawsze zapewnia spełnienie wymogów prawnych, osiągnięcie wysokiej wydajności usuwania azotu ze ścieków przy jak najniższych kosztach eksploatacji [Verstraete i Philips, 1998; Schmidt et al., 23]. W ciągu ostatnich lat wiele ośrodków naukowych z całego świata podjęło badania zmierzające do opracowania nowych rozwiązań biologicznego oczyszczania ścieków, zwłaszcza zawierających znaczne ilości związków azotu, większe niż w ściekach komunalnych. Do najbardziej znanych ośrodków naukowych należą Delft University of Technology, Holandia [Schmidt et al., 23], University of Nijmegen, Holandia [Jetten, 1999, 22], University of Hannover, Niemcy [Hippen, 1

1997; Helmer et al., 21; Rosenwinkel et al., 25] Ghent University, Belgia [Verstrataete i Philips, 1998; Van Hulle, 25] oraz Royal Institute of Technology in Stockholm, Szwecja [Płaza et al., 23]. Proces SHARON (Single reactor High activity Ammonia Removal Over Nitrite) jest modyfikacją konwencjonalnej nitryfikacji/denitryfikacji opracowaną w Technical University of Delft [Hellinga et al., 1998]. Polega na konwersji jonów amonowych do azotynowych w aerobowych warunkach przez bakterie utleniające NH 4 -N. Następnie NO 2 -N jest redukowany w anoksycznych warunkach do azotu gazowego. W metodzie tej, ze względu na niski stosunek ChZT/N konieczne jest dodanie zewnętrznego źródła węgla organicznego (rys.1 procesy 4+7). Proces ten jest bardziej dostosowany do konwersji amoniaku w azot cząsteczkowy z dobrą wydajnością dla stężonych wód nadosadowych z przeróbki osadów. Proces prowadzony jest w jednym reaktorze (SHARON) ze strefą napowietrzania oraz ze strefą mieszania mechanicznego, podczas którego związki azotu są usuwane w temperaturze 35 C oraz przy poziomie ph około 7. Wysoka temperatura, stężenie substratu oraz krótki czas zatrzymania umożliwiają prowadzenie procesu bez recyrkulacji osadu [Van Dongen et al., 21 a, b]. Wymierne korzyści możliwe do uzyskania w procesie SHARON to obniżenie kosztów eksploatacji bez znaczącej zmiany wydajności usuwania azotu. Rozwiązania zastosowane w tej technologii pozwalają na uzyskanie 9% wydajności usuwania azotu nieorganicznego oraz umożliwiają ograniczenie zapotrzebowania na tlen (25%) i na zewnętrzne źródło węgla organicznego (4%) [Van Dongen et al., 21 a, 21 b]. Proces SHARON został po raz pierwszy zastosowany na pełną skalę w oczyszczalniach ścieków Sluisjesdijk w styczniu 1999 roku a następnie Dokhaven oraz Ultrecht w Rotterdamie (Holandia). Odkrycie grupy bakterii procesu Anammox, należących do rzędu Planctomycetales, otworzyło nowe kierunki w usuwaniu związków azotu ze ścieków. Procesy CANON, deamonifikacja, NO x oraz OLAND zostały rozwinięte wychodząc naprzeciw potrzebom oczyszczalni ścieków w rozwiązywaniu problemów oczyszczania wód osadowych, odcieków z wysypisk, odcieków z wirówek, a także niektórych ścieków przemysłowych, charakteryzujących się dużą zawartością nieorganicznych form azotu [Jetten et al., 22; Strous, 1999]. Proces Anammox (ANaerobic AMMonium OXidation) jest biologicznym, autotroficznym procesem, który zachodzi w warunkach anaerobowych [Mulder et al., 1995; Van de Graaf et al., 1996]. Z tego powodu podczas procesu Anammox zachodzi całkowita konwersja jonów amonowych do gazowego azotu bez konieczności doprowadzania zewnętrznego źródła węgla organicznego (rys. 1 - proces 8). W reakcji tej azotyny są używane jako akceptory elektronów w biologicznej oksydacji do azotu gazowego. Proces Anammox odgrywa istotną rolę w oczyszczaniu ścieków o wysokich wartościach ChZT oraz wysokich stężeniach azotu amonowego (NH 4 -N). Połączenie tego procesu z beztlenowym 11

oczyszczaniem ścieków, w którym materia organiczna jest przekształcana w metan stanowi skuteczne i ekonomiczne rozwiązanie problemu oczyszczania tego rodzaju ścieków [European Comission, 24]. Istotną zaletą procesu jest niższe zapotrzebowanie energii względem konwencjonalnych metod usuwania związków biogennych o ponad 35 % [Trela et al., 24]. Proces ten nie wymaga dostarczania zewnętrznego źródła węgla organicznego a emisja CO 2 do atmosfery w porównaniu z nitryfikacją oraz denitryfikacją jest mniejsza o ponad 85%. Należy zwrócić uwagę na fakt, że do prowadzenia procesu Anammox mogą być stosowane różne konfiguracje reaktorów [Trela et al., 24; Mulder, 23]. Z tego względu wdrożenie procesu Anammox, jako metody usuwania związków azotowych, ma na celu znaczną redukcję kosztów eksploatacyjnych. Dlatego też, proces ten ma szansę całkowicie zastąpić denitryfikację, jak również zaoszczędzić połowę kosztów natleniania ścieków podczas nitryfikacji. Obecnie w czterech oczyszczalniach ścieków zastosowano proces Anammox do usuwania azotu ze ścieków przemysłowych. Trzy z nich znajdują się na terenie Holandii (Rotterdam, Lichteenvorde, Olburger) oraz jedna w Japonii (Mie). Pierwszy reaktor Anammox w pełnej skali do usuwania azotu z wód osadowych został zainstalowany w Rotterdamie w Holandii w roku 22. W Hattingen (Niemcy) i Grodinge (oczyszczalnia ścieków Himmerfjerden, Szwecja) proces Anammox jest prowadzony jako ruchome złoże z błoną biologiczną na kształtkach Kaldness. W oczyszczalni ścieków w Strass (Austria) wybudowano reaktor Anammox w oparciu o technologię SBR z osadem czynnym [Abma et al., 27; Manipura et al., 25; Alvarez, 27; Szatkowska, 27]. Ze względu na wymierne korzyści uzyskiwane w procesach SHARON i Anammox, połączenie obu koncepcji umożliwiło uzyskanie innowacyjnych technologii oczyszczania ścieków o wysokim stężeniu jonów amonowych oraz o niskim stosunku ChZT/N (rys. - proces 4+8). Są to takie procesy jak deamonifikacja, realizowana jako proces dwustopniowy lub jako proces jednostopniowy (CANON). Pozwalają one przy zachowaniu wysokiej wydajności usuwania azotu obniżyć koszty eksploatacyjne [Van Dongen et al., 21a, 21b]. Technologie te wymagają znacznie mniejszych zawartości węgla oraz tlenu niż ma to miejsce w tradycyjnej nitryfikacji i denitryfikacji. Produktem końcowym utleniania jest cząsteczkowy azot. Wydajność obu procesów osiąga wartości około 8-9%, również emisja dwutlenku węgla do atmosfery i zapotrzebowanie energii zostają ograniczone w znaczny sposób [Hippen et al., 1998, 1999; Seyfried et al., 21, 22]. Ponadto, niższe szybkości wzrostu mikroorganizmów prowadzących proces zapobiegają powstawaniu dużych ilości osadu nadmiernego [Seyfried et al., 21; Fux et al., 22]. Proces CANON (Completely Autotrophic N-removal Over Nitrite) [Sliekers et al., 22; Third et al., 22]) jest procesem, gdzie równocześnie zachodzą częściowa nitryfikacja oraz proces Anammox (rys. 1 - procesy 4+8). Za proces odpowiedzialne są dwie grupy mikroorganizmów: bakterie nitryfikujące, które podczas utleniania jonów amonowych do azotynów zużywają tlen rozpuszczony, stwarzając tym samym anaerobowe warunki niezbędne dla aktywności bakterii procesu Anammox [Sliekers et al., 23]. Proces ten niweluje koszty dostarczania ładunku ChZT, ogranicza 12

emisję dwutlenku węgla i zapotrzebowanie energii poprzez obniżenie do 5% zapotrzebowania na tlen. W przypadku tego rozwiązania technologicznego, wydajność usuwania związków azotowych wzrasta do 9%. Proces jest nadal intensywnie badany, choć już został wdrożony w pełnej skali w oczyszczalni ścieków Himmerfjärden w Sztokholmie w Szwecji i Hattingen w Niemczech. Deamonifikacja dwustopniowa jest rozwiązaniem, w którym połączono częściową nitryfikację z beztlenowym utlenianiem jonów amonowych (Anammox) w dwustopniowy proces (rys. 1 - proces 4+8) [Helmer et al., 21, Helmer-Madhok et al., 22; Hao et al., 22]. Reakcje te są, w przeciwieństwie do procesu CANON, rozdzielone przestrzennie. Wydajność procesu osiąga wartości około 7-8%, a zalety tej metody są podobne do uzyskiwanych w procesie CANON. Emisja dwutlenku węgla do atmosfery i zapotrzebowanie energii zostają ograniczone w znaczny sposób [Hippen et al., 1997, 1998, 1999; Seyfried et al., 21]. Dodatkowo, niższe szybkości wzrostu mikroorganizmów prowadzących proces zapobiegają powstawaniu dużych ilości osadu nadmiernego [Fux et al., 22; Seyfried et al., 21]. Wdrażanie procesu deamonifikacji w skali technicznej zostało rozpoczęte w 1995 roku oczyszczalni ścieków w Mechernich (Niemcy), a w 22 roku w oczyszczalni ścieków w Hattingen, Niemcy [Hippen et al., 21; Seyfried et al., 22]. Obecnie istnieją także instalacje w oczyszczalniach w Rotterdamie, Sztokholmie (Syvab), Strass (Austria) [Szatkowska, 27; Trela et al., 24 a, b; Abma et al., 27; Wett, 26]. Proces OLAND (the Oxygen-Limited Autotrophic Nitrification-Denitrification) to system, który wykorzystuje osad czynny z przewagą bakterii nitryfikujących jako biokatalizator dla usuwania form azotu nieorganicznego z wód osadowych, pochodzących z przeróbki osadów [Verstraete oraz Philips, 1998; Schmidt et al., 23]. Proces przebiega w warunkach ograniczonego stężenia tlenu rozpuszczonego, w których jony amonowe są usuwane w jednostopniowej reakcji. Podczas procesu OLAND, podobnie jak podczas procesu CANON, nie dochodzi do produkcji jonów azotanowych. N- NH + - 4 oraz N-NO 2 reagują z jednakową szybkością a produktem końcowym procesu jest tylko N 2 (azot gazowy) [Windey et al., 25]. Najważniejszym parametrem umożliwiającym kontrolę procesu jest stężenie tlenu. Podczas procesu zużywane jest około 1.7 kg O 2 /kg N, co daje niższą o 62.5% wartość zużycia tlenu w porównaniu z klasycznymi procesami nitryfikacji denitryfikacji. W procesie Oland nie ma potrzeby dodawania do ścieków zewnętrznego źródła węgla. Badania procesu OLAND są prowadzone w Laboratory Microbial Ecology w Gent (Belgia) [Vlaeminck, 27; Windey, 25]. W dalszym ciągu prowadzone są szerokie badania nad możliwością poprawy efektywności usuwania azotu z wykorzystaniem bakterii Anammox i można spotkać szereg propozycji rozwiązań takich jak DEMON [Innerebneret al., 27] czy DEAMOX [Kalyuzhnyi et al., 26]. W tabeli 1 porównano najważniejsze metody usuwania azotu ze ścieków [Mulder, 23; Schmidt et al., 23; Vlaeminck, 27]. Klasyczna metoda usuwania związków azotowych ze 13

ścieków z wykorzystaniem nitryfikacji-denitryfikacji charakteryzuje się najwyższą wartością produkcji biomasy oraz najwyższym zużyciem tlenu podczas nitryfikacji oraz dodatkowego węgla organicznego przy denitryfikacji. Mimo, iż efektywność usuwania azotu za pomocą klasycznej metody jest wysoka, uzasadnione jest poszukiwanie nowych metod usuwania tych związków ze ścieków. Przedstawione w tabeli 1 alternatywne procesy wymagają mniejszych nakładów energetycznych, jak i mniejszego zapotrzebowania węgla i tlenu w porównaniu z konwencjonalnymi procesami nitryfikacji i denitryfikacji. Mogą one znaleźć zastosowanie głównie do oczyszczania wód nadosadowych, ale także ścieków o innej charakterystyce niż ścieki komunalne, np. z różnych sektorów przemysłowych, odcieków ze składowisko odpadów itp. W przyszłości, zastosowanie kombinacji różnych grup mikroorganizmów oraz optymalizacja kierowania procesem (np. adaptacja do określonych składników ścieków, temperatura, stężenie rozpuszczonego tlenu itp.) pozwolą udoskonalić technologie usuwania związków azotu. Należy jednak podkreślić, że wyżej opisane procesy nie są jeszcze w pełni poznane. Zdobycie bardziej dokładnej wiedzy o mechanizmach, biochemii, kinetyce, kontroli tych, jakże obiecujących procesów, wymaga nadal szeroko zakrojonych, specjalistycznych badań. Powinno to dotyczyć szczególnie tych aspektów, które wiążą się z obecnością w ściekach zanieczyszczeń nietypowych, szkodliwych dla mikroorganizmów. W kolejnych rozdziałach bardziej szczegółowo opisano procesy nitryfikacji i Anammox oraz parametry wpływające na ich prawidłowy przebieg, jako, że są one podstawą przeprowadzonych w ramach pracy doktorskiej badań. 14

Tab. 1 Charakterystyka eksploatacyjna procesów biologicznego usuwania związków azotowych ze ścieków [Vlaeminck et al., 27, Mulder, 23, Schmidt et al. 23] Nitryfikacjadenitryfikacja SHARON Anammox CANON Tlenowa deamonifikacja OLAND NO x Typ mikroorganizmów Aerobowe oksydanty NH 4 + i NO 2 _ ; heterotrofy Aerobowe oksydanty NH 4 + ; N. eutropha heterotrofy Anaerbowe oksydanty; B. anammoxidans, K. Stuttgartiensis; Scalindua brodae, S. wagneri, S.sorokinii; Planctomycetales Planctomycetales; N. eutropha Oksydanty amonowe o nieznanej tolerancji na sole Nitrobacter K. stuttgartiensis Nitrosomonas sp oraz bakterie z grupy Planctomycetales (podobne do K. Stuttgartiensis N. eutropha Mikro- organizmy Osad czynny/ błona biologiczna Osad czynny Błona biologiczna, granule, osad czynny Błona biologiczna Błona biologiczna Błona biologiczna Osad czynny Ładunek NH 4 + [kg N*m -3 reaktora * d] Zapotrzebowanie na tlen [kgo 2 /kg N] Wydajność usuwania azotu 2-8,5-1,5 1-2 2-3 1-2,1 5 Wysokie (4,6) Niskie (3,4) Warunki anaerobowe Niskie (~2) Niskie (~2) Niskie (~2) 95% 9% 9% 9% 6-85% 85% 95% Złożoność Procesu Oddzielne komory tlenowe i beztlenowe, lub czasowe rozdzielenie procesów, dozowanie metanolu Oddzielne komory tlenowe i beztlenowe, lub czasowe rozdzielenie procesów, dozowanie metanolu Wymagana wstępna częściowa nitryfikacja Napowietrznie wymaga dostosowania do ładunku jonów amonowych Napowietrznie wymaga dostosowania do ładunku jonów amonowych Napowietrznie wymaga dostosowania do ładunku jonów amonowych Oddzielne komory tlenowe i beztlenowe, dozowanie metanolu obecność membrany do retencji osadu Status użytkowy Stosowana powszechnie 4 obiekty w skali technicznej 2 obiekty w skali technicznej 2 obiekty w skali technicznej 2 obiekty pilotażowe w skali technicznej Skala półtechniczna Pilot w skali laboratoryjnej Koszty inwestycyjne Średnie Średnie Niskie Średnie Średnie Średnie Średnie Koszty eksploatacyjne Wysokie Niskie Bardzo niskie Niskie Niskie Nieznane Niskie 15

1.2 Proces nitryfikacji Jak wcześniej stwierdzono, nitryfikacja jest dwustopniowym procesem utleniania jonów amonowych do azotanów poprzez azotyny, prowadzonym przez bakterie nitryfikujące. Te wysoko wyspecjalizowane mikroorganizmy są bezwzględnymi tlenowcami, które zdolne są do życia w środowisku mineralnym, często bez śladów związków organicznych, kosztem energii chemicznej związanej w zredukowanych związkach nieorganicznych. 1.2.1 Bakterie nitryfikujące Bakterie nitryfikujące można podzielić na dwie grupy: bakterie utleniające azot amonowy (NH 4 -N) do azotu azotynowego (NO 2 -N) (ammonia oxidizing bacteria, AOB) oraz bakterie utleniające NO 2 -N do azotu azotanowego (NO 3 -N) (nitrite oxidizing bacteria, NOB) (rys.1 proces 4+5). Dotychczas nie znaleziono autotroficznych AOB utleniających NH 4 -N bezpośrednio do NO 3 -N [Verstraete i Philips, 1998]. Uproszczone równania reakcji mają postać: nitrytacja NH + 4 - + 1,5 O 2 = NO 2 nitratacja - NO 2 - +,5 O 2 = NO 3 + H 2 O = 2 H + (1) (2) AOB są klasyfikowane przez morfologię komórek jako pięć różnych rodzajów: Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrosovibrio oraz Nitrosolobus [Bothe et al., 2; Koops i Moeller, 1992]. Ostatnio na podstawie badań 16S rrna zaproponowano przyporządkowanie Nitrosospira, Nitrosovibrio oraz Nitrosolobus do jednego wspólnego rodzaju Nitrosospira [Head et al., 1993]. Ogólnie AOB są bezwzględnymi chemolitotrofami, chociaż część z nich może zużywać substancje organiczne (octany, pirogroniany) do miksotroficznego wzrostu. NOB są względnymi autotrofami, zdolnymi do wzrostu heterotroficznego, które utleniają NO 2 - N do NO 3 -N. Przedstawicielem tej grupy są rodzaje Nitrobacter, Nitrospina oraz Nitrococcus. Wiążą CO 2 wykorzystując energię uwalniana podczas utleniania N (III) do N (V). Niektóre heterotroficzne bakterie i grzyby mogą również utleniać azot amonowy oraz/lub redukować azot z substancji organicznych do hydroksylaminy [Bothe et al., 2]. Podczas gdy utlenianie związków azotu jest procesem produkcji energii u autotroficznych nitryfikatorów, to nitryfikacja prowadzona przez heterotroficzne organizmy pozornie nie ma wpływu na ich metabolizm. Heterotroficzne nitryfikatory są zdolne do jednoczesnej nitryfikacji i denitryfikacji [Robertson et al., 1988]. Ostatnio zostało wykazane, że autotroficzne AOB, N.europaea oraz N. eutophea mogą również prowadzić jednoczesną nitryfikację i denitryfikację w warunkach anoksycznych [Bock et al., 1995]. 16

1.2.2 Wpływ różnych czynników na bakterie procesu nitryfikacji Wzrost bakterii nitryfikujących może być limitowany przez wiele czynników: skład pożywki bakteryjnej, temperatura, ph, natlenienie, oraz obecność substancji toksycznych. Gdy ścieki poprodukcyjne doprowadzane są do osadu czynnego początkowo aktywność bakterii nitryfikujących obniża się aż do pełnego przerwania nitryfikacji. Inhibicja procesu nitryfikacji może być powodowana przez inaktywację enzymów utleniających jony amonowe lub poprzez zahamowanie szlaku biosyntezy, co objawia się zahamowaniem wzrostu bakterii. Kiedy stężenie inhibitora obniża się poniżej poziomu inhibicji, bakterie nitryfikujące odzyskują zdolność prowadzenia nitryfikacji. Jednak jeżeli stężenie inhibitora jest znacznie wyższe od progu tolerancji, może dojść do nieodwracalnego uszkodzenia mikroorganizmów, którego później nie zniweluje obniżenie stężenia inhibitora do poziomu niższego niż próg tolerancji. Poniżej przedstawiono krótką charakterystykę czynników, które mogą wpływać na proces nitryfikacji. Wpływ temperatury Temperatura ścieków komunalnych podczas biologicznego oczyszczania wynosi zazwyczaj 5-2 C. Jednak podczas oczyszczania ścieków przemysłowych temperatura zależy od rodzaju produkcji w danym zakładzie. Mikroorganizmy osadu czynnego wykazują tolerancję w dość szerokim zakresie temperatur 1-35 C. Dopiero niższe temperatury ograniczają rozwój mikroorganizmów odpowiedzialnych za proces nitryfikacji i denitryfikacji. Hao stwierdził możliwość zastosowania równania Arrheniusa do opisania zależności szybkości wzrostu bakterii nitryfikujących od temperatury procesu. Wykazał, że obniżenie aktywności mikroorganizmów jest powodowane obniżeniem temperatury procesu [Hao et al., 22]. Nitrosomonas sp. prowadzą I etap nitryfikacji w temperaturach optymalnych 25-36 C. Niższe temperatury obniżają maksymalną szybkość wzrostu tych organizmów (μ max ), a w temperaturze zbliżonej do 5 C proces ulega całkowitemu zahamowaniu. Zależność szybkości wzrostu bakterii Nitrosomonas od temperatury prowadzenia procesu z zastosowaniem osadu czynnego przedstawia równanie 3 [Kunst, 22]. gdzie: μ max - maksymalna szybkość wzrostu [d -1 ], T - temperatura [º C].,116( T 15) µ max =, 18 e (3) Inaczej zależy od temperatury wzrost bakterii Nitrobacter. W temperaturach w zakresie 1-15 C szybkość wzrostu NOB (Nitrobacter) w porównaniu z szybkością wzrostu AOB (Nitrosomonas) jest wyższa. Natomiast w temperaturze powyżej 3 C szybkość wzrostu NOB jest hamowana i jest 17

znacznie niższa (wynosi 1,87 d -1 ) niż bakterii AOB w tej samej temperaturze (2,97 d -1 ). Różnice szybkości wzrostu poszczególnych grup bakterii nitryfikujących mogą być wykorzystane w procesach skróconej nitryfikacji [Szewczyk, 25]. Na rysunku 2 przedstawiono zależność szybkości wzrostu bakterii AOB i NOB od temperatury według Kunsta [Kunst, 22]. Rys. 2 Zależność szybkości wzrostu od temperatury bakterii Nitrosomonas i Nitrobacter [Kunst, 22] Z kolei Fux wykazał [Fux et al., 22], że już w temperaturze 24 o C przewaga wzrostu bakterii AOB nad wzrostem NOB jest znaczna i może być wykorzystana w praktyce. Wpływ ph Wartość ph w środowisku ma również znaczący wpływ na rozwój mikroorganizmów. Optymalny poziom ph procesu nitryfikacji jest podawany różnie przez różnych autorów. Mayerhoff [Mayerhoff, 1916] wyznaczył optimum ph dla bakterii rodzaju Nitrosomonas w przedziale od 8,5 do 8,8 a dla bakterii rodzaju Nitrobacter w przedziale od 7,7 do 8,4. Natomiast Painter [Painter, 197] wyznaczył optymalny przedział nitryfikacji w granicach ph 6,3-6,7. Ruitz [Ruitz et al., 23] stwierdził, że całkowita nitryfikacja może zachodzić w szerokim przedziale ph - między 6,45 i 8,95. Po przekroczeniu wartości granicznych tego przedziału nitryfikacja ulega zahamowaniu w wyniku całkowitej inhibicji aktywności bakterii nitryfikujących [Ruitz et al., 23]. Potwierdził te wartości Park [Park et al., 27], który badał wpływ zmian ph na aktywność mikroorganizmów AOB i NOB, wyrażanej jako maksymalna specyficzna szybkość nitryfikacji. Wykazał, że optymalne warunki ph dla AOB wynoszą 8,2 ±,3, natomiast wartość optymalnego ph dla NOB wynosiła 7,9 ±,4. Stwierdził też, że NOB wykazują większą niż AOB wrażliwość względem zmian ph [Park et al., 27]. Zależność szybkości wzrostu opisywana jest równaniem 4 (przy zachowaniu warunku nie przekroczenia granicy ph równej 7,2) [Kunst et al., 22]. 18

µ = µ [1,833(7,2 ph )] (4) max gdzie: µ- szybkość wzrostu [d -1 ], µ max - maksymalna szybkość wzrostu [d -1 ]. Wpływ stopnia natlenienia Do prawidłowego rozwoju mikroorganizmów procesu nitryfikacji konieczne jest stężenie tlenu rozpuszczonego około 1-1,5 mg O 2 /l. Ograniczenie lub inhibicja wzrostu NOB pozwala uzyskać warunki, w których zachodzi częściowa nitryfikacja. Takie warunki zapewniają niskie stężenia tlenu, ponieważ NOB wykazują mniejsze powinowactwo do tlenu niż AOB, a wymagane współczynniki saturacji wynoszą dla AOB i NOB odpowiednio,3 mg O 2 /l i 1,1 mg O 2 /l ). Niższe powinowactwo NOB do tlenu w porównaniu do AOB jest też prawdopodobnie przyczyną wymywania NOB z reaktorów przy niskich wartościach DO [Wiesmann, 1994; Ciudad et al., 27; Yong et al., 29]. Zależność szybkości wzrostu bakterii nitryfikujących od stężenia tlenu przedstawia równanie 5: µ DO / K + O DO (5) = µ max 2 gdzie: µ- szybkość wzrostu [d -l ], µ max - maksymalna szybkość wzrostu [d -1 ], K O 2 - stała napowietrzania dla tlenu, DO - stężenie tlenu rozpuszczonego [g/ml]. Inhibicyjny wpływ amoniaku oraz wolnego kwasu azotowego Nitryfikacja może być hamowana przez wysokie stężenie wolnego amoniaku jak i kwasu azotowego (III). Zależności miedzy substancjami procesu nitryfikacji przedstawia rysunek 3. Rys. 3 Zależności między substancjami procesu nitryfikacji Głównymi inhibitorami procesu nitryfikacji są amoniak NH 3 oraz kwas azotowy (III) HNO 2. Pozostałe czynniki inhibitujące proces takie jak temperatura, natlenienie, ph zostały opisane powyżej. 19

Zmiany stężeń NH 3 oraz HNO 2 wraz ze zmianą ph powodują inhibicję procesu. Aktywność Nitrosomonas sp. obniża wysokie stężenia amoniaku (1-15 mg NH 3 -N/l), a bakterie rodzaju Nitrobacter sp. są bardzo wrażliwe na obecność amoniaku już przy stężeniach równych.1-1 mg NH 3 -N/l [Anthosien et al., 1976]. Równowagę NO - 2 /HNO 2 w reakcji dysocjacji opisuje równanie 6, a zależność od ph przedstawia rysunek 4. Ponadto, na rysunku 5 przedstawiona jest zależność inhibicji procesu nitryfikacji od ph w obecności wolnego amoniaku oraz kwasu azotowego (III). Można zauważyć, że wraz ze spadkiem ph, w roztworze wzrasta zawartość HNO 2, którego wysokie stężenie hamuje aktywność Nitrobacter sp., natomiast przy wysokim ph kwas azotowy (III) łatwo dysocjuje, stała równowagi reakcji przesuwa się w kierunku tworzenia jonów azotynowych, których wysokie stężenie hamuje aktywność Nitrosomonas sp., odpowiedzialnych za pierwszy etap nitryfikacji. + + HNO2 NO2 H (6) Rys. 4 Równowaga NO 2 - / HNO 2 procesu dysocjacji w zależności od ph przy różnych temperaturach [Kunst, 22]. Rys. 5 Zależność inhibicji procesu nitryfikacji od ph w obecności wolnego amoniaku oraz kwasu azotowego [Anthosien et al., 1976] 2

1.2.3 Adaptacja osadu czynnego do ścieków zawierających inhibitory procesu nitryfikacji Niektóre ścieki w swoim składzie zawierają substancje toksyczne względem mikroorganizmów osadu czynnego. Wymagają one wcześniejszego podczyszczania z wykorzystaniem metod fizycznych jak i chemicznych w celu obniżenia stężeń substancji hamujących do poziomu, który nie zakłóca procesu [Greń, 1978; Nowak et al., 1996]. Jednak często, ze względu na wysokie koszty podczyszczania, pożądane jest ograniczenie efektu inhibicji poprzez wzmożenie zdolności osadu czynnego do biodegradacji inhibitorów lub/i wzrost tolerancji osadu nitryfikującego względem inhibitorów, a więc przeprowadzenie aklimatyzacji w celu osiągnięcia adaptacji osadu czynnego do szkodliwych czynników. Zaproponowano dwa mechanizmy tłumaczące aklimatyzację. Pierwszy zakłada nabywanie przez mikroorganizmy osadu czynnego zdolności do biodegradacji inhibitorów w przypadku kontaktu osadu z inhibitorem przez długi okres czasu, drugi natomiast - nabywanie zdolności regenerowania nowych białek w nieaktywnych komórkach w celu przywrócenia ich aktywności [Nowak et al., 1996; Hyman et al., 1995]. Przywrócenie aktywności nitryfikacyjnej może nastąpić nawet wówczas, gdy bakterie nitryfikujące są całkowicie inhibitowane. W konsekwencji osad aklimatyzowany z całkowicie przywróconą nitryfikacją może łatwo osiągnąć wyższą tolerancję na stężenia inhibitorów wyższe, niż w przypadku osadu nieaklimatyzowanego. Taka sytuacja może nastąpić ze względu na istnienie dużej ilości opornych bakterii powstałych w sposób naturalny, wcześniej, w okresie aklimatyzacji. Özbelge i współpracownicy [Özbelge et al., 27] poddali ocenie efekt aklimatyzacji mikroorganizmów osadu czynnego wystawionego na działanie metali ciężkich. Badano łączny wpływ miedzi i cynku poprzez zmieszanie tych metali w odpowiednich kombinacjach, takich jak: 1,5 mg /l Cu 2+ + 9mg/l Zn 2+ oraz 4,5 mg/l Cu 2+ + 27mg/l Zn 2+. Zaobserwowano, że użycie aklimatyzowanych mikroorganizmów osadu czynnego podczas doświadczeń z wykorzystaniem obu kombinacji stężeń przez nadmiernie długi okres czasu (1-4 miesięcy) spowodowało spadek wydajności oczyszczania ścieków. Poza tym stwierdzono, że wydłużenie czasu aklimatyzacji osadu czynnego powoduje zmniejszenie inhibicji, a w celu osiągnięcia najwyższej wydajności procesu oczyszczania ścieków należy starannie dostosować stężenia dozowanych metali ciężkich. Osad aklimatyzowany był również używany przez Chaojie i jego grupę [Chaojie et al., 27] do badania zdolności degradacji meta-fluorofenolu. W pierwszej fazie aklimatyzacji, trwającej 2 miesiące, źródło węgla stanowiły jedynie ścieki bytowe. Wraz z poprawą podatności osadu na biodegradację zwiększano stężenie fluorofenolu w dopływie. Kiedy podatność na biodegradację osiągnęła wartość stałą rozpoczęto drugą, czteromiesięczną fazę aklimatyzacji, podczas której dozowano fluorofenol w stężeniu 1 mg/l. Parametry procesu były takie same w obu fazach aklimatyzacji. Stężenie tlenu i temperatura wynosiły odpowiednio 2-3 mg/l i 25 C. 21

Jianlong [Jianlong, 24] posłużył się testami OUR w celu określenia wpływu ftalanu dibutylu (DBP) na aklimatyzowany i nieaklimatyzowany osad czynny. Proces aklimatyzacji osadu czynnego prowadzono przez 15 dni, przy czym stężenie DBP zwiększano od 25 do 3 mg/l. Wyniki wskazują, że szybkość respiracji znacząco wzrasta, dzięki uodpornieniu się osadu na DBP podczas jego adaptacji, a mikroorganizmy wytworzyły system enzymatyczny, metabolizujący DBP. Zdolność do rozkładu DBP badano na osadzie aklimatyzowanym i nieaklimatyzowanym. Po 1 godzinnym doświadczeniu zaobserwowano całkowity zanik DBP (od stężenia 1 mg/l) tylko w przypadku osadu aklimatyzowanego, natomiast stężenie DBP w przypadku nieaklimatyzowanego osadu niemalże nie uległo zmianie w tym okresie. Xiong i współpracownicy [Xiong et al., 1998] prowadzili badania nad procesem aklimatyzacji osadu czynnego do inhibitorów procesu nitryfikacji takich jak mocznik i anilina. Eksperyment polegał na ciągłym dostarczaniu wyżej wymienionych substancji lub ich mieszaniny do komór nitryfikacji w skali laboratoryjnej. Stężenie inhibitorów procesu zostało ustalone na poziomie całkowitej inhibicji procesu nitryfikacji, ale w sposób nie wpływający na redukcję ładunku BZT (biodegradację). Badano zmiany stężeń sumy jonów azotynowych i azotanowych jak również przeprowadzano testy OUR. Przeprowadzono krótką i długą aklimatyzację. Stwierdzono, że w okresie aklimatyzacji wzrastał stopień biodegradacji inhibitora oraz aktywność mikroorganizmów osadu czynnego. Jednak procesy zachodziły w sposób odmienny zarówno dla mocznika jak i aniliny. Mocznik powodował ostrą inhibicję oksygenazy AMO podczas utleniania jonów amonowych do azotynów, a jego stopień biodegradacji był niski do chwili osiągnięcia nie inhibicyjnego poziomu. Natomiast anilina hamowała oba etapy nitryfikacji, choć była łatwo biodegradowana. Podczas równoczesnego podawania obu inhibitorów dochodziło do równoczesnej inhibicji nitryfikacji przez oba związki. Co więcej, adaptowany do obecności mocznika osad czynny wykazywał wyższą tolerancję niż nieaklimatyzowany osad. Po zaprzestaniu dodawania inhibitorów następowało całkowite przywrócenie aktywności osadu czynnego, nie tylko dzięki zmniejszaniu stężenia wskutek biodegradacji, ale również spowodowane wyższą tolerancją zdobytą podczas aklimatyzacji [Xiong et al., 1998]. Również sulfonamidy zostały poddane testom na biodegradowalność oraz badaniom wpływu ich obecności na zdolności adaptacyjne osadu czynnego. Ingerslev oraz Hal1ing - Sørensen badali zdolność osadu czynnego do biodegradacji sulfonamidów [Ingerslev i Halling- Soerensen, 2]. Stopień wstępnej biodegradacji określono przy użyciu technik HPLC. Dodatkowo przeprowadzono test respirometryczny ekranowania tlenowej biodegradacji (OECD 31 D) oraz test inhibicji aktywności mikroorganizmów osadu czynnego (ISO 15522) [OECD, 1998; ISO 15522]. Autorzy wykazali, że sulfonamidy należą do grupy związków trudno biodegradowalnych. Ponadto stwierdzili, że adaptacja bakterii osadu czynnego do obecności sulfonamidów prowadzi do powstania oporności nie tylko na sulfonamidy użyte podczas procesu przystosowania, ale również na inne związki tej grupy. 22

1.3 Proces Anammox Proces Anammox (Anaaerobic Ammonium Oxidation) jest nowatorskim procesem usuwania związków azotowych ze ścieków. Jest on prowadzony w warunkach beztlenowych przez grupę autotroficznych mikroorganizmów. Proces ma zastosowanie do oczyszczania ścieków o podwyższonych stężeniach jonów amonowych (>,2 g NH 4 -N/l) oraz azotynowych. Jony amonowe utleniane są przy udziale azotynów jako akceptorów elektronów. Ponieważ nie ma konieczności doprowadzania zewnętrznego źródła węgla, proces jest także odpowiedni dla ścieków o relatywnie niskiej zawartości materii organicznej. Stosunek NO 2 -N/NH 4 -N w zakresie 1, 1,5 (optimum 1,3) w ściekach doprowadzanych ma kluczowe znaczenie dla efektywności procesu Anammox. Ścieki o takiej charakterystyce mogą być generowane zarówno w przemyśle, jak i w oczyszczalniach ścieków komunalnych, np. wody osadowe [European Comission, 24; Van de Graaf et al., 1996; Jetten et al., 1997]. Stechiometrię procesu przedstawia równanie 7 [Strous et al., 1997, 1999]: NH + 4 1.2N + 1.32NO 2 2 +.26NO +.66HCO 3 3 + 2.3H 2 +.13H O +.66CH O + 2.5 N.15 (7) 1.3.1 Mikroorganizmy procesu Anammox Proces Anammox został zaobserwowany w anaerobowym reaktorze ze złożem fluidalnym już w 1985 roku. Jednak jako pierwszy potwierdził eksperymentalnie proces Anammox zespół Arnolda Muldera w 1995 roku [Mulder et al., 1995]. W następnych latach opublikowano wiele innych doniesień o usuwaniu azotu w reaktorach nitryfikacyjnych [Hippen et al., 1997; Siegrist et al., 1998]. Natura procesu Anammox była intensywnie badana przez ostatnią dekadę. Mikroorganizmy odpowiedzialne za prowadzenie procesu Anammox należą do monofiletycznej grupy bakterii typu Planctomycetales z domeny Bacteria [Błaszczyk i Rzeczycka, 26]. Bakterie te należą do trzech rodzajów: Brocadia (B. anammoxidans i B. fulgida), Kuenenia (K. stuttgartiensis) oraz Scalindua (S. wagneri, S. brodae i S. sorokinii) [Op den Camp et al., 26]. Badania wykonane przy pomocy techniki FISH (Fluorescent in situ Hybridization) oraz PCR (Polymerase Chain Reaction) wykazały, że w systemach oczyszczających ścieki występują tylko dwa pierwsze rodzaje [Schmidt et al., 23]. Jednakże stwierdzono, że bardzo rzadko występują one razem w tym samym reaktorze, ponieważ prawdopodobnie stanowią dwie różne nisze ekologiczne [Shivaraman i Shivaraman, 23]. K. stuttgartiensis posiada wyższą tolerancję na azotyny oraz fosforany, poza tym jest bardziej aktywna przy niższej gęstości kultur komórek w porównaniu z B. anammoxidans [Khin i Annachhatre, 24]. Natomiast bakterie z rodzaju Scalindua zostały wyizolowane z wielu morskich oraz słodkowodnych ekosystemów. Obecnie bakterie przeprowadzające proces Anammox zostały odkryte w kilkudziesięciu wodnych ekosystemach naturalnych [Ahn, 26], m.in. w Morzu Czarnym [Kuypers 23

et al., 23], w estuarium Tamizy [Trimmer et al., 23] czy w Zatoce Golfo Dulce u wybrzeży Kostaryki [Dalsgaard et al., 23]. Przypuszcza się, że bakterie prowadzące proces Anammox odpowiedzialne są za obieg azotu w środowisku wodnym oraz produkcję azotu cząsteczkowego w oceanach, wynoszącą powyżej 5% [Dalsgaard et al., 25]. Wszystkie trzy rodzaje bakterii posiadają jednakowy metabolizm, podobną ultrastrukturę oraz charakteryzują się podobną, bardzo niską szybkością wzrostu (,1-,15 d -1 ). Ponadto, w ich komórkach znajdują się unikalne lipidy ladderanowe, występujące tylko u tych bakterii. Ze względu na niską szybkość wzrostu (czas podwojenia masy jest dłuższy niż 3 tygodnie) reaktory Anammox powinny mieć długi czas zatrzymania [Kuypers et al., 23; Van Niftrik et al., 24]. 1.3.2 Mechanizm procesu Anammox Poznanie ścieżki metabolizmu procesu Anammox było możliwe dzięki metodzie ze znakowanym azotem 15 N [Błaszczyk i Rzeczycka, 26; Jetten oraz Cirpus, 25]. Hydroksyloamina oraz hydrazyna zostały zidentyfikowane jako ważne produkty pośrednie procesu. W reakcji Anammox jony azotynowe stanowiące akceptor elektronów są redukowane do hydroksyloaminy. W kolejnym etapie hydroksyloamina reaguje z jonami amonowymi, w wyniku czego powstaje hydrazyna, która jest ostatnim produktem przejściowym. Podczas utleniania hydrazyny do azotu cząsteczkowego uwalniane są elektrony, które zużywane są podczas redukcji jonów azotynowych do hydroksyloaminy [Błaszczyk i Rzeczycka, 26; Ahn, 26]. Całkowita konwersja jonów amonowych do gazowego azotu jest możliwa bez dodatku metanolu lub innego źródła węgla organicznego, co jest niezbędne w procesie denitryfikacji [Jetten et al., 22; Van Dongen et al., 21a, 21b]. Schemat przemian związków azotowych zachodzących w komórkach bakterii prowadzących proces Anammox pokazano na rysunku 6 [Van Niftrik et al., 28; Błaszczyk i Rzeczycka, 26; Van Niftrik et al., 24]. Rys. 6 Mechanizm procesu Anammox [Van Niftrik et al., 28, Błaszczyk i Rzeczycka, 26] 24

Badania przeprowadzone na B. anammoxidans pokazały, że kluczowym enzymem reakcji Anammox jest oksydoreduktaza hydroksyloaminy, która stanowi aż 1% wszystkich białek komórkowych [Fuerst, 24]. Reakcja ma miejsce wewnątrz anammoksyzomów czyli przestrzeni wewnątrz cytoplazmy otoczonej przez charakterystyczne lipidy ladderanowe, tworzące bardzo zwartą podwójną błonę lipidową [Van Niftrik et al., 28; Van Niftrik et al., 24]. Anammoksyzomy stanowią 3% objętości komórki. Wszystkie lipidy ladderanowe zawierają od 3 do 5 liniowo połączonych pierścieni cyklobutanowych a także grupy eterowe oraz estrowe [Jetten i Cirpus, 25]. Produktem reakcji obok azotu cząsteczkowego są także jony azotanowe, stanowiące około 1% sumy substratów zawierających azot [Ahn, 26]. Część azotynów jest wykorzystywana do asymilacji dwutlenku węgla, który jest głównym źródłem węgla niezbędnym dla wzrostu bakterii prowadzących proces. W wyniku tej reakcji powstają azotany. Równanie 8 przedstawia reakcję asymilacji dwutlenku węgla przez bakterie Anammox [Ahn, 26]. CO 2 + 2NO 2 - + H 2 O CH 2 O + 2NO 3 - (8) Bakterie odpowiedzialne za proces Anammox charakteryzują się niską szybkością wzrostu wynoszącą,27 h -1, co daje czas podwojenia biomasy 11 dni [Szewczyk, 25; Szatkowska, 24], podczas gdy bakterie nitryfikujące charakteryzują się czasem podwojenia wynoszącym,73 doby [Błaszczyk i Rzeczycka, 26]. Wolny wzrost bakterii Anammox jest prawdopodobnie spowodowany małą szybkością asymilacji jonów amonowych. Zatem systemy, w których hodowane są kultury Anammox wymagają odpowiednio długiego czasu retencji biomasy. Bakterie K. stuttgartiensis są bardziej aktywne niż bakterie B. anammoxidans. W temperaturze 4ºC i przy ph 8, bakterie te charakteryzują się produkcją azotu cząsteczkowego wynoszącą odpowiednio 55 i 26,5 nmoli N 2 /(mg białka min) [Błaszczyk i Rzeczycka, 26; Khin i Annachhatre, 24]. Aktywność bakterii Anammox, wyrażona przez produkcję azotu cząsteczkowego na jednostkę masy białka, jest około 25 razy wyższa niż aktywność tlenowych nitrozobakterii, utleniających jony amonowe w warunkach sprzyjających procesowi denitryfikacji oraz jest ponad 7 razy niższa niż aktywność nitrozobakterii utleniających jony amonowe w warunkach tlenowych [Błaszczyk i Rzeczycka, 26]. Potencjał termodynamiczny reakcji Anammox wynosi 357 kj/mol i jest korzystniejszy od potencjału termodynamicznego procesu nitryfikacji, wynoszącego 275 kj/mol [Jetten et al., 21]. 1.3.3 Wpływ różnych czynników na proces Anammox Wiele parametrów wpływa hamująco na przebieg procesu Anammox. Aktywność procesu jest ściśle zależna od wartości parametrów takich jak stężenie tlenu rozpuszczonego, temperatura czy ph. Na przebieg procesu wpływa również obecność różnego rodzaju związków chemicznych znajdujących się w ściekach [Helmer et al., 21; Van Dongen et al., 21; Wyffels et al., 23; 25

Szatkowska et al., 24]. Jednak jak do tej pory wpływ większości związków chemicznych na przebieg procesu Anammox wciąż nie jest poznany. Poniżej omówiono czynniki wpływające na ten proces. Wpływ temperatury Strous i współpracownicy stwierdzili najwyższą efektywność procesu Anammox w przedziale temperatur od 2 do 43ºC [Strous et al., 1999]. Natomiast Egli i współpracownicy wyznaczyli przedział temperatur od 1 do ºC, 43w którym stwierdzili aktywno ść bakterii Anammox. Za temperaturę optymalną do prowadzenia procesu uznali oni 37ºC. Powyżej 45 C zostaje zahamowana aktywność biologiczna bakterii Anammox - nie jest produkowany gazowy azot. Obniżenie temperatury do 37 C nie powoduje przywrócenia aktywności mikrobiologicznej. Natomiast temperatura równa 11 C powoduje 76%-owy spadek aktywności w porównaniu z aktywnością mikroorganizmów w temperaturze 37 C [Egli et al., 21]. Stwierdzono ponadto, że bakterie prowadzące proces Anammox w oceanach wykazują wysoką aktywność już ºC od [Błaszczyk 6 i Rzeczycka, 26]. Szatkowska i Płaza wykazały liniowy wzrost szybkości usuwania azotu w procesie Anammox w zakresie temperatur 2-35ºC [Szatkowska i Płaza, 26]. Optymalna temperatura dla kultury bakterii Anammox występujących w osadach morskich wynosi 15ºC [Dalsgaard i Thamdrup, 22]. Wpływ ph Jetten wyznaczył dla procesu Anammox optymalne wartości ph w przedziale 8,-8,5 [Jetten et al., 1999, 21]. Potwierdził te doniesienia Egli, który określił występowanie aktywności bakterii Anammox w przedziale tolerancji ph od 6,5 do 9, oraz wyznaczył optymalny poziom ph równy 8, [Egli et al., 21]. Podczas procesu Anammox jony H + wyprodukowane podczas częściowej nitryfikacji są zużywane do redukcji azotynów do gazowego azotu, co powoduje wzrost ph [Siegrist et al., 1998]. Fux stwierdził, że tak długo jak azot azotynowy jest obecny w mieszaninie reakcyjnej, ph rośnie w sposób ciągły do czasu jego wyczerpania [Fux et al., 22]. Wpływ tlenu rozpuszczonego Jest szereg prac, w których opisano badania nad wpływem stężenia tlenu rozpuszczonego na proces Anammox. Maksymalną wydajność procesu stwierdzono przy stężeniu tlenu rozpuszczonego około,3 mg/l w stałej temperaturze 32,5 o C [Szatkowska et al., 23]. Anammox jako proces anoksyczny ulega całkowitej inhibicji przy stężeniu tlenu rozpuszczonego około,5 %. [Hippen et al., 1997]. W warunkach ograniczonego natlenienia (<,5%) powstaje mieszana kultura aerobowych oraz anaerobowych oksydantów. Wówczas jony amonowe są bezpośrednio przekształcane do gazowego azotu, gdzie NO 2 -N pełni rolę produktu pośredniego [Third et al., 21]. Zastosowanie tego zjawiska 26

doprowadziło do rozwinięcia technologii CANON (Completely Autotrophic Nitrogen Removal Over Nitrite), która polega na symultanicznym utlenianiu azotu amonowego i usuwaniu azotu cząsteczkowego w pojedynczym, autotroficznym reaktorze [Hao et al., 22]. Hao stwierdził, że optymalne stężenie tlenu rozpuszczonego, przy którym następuje maksymalne usuwanie azotu jest ściśle związane z ASL (Ammonium Surface Load, ładunek azotu amonowego przypadający na jednostkę powierzchni błony biologicznej). Wyznaczył, że przy ASL równym 2 g N/m 2 d oraz DO równym 1,3 g/m 3 zużycie jonów amonowych wynosi około 94% [Hao et al., 22]. Wpływ związków azotowych W warunkach optymalnych maksymalna szybkość zużywania jonów amonowych wynosi 55 µmol NH 4 -N/g białka min. Stwierdzono, że proces Anammox przebiega z najwyższą wydajnością w zakresie początkowego stosunku NO 2 -N/NH 4 -N pomiędzy 1 a 1,5 [Van Niftrik et al., 24]. Bakterie katalizujące proces Anammox konsumują jony amonowe i azotynowe w proporcji około 1:1,3 [Schmidt et al., 23]. Zatem proces Anammox najlepiej nadaje się do usuwania azotu ze ścieków o takiej właśnie proporcji wymienionych jonów. Nadmiar jonów azotynowych w stosunku do amonowych wynika z faktu, iż część ich utleniana jest do azotanów podczas asymilacji dwutlenku węgla (patrz, reakcja 8). Przy stężeniu NO 2 -N wyższym niż 5 mm przez dłuższy okres (12 h), dochodzi do całkowitej utraty aktywności procesu Anammox. Proces ten może zostać przywrócony poprzez dodanie śladowych ilości produktów przejściowych procesu - hydrazyny oraz hydroksylaminy [Dalsgaard i Thamdrup, 22]. Aktywność bakterii B. anammoxidans oraz K. stuttgartiensis jest nieodwracalnie inhibitowana przez azotyny przy stężeniu odpowiednio powyżej 7 i 18 mg N/l po kilku dniach inkubacji [Schmidt et al., 23; Egli et al., 21]. Z kolei Van Hulle nie stwierdził inhibicji procesu Anammox przez NH 4 -N oraz przez NO 3 -N o stężeniach poniżej 1 g/l [Van Hulle, 25]. Wpływ związków organicznych W ściekach może znajdować się ogromna ilość różnorodnych substancji organicznych. Ponieważ ich wpływ na przebieg procesu oczyszczania ścieków nie zawsze jest obojętny bardzo ważne jest poznanie tego oddziaływania. Do tej pory prowadzono wiele badań określających wpływ różnych związków organicznych na przebieg procesu Anammox, a mimo to wpływ znacznej ilości związków nie jest wciąż poznany. Güven i inni [Güven et al., 25] badali wpływ związków organicznych na bakterie procesu Anammox. Wykazali, że alkohole takie jak metanol powodują utratę aktywności tych mikroorganizmów, podczas gdy kwasy karboksylowe są przez nie przyswajane. Najsilniejszy inhibitor procesu metanol już przy tak niskich stężeniach jak,5 mm prowadził do całkowitej 27

oraz nieodwracalnej utraty aktywności biologicznej. Natomiast kwasy organiczne takie jak kwas octowy oraz propioniowy są zużywane ze znaczną szybkością (około,8 nmol/min mg białka) przez oczyszczone komórki bakteryjne. Inne związki organiczne, takie jak glukoza, mrówczany oraz alanina, nie mają wpływu na aktywność mikrobiologiczną bakterii. Ponadto, stwierdzono brak istotnych zmian liczby komórek bakterii Anammox oraz bakterii denitryfikujących podczas 15 dniowego działania kwasem propioniowym [Güven et al., 25]. Van de Graaf z zespołem przeprowadził badania wpływu chloramfenikolu, ampicyliny, 2,4-dinitrofenolu oraz chlorku rtęci (II) na proces Anammox [Van de Graaf et al., 1995]. Zaobserwowano zahamowanie aktywności biologicznej mikroorganizmów Anammox w obecności ampicyliny. Również 2,4-dinitrofenol oraz chlorek rtęci (II) znane inhibitory fosforylacji oksydacyjnej - całkowicie zahamowały proces. Natomiast chloramfenikol ograniczył częściowo aktywność enzymów denitryfikacji. Ponadto stwierdzono, że szybkość utleniania jonów amonowych NH 4 -N była proporcjonalna do początkowej ilości osadu czynnego [Van de Graaf et al.,1995]. Chamchoi i współpracownicy [Chamchoi et al., 28] badali zależność efektywności procesu Anammox od wartości ChZT ścieków. Zaobserwowali oni wyraźny spadek aktywności bakterii Anammox przy wartości ChZT powyżej 3 mg O 2 /l, natomiast w przedziale wartości ChZT od 1 do 3 mg O 2 /l aktywność bakterii Anammox była bardzo podobna [39]. Spadek aktywności bakterii Anammox przy wartości ChZT powyżej 3 mg O 2 /l wynikał ze zwiększenia się udziału procesu denitryfikacji. 1.3.4 Zastosowanie procesu Anammox Proces Anammox został wykorzystany przy wdrażaniu nowych, ekonomicznych technologii usuwania związków azotowych ze ścieków. Wiele współpracujących ze sobą zespołów badawczych w całej Europie, które opracowywały metody kontroli procesu Anammox w skali laboratoryjnej doprowadziło do powstania oczyszczalni w skali ćwierć, pół i pełno technicznych, w których następuje usunięcie azotu w procesie Anammox. Połączenie częściowej nitryfikacji i procesu Anammox może być stosowane do usuwania azotu ze ścieków o wysokiej zawartości azotu amonowego generowanych podczas odwadniania przefermentowanych osadów lub z odcieków ze składowisk odpadów [Egli et al., 21; Gut et al., 23]. Może również znaleźć zastosowanie w oczyszczaniu ścieków przemysłowych np. z sektora spożywczego [Keller et al., 1997; Banas et al., 1999; Hippen et al., 21; Carrera et al., 23], oraz ścieków z hodowli zwierząt [Waki et al., 27]. Dotychczasowe badania zaowocowały wdrożeniem procesu Anammox w pełnej skali w kilku oczyszczalniach ścieków. W Hattingen (Niemcy) do usuwania związków azotowych ze ścieków o wysokich stężeniach jonów amonowych został w 24 roku wprowadzony proces Anammox. Wyżej wymieniona oczyszczalnia ścieków komunalnych zajmuje się odwadnianiem osadu 28

przefermentowanego z kilku mniejszych oczyszczalni ścieków komunalnych. Duże ładunki NH 4 -N usuwane są na drodze deamonifikacji z wykorzystaniem kultury bakterii Anammox rozwiniętej na pierścieniach Kaldnes jako nośniku błony biologicznej [Fux et al., 22]. W 24 roku w Holandii zostały uruchomione dwie instalacje w których oczyszczano ścieki przemysłowe (Lichteenvorde, Odburger). Pierwsza z nich jest zasilana strumieniem ścieków z garbarni, podczas gdy druga ściekami z przemysłu spożywczego (przerób ziemniaków). Do roku 26 zostały uruchomione następne instalacje, w Holandii (Rotterdam) i w Japonii (Mie) [Abma et al., 27; Manipura et al., 25; Alvarez, 27]. W Szwecji, bardzo intensywnie prowadzone były badania nad deamonifikacją wód osadowych (połączenie nitrytacji z procesem Anammox). Dotychczasowe badania pozwoliły na opracowanie metodyki i kontroli procesu prowadzonego z użyciem błony biologicznej na nośniku, jakim są pierścienie Kaldnes [Szatkowska et al., 23, 24; Płaza et al., 23; Gut et al., 23; Trela, 24]. Zaowocowało to wdrożeniem tego procesu w roku 27 do oczyszczania wód osadowych w oczyszczalni Himmerfjärden (Sztokholm) [Szatkowska, 27]. 1.4 Metody badania aktywności mikroorganizmów osadu czynnego Technologia osadu czynnego, znalazła najszersze zastosowanie spośród wszystkich technologii oczyszczania ścieków. Początkowo system ten został zaprojektowany w celu usuwania zanieczyszczeń organicznych ze ścieków, jednakże stopniowo, narzucane przez prawodawstwo coraz surowsze wymogi oczyszczania ścieków względem zawartości azotu oraz fosforu, doprowadziły do ulepszenia oraz rozwoju bardziej złożonej pod względem mikrobiologicznym biomasy osadu czynnego, zdolnego do biologicznego usuwania wszystkich substancji biogennych. Złożoność oraz różnorodność procesów zachodzących w osadzie czynnym spowodowała zapotrzebowanie na opracowanie prostych i szybkich metod oceny szybkości tych procesów. Częściowo zostało to rozwiązane poprzez opracowanie sensorów, elektrod, przy pomocy których można w sposób ciągły i zautomatyzowany monitorować i kontrolować zachowanie biomasy w procesach oczyszczania ścieków. zachodzących prawidłowo jak i w warunkach zakłóceń. Mierzone parametry procesu to tlen rozpuszczony (DO), ph, mętność czy przewodność właściwa [Van Rolleghem i Coen, 1995; Gernaey et al., 1998]. Jednakże, do określenia kondycji osadu czynnego oraz występowania czynników toksycznych bardzo pomocne są badania zmian aktywności mikroorganizmów osadu czynnego w funkcji czasu. Wykorzystuje się tu wiele różnorodnych testów biochemicznych np. oznaczenie aktywności dehydrogenaz, oznaczenie aktywności oddechowej czy oznaczenie aktywności w stosunku do elektrody glukozowej. 29

Testy biochemiczne wprowadzone zostały na początku lat 9-tych i zdobyły rangę standardowych oznaczeń do oceny kondycji fizjologicznej osadu czynnego i jego funkcyjnych grup drobnoustrojów (bakterii heterotroficznych, nitryfikujących, denitryfikujących oraz fosforowych) [Blok, 1974, Kristensen et al., 1991; Spanjers i Vanrolleghem, 1995, 1996; Kosińska, 25]. Są to następujące testy [Kristensen et al., 1991; Baczyński, 1998]: test uwalniania i poboru fosforu przez biomasę osadu czynnego (PRR- Phosphorus Release Rate), test szybkości zużycia azotu amonowego (AUR- Ammonia Uptake Rate), test szybkości zużycia azotanów (NUR- Nitrate Uptake Rate), test szybkości poboru tlenu przez biomasę (OUR- Oxygen Uptake Rate). Kristensen [Kristensen et al., 1991] przeprowadził charakterystykę funkcyjnych grup mikroorganizmów osadu czynnego oraz substratów w osadzie czynnym poprzez zastosowanie testów AUR, NUR oraz OUR. Stwierdził, iż testy te są cennym narzędziem do wykonania charakterystyki biomasy oraz substratów w ściekach. Leta i inni [Leta et al., 24] przeprowadzili badania dotyczące oceny biologicznego usuwania związków azotu oraz substancji organicznych ze ścieków pochodzących z garbarni. Średnie wartości szybkości nitryfikacji i denitryfikacji zostały określone przy użyciu testów AUR i NUR. Ponadto test AUR posłużył autorom jako narzędzie do oceny wpływu chromu (III) na proces nitryfikacji zachodzący w osadzie czynnym, który pokazał, iż metal ten, w stężeniu 85 mg/l powoduje 5% zahamowanie aktywności bakterii nitryfikujących. Natomiast Trela [Trela, 2] zastosował testy OUR i NUR do monitorowania aktywności osadu czynnego podczas badań nad zintensyfikowaniem procesu denitryfikacji, poprzez dodanie substancji organicznej. Kosińska [Kosińska, 25] przeprowadziła badania dotyczące wpływu określonego udziału ścieków przemysłowych z przetwórstwa spożywczego w ściekach komunalnych na proces biologicznego oczyszczania ścieków. Jako narzędzia służące do tej oceny wykorzystała testy AUR, NUR, PRR oraz OUR. Na podstawie przeprowadzonych testów PRR autorka stwierdziła, iż badane ścieki przemysłowe stanowiły źródło przyswajalnego węgla, niezbędnego w beztlenowych przemianach fosforu. Uwalnianie fosforu z biomasy przebiegało z podobną maksymalną prędkością (6,11mg P/g smo * h) dla ścieków komunalnych oraz dla ścieków komunalnych z 2% udziałem ścieków z przetwórstwa ziemniaków (6,1mg P/g smo * h). Niemniej, średnia prędkość uwalniania fosforu w takim samym czasie (3,5 h) przy dodatku ścieków przemysłowych była ponad dwukrotnie większa, niż w przypadku samych ścieków komunalnych. Podobnie, pobór fosforu przez osad czynny w warunkach tlenowych dla ścieków mieszanych w takim samym czasie (2,5 h) charakteryzowała średnia szybkość, większa o ok. 35% w stosunku do układu odniesienia (wyłącznie ścieki komunalne). Do podobnych wniosków doszła autorka analizując otrzymane wyniki w testach NUR, AUR oraz OUR. Ścieki spożywcze (z przetwórstwa ziemniaków) w stosowanych ilościach nie stanowiły czynnika toksycznego oraz nie powodowały hamowania procesu nitryfikacji i 3

denitryfikacji, a także szybkości poboru tlenu. Kosińska stwierdziła, iż testy biochemiczne są przydatnym narzędziem do szybkiej porównawczej oceny funkcjonowania osadu czynnego w zakresie jednostkowych procesów biologicznego oczyszczania ścieków. 1.4.1 Ocena aktywności osadu czynnego z wykorzystaniem testów OUR Pomiary respirometryczne są często stosowaną techniką służącą do określenia kondycji osadu czynnego. Szybkość poboru tlenu jest jednym z ważniejszych czynników służących do oceny biologicznej aktywności w procesach osadu czynnego. Podstawowe parametry takie jak biochemiczne zapotrzebowanie na tlen, toksyczność zanieczyszczeń oraz zapotrzebowanie na tlen mogą być oszacowane na podstawie szybkości respiracji w komorach napowietrzania. Ponadto pomiary szybkości poboru tlenu przez osad czynny zawierają cenną informację o dynamice biologicznych procesów zachodzących w komorze osadu czynnego [Suescrun et al., 1998]. Należy podkreślić istotną różnicę pomiędzy oddychaniem komórkowym a zużywaniem tlenu przez komórki. W procesach oddychania komórkowego glikolizy i fermentacji związki pokarmowe są utleniane bez udziału tlenu atmosferycznego. Podczas tlenowego procesu utleniania związków pokarmowych w komórce następuje zużycie tlenu w komórkach, przez co uwalniana jest energia i wydzielany dwutlenek węgla. Stąd też pojęcie zużycia tlenu jest znacznie węższe [Giese et al., 1985]. Zużycie tlenu, czyli OUR, mierzy się poprzez oznaczenie objętości zużytego tlenu w standardowych warunkach (ciśnienie, temperatura) na jednostkę masy organizmu i jednostkę czasu. Testy OUR (Oxygen Uptake Rate) służą do wyznaczenia szybkości respiracji osadu czynnego i dostarczają informacji o kondycji osadu czynnego i mikroorganizmów biorących udział w podstawowych procesach biologicznego oczyszczania ścieków. Osad czynny napowietrza się wstępnie do odpowiedniego poziomu stężenia tlenu 8-12 g O 2 /m 3, następnie aerację wstrzymuje się, natomiast osad nadal poddaje się mieszaniu. Szybkość poboru tlenu przez mikroorganizmy osadu czynnego wyznacza się z nachylenia linii trendu krzywej zależności stężenia tlenu od czasu. Z krzywej tej określa się ubytek zawartości rozpuszczonego tlenu, a na tej podstawie oblicza się aktywność oddechową biomasy osadu [Kristensen et al., 1991]. Szybkość respiracji osadu na poziomie 2-4 g O 2 /(kg smo * h) oznacza, że osad jest aktywny, zawiera dużo żywych mikroorganizmów. Świadczy to również o tym, że osadowi jest dostarczona wystarczająca ilość substratu substancji organicznych. Niska szybkość respiracji (5-1 g O 2 /(kg smo * h) może dostarczyć dodatkowych informacji, np. o zatruciu osadu, o braku łatwo rozkładalnych substancji organicznych lub, że osad został ustabilizowany [Pawlaczyk-Szpilowa, 198.] Richard [Richard, 23] posłużył się testami OUR w celu określenia przyczyny mikrobiologicznych problemów osadu czynnego związanych ze słabym formowaniem się kłaczków, toksycznym wpływem dużej ilości kwasów organicznych, niedoborem nutrientów, pęcznieniem i pienieniem się osadu oraz próby kontroli i przywrócenia pierwotnej aktywności osadu czynnego. 31

Zdaniem autora, testy OUR są bezcennym narzędziem dla zrozumienia i usunięcia problemów występujących w komorach osadu czynnego. Przedmiotem badań Ning et al. [Ning et al., 2] było zidentyfikowanie i oznaczenie ilościowe związków azotu w osadzie czynnym. Autorzy wykorzystali test szybkości poboru tlenu w celu oszacowania czy osad czynny jest ubogi w azotowe substancje odżywcze oraz do określenia ilości azotu potrzebnego do uzupełnienia tego składnika w osadzie czynnym w celu zapewnienia optymalnych warunków. Autorzy powyższych badań stwierdzili, iż testy OUR są odpowiednią metodą do ilościowego określenia azotowych substancji odżywczych w osadzie czynnym. Na kinetykę zużywania tlenu wpływają: temperatura, odczyn, liczebność i stan fizjologiczny obecnych organizmów. Substancje lotne mogą ulec wydmuchiwaniu podczas napowietrzania próbki. Pomiary szybkości zużywania tlenu mogą służyć do badania krótkotrwałego działania na osad czynny poszczególnych substancji występujących w danych ściekach. Przy badaniu osadu czynnego stosowanego do oczyszczania ścieków przemysłowych można otrzymać zbyt wysokie wartości aktywności na skutek zużycia tlenu przez substancje redukujące, jak np. żelazo (II), siarczki, siarczyny i tiosiarczany. Na wyniki oznaczeń mogą też wpływać substancje utleniające [Hermanowicz i Dojlido, 1999]. Testy OUR można stosować do określenia aktywności bakterii nitryfikujących i heterotroficznych. Surmacz-Górska i inni [Surmacz-Górska et al., 1996] prowadzili badania monitujące przebieg procesu nitryfikacji w oparciu o test OUR, przy jednoczesnej regulacji procesu utleniania jonów NH + 4 i NO - 2. Metoda pomiaru opierała się na dodawaniu kolejno NaClO 3 i allilotiomocznika (ATU), selektywnych inhibitorów bakterii, odpowiednio Nitrobacter i Nitrosomonas. Pierwszy z nich, NaClO 3 jest inhibitorem bakterii Nitrobacter i nie wywiera on negatywnego wpływu na utlenianie jonów amonowych przez bakterie Nitrosomonas. Natomiast inhibicja nitryfikacji przez ATU polega na hamowaniu I etapu nitryfikacji prowadzonego przez bakterie Nitrosomonas. W trakcie pomiarów osad czynny napowietrzano do wartości 8 mg O 2 /l i szczelnie zamykano. W tym czasie tlen był zużywany przez wszystkie grupy bakterii. Kiedy stężenie tlenu rozpuszczonego zmniejszyło się do około 3 mg O 2 /l dodawano NaClO 3 w ilości 2,13 g/l w celu zahamowania aktywności bakterii Nitrobacter. Natomiast, gdy poziom tlenu zmniejszył się o kolejne 2 mgo 2 /l aplikowano ATU w stężeniu 5 mg/l (zahamowanie aktywności bakterii Nitrosomonas). Stężenie tlenu mierzono za pomocą elektrody tlenowej połączonej z urządzeniem rejestrującym. Ilość tlenu potrzebnego do utlenienia NO - 2 autorzy wyznaczali z różnicy między całkowitym OUR a OUR zmierzonym po dodaniu NaClO 3. Natomiast ilość tlenu pobranego przez bakterie Nitrosomonas do utlenienia NH + 4 wyznaczano z różnicy miedzy OUR po dodaniu NaClO 3 a OUR zmierzonym po dodaniu obu inhibitorów, który to z kolei wskazuje na ilość tlenu pobranego przez bakterie heterotroficzne. Obszar działania selektywnych inhibitorów pokazano na rysunku 7. 32

Rys. 7 Schemat działania selektywnych inhibitorów nitryfikacji [Surmacz-Górska et al., 1996] Gut i inni [Gut et al., 26] przeprowadzili ocenę aktywności bakterii biorących udział w utlenieniu azotu amonowego i azotynowego w systemie dwustopniowego procesu deamonifikacji. Wykonano trzynaście serii testów OUR w celu ilościowego i jakościowego określenia bakterii utleniających NH 4 -N i NO 2 -N oraz bakterii heterotroficznych. Badania obejmowały pomiar całkowitej nitryfikacji oraz poszczególnych etapów nitryfikacji po zastosowaniu selektywnych inhibitorów. Zahamowanie aktywności bakterii Nitrobacter uzyskano za pomocą NaClO 3 (przy stężeniu 17 mm/l), natomiast bakterii Nitrosomonas po zastosowaniu ATU (przy stężeniu 43 μm/l). Testy OUR posłużyły Cui i innym [Cui et al., 25] jako narzędzie do oceny negatywnego wpływu niektórych substancji na proces utleniania azotu amonowego przez bakterie Nitrosomonas europea. Badanymi inhibitorami były ATU, fenol, tioacetamid oraz tiomocznik, a wyznaczone dla nich wartości EC 5 wyniosły odpowiednio,18; 1,1;,27 oraz,1 mg/l. 1.4.2 Oznaczanie aktywności drobnoustrojów z wykorzystaniem sztucznych akceptorów Reakcje rozkładu zanieczyszczeń obecnych w osadzie czynnym przebiegają z udziałem enzymów występujących w komórkach drobnoustrojów. Dlatego efektywność utleniania substratów jest zależna od aktywności enzymów łańcucha oddechowego mikroorganizmów [Glikeboom, 1999]. Jednym z enzymów katalizujących utlenianie substancji organicznych są dehydrogenazy enzymy z grupy oksydoreduktaz, które biorą udział w procesach utleniania komórkowego. Katalizują one reakcje odwodorowania substratu i przenoszenia protonów i elektronów na dalsze ogniwa łańcucha oddechowego. Metoda oznaczania aktywności dehydrogenaz służy do oceny aktywności biochemicznej mikroorganizmów w procesach utleniania związków organicznych, a dzięki temu do kontroli 33

prawidłowości przebiegu procesu oczyszczania ścieków oraz określania stopnia adaptacji osadu czynnego do ścieków przemysłowych [Pawlaczyk-Szpilowa, 1978]. W przypadkach pogarszania się efektu oczyszczania ścieków, pomiar aktywności dehydrogenaz daje podstawę do wprowadzania zmian parametrów technicznych. Jedno z najszerszych zastosowań oznaczania aktywności dehydrogenaz w osadzie czynnym znalazła metoda z wykorzystaniem chlorku 2,3,5-trójfenylotetrazoliowego (TTC). Sumę reakcji utleniania substancji organicznych, katalizowanych przez dehydrogenazy, można stwierdzić za pomocą redukcji TTC (chlorku trifenylotetrazoliowego) do TF (TTCH 2 -trifenyloformazanu) zwanego testem TTC (równanie 9) [Buraczewski, 1973]. Test TTC jako pierwszy wprowadził Lenhard [Lenhard, 1956]. Temat rozwinęli Casida et al. [Casida et al., 1964] i Thalmann [Thalmann, 1968]. Tlen i światło są czynnikami zakłócającymi oznaczenie. (9) Reakcja odwodorowania substratów przez dehydrogenazy zachodzi podczas inkubacji odtlenionych próbek w określonym czasie, temperaturze i odczynie. Intensywność zabarwienia próbki oznacza się spektrofotometrycznie. Ze względu na trudności w określaniu żywej biomasy, oznaczane są zawartości zawiesin ogólnych badanego osadu, w skład których wchodzą żywe organizmy i zawiesiny. Jako wynik oznaczenia przyjmuje się iloraz ilości trifenyloformazanu do zawartości zawiesin ogólnych. Z badań Upadhyaya i Eckenfeldera wynika, że stężenie TF rośnie wraz ze wzrostem obciążenia osadu czynnego i wynosi od 2 25 do 3 7 μmoli TF/g smo i zależy od obciążenia osadu czynnego substancjami organicznymi zawartymi w ściekach i od rodzaju tych substancji [Thalmann, 1968]. Zhao i Li [Zhao i Li, 1999] zastosowali test TTC do określenia stopnia inhibicji odcieku z wysypiska śmieci na aktywność mikroorganizmów osadu czynnego. Odciek zawierał azot amonowy w stężeniu 5 g/l. Wykonano dwa doświadczenia. W pierwszym z nich, syntetyczne ścieki zawierające glukozę zmieszano z odciekiem. Wyniki doświadczenia wykazały spadek aktywności dehydrogenaz osadu od około 11 do 4,2 μg TF/ MLSS (mixed liquor suspended 34

solids zawiesina osadu czynnego), przy jednoczesnym wzroście stężenia azotu amonowego od 5 do 8 mg/l. W drugim doświadczeniu próbki ścieków zmieszane z odciekiem i glukozą umieszczono w reaktorze do biologicznego oczyszczania ścieków. Aktywność dehydrogenaz zmalała od 9,29 do 4,93 μg TF/mg MLSS, podczas gdy ężenie st azotu amonowego wzrosło tak samo jak w poprzednim doświadczeniu. Jak pokazują wyniki, dzięki zastosowaniu testu TTC stwierdzono znaczącą inhibicję aktywności dehydrogenaz osadu czynnego, co wskazało na konieczność redukcji zawartości azotu amonowego w odcieku, przed poddaniem go biologicznemu oczyszczaniu. Le Bihan i Lessard [Le Bihan i Lessard, 1998] przy pomocy testu TTC badali aktywność dehydrogenaz mikroorganizmów podczas oczyszczania ścieków na biofiltrach. Zbadano zależność aktywności tych enzymów od zawartości zawiesiny organicznej (smo) i od chemicznego zapotrzebowania na tlen, ChZT. Wyniki dowodzą, że aktywność dehydrogenaz była zależna od zawartości biomasy i substratów w wodzie oczyszczanej na filtrach. Zależała ona również od szybkości filtracji, a także od składu ścieków. Inną metodą oznaczania aktywności dehydrogenaz jest metoda INT, którą opracowali Benefield i współpracownicy [Benfield et al., 1977] oraz Trevors i współpracownicy [Trevors et al., 1982]. Wprowadzili INT (chlorek 2-p-jodofenylo-3-p-nitrofenylo-5-fenylotetrazoliowy) jako akceptor wodoru przy oznaczaniu aktywności dehydrogenaz. Porównywano ze sobą testy INT i TTC. Wykazano, że oznaczenia aktywności dehydrogenaz przy pomocy INT mają większą czułość [Gong, 1997]. Mosher i inni [Mosher et al., 23] udoskonalili metodę oznaczania aktywności dehydrogenaz za pomocą testu INT. Wcześniejsze publikacje donoszą, że związki takie jak WWA (wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne) czy metale występujące w osadzie zakłócały znacznie proces ekstrakcji zredukowanej formy INT, czyli INTF. W zmodyfikowanej metodzie badacze użyli acetonitrylu do ekstrakcji INF z osadu. Wcześniej używany do ekstrakcji N,Ndimetyloformamid, aceton czy formalina powodowały chemiczną redukcję INT, co nie pozwalało na uzyskanie miarodajnych wyników aktywności dehydrogenaz. Proces przebiegał z większą wydajnością i nie powodował dodatkowej redukcji INT [Mosher et al., 23]. Uzupełnieniem do stosowanych metod oznaczania aktywności enzymatycznej jest określenie aktywności katalazowej, enzymu biorącego czynny udział w rozkładzie toksycznego nadtlenku wodoru, powstającego w końcowym etapie oddychania komórkowego u wielu drobnoustrojów [Pawlaczyk-Szpilowa, 198]. Nadtlenek wodoru jest silnym inhibitorem enzymów, dlatego bakterie wytwarzają enzymy katalizujące rozkład nadtlenku wodoru - katalazę. Jest ona enzymem wewnątrzkomórkowym, wytwarzanym w cytoplazmie i peroksysomach. Metoda określenia aktywności katalazowej polega na dodaniu do zawiesiny bakterii osadu czynnego nadtlenku wodoru, który jest substratem dla enzymu katalazy. Pozostały, nierozłożony przez katalazy nadtlenek wodoru odmiareczkowuje się nadmanganianem potasu w środowisku kwaśnym. Aktywność katalazy wyraża się w µmol H 2 O 2 /g smo min [Brzezińska, 26]. 35

2 Farmaceutyki w środowisku 2.1 Źródła zanieczyszczeń substancjami farmaceutycznymi Według danych z raportu o firmach farmaceutycznych zarejestrowanych w Polsce, przygotowanego przez Centrum Transferu Technologii w Gdańsku, w oparciu o dane ze stanu rejestru postaci farmaceutycznych na dzień 3.9.22 roku Ministerstwa Zdrowia [Chmiel i Grudziński, 1998; Bazy Danych MP, 26], w Polsce jest zarejestrowanych około 8 różnych farmaceutyków, z czego około 35 jest produkowanych przez polskie firmy farmaceutyczne. Z pośród 13 rodzajów dostępnych antybiotyków, 9 jest zarejestrowanych w Polsce z przeznaczeniem do lecznictwa ludzi, natomiast w żywieniu zwierząt gospodarskich znalazło zastosowanie 2, z których jedynie kilka jest zarejestrowanych w Polsce. Zarówno antybiotyki jak i chemoterapeutyki są substancjami o aktywności biobójczej, jednak antybiotyki są wytwarzane przez mikroorganizmy (bakterie i grzyby) lub uzyskane na drodze półsyntetycznej bądź syntetycznej, ale mające naturalny wzorzec. Natomiast chemoterapeutyki są wytwarzane na drodze syntezy chemicznej, czyli nie posiadają naturalnego wzorca. Wysokie zużycie antybiotyków naturalnych i syntetycznych powoduje, że substancje te są rozpowszechnione w przyrodzie. Zużycie antybiotyków oraz chemoterapeutyków w Europie w roku 21 przedstawia Rys. 8 [Elseviers et al., 21a, 21b]. Jak widać, wśród nich sulfonamidy stanowią około 4-15%, zależnie od kraju (w Polsce około 15%). Powyższe związki są często odporne na biodegradację, a ich długotrwała obecność w ściekach, w szczególności pochodzących z przemysłu farmaceutycznego, ale także bytowych może powodować zakłócenia procesów biologicznego oczyszczania ścieków, w tym procesów nitryfikacji oraz denitryfikacji. Zużycie w DID * 25 2 15 1 5 FI FR BE PL GRLU HR SI DK SK SE HU NO Kraj cefalosporyny tetracykliny makrolidy penicyliny chinolony inne sulfonamidy Rys. 8 Zużycie antybiotyków w szpitalach oraz w lecznictwie ambulatoryjnym w Europie w 21 roku * DID dawka dobowa na 1 mieszkańców [Elseviers, 21a, 21 b] 36

Leki są z natury substancjami biologicznie czynnymi, skonstruowanymi w taki sposób, by wywołać konkretny efekt biologiczny. Są często odporne na biodegradację, jako że stabilność metaboliczna jest niezbędna do ich skutecznego działania. Rysunek 9 przedstawia możliwe ścieżki migracji farmaceutyków w przyrodzie, od miejsca ich powstania w fabrykach przemysłu farmaceutycznego aż w ostateczności do środowiska wodnego [Halling-Sørensen et al., 1998; Metcalfe et al., 23]. Farmaceutyki mogą być stosowane w medycynie lub/i w weterynarii, toteż ich ścieżki migracji w środowisku są różne (Rys. 9). Zarówno ścieki z przemysłu farmaceutycznego zawierające półprodukty lub pozostałości leków po wcześniejszym podczyszczeniu, jak też ścieki bytowe, zawierające leki i ich metabolity, wraz z moczem i fekaliami trafiają bezpośrednio do systemu kanalizacji i odprowadzane są do oczyszczalni ścieków (Rys. 9 ścieżka 1 i 8) [Metcalfe et al., 23]. Substancje farmaceutyczne stosowane w weterynarii można podzielić na: składniki pasz zwierząt hodowlanych stymulujące ich wzrost, bądź hamujące rozwój niektórych mikroorganizmów np. ziarniaków w hodowli drobiu (Rys. 9, ścieżka 11), leki stosowane doraźnie w przypadku chorób (Rys. 9, ścieżka 1), substancje medyczne stosowane jako dodatek do karmy w hodowli ryb (Rys. 9, ścieżka 9) Substancje medyczne stosowane jako pożywki w hodowli zwierząt oraz terapeutyki są wydalane z ich organizmów w postaci niezmienionej lub w postaci metabolitów (Rys. 9, ścieżki 19, 2, 21). Wraz z nawozem naturalnym (stosowanym w rolnictwie, leśnictwie itp.) mogą być wprowadzane do gruntu (Rys. 9, ścieżka 22), w wyniku, czego powstają lokalnie wysokie stężenia antybiotyków w glebie, skąd mogą się przedostawać do środowiska wodnego (Rys. 9, ścieżki 24, 25). Natomiast dodatki antybiotyków do pokarmu ryb są dawkowane bezpośrednio do stawów hodowlanych, gdzie są częściowo spożywane i wydalane przez ryby, ale większa część z nich opada i ulega akumulacji na dnie lub trafia dalej, do innych akwenów w przypadku zbiorników połączonych (Rys. 9, ścieżki 17, 18). Niektóre farmaceutyki lub ich metabolity są także dobrze rozpuszczalne w wodzie. Wysoka rozpuszczalność w połączeniu z długim okresem biodegradacji bądź też nawet z jej brakiem może znacznie ograniczać ich usuwanie podczas oczyszczania ścieków. Jednak większość substancji farmaceutycznych ma właściwości lipofilowe i jest odporna na biodegradację, toteż antybiotyki są wykrywane na całym świecie w ściekach oczyszczonych [Batt and Aga, 25; Carballa et al., 24; Costanzo et al., 25; Miao et al., 24]. 37

Rys. 9 Ścieżki przepływu substancji farmaceutycznych w przyrodzie [Halling Sørensen et al., 1998] 38

Tradycyjne oczyszczalnie ścieków nie są zaprojektowane i dostosowane do usuwania niskich stężeń takich zanieczyszczeń jak farmaceutyki. Z tego względu ich część pozostaje w ściekach oczyszczonych i trafia do odbiorników wodnych (Rys. 9, ścieżka 14, 15), a część wraz z osadem ściekowym może być wprowadzana do gleby (Rys. 9, ścieżki 12, 13). W ten sposób farmaceutyki nieustannie przedostają się do środowiska, wpływając na jego faunę i florę [Glassmeyer et al., 25; Kolpin et al., 22; Stumpf et al., 1999]. Rabølle oraz Spliid [Rabølle i Spliid, 2] badali sorpcję oraz migrację czterech antybiotyków w różnych rodzajach gleb. Wykazali znaczne różnice w mobilności antybiotyków w zależności od ich indywidualnych zdolności adsorpcyjnych. Stwierdzili, że oksytetracyklina oraz Tylozyna silnie adsorbują się w glebie i nie przenikają do odcieków przez piaski oraz iły piaszczyste, czyli wykazują niższą mobilność niż słabo adsorbujące się Metronidazol oraz Olaquinedox (chinon), które bardzo szybko przedostają się do odcieku bez względu na rodzaj gleby. Natomiast, Boxall i inni badali transport w wodach powierzchniowych i gruntowych sulfonamidów, takich jak sulfonamid i sulfachloropirydazyna [Boxal et al., 22]. Badania wykazały, że podobnie jak inne sulfonamidy, również sulfachloropirydazyna wykazuje niski potencjał sorpcyjny i jest wysoce mobilna, czyli z łatwością przedostaje się do środowiska wodnego. Wykazano jednak, że stężenie związku w wodach powierzchniowych wynosi poniżej 1 μg/l, pomimo oczekiwanej wysokiej wartości. Prowadziło to do wniosku, że sulfachloropirydazyna jest degradowana w glebie. Wykazano nieznaczny wpływ ph gleby na przepływ badanych sulfonamidów w ziemi gliniastej. Występowanie w środowisku wybranych substancji farmaceutycznych o działaniu biobójczym przedstawiono w tabeli 2 [Halling-Sørensen et al., 1998]. 39

Tab. 2 Występowanie wybranych antybiotyków w środowisku [Kumerer, 29, Halling-Sørensen et al., 1998] Antybiotyk Działanie Stężenie w środowisku Warunki Literatura Stosowane w medycynie Bleomycyna Cyklofosfamid Erytromycyna Ifosfamid Grupy penicylinowe Sulfametoksazol Tetracyklina Antybiotyk przeciwnowotworowy Antybiotyk cytostatyczny z grupy oksazofosforyn o działaniu alkilującym stosowany w chemioterapii Antybiotyk Antybiotyk cytostatyczny, syntetyczny analog Cyklofosfamidu Antybiotyki Chemoterapeutyk Antybiotyk 11 19 ng/l < 5-17 ng/l 5-13 ng/l 146 ng/l (szacowany 1-1 μg/l) ~1μg/l do 17 ng/l do 49 ng/l do 6 ng/l 24 ng/l (szacowany 1-1 μg/l) >25 ng/l >1 ng/l do 2 ng/l ~1μg/l do 37 ng/l do 163 ng/l do 41 ng/l ~1μg/l do 2 ng/l do 11 ng/l Kanał zrzutowy z oczyszczalni ścieków Woda rzeczna Woda pitna Oczyszczone szpitalne odcieki z oczyszczalni ścieków Woda rzeczna Wody powierzchniowe Wody gruntowe Oczyszczone szpitalne odcieki z oczyszczalni ścieków Woda rzeczna Woda pitna Kanał zrzutowy z oczyszczalni ścieków Woda rzeczna Kanał zrzutowy z oczyszczalni ścieków Wody powierzchniowe Wody gruntowe Woda rzeczna Kanał zrzutowy z oczyszczalni ścieków Wody powierzchniowe Aherne et al., 199 Steger Hartman et al., 1996 Watts et al., 1983 Kolpin. et al., 22 Sacher, 22 Hirsch et al., 1999 Steger Hartman et al., 1996 Richardson i Brown, 1985 Faber, 22 Watts et al., 1983 Alexy et al., 26 Sacher et al., 22 Watts et al., 1983 Faber, 22 Kolpin et al., 22 Stosowane w weterynarii Oksytetracyklina Antybiotyk dodawany do pożywienia ryb,1-11μg/g osadu 285 μg/g osadu do 34 ng/l Sulfanilamid Chemoterapeutyk Do 1 ng/l Do 4 ng/l Do 2 ng/l Osad Osad Wody powierzchniowe Kanał zrzutowy z oczyszczalni ścieków Wody powierzchniowe Wody gruntowe Coyone et al., 1994 Poliquen et al., 1993 Weston et al., 1994 Kerry et al., 1995 Samuelsen et al., 1992 Kolpin et al., 22 Faber, 22 Alexy et al., 26 Sulfadiazyna Chemoterapeutyk Do 17 ng/l Wody gruntowe Sacher et al., 22 4

2.2 Wpływ substancji farmaceutycznych na środowisko naturalne Substancje lecznicze zwykle występują w środowisku w niskich stężeniach, jednak ich negatywny wpływ na ekosystemy nie może być wykluczony bez wystarczających badań. O wpływie na środowisko substancji bakteriostatycznych i bakteriobójczych decydują stężenia, ale wpływ na organizmy żywe jest różny dla gatunków z różnych poziomów łańcucha pokarmowego (tzn. jest inny dla mikroorganizmów, fitoplanktonu czy skorupiaków). 2.2.1 Toksyczność Toksyczność wybranych substancji bakteriostatycznych przedstawia tabela 3 [Halling-Sørensen et al., 1998; Bazy Danych MP, 26; Slugaj et al., 24; Ternes i Joss, 26]. Poniżej, przytoczono wnioski z niektórych badań. Harrass i inni [Harrass et al., 1985] wykazali, że Streptomycyna ogranicza wzrost 6 gatunków sinic przy stężeniach antybiotyku w zakresie,9 do,86 mg/l. Natomiast Chlorella vulgaris, Scenedesmus obliguus oraz gatunek Ulothrix rozwijają się w stężeniach poniżej 21 mg/l, podczas gdy ograniczenie wzrostu Chlamydomonas reinhardtii obserwowano już przy stężeniu,66 mg/l. Subletalne stężenie streptomycyny spowalniało lub wstrzymywało rozwój tych organizmów [Harrass et al., 1985]. Lanzky oraz Halling-Sørensen [Lanzky i Halling-Sørensen, 1997] badali wpływ metronidazolu na zielenice gatunku Chlorella. Wykazali, że stężenie EC 5 p powodujące powstanie 5% przyżyciowego efektu testowego tego chemioterapeutyku na te organizmy wynosiło 12,5 mg/l, a EC 1 wynosiło 2,3 mg/l [Lanzky i Halling-Sørensen, 1997]. Również antybiotyki z grupy tetracyklin były badane pod względem fitotoksyczności. Pierwsze badania przeprowadził Batchelder, a swoje wyniki opublikował w latach 1981-82 [Batchelder 1981, 1982]. Wykazał, że chlorotetracyklina oraz oksytetracyklina wykazują najwyższą toksyczność względem Phaseolus vulgaris L. (Fasola zwykła) objawiającą się poprzez redukcję świeżej masy oraz zakłócenie poboru mikroelementów: Ca, K oraz Mg [Jjemba, 22; Batchelder, 1982]. Jednak wpływ tych substancji był różny względem różnych gatunków roślin. Na podstawie testów bioindykacyjnych wykonanych na pierwotniakach Spirostomum ambiquum i Tetrahymena termophila stwierdzono niską toksyczność szeregu wybranych leków biobójczych, zwłaszcza sulfonamidów. Sulfonamidy były nietoksyczne w stężeniu nie przekraczającym 1 mg/l [Nałęcz-Jawecki i Sawicki, 23]. Marcí [Marcí et al., 1988] badał ostrą toksyczność Furazolidonu oraz 3-[(5-Nitrofurfurylideno) amino)]2-oksazolidonu, antybiotyków stosowanych powszechnie w hodowli ryb. Wykazał znaczący toksyczny wpływ tych substancji na skorupiaki Daphnia magna oraz mniejszą toksyczność wobec skorupiaków z gatunku Artemia salina [Marcí et al., 1988]. Z kolei Migliore [Migliore, 1997a] udowodnił toksyczny wpływ wybranych antybiotyków na Artemia salina. Wykazał, że spośród 42

badanych antybiotyków Bacytracyna i Flumequine wykazują najsilniejszą toksyczność. Bacytracyna hamuje wylęg larw, natomiast Flumequine znacznie zmienia pigmentację postaci młodocianych. Najmniejszy toksyczny wpływ na Artemia salina wywiera erytromycyna [Migliore, 1997a]. Z kolei badania prowadzone na Daphnia magna wykazały toksyczny wpływ Bacytracyny (EC 5 po 48 h w przedziale 3-5 mg/l), Metronidazolu ( EC 24h 5 = 4,6mg/l), Oksytetracykliny ( EC 24h 5 około 1mg/l), Streptomycyny ( EC 24h 5 = 487mg/l), Sulfadiazyny ( EC 24h 5 = 221mg/l) oraz Tetracykliny (NOEC = 34mg/l). Antybiotyki te są powszechnie dodawane do pożywek w hodowlach rybnych. Substancje te wpływają niekorzystnie na zdolności reprodukcyjne Daphnia magna [Wollenberger et al., 2]. Lee oraz Arnold badali toksyczne efekty odpadów farmaceutycznych zrzucanych do oceanów na skorupiaka Amphipod - Amphithoe valid [Lee i Arnold, 1983]. Stwierdzili, że toksyczny wpływ wzrasta wraz z wydłużaniem się okresu ekspozycji organizmu na badane substancje. Skorupiak ten, chronicznie wystawiony na kontakt ze ściekami o stężeniu powyżej 1%, wykazywał w porównaniu z grupami kontrolnymi mniejszą przeżywalność oraz obniżenie zdolności rozrodczych. Natomiast stężenie 3% dawało 1% śmiertelności osobników po 3 tygodniach, podczas gdy grupa wystawiona na stężenie substancji farmaceutycznych poniżej 2% zdolna była przeżyć w tych warunkach powyżej 2 miesięcy. Postacie młodociane wystawione na te warunki wykazywały mniejsze zdolności przeżycia. [Lee i Arnold, 1983; Halling-Sørensen et al., 1998]. Bauger [Bauger et al., 2] badał wpływ Oksytetracykliny oraz Tyrozyny, antybiotyku stosowanego w hodowli zwierząt, na trzy gatunki organizmów gleby: dżdżownic, skoczogonków oraz Enchytraeidae E. crypticus. Otrzymane wyniki doprowadziły do wniosku, że badane substancje mają niską toksyczność względem tych zwierząt. Najniższy znaczący efekt obserwowano przy stężeniu 3 mg/kg, jakkolwiek często nie stwierdzano żadnego efektu przy najwyższym testowym stężeniu 5 mg/kg. Toksyczny wpływ badanych antybiotyków na zdolności reprodukcyjne był znacznie wyższy, niż na zdolność przeżycia [Bauger et al., 2]. Toksyczność ostrą (LD 5 ) Furazolidonu, stosowanego głównie jako lek w pożywkach używanych w hodowli ryb, wyznaczono na poziomie 4 mg/kg larw komarów gatunku Culex pipiens molestus [Marcí et al., 1998]. Stwierdzono również negatywny wpływ Avercyny (leku stosowanego do leczenia bydła) oraz jej pochodnych na owady degradujące odchody zwierzęce, co przejawia się spowolnieniem rozkładu odchodów zwierząt hodowlanych [Halling- Sørensen et al., 1998; Marcí et al., 1998]. W pszczelarstwie szczególnie niebezpiecznymi są dość powszechnie stosowane w lecznictwie weterynaryjnym sulfonamidy, które mogą prowadzić do poważnego skażenia miodu. W krajach unijnych oraz w Polsce nie dopuszcza się obecności tych związków w miodzie [Szczęsna, 24]. 43

Tab. 3 Toksyczny wpływ wybranych substancji bakteriostatycznych [Halling- Sørensen et al., 1998; Bazy leków Medycyny Praktycznej, 26; Slugaj et al., 24; Ternes i Joss, 26] Antybiotyk Działanie Organizm testowy Toksyczność Warunki Literatura Stosowane w medycynie Ścieki szpitalne Antybiotyk cytotoksyczny, Umu C test (bakterie) Aktywność genotoksyczna Próbka ścieków szpitalnych Giuliana et al., 1996 zawierające hamowanie syntezy DNA Mitomycynę oraz Cisplatynę Kanamycyna Antybiotyk Test Microtox EC 5 (5 min)=12,3mg/l Wykryto szczepy oporne Leff et al., 1993 Metronidazol Chemioterapeutyk Chlorella sp. EC 1 (72 h) =2,3mg/l Lanzky oraz Halling Pochodna 5-nitroimidazolu Selenastrum carpricronutum EC 1 (72 h) = 19 mg/l Sørensen, 1997 Neomycyna Antybiotyk Bakterie Nie stwierdzono Wykryto szczepy oporne Leff et al., 1993 Chloramfenikol Antybiotyk naturalny, lecz uzyskiwany na drodze syntezy chemicznej Trimetoprim Bakterie Testy kiełkowania (germination tests) Owies Ryż Ogórek Bakterie osadu czynnego Tetracyklina Antybiotyk Testy rozwoju roślin: Ryż Ogórek Lekooporność Nie stwierdzono Toksyczności EC 5 = 86 mg/l EC 1 =24 mg/l EC 5 = 118 mg/l EC 1 =23 mg/l EC 5 >3 mg/l EC 1 = 2 mg/l Lekooporność EC 5 >3 mg/l EC 5 >3 mg/l EC 5 >3 mg/l EC 5 >3 mg/l Wykryto szczepy oporne Thomulka et al., 1993 Upośledzenie wzrostu korzeni Liu et al., 29 Upośledzenie wzrostu liści Upośledzenie wzrostu korzeni Upośledzenie wzrostu liści Upośledzenie wzrostu korzeni Kummerer, 29 Liu et al., 29 Bakterie osadu czynnego Chlorotetracyklina Antybiotyk Testy rozwoju roślin: Ryż Lekooporność EC 5 >3 mg/l EC 5 >3 mg/l Upośledzenie wzrostu liści Upośledzenie wzrostu korzeni Kummerer, 29 Liu et al., 29 Ogórek EC 5 >3 mg/l EC 5 >3 mg/l Upośledzenie wzrostu liści Upośledzenie wzrostu korzeni 44

Antybiotyk Działanie Organizm testowy Toksyczność Warunki Literatura Stosowane w weterynarii Ampicylina Antybiotyk Bakterie sedymentacyjne Vibrio harvei Lekooporność >1 mg/l Przyśpieszanie wzrostu Sandaa et al., 1992 Bacytracyna Antybiotyk promotor wzrostu Daphnia magna Artemia salina Daphnia magna LC 5 (24h)=126 mg/l LC 5 (48h)=3 mg/l LC 5 (24h)=34 mg/l LC 5 (48h)=21,8 mg/l LOEC = 5 mg/l EC 5 (24 h)=126 mg/l Brambilla et al., 1994 Migliore et al.,1997 Di Delupis et al., 1992 Brambilla et al., 1994 Rośliny EC 5 (5 min)= 3mg/l Upośledzenie wzrostu korzeni i liści Chloramfenikol Antybiotyk syntetyczny Vibrio harvei EC 5 =,16 mg/l Test bioluminescencji Thomulka et al., 1993 Flumequine Furazolidon Chemioterapeutyk z grupy fluorochinonów Chemioterapeutyk pochodna 5-nitrofuranu Dodatek do pokarmu w hodowli ryb Artemia salina Aeromonas salmonicida Bakterie Rośliny Bakterie sedymentacyjne Chlorella pyrenoidosa (algi) Daphnia magna Salmo gairdineri Lebistes reticulatus (gupik) LC 5 (24h)=477mg/l LC 5 (48h)=38 mg/l LC 5 (72h)=96 mg/l MIC (24h)=128 μg/ml (bulion z jonami morskiej wody) MIC (24h)= 16 μg/ml MIC- minimum inhibitory concentration Lekooporność EC 5 =1,3 mg/l LC 5 = > 3mg/l LC 5 = > 3 mg/l LC 5 = 26 mg/l MIC- minimum inhibitory concentration Upośledzenie wzrostu korzeni i liści Test z wykorzystaniem glonów (algal toxicity test) Brambilla et al., 1994 Migliore et al., 1997 Brambilla et al., 1994 Nygaard et al., 1992 Canton and Van Esch, 1976 Kanamycyna Antybiotyk Bakterie sedymentacyjne Lekooporność Wardhaugh et al., 1996 Novobicin Antybiotyk Bakterie sedymentacyjne Vibrio harvei Lekooporność LC 5 =,8 mg/l Test bioluminescencji Sandaa et al., 1992 Thomulka et al., 1993 45

Antybiotyk Działanie Organizm testowy Toksyczność Warunki Literatura Sulfametazyna Chemoterapeutyk z grupy sulfonamidów Testy rozwoju roślin: Ryż EC 5 =22 mg/l EC 5 =43 mg/l Upośledzenie wzrostu liści Upośledzenie wzrostu korzeni Liu et al.29 Sulfametoksazol Chemoterapeutyk z grupy sulfonamidów Ogórek Testy rozwoju roślin: Ryż EC 5 >3 mg/l EC 5 >3 mg/l EC 5 =38 mg/l EC 5 =13 mg/l Upośledzenie wzrostu liści Upośledzenie wzrostu korzeni Upośledzenie wzrostu liści Upośledzenie wzrostu korzeni Liu et al.29 Ogórek EC 5 =3 mg/l EC 5 >3 mg/l Upośledzenie wzrostu liści Upośledzenie wzrostu korzeni Bakterie osadu czynnego Oksytetracyklina Antybiotyk Phaseolus vulgaris (Fasola zwykła) Raphanus sativus L. (rzodkiew zwyczajna) Tricum aestivum L. (pszenica) Bakterie sedymentacyjne Streptomycyna Antybiotyk Vibrio harvei Sinice Chlorella vulgaris Scenedesmus obliquus Chlamydomonas reinhardtii Sulfadimetoksyna Chemoterapeutyk Artemia salina Rośliny Lekooporność Przy stężeniu do 16 ppm w roztworach - redukcja suchej masy w zakresie od 66 do 94%.Przy stężeniu na poziomie 16 ppm powoduje śmierć roślin Zahamowanie wzrostu oraz poboru azotu obserwowano w uprawach w glebie piaszczystogliniastej Lekooporność LC 5 = 19mg/l Zahamowanie wzrostu przy stężeniu,9 -,86 mg/l Zahamowanie wzrostu przy stężeniu 21mg/l Zahamowanie wzrostu przy stężeniu,66 mg/l LC 5 (24 h)=1,8 g/l LC 5 (48 h) =,9 g/l LC 5 (72 h) =,5 g/l LC 5 (96 h) = 19 mg/l Test bioluminescencji Obniżenie średniej wagi korzeni i łodyg, znaczna redukcja wagi liści Kummerer 29 Batchelder 1981 Batchelder 1982 Thomulka et al.,1993 Harrass et al.,1985 Brambilla et al.,1994 Brambilla et al.,1994 46

Zainteresowanie zjawiskiem genotoksyczności w pojęciu ogólnym rośnie obecnie ze względu na rozpowszechnianie genotoksyn w środowisku naturalnym. Bardzo duża uwaga jest poświęcana środowisku wodnemu; badane są wody powierzchniowe, woda pitna, odcieki, osady. Długoterminowa ekspozycja ekosystemów do niskich dawek antybiotyków prowadzi do selektywnego rozmnażania się opornych bakterii, które mogą przekazywać geny oporności pozostałym bakteriom [Levy, 1997]. Antybiotyki są wykrywane na całym świecie w ściekach oczyszczonych [Batt i Aga, 25; Carballa et al., 24; Costanzo et al., 25; Miao et al., 24]. Potwierdza to fakt wykrycia obecności kilku antybiotyko-opornych bakterii i/lub genów w ściekach komunalnych, wodach powierzchniowych oraz wodzie pitnej [Schwarz et al., 23; Volkmann et al., 24]. 8 zanieczyszczonych, nie skoncentrowanych ścieków ze szpitali zostało przebadanych na potencjalną genotoksyczość z wykorzystaniem umuc testu, z których 13% wykazało aktywność genotoksyczną. Najwyższa genotoksyczność była obserwowana w godzinach porannych, pomimo że badania były prowadzone przez całą dobę. 96% genotoksycznych, zanieczyszczonych wód ujawniło potencjalną genotoksyczność bez wpływu inhibicyjnego na wzrost monitorowanych mikroorganizmów - OD6 (w taki sam sposób jak antybiotyk przeciwnowotworowy - Mitomycyna w połączeniu z Cysplatyną, patrz, tab. 3) [Giuliana et al., 1996]. 2.2.2 Wytwarzanie lekooporności Antybiotyki są substancjami wytwarzanymi przez organizmy żywe w celu ustalenia i utrzymania równowagi całego ekosystemu. Powstanie oporności pewnych mikroorganizmów na te substancje było naturalnym mechanizmem regulującym, wynikającym ze zjawiska konkurencji organizmów, zajmujących wspólną niszę ekologiczną. Rozwój technologii produkcji leków przeciwdrobnoustrojowych w ciągu ostatnich pięćdziesięciu lat spowodował znaczny wzrost zużycia antybiotyków, co tym samym doprowadziło, na drodze genetycznej selekcji, do wytworzenia oporności (zwanej lekoopornością) na coraz to nowe generacje antybiotyków [Batt et al., 26; Levy et al., 1997; Chmiel i Grudziński, 1998; Bazy Danych MP, 26]. W tabeli 3 zaznaczono, które z badanych farmaceutyków przedostających się do środowiska wytwarzają lekooporność. Oporność drobnoustrojów na antybiotyki i chemoterapeutyki jest cechą dziedziczną, przenoszoną z pokolenia na pokolenie. Wyróżnia się dwa rodzaje oporności: związaną z układem chromosomalnym lub z cytoplazmatycznymi układami pozachromosomalnymi. Sulfonamidy należą do najdłużej stosowanych chemoterapeutyków. Są one aktywne wobec wielu bakterii Gram-ujemnych, Gram-dodatnich, promieniowców, chlamydii i toksoplazm. Wzrost liczby opornych szczepów pałeczek jelitowych datuje się od roku 1952, co było związane z rozprzestrzenianiem się plazmidów wielorakiej oporności. Szczepy gonokoków oporne na sulfonamidy pojawiły się już w latach 195 196, wzrosła także liczba meningokoków opornych na sulfonamidy, osiągając w latach 197 198 od 2 do 8%, zależnie od grupy serologicznej powodującej epidemie. Z badań przeprowadzonych w 15 centrach medycznych w różnych częściach świata w latach 48

siedemdziesiątych ubiegłego wieku wynikało, że częstość izolowanych szczepów E. Coli opornych na sulfonamidy wahała się od 21% aż do 85% i była większa od częstości szczepów opornych na inne chemoterapeutyki. Podobnie 75% szczepów Shigella dysenteriae, S. flexneri i S. boydii izolowanych w latach 1984 1988 w Londynie, wykazało oporność na sulfonamidy [Markiewicz i Kwiatkowski, 21]. Oporność bakterii na sulfonamidy jest związana najczęściej z wytwarzaniem przez bakterie enzymu syntazy dihydropterynianowej (DHPS) tak zmodyfikowanego, iż nie wykazuje on powinowactwa do leku. Ten mechanizm charakteryzuje liczne przypadki oporności na sulfonamidy bakterii gramujemynych i gramdodatnich. Gen określający oporność umiejscowiony jest w plazmidzie. Natomiast drugi gen, umiejscowiony na chromosomie i obecny zarówno w komórkach wrażliwych, jak i opornych, koduje syntezę normalnego enzymu DHPS wrażliwego na sulfonamidy. DHPS kodowany przez gen plazmidowy i obecny tylko w komórkach opornych jest 1 krotnie mniej wrażliwy na sulfonamidy niż produkt genu chromosomalnego. Inny mechanizm oporności na sulfonamidy polega na nadprodukcji kwasu p-nobenzoesowego (PABA), który bezpośrednio współzawodniczy o dostęp do centrum aktywnego DHPS [Markiewicz i Kwiatkowski, 21]. Mniejsza wrażliwość mikroorganizmów na leki bakteriostatyczne stanowi znaczne utrudnienie w leczeniu zakażeń wywołanych przez drobnoustroje chorobotwórcze, a także prowadzi do powstawania i rozpowszechniania nowych mechanizmów oporności, poprzez powstawanie mutacji lub zmian niegenetycznych (np. adaptacja). Z tego względu coraz to nowe antybiotyki przestają być skuteczne w walce z mikroorganizmami chorobotwórczymi [Levinson i Jawetz, 1998]. Nieracjonalne stosowanie antybiotyków, a w konsekwencji przedostawanie się nie kontrolowanych ilości do środowiska, umożliwia coraz szybsze rozpowszechnianie lekooporności. Antybiotyki są stosowane w weterynarii i w hodowli zwierząt już od wczesnych lat pięćdziesiątych, ale już po 1 latach pojawiły się pierwsze doniesienia o tym, że zawartość tetracykliny w pokarmie dla kurcząt ma bezpośredni związek z narastaniem oporności gronkowców w środowisku. Stosowanie leków w hodowli zwierząt prowadzi do akumulacji tych substancji w produktach spożywczych np. mięsie, miodzie, warzywach. Jest to zjawisko skrajnie niekorzystne, ponieważ wywołuje poważne zaburzenia równowagi biocenozy i rozległe skutki w środowisku, widoczne przeważnie dopiero po wielu latach. Oporność na działanie różnych antybiotyków bardzo często stwierdzano u bakterii w osadach dennych, pobranych ze stawów hodowlanych [Nygaard et al., 1992; Sandaa et al., 1992]. Długoterminowa ekspozycja ekosystemów do niskich dawek antybiotyków prowadzi do selektywnego rozmnażania opornych bakterii, które mogą przekazywać geny oporności pozostałym bakteriom [Levy, 1997]. Attrasi [Attrasi et al., 1993] wykazał, że flora bakteryjna wyizolowana z wody oceanicznej (ocean Atlantycki), muszli oraz osadów dennych pobranych z okolic Maroka jest oporna na antybiotyki. Oporność tych mikroorganizmów na penicylinę była niezależna od faktu czy dany region był 49

zanieczyszczony czy nie. Natomiast mniejszą wrażliwość na działanie tetracykliny, erytromycyny, tobracyny czy chloramfenikolu wykazywały drobnoustroje wyizolowane z próbek pobranych z regionów zanieczyszczonych. Badano także oporność krzyżową. Wykazano, że ponad 55% szczepów było opornych, na co najmniej jeden antybiotyk a ponad 2% posiadała plazmid oporności na lek lub grupę leków [Halling-Sørensen et al., 1998; Attrasi et al., 1993]. 2.3 Ścieki farmaceutyczne Przy tak dużej ilości produkowanych leków, istotnym problemem staje się zagospodarowanie i unieszkodliwienie ścieków poprodukcyjnych. Ścieki te są trudne do scharakteryzowania, ponieważ ich skład jest zależny od specyfiki produkcji danego zakładu. Najczęściej charakteryzują się wysoką zawartością związków organicznych (surowców i półproduktów np. benzen, anilina, nitrozwiązki benzenowe, oraz pozostałości gotowych produktów leków), związków azotu i fosforu, chlorków, siarczanów, fenolu, związków arsenu, chromu, a nieraz także cyjanków. Większość to substancje szczególnie uciążliwe dla środowiska ze względu na fakt, że wykazują wysoką toksyczność a często są trudno biodegradowalne, ponieważ stabilność metaboliczna jest podstawą działania farmakologicznego leków [Steuer-Lauridsen et al., 2; Halling-Sørensen et al., 1998]. Ze względu na dużą uciążliwość, ścieki z przemysłu farmaceutycznego nie mogą być odprowadzane do środowiska, a także do systemu kanalizacji bez wcześniejszego podczyszczania. Ścieki farmaceutyczne zazwyczaj po odzyskaniu części rozpuszczalników, usunięciu zawiesin, emulsji, korekcie ph, a również rozcieńczeniu wodami pochłodniczymi są kierowane do oczyszczalni biologicznej, gdzie powinien następować rozkład związków organicznych oraz usuwanie substancji biogennych (związków azotu i fosforu). Jednak ze względu na obecność czynników bakteriostatycznych oraz bakteriobójczych (takich jak fenole, krezole, azydki, sulfonamidy, cyjanki) efektywność biologicznych procesów jest często niezadowalająca [Meinck et al., 1975]. 2.3.1 Sulfonamidy a oczyszczanie ścieków Charakterystyka sulfonamidów Sulfonamidy stanowią grupę związków organicznych, które są pochodnymi amidu kwasu sulfanilowego. Zawierają one w swojej cząsteczce grupę sulfonamidową -SO 2 NH 2. Grupa sulfonamidowa może być podstawiona lub niepodstawiona. Związki te stosowane są w medycynie oraz w weterynarii jako środki odkażające oraz bakteriostatyczne. Dla aktywności przeciwbakteryjnej niezbędna jest wolna, niepodstawiona grupa aminowa w pozycji para względem grupy sulfonamidowej. Najbardziej popularnym sulfonamidem stosowanym w lecznictwie jest sulfanilamid. Obecnie, ze względu na efekty uboczne u ludzi powstałe w wyniku jego stosowania, ograniczono 5

użycie tego związku. Wiele ze stosowanych sulfonamidów wykazuje skłonność do powodowania uszkodzeń układu pokarmowego [Manahan, 26]. Właściwości bakteriostatyczne sulfonamidów zostały odkryte w 193 roku. Od tego czasu tysiące sulfonamidów zostało zsyntetyzowanych, ale tylko nieliczne z nich znalazły zastosowanie w lecznictwie. Kolejno opracowywane i wprowadzane do lecznictwa sulfonamidy są pochodnymi sulfanilamidu tj. p-aminobenzenosulfonamidu. Jako analogi kwasu p-aminobenzoesowego są jego antagonistami i wykazują działanie bakteriostatyczne. Istotną cechą sulfonamidów są ich toksyczne właściwości oraz długi okres półtrwania (do 48 godzin) oraz szybko pojawiająca się i narastająca oporność bakterii na te substancje [Chmiel i Grudziński, 1998]. Sulfonamidy jako związki chemiczne wykazują charakter amfoteryczny. Związki te trudno rozpuszczają się w wodzie, łatwo w kwasach oraz w roztworach wodorotlenków i węglanów zasadowych, zgodnie z reakcją przedstawioną równaniem 1: SO 2 NH R HCl SO 2 NH R NaOH _ SO 2 N R Na + (1) NH 3 + Cl - NH 2 NH 2 Pierwszorzędowa grupa aminowa, związana z pierścieniem aromatycznym nadaje sulfonamidom charakter słabo zasadowy - pk b mieści się w granicach 12,3 11,64. Z kwasami tworzą nietrwałe sole, a wodne roztwory ich chlorowodorków łatwo hydrolizują. Kwasowość sulfonamidów jest uzależniona od rodzaju podstawnika przy grupie sulfonamidowej. Prawie wszystkie związki podstawione w grupie sulfonamidowej wykazują charakter kwasowy, ich pk a zawiera się w granicach 6,5-7,5. Kwasowość wybranych sulfonamidów przedstawia tabela 4 [Garbuliński, 198]. Im silniejsze są właściwości elektronoakceptorowe podstawnika, tym łatwiejsze odszczepianie protonu i tym większa jest trwałość soli sulfonamidów. Aktywność biologiczna tych leków zależy od stopnia jonizacji. Najsilniej działają te sulfonamidy, których wartość pka wynosi od 7, do 7,4 [Zejca i Gorczyca, 1999]. 51

Tab. 4 Wykaz wybranych sulfonamidów wraz z ich wartościami pk a [Garbuliński, 198] Nazwa pk a Nazwa pk a Sulfacetamid 5,4 Sulfadimetoksyna 6,3 Sulfatiazol 7,2 Sulfametoksypiridazyna 7,2 Sulfadimidyna 7,4 Sulfafenazol 6,1 Sulfafurazol 5, Sulfaproksylina 4,9 Sulfachloropirydazyna 6,1 Sulfadiazyna 6,4 Sulfapirydyna 8,4 Sulfametylopirymidyna 6,95 Sulfametoksazol 5,7 Sulfametoksydiazyna 7, Sulfakarbamid 5,5 Podatność sulfonamidów na biodegradację Jak już wcześniej wspomniano, chemoterapeutyki, jako substancje biologicznie czynne wykorzystywane w lecznictwie, muszą wykazywać wysoką stabilność metaboliczną, a to oznacza, że są substancjami, które trudno ulegają biodegradacji. Jest to niekorzystne w kontekście biologicznego oczyszczania ścieków. Zdolność do biodegradacji para-toluenosulfonamidu (p-tsa) przez bakterie Pseudomonas sp. opisali Van Haperen et al. [Van Haperen et al., 21]. Zaproponowaną przez Van Haperen ścieżkę biodegradacji p-tsa pokazano na rysunku 1. Ten rodzaj bakterii został wyizolowany z osadu czynnego. Wykonano test zamkniętej butelki, który wykazał, że p-tsa ulega całkowitej degradacji w ciągu kliku dni, co świadczy o tym, że jest to sulfonamid łatwo biodegradowalny. Badanie oczyszczonej zawiesiny komórkowej (washed cell suspensions) wykazało wzrost bakterii po kilku dniach inkubacji i identyfikację ich jako Pseudomons sp., wykorzystujących p-tsa jako źródło węgla, siarki, azotu. W jednym z etapów rozkładu pojawia się 4-hydroksymatylobenzenosulfonamid oraz 4-karboksybenzenosulfonamid, co dowodzi, że zachodzą procesy utleniania grup metylowych we wstępnych etapach degradacji (Rys. 1). Prawdopodobnie 4-karboksybenzeno-sulfonamid przekształca się w kwas dihyroksy-benzoesowy oraz kwas amidosiarkowy (IV). Kwas amidosiarkowy (IV) w środowisku wodnym jest nietrwały i rozpada się na jony siarczanowe (IV) oraz amonowe. Metabolizm kwasu 3,4-dihydroksybenzoesowego przez drobnoustroje został przedstawiony w pracy Guzik [Guzik, 27]. W proponowanym mechanizmie degradacji następuje otwarcie pierścienia aromatycznego, a następnie utlenienie alifatycznego łańcucha powstałego po rozszczepieniu pierścienia. Prowadzi to do utworzenia substratów cyklu Krebsa (bursztynylo-coa oraz acetylo-coa) i w końcowym efekcie powstania ditlenku węgla oraz wody. Zaproponowaną przez Van Haperen ścieżkę biodegradacji p-tsa pokazano na rysunku 1 [Van Haperen et al., 21]. 52

Rys. 1 Proponowana ścieżka degradacji p-toluenosulfonamidu [Van Haperen et al., 21] Radka [Radka et al., 24] wykonał badania podatności na biodegradację 18 antybiotyków, w tym z grupy sulfonamidów sulfametoksazolu. Do badań biodegradacji zastosowano test zamknietej butelki (CBT closed bottle test), a do określenia toksyczności- test zdolności tworzenia kolonii (CFUs-colony forming units). Toksyczność badano na mieszanej populacji bakterii z roślinnej oczyszczalni ścieków. Test zamkniętej butelki wykazał, że żaden ze związków nie jest łatwo biodegradowalny, a podatność na biodegradację rośnie w obecności łatwo przyswajalnego źródła węgla. Żaden z antybiotyków nie zadziałał toksycznie na wzrost bakterii. Niektóre antybiotyki wywarły nagatywny wpływ na zdolność tworzenia kolonii, lecz nie sulfametoksazol. Zachowanie sulfonamidów w środowisku Sulfonamidy powodują szereg niekorzystnych efektów w środowisku, między innymi wskutek właściwości toksycznych wobec mikroorganizmów [Nimenya et al., 1999]. Wykazano także szkodliwość sulfonamidów wobec roślin [Migliore et al., 1997, 1998, 2]. Sulfonamidy wykazują słabe zdolności adsorpcyjne, zarówno w glebie jak w osadzie czynnym [Huang et al., 21; Ingerslev i Halling- Søerensen, 2; Thiele, 2; Fontanie et al., 1991]. Zostały zbadane przemiany sulfonamidów w różnych warunkach środowiskowych. Związki te okazały się podatne na hydrolizę. Proces ten przebiegał bardzo wolno przy neutralnym ph i jego znaczenie jest znikome [Volmer i Hui, 1998]. Leki te nie ulegały przemianom w osadach morskich [Samuelson et al., 1994]. Wyniki uzyskane we wszystkich metodach badań sorpcji sulfonamidów w środowisku glebowym potwierdzają wysokie powinowactwo nieekstrahowalnych pozostałości tych substancji do matrycy glebowej. Sulfonamidy w ściekach Chemoterapeutyki takie jak sulfonamidy są wydzielane do systemów ściekowych przez organizm człowieka lub zwierząt, po normalnym, terapeutycznym stosowaniu [Jjemba, 22]. Znajdują się także w ściekach przemysłowych, generowanych w zakładach produkujących lub stosujących te związki. 53

Stężenia sulfonamidów w ściekach przemysłowych są znacznie wyższe niż w ściekach bytowych, czy nawet szpitalnych, toteż konieczne jest ich wcześniejsze usuwanie. Niestety, mogą one stwarzać problemy podczas oczyszczania ścieków farmaceutycznych. Dodatkowo obecność sulfonamidów w ściekach zwiększa łączny ładunek azotu a ponadto, ich właściwości mogą utrudniać procesy biologicznego usuwania związków azotu ze ścieków. Huang [Huang et al., 21] podsumował stan wiedzy dotyczący występowania i losów antybiotyków zawartych w ściekach komunalnych, w ściekach z hodowli zwierząt oraz ekskrementach zwierząt. Zidentyfikował powszechnie stosowane antybiotyki oraz chemoterapeutyki zawarte w tych ściekach. Dokonano przeglądu antybiotyków ze względu na ich zdolności sorpcyjne i ich transformację w oczyszczalni. Zbadano 1 klas antybiotyków. Stężenia farmaceutyków na wejściu do oczyszczalni ścieków komunalnych zawierały się w zakresie od 3,9 ng/l do maksymalnie 27 ng/l. Według doniesień Huang, sulfametoksazol był najczęściej występującą substancją na wyjściu z oczyszczalni, natomiast sulfametazyna była obecna w ściekach pochodzących z rolnictwa [Huang et al., 21]. Stężenie sulfametoksazolu w ściekach surowych wynosiło około 38 ng/l z uwzględnieniem jego metabolitów (32 ng/l bez metabolitów). W ściekach pochodzących z hodowli świń zostały wykryte tyrozyna wraz z sulfametazyną w znacznie wyższym stężeniu, równym 496 mg/dobę. Z powodu słabej podatności sulfonamidów na biodegradację, czas ich przebywania w środowisku jest na tyle długi, że możliwe jest wytworzenie się szczepów opornych na te związki, co jest szczególnie niekorzystnym efektem [Al-Almad et al., 1999; Ingerslev i Halling-Sørensen, 2]. Z drugiej strony, związki te mają istotny wpływ na usuwanie innych zanieczyszczeń z wody lub ze ścieków, zwłaszcza metodami biologicznymi. Okazało się, że sulfonamidy hamują nitryfikację, co może być szczególnym problemem w procesach zachodzących w glebie i wodach naturalnych. Może też stwarzać kłopoty w oczyszczalni ścieków [Nimenya et al.,1999]. 2.3.2 Problem usuwania azotu ze ścieków farmaceutycznych O ile związki fosforu często usuwa się metodami chemicznymi, o tyle w przypadku substancji zawierających azot, metoda biologiczna dominuje w większości systemów oczyszczania ścieków. Według doniesień literaturowych [Jamróz, 21], usuwanie związków azotu ze ścieków farmaceutycznych jest istotnym problemem. Ze względu na obecność bakteriostatyków, inhibicji ulegają procesy nitryfikacji, denitryfikacji, a początkowy proces amonifikacji, czyli biologicznego rozkładu azotowych związków organicznych przebiega z niską wydajnością. Na podstawie badań przeprowadzonych w jednym z zakładów farmaceutycznych w Polsce wynika, że redukcja ChZT w oczyszczalni z osadem czynnym jest zadowalająca (ok. 85-9%), niemniej na odpływie z oczyszczalni pozostają jony amonowe w stężeniach nie dopuszczalnych dla środowiska [Jamróz, 21]. Zawartość azotu ogólnego w ściekach dopływających wynosiła średnio 17 mg/l, a w kanale zrzutowym około 47 mg/l, a stężenie azotu organicznego wynosiło odpowiednio 54

ok. 7 mg/l i 19 mg/l. Tak więc widać, że wydajność usuwania azotu ogólnego wynosiła około 55 6%, ale wydajność procesu amonifikacji zaledwie około 7%. Równocześnie nie stwierdzono ubytku jonów amonowych, podczas całego procesu oczyszczania ich stężenie było prawie stałe (około 4-45 mg/l) a nawet nieznacznie wzrastało. Wyniki te są dowodem na całkowitą inhibicję procesu nitryfikacji, co wynika z toksyczności składników tych ścieków. Ze względu na niską zawartość azotanów i azotynów, będącą efektem zahamowania nitryfikacji, także proces denitryfikacji został drastycznie ograniczony. Przyczyną tego okazało się połączenie ścieków z produkcji sulfonamidów z pozostałymi strumieniami ścieków, co pogarszało efektywność biologicznego usuwania azotu. Wykazano, że bakterie denitryfikujące są mniej wrażliwe na bakteriostatyki zawarte w ściekach z tego zakładu, ale ich aktywność także ulegała inhibicji. Wyżej opisana sytuacja jest charakterystyczna dla dużej części zakładów farmaceutycznych. Przykładowe wartości wybranych wskaźników zanieczyszczeń z różnych oczyszczalni ścieków przemysłu farmaceutycznego przedstawiono w tabeli 5. Tab. 5 Przykładowe wskaźniki zanieczyszczeń ze ścieków pochodzących z przemysłu farmaceutycznego Parametr ph ChZT TKN NH 4 - N Literatura Kraj [mg/l] [mg/l] [mg/l] Starogard Gdański 7,2-8,1 89-115 Brak danych 3-5 Jamróz M., 21 Polska Beerse, Belgia 7,3 74,6 8,9 Brak danych Liessens et al., 1995 Kocaeli, Turcja,9 2675 745 532 Gulmez et al., 1998 Nagpur, Indie 4,2-4,5 5-8 135-125 4-32 Nandy i Kaul, 21 Kair, Egipt 1,87-4,4 1488-9318 21-572 -194 El-Gohary et al., 1995 Tab. 6 Wybrane wskaźniki zanieczyszczeń ścieków farmaceutycznych w jednym z zakładów w Polsce [Rudnicka, 27] Zestawienie miesięczne ph średnie ChZT [mg/l] NH 4 - N [mg/l] NO 2 - N [mg/l] NO 3 - N [mg/l] N org [mg/l] N tot. [mg/l] Homogenizator 9, 762,3 37,3,4,96 39, 76,3 Kanał zrzutowy 8,1 135,5 32,9,41,15 16,6 49,7 Zestawienie kwartalne ph średnie ChZT NH 4 - N NO 2 - N NO 3 - N N org TKN [mg/l] [mg/l] [mg/l] [mg/l] [mg/l] [mg/l] Homogenizator 7,6 1472,14 1,1,9,91 45,3 145,4 Kanał zrzutowy 8, 131,8 32,5,45,18 15,6 48,4 55

Charakterystyki ścieków dla jednego z zakładów farmaceutycznych w różnych przedziałach czasowych mogą się zmieniać w zależności od profilu produkcji. Przykładem może być zestawienie wybranych parametrów jednego z zakładów farmaceutycznych w Polsce (tab. 6). Powyższe dane pokazują, że odprowadzane ścieki (kanał zrzutowy) zawierały zbyt wysokie stężenia związków azotu, zwłaszcza azotu amonowego. Konieczne stało się więc poszukiwanie możliwości intensyfikacji biologicznego usuwania związków azotu z tego typu ścieków. Toteż, uznano za ważne podjęcie badań nad poprawą efektywności biologicznego usuwania azotu, w przypadku obecności w ściekach substancji farmaceutycznych. 2.3.3 Oznaczanie sulfonamidów w wodzie i ściekach Do wykrywania, identyfikacji i oznaczania ilościowego sulfonamidów w próbkach wodnych wykorzystuje się chromatografię cieczową z odpowiednim systemem detekcji. Hartig [Hartig et al., 1999] opracował metodykę detekcji i identyfikacji sulfonamidów w ściekach komunalnych z wykorzystaniem chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas z jonizacją poprzez elektrorozpraszanie. Metoda ta jest odpowiednia do wykrywania niewielkich ilości związków, zawierających w swojej budowie siarkę. Zostało oznaczonych 14 różnych sulfonamidów takich jak sufanilamid, sulfacetamid, sulfadiazina, sulfametoksazol, sulfmetizol, itp. Ze średniodobowych 1 ml próbek ścieków komunalnych w Berlinie ekstrahowano sulfonamidy. Uzyskano 5-9% wydajność ekstrakcji, lecz nie zdołano wydzielić sulfanilamidu oraz sulfacetamidu. Czułość tej metody pozwalała wykryć powyższe sulfonamidy w stężeniach powyżej 12 μg. Sulfametoksazol oraz sulfadiazyna były wykrywane w zakresie odpowiednio, 3-2 ng/l oraz 1-1 ng/l. Hirsch [Hirsch et al., 1999] również zastosował wysokosprawną chromatografię cieczową, sprzężoną z tandemową spektrometrią mas z jonizacją poprzez elektrorozpraszanie, do wykrycia 18 antybiotyków różnych grup takich jak penicyliny, tetracykliny jak również sulfonamidy oraz makrolidy w kanałach zrzutowych oczyszczalni ścieków i wodach powierzchniowych. W próbkach wykryto obecność śladowych ilości sulfametoksazolu i jego produktów rozkładu jak również erytromycyny w stężeniach poniżej μg/l 6 [Hirsch et al., 1999]. W tabeli 7 przedstawiono zestawienie metod analitycznych, wykorzystywanych do oznaczania sulfonamidów w próbkach wód powierzchniowych oraz w ściekach, opracowane na podstawie przeglądu literaturowego. 56

Tab. 7 Metody analityczne do oznaczania sulfonamidów w wodzie i ściekach Analizowany związek Metoda Kolumna Faza ruchoma Długość fali Literatura Sulfatiazol Sulfanilamid Fotochemicznie indukowana fluorescencja oraz first derivative Garcia et al., 1995 Sulfametazina Sulfametoksazol Sulfadiazyna Sulfatiazol Sulfamerazyna Sulfmetazyna Sulfametoksazol fluorescence LC /MS/MS Rozdzielanie: YMC Pro C18 15x2 mm, 3-μm średnica wypełnienia (Stagroma) HPLC-MS/MS Detekcja: TSQ Quantum Discovery triple quadrupole mass spectrometry + electro spray ionisation Rozdział: 2,1x15mm, 5 μm Zorbax SB w 3 ºC Positive mode elektrospray ionization and selected ion monitoring Sulfadimetoksyna HPLC Capcell Pak C18 (UG12 S-5 μm 4,6 mm i.d.x 25mm L, Shishedo Co.Ltd. Sulfachloropirydazyna LC-UV + detekcja 15x4,6-mm, 4,6 μm, Genesis C18 (Jones fluorescencyjna Chromatography) Sulfametoksazol Sulfametazina Chloramfenikol HPLC- electrospray tandem MS Rozdzielanie: 125x3 mm Merck LiChrospher RP-18, 5-μm średnica wypełnienia Metanol-woda zawierająca 1% kwasu mrówkowego A:1mM octanu amonu,,7% lodowego kwasu octowego oraz 1% acetonitryl (ACN) B: 1% ACN v Woda, metanol, kwas octowy (6/4/.5) A: TFA B: MeCN C:,5%TFA w wodzie Kompozycja A:B:C::5:2,5:92,5 w czasie -4 min, oraz 18-25 min. A:B:C:5:75:2 w czasie 4-18 min 1 mmol/l octanu amonu w woda acetonitryl (metoda ANT) 1 Å Göbel et al., 25 Renew et al., 24 27 nm Eguchi et al., 24 285 nm Blackwell et al., 24 Hirsch et al., 1998, 1999 p-toluenosulfonamid 4-karboksybenzenosulfonamid Detekcja: Perkin- Elmer Sciex API III plus triple quadruple mass spectrometry + electrospray ionization HPLC Hypersil 5 ODS 1x3 mm (Chrompack) 4% metanol (v\v) w demineralizowanej wodzie ph =2.5 (H 3 PO 4 stężony) 229 nm UV Van Haperen et al., 21 58

c.d. Analizowany związek Metoda Kolumna Faza ruchoma Długość fali Literatura Sulfanilamid; Sulfacetamid Sulfabenzamid; Karbutamid Sulfmetoksypirydyna HPLC Spherisorb ODS-2 analytical C 18, 5 μm, 125x4.6 mm (Phenomenex) Acetonitryl i 16,7 mm lodowatego kwas octowy ph=5 z 4M NaOH w stosunku 17,5 : 82,5 Flumetsulam (sulfonamide - herbicyd) 6-[methyl(phenylsulfonyl) amino]-hexanoic acid HPS 4-[methyl(phenylsulfonyl) amino]butyric acid BPS sarkosin- N-(pheylsulphonyl) SPS methyl(phenylsulphonyl)amide MPS p-aminobenzenesulphonamides np. Sulfanilamid Sulfanilamid; Sulfacetamid; Sulfisomidyna; Sulfamerazyna Sulfametizol; Sulfametazina Sulfametoksazol; Sulfadiazyna Sulfathiazole; Sulfametoksypiridazyna Sulfisoxazol; Sulfadimetoksyna Sulfafenazol; Sulfaquinoxalina Sulfacetamid sodu Sulfamerazyna Sulfanilamid Sulfathiazol Sulfametoksazol Sulfmetazyna HPLC/MS LC-MS HPLC- electrospray tandem MS HPLC Kolumna analityczna HPLC Metasil Basis 3-μm średnica wypełnienia 2x15-mm (Metachem Technologies Inc.) Hypersil ODS (MERCK) HPLC column (25x3,6 mm) Perkin-Elmer-Sciex API 15 negative ionization mode Spherisorb ODS-2 analytical C 18, 5 μm, 125x4.6 mm (Scharlau) Acetonitryl + bufor 1mM mrówczan amonu/kwas mrówkowy (ph 3,7 w wodzie) 28 nm Ingerslev and Halling- Sørensen, 2 Furlong et al., 2 Methanol/woda (5:5, v/v) Knepper et al., 1999,1 M wodny roztwór siarczanu dodecylosodowego/alkohol po derywatyzacji z NED (V\V) ph 7 i ph 3 w obecności lub bez 4% propanolu Sulfadimetoksyna HPLC Hypersil ODS C 18 1x4,6 mm 5 mm Kwas ortofosforowy (V) ph 3,5 + acetonitryl (9+1) z 5 mm kwasem ortofosforowym (V) ph 3,5 + acetonitryl (5+5) w stosunku 5:5 55 lub 49 nm Hartig et al., 1999 Garcia-Alvarez-Coque et al., 1995 27 nm Samuelsen et al., 1994 59

CEL I ZAKRES BADAŃ Przedstawiony w części teoretycznej przegląd literaturowy i analiza licznych, opublikowanych wyników badań wykazały, że jest wiele niejasności w rozumieniu i ocenie wpływu sulfonamidów na procesy oczyszczania ścieków, a zwłaszcza usuwania z nich azotu. Szczególne braki dotyczą procesu Anammox, który jest obiecującym rozwiązaniem dla oczyszczania ścieków zawierających znaczne ilości azotu amonowego, ale w obecności farmaceutyków nie był jeszcze przebadany. Toteż uznano, że konieczne jest poszukiwanie możliwości intensyfikacji biologicznego usuwania związków azotu ze ścieków pochodzących z przemysłu farmaceutycznego, a w szczególności w przypadku obecności w nich sulfonamidów. Głównym celem pracy doktorskiej była ocena wpływu sulfonamidów na procesy biologicznego usuwania azotu ze ścieków. Zamierzano sprawdzić możliwość zastosowania procesu deamonifikacji (nitrytacja + Anammox) do usuwania azotu ze ścieków zawierających sulfonamidy. Deamonifikacja jest procesem mało poznanym pod względem wrażliwości bakterii Anammox na toksyczne działanie różnych związków oraz ich adaptacyjnych zdolności do wysokiego stężenia tych związków. Ponieważ pierwszym stopniem deamonifikacji jest częściowa nitryfikacja (nitrytacja) i od jej efektywności zależy proces deamonifikacji, celem pracy była też ocena wpływu sulfonamidów na aktywność bakterii procesu nitryfikacji. Było to tym bardziej uzasadnione, że osad czynny jest wciąż najpowszechniej stosowaną metodą do oczyszczania ścieków. Dla osiągnięcia celów pracy konieczna była analiza niżej wymienionych zagadnień studialnobadawczych: ocena wpływu sulfonamidów na osad czynny i proces nitryfikacji oparta o badanie: 1. wpływu wybranych sulfonamidów na przebieg procesu nitryfikacji, 2. wpływu sulfonamidów na aktywność oddechową mikroorganizmów osadu czynnego, 3. wpływu sulfonamidów na aktywność dehydrogenaz mikroorganizmów osadu czynnego, 4. inhibicji nitryfikacji przez sulfonamidy; ocena wpływu sulfonamidów na proces Anammox w oparciu o badanie: 1. wpływu wybranych sulfonamidów na przebieg procesu Anammox, 2. wpływu sulfonamidów na szybkość usuwania azotu w procesie Anammox, 3. wpływu sulfonamidów na aktywność dehydrogenaz bakterii Anammox; określenie związku między podatnością sulfonamidów na biodegradację a ich wpływem na proces nitryfikacji i proces Anammox; 6

porównanie wybranych sulfonamidów pod względem ich oddziaływania na procesy usuwania azotu; ocena możliwości adaptacji mikroorganizmów osadu czynnego i bakterii Anammox do obecności sulfonamidów. W ramach niniejszej pracy podjęto się zbadania wpływu 3 sulfonamidów: sulfanilamidu (SA), sulfacetamidu (SCM), oraz p-toluenosulfonamidu (p-tsa), na procesy biologicznego usuwania azotu ze ścieków: na proces nitryfikacji prowadzony metodą osadu czynnego oraz proces Anammox prowadzony metodą z użyciem złoża ruchomego. Badania nad biodegradacją przeprowadzono także dla tolbutamidu (TB). W oparciu o przeprowadzone badania planowano uzyskać odpowiedź na pytania: czy możliwe jest osiągnięcie wysokiej efektywności procesu nitryfikacji w obecności sulfonamidów oraz czy możliwe jest zastosowanie procesu deamonifikacji do usuwania azotu ze ścieków zawierających sulfonamidy? 61

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA 3 Materiały i metodyka badawcza 3.1 Materiały Materiały stosowane w pracy to: wybrane sulfonamidy, osad czynny i ciecz nadosadowa oraz kultura bakterii Anammox w postaci błony biologicznej rozwiniętej na złożu nośnym pierścieniach Kaldnes. Ich szczegółowa charakterystyka jest opisana poniżej. 3.1.1 Sulfonamidy We wszystkich badaniach stosowano trzy wybrane sulfonamidy o prostej budowie chemicznej: sulfanilamid, sulfacetamid, p-toluenosulfonamid (metabolit chloraminy T). Natomiast czwarty sulfonamid, tolbutamid, ze względu na jego niską rozpuszczalność, był użyty tylko w badaniach biodegradacji i nie zamieszczono jego charakterystyki w pracy. Producentem sulfonamidów była Sigma-Aldrich Co. Wszystkie miały czystość analityczną 99%. W tabeli 8 przedstawiono krótką charakterystykę tych związków. Tab. 8 Charakterystyka wybranych sulfonamidów Nomenklatura Masa cząsteczkowa [g/mol] Sulfacetamid - SCM Sulfanilamid - SA p-toluenosulfonamid p-tsa N-[p- aminobenzenosulfonylo] acetamid 4-amino benzenosulfonamid 4-metylobenzenosulfonamid 214,2 172,21 171,22 Wzór sumaryczny C 6 H 1 N 2 O 3 S C 6 H 8 N 2 O 2 S C 7 H 9 NO 2 S Wzór strukturalny H 2 N O S NH C O H 2 N O S NH 2 H 3 C O S NH 2 O CH 3 O O Rozpuszczalność w H 2 O 6,7 g/l 7,5 g/l 3,16 g/l ph Około 7,5 5,8 6,1 (,5% roztwór, 2 C) Około 7,3 62

3.1.2 Ścieki modelowe W zależności od celu badań, w poszczególnych doświadczeniach stosowano odpowiednio dobrane ścieki modelowe. Ścieki modelowe użyte podczas badań wpływu sulfonamidów na proces nitryfikacji sporządzano z roztworu podstawowego, którego skład jest przedstawiony w tabeli 1 (rozdz. 5.4). Roztwór ten był wzbogacany w glukozę w stężeniu 1g/l jako źródło węgla organicznego Podczas badań wpływu sulfonamidów na proces Anammox ścieki modelowe sporządzano z cieczy nadosadowej (odciek po wirówkach z procesu odwadniania osadu nadmiernego, pobrany w oczyszczalni ścieków), która stanowiła źródło węgla oraz azotu amonowego. Przed procesem supernatant wzbogacono odpowiednią ilością NaNO 2, tak by zachować odpowiedni stosunek azotu amonowego do azotu azotanowego (III). Zarówno w badaniach nad procesem nitryfikacji jak i procesem Anammox do ścieków syntetycznych dodawano odpowiednie ilości sulfonamidów. Dla przejrzystości opisu poszczególnych metodyk szczegółowa charakterystyka ścieków modelowych podana jest w odpowiednich rozdziałach, dotyczących opisu metody badań procesów nitryfikacji i Anammox. 3.1.3 Osad czynny i ciecz nadosadowa Do badań biodegradacji sulfonamidów i hamowania przez nie procesu nitryfikacji osad czynny był pobierany z komory nitryfikacyjnej oczyszczalni ścieków komunalnych Wschód w Gdańsku oraz z oczyszczalni ścieków w Swarzewie. W długookresowych badaniach wpływu sulfonamidów na nitryfikację oraz powiązanych z nimi testach szybkości zużywania tlenu (OUR) i aktywności dehydrogenaz (TTC) użyto osad z komory nitryfikacyjnej wyłącznie z oczyszczalni Wschód. Ciecz nadosadowa wykorzystana w badaniach wpływu SA na proces Anammox pochodziła z oczyszczalni ścieków komunalnych Himmerfjärden w Grödinge (Szwecja). Natomiast w badaniach wpływu SCM oraz p-tsa użyto ciecz nadosadową pochodzącą z oczyszczalni Wschód w Gdańsku. Szczegółowe charakterystyki osadu czynnego zostały zamieszczone w opisie metodyk badawczych w odnośnych rozdziałach. 3.1.4 Kultura Anammox Badania nad procesem Anammox prowadzone były w ramach współpracy z Królewską Politechniką w Sztokholmie (KTH). Mikroorganizmy Anammox (błona biologiczna rozwinięta na powierzchni pierścieni Kaldnes) pochodziły ze stacji pilotażowej procesu deamonifikacji, znajdującej się w oczyszczalni ścieków komunalnych Himmerfjärden w Grödinge, (Szwecja). Obecność mikroorganizmów Anammox w złożu tej stacji pilotażowej została potwierdzona w badaniach wykonanych we współpracy grup badawczych z KTH oraz z Uniwersytetu w Nijmegen. W tym celu 63

wykorzystano metodę FISH (Fluorescence In Situ Hybridization). Mikroorganizmy Anammox zidentyfikowano jako Brocadia anammoxidans [Szatkowska, 24]. Pierścienie Kaldnes są materiałem nośnym wykonanym z polietylenu, który został zaprojektowany tak, by zapewnić jak największą powierzchnię, na której rozwija się błona biologiczna. Gęstość pierścieni jest zbliżona do gęstości wody, co sprawia, że pierścienie nie toną, lecz są zawieszone tuż pod powierzchnią wody. Zaletą złóż ruchomych z pierścieniami Kaldnes są niskie koszty inwestycyjne, niska produkcja osadu nadmiernego oraz duża odporność rozwiniętej na nich błony na niekorzystne warunki środowiska. Pierścienie Kaldnes przedstawione są na Rysunku 11, natomiast tabela 9 zawiera ich krótką charakterystykę [www.kaldnes.com- strona producenta]. Rys. 11 Pierścienie Kaldnes oraz widok rozwiniętej na nich błony biologicznej Tab. 9 Charakterystyka pierścieni Kaldnes [www.kaldnes.com] Materiał PE (polietylen) Gęstość [kg/m 3 ] 95 Rozmiar [mm] 9,1 x 7,2 Powierzchnia właściwa [m 2 /m 3 ] 5 Gęstość nasypowa [kg/m 3 ] 17 Stopień wypełnienia objętości 35-7 reaktora pierścieniami [%] Badania wpływu sulfanilamidu (SA) na proces Anammox prowadzono w Królewskiej Politechnice w Sztokholmie (KTH). W badaniach tych, jako proces odniesienia, wykorzystano proces Anammox prowadzony w półtechnicznej stacji pilotażowej systemu deamonifikacji w Oczyszczalni Ścieków Komunalnych Himmerfjärden w Grödinge (Szwecja). Natomiast badania wpływu sulfacetamidu (SCM) oraz p-toluenosulfonamidu (p-tsa) prowadzono w Politechnice Gdańskiej. 64

3.2 Metodyki badawcze 3.2.1 Metody analiz chemicznych W celu określenia charakterystyki ścieków komunalnych oraz oceny efektywności prowadzonych procesów wykonywano następujące oznaczenia: ChZT - chemiczne zapotrzebowanie tlenu metodą dwuchromianową PN-74/C- 4578.3 - modyfikacja HACH; DO - stężenie tlenu rozpuszczonego metodą Winklera - PN-72/C-4545.1; BZT - biochemiczne zapotrzebowanie tlenu - Oznaczenie BZT przeprowadzono według metodyki testu zamkniętej butelki testu 31D [OECD, 1992]; Zawiesina ogólna PN-72/C-4559; Sucha pozostałość PN-72/C-4541; Pozostałość po prażeniu PN-72/C-4541. W badaniach realizowanych w Polsce formy azotu nieorganicznego były oznaczane przy użyciu spektrofotometru Hach 2 z wykorzystaniem następujących metod: Azot amonowy - metoda Nesslera, PN 94/C-4576.2; Azot azotanowy (III ) - PN-73/C-4576.3; Azot azotanowy (V) - PN-82/C-4576.8; Azot ogólny metoda Kjedahla - PN-73/ C-4576.12; Całkowity azot nieorganiczny N tot = [NH 4 -N] + [NO 2 -N] + [NO 3 -N]. Natomiast w badaniach realizowanych w Szwecji formy azotu nieorganicznego oznaczano stosując spektrofotometr TECATOR AQUATEC 54 ANALYZER. Azot amonowy metoda Nesslera - PN-EN ISO 11732:21; Azot azotanowy (III) i azot azotanowy (V) - PN-EN ISO 13395:21. Zmiana metodyki oznaczania form azotu nieorganicznego podczas badań na kulturze Anammox wynikała z dostępności sprzętu pomiarowego w Politechnice Gdańskiej oraz w Królewskiej Politechnice w Sztokholmie. 65

3.2.2 Metody prowadzenia doświadczeń Metodyki prowadzenia doświadczeń opisano w dalszych rozdziałach, aby łatwiejsze było śledzenie wyników w odniesieniu do całej procedury postępowania w doświadczeniach. I tak poszczególne metodyki zamieszczono w następujących rozdziałach: - badanie podatności sulfonamidów na biodegradację według testu 31D rozdział 4.1.1; - badanie produktów biodegradacji sulfonamidów metodą HPLC rozdział 4.2.1; - badanie aktywności oddechowej za pomocą testów OUR rozdział 5.1.1; - badanie aktywności dehydrogenaz za pomocą testów TTC rozdziały 5.2.1 i 6.5.1; - badanie inhibicji nitryfikacji według PN-EN ISO 959.1 rozdział 5.3.1; - badanie mikroskopowe osadu czynnego rozdział 5.5.1; - badanie wpływu sulfonamidów na proces nitryfikacji rozdział 5.4.1; - badanie wpływu sulfonamidów na proces Anammox rozdziały 6.2.1, 6.3.1, 6.4.1. 3.2.3 Ocena statystyczna wyników eksperymentalnych Wyniki uzyskane podczas prowadzonych eksperymentów poddano analizie statystycznej stosując test Q-Dixona oraz test t-studenta [Czermiński, 1992]. Test Q-Dixona pozwala ocenić czy któryś z wyników jest obarczony błędem grubym i czy w związku z tym należy go uwzględnić przy obliczaniu średniej arytmetycznej. Dla wyznaczenia parametru Q d należy wyniki oznaczeń uporządkować w ciąg rosnący i policzyć go z zależności (11). x2 x = (11) R Q d 1 gdzie: x 1 wynik wątpliwy, x 2 najbliższy wynik sąsiadujący z wątpliwym, R rozstęp wyników w serii. Wartość Q d oblicza się dla wyników ekstremalnych (największego i najmniejszego), a następnie wybiera wartość większą i porównuje z parametrem Q kr. Wynik wątpliwy należy odrzucić, jeżeli wyliczona wartość doświadczalna Q d jest większa od wartości krytycznej dla danej liczby wyników i danego poziomu istotności. 66

Test t-studenta służy do określania błędów systematycznych. Poniżej przedstawiono podstawowe zasady wyznaczania wielkości niezbędnych do statystycznej obróbki wyników. Średnia arytmetyczna ( x ) Średnią arytmetyczną serii wyników wyraża się wzorem 12: x = x x 1 + x2 + x3 +... + xn i = (12) n n gdzie: n liczba wyników w serii, i kolejny numer wyniku. Odchylenie standardowe próby (s) ( x x) s = n 1 i 2 (13) Przedział ufności średniej arytmetycznej Przedział ufności to zakres obejmujący średnią arytmetyczną, o którym można powiedzieć, że przy założonym prawdopodobieństwie (poziom ufności) wartość prawdziwa jest w nim zawarta (równanie 14). µ = x ± ts (14) W pracy przeprowadzono ocenę statystyczną wyników dotyczących oznaczania stężeń poszczególnych form azotu we wszystkich procesach, a także wyników testów OUR. Wyznaczone przedziały ufności zamieszczono w tabelach znajdujących się w Załącznikach 1A, 1B i 2 a także na niektórych rysunkach w tekście pracy. 67

4 Badanie biodegradacji sulfonamidów 4.1 Badanie podatności sulfonamidów na biodegradację metodą OECD Celem tej części badań było określenie podatności na biologiczny rozkład sulfacetamidu (SCM), sulfanilamidu (SA), p-toluenosulfonamidu (p-tsa) i tolbutamidu (TB). 4.1.1 Sposób wykonania testu 31 D Oznaczanie podatności na biodegradację sulfonamidów i wykonywano według wytycznych OECD (Organisation for Economic Co-operation and Development Organizacji Współpracy Gospodarczej i Rozwoju), a więc stosując Test Zamkniętej Butelki test 31 D [OECD, 1992]. Dla każdego sulfonamidu przeprowadzono trzy serie badań. Równocześnie do każdej z serii przygotowano próbę zawierającą zamiast sulfonamidu łatwo biodegradowalną substancję referencyjną (glikol etylenowy) w celu sprawdzenia prawidłowości warunków prowadzenia testu. W każdej serii wykonano też ślepą próbę, z pożywką i inokulum, ale bez dodatkowych substancji. W badaniach używano pożywki, przygotowanej z roztworów podstawowych, których skład przedstawiono w tabeli 1. Tab. 1 Roztwory podstawowe do testu 31D [OECD 1992] Roztwory Składniki podstawowe A Dwuwodoroortofosforan potasu, KH 2 PO 4 Wodoroortofosforan potasu, K 2 HPO 4 Wodoroortofosforan sodu dwuwodny, Na 2 HPO 4 2H 2 O Chlorek amonu, NH 4 Cl Stężenie [g/l] 8,5 21,75 33,4,5 B Chlorek wapnia bezwodny, CaCl 2 27,5 C Siarczan magnezu siedmiowodny, MgSO 4 7H 2 O 22,5 D Chlorek żelaza (III) sześciowodny, FeCl 3 7H 2 O,25 Składniki roztworów podstawowych rozpuszczono w wodzie i uzupełniono każdy do objętości 1 litra. Z poszczególnych roztworów sporządzano pożywkę w ten sposób, że do 1 litra wody destylowanej dodawano po jednym ml każdego z roztworów podstawowych (A, B, C, D). Następnie przygotowywano roztwory sulfonamidów w pożywce (4 mg/l dla SCM, SA, p-tsa oraz 2 mg/l dla TB ze względu na niską rozpuszczalność). Tak przygotowane roztwory zaszczepiano inokulum w ilości 1 ml/l, a następnie przechowywano w całkowicie napełnionych i 68

zamkniętych butelkach, w ciemności i w stałej temperaturze. Inokulum stanowiła ciecz nadosadowa, która została pobrana z komory nitryfikacji w oczyszczalni ścieków bytowo-gospodarczych Wschód w Gdańsku lub z reaktora SBR w oczyszczalni ścieków w Swarzewie. Standardowy okres inkubacji wynosi 28 dni, jednak został on wydłużony do 49 dni ze względu na niski stopień biodegradacji badanych substancji, a także w celu wstępnej oceny możliwości adaptacji mikroorganizmów do obecności badanych sulfonamidów. Stopień biodegradacji wyrażano jako stosunek BZT do teoretycznego zapotrzebowania na tlen (TZT). Wyniki obliczano ze wzoru (15) [OECD, 1992]: BZT % = 1 TZT gdzie: BZT- biochemiczne zapotrzebowanie na tlen [mgo 2 /l], TZT- teoretyczne zapotrzebowanie na tlen [mgo 2 /l]. rozkadu (15) Ilość teoretycznego zapotrzebowania na tlen (TZT) obliczono na podstawie składu chemicznego substancji [OECD, 1992]. Dla związku: C c H h Cl cl N n Na na O o P p S s wartość teoretycznego zapotrzebowania na tlen obliczono ze wzoru (16). TZT= 16 [ 2c + 1/ 2( h cl) + 5/ 2n + 3s + 5/ 2 p + 1/ 2na o] M (16) gdzie: M masa molowa związku [g/mol]. Wyliczone wartości TZT dla badanych sulfonamidów przedstawiono w tabeli 11. Tab. 11 Wartości teoretycznego zapotrzebowania na tlen badanych sulfonamidów Substancja Wzór sumaryczny TZT [mg O 2 /mg badanej substancji] SCM C 6 H 1 N 2 O 3 S 1,94 SA C 6 H 8 N 2 O 2 S 2,4 TB C 12 H 18 N 2 O 3 S 2,25 p-tsa C 7 H 9 NO 2 S 2,6 Glikol etylenowy C 2 H 6 O 2 1,29 69

4.1.2 Wyniki i dyskusja Na rysunkach 12 i 13 przedstawiono szybkość biodegradacji badanych sulfonamidów. Każdy z punktów na rysunkach 12 i 13 reprezentuje średnie wartości z trzech niezależnych doświadczeń. Według wytycznych OECD, dowodem wysokiej podatności na biodegradację w teście 31 D jest minimum 6% biodegradacji substancji, uzyskane w ciągu 1 dni podczas 28 dniowego testu [OECD, 1992]. Już na podstawie wstępnych badań stwierdzono, iż badane związki są trudno biodegradowalne (rys. 12). Toteż w następnej serii czas trwania badania przedłużono o kolejne 21 dni. Tak więc ostatecznie, czas trwania tych badań wynosił 49 dni (rys. 13). Biodegradacja [%] 6 5 4 3 2 1 SCM TB SA p-tsa 5 1 15 2 25 3 Czas [dni] Rys. 12 Biodegradacja sulfonamidów. Inokulum pobrane z oczyszczalni ścieków SBR w Swarzewie Biodegradacja [%] 6 5 4 3 2 1 SA p-tsa SCM TB 1 2 3 4 5 Czas (dni) Rys. 13 Biodegradacja sulfonamidów. Inokulum pobrane z oczyszczalni Wschód w Gdańsku W pierwszym doświadczeniu zastosowano inokulum pochodzące z oczyszczalni ścieków w Swarzewie, która pracuje w systemie SBR (Sequence Batch Reaktor), natomiast do przeprowadzenia drugiego doświadczenia wykorzystano inokulum pochodzące z oczyszczalni Wschód, pracującej w systemie UCT (University Cape Town). W tych dwóch oczyszczalniach ścieków stosowane są różne technologie, różna jest też jakość osadu czynnego, stąd obserwowane są różnice wyników testu, w szczególności w ciągu pierwszych dni doświadczeń. Wyższe wartości stopnia biodegradacji uzyskano stosując inokulum ze Swarzewa. 7

Niemniej, na podstawie wyników obu doświadczeń stwierdzono, że sulfonamidy: sulfacetamid, sulfanilamid oraz tolbutamid są związkami trudno biodegradowalnymi, ponieważ ich stopień biodegradacji mieści się w zakresie zaledwie 1-2% i po 2-3 dniach stopień biodegradacji już się nie zmieniał. Stwierdzono natomiast, że p-toluenosulfonamid jest łatwiej degradowalny od pozostałych związków. Biodegradacja badanych sulfonamidów w serii badań wykorzystującej osad czynny z oczyszczalni w Swarzewie wynosiła po 28 dniach 46,8%, 13,5%, 14,7%, 17% odpowiednio dla p-tsa, SCM, SA i TB (rys. 12). Natomiast biodegradacja przeprowadzona przy użyciu inoculum z Oczyszczalni Wschód wynosiła po 28 dniach dla p-tsa 32,3%, a dla SCM, SA i TB wynosiła odpowiednio 8%, 1,6% i 9,2% (rys. 13). W dłużej prowadzonym doświadczeniu z tym samym inoculum (po 49 dniach, Rys. 13) uzyskano nieznacznie lepsze wyniki: 15,7%, 17,4%, 17,3 % oraz 44,6%, odpowiednio dla SCM, SA, TB oraz p-tsa. Może to wynikać ze zdolności mikroorganizmów do adaptacji, w szczególności w przypadku p-tsa. Jednakże, zgodnie z wytycznymi OECD przyjmuje się, że substancja chemiczna może być sklasyfikowana jako podatna na biodegradację, gdy w trakcie 28 dniowego testu osiągnie co najmniej 6% biodegradacji w ciągu dowolnego okresu 1 dni [OECD, 1992]. Toteż należy stwierdzić, że badane sulfonamidy trudno ulegają biodegradacji. Powyższe wyniki potwierdziły obserwacje niskiej podatności sulfonamidów, raportowane przez innych naukowców [Halling-Sørensen et al., 1998; Al-Ahmed et al., 1999]. Wydłużenie czasu ekspozycji mikroorganizmów na działanie sulfonamidów tylko nieznacznie zwiększa stopień biodegradacji SA, TB i SCM, natomiast stopień biodegradacji p-tsa wzrósł od 32% do 44,6% (czyli wzrósł aż o 38% w stosunku do wartości uzyskanej w standardowym czasie). Reasumując, można uszeregować badane sulfonamidy pod względem podatności na biodegradację w sposób następujący: SA = TB SCM << p-tsa 71

4.2 Badanie postępu biodegradacji sulfonamidów metodą HPLC Celem tej części pracy było zbadanie przemian sulfonamidów w trakcie procesu biologicznego oczyszczania ścieków z osadem czynnym. Wykorzystano w tym celu metodę wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC). 4.2.1 Sposób wykonania badań HPLC Do badania biodegradacyjnych przemian sulfonamidów, zamiast próbek z badań biodegradacji testem OECD, wykorzystano próbki cieczy nadosadowej, pobrane z reaktorów biologicznych, w których prowadzono długookresowe procesy nad wpływem sulfonamidów na osad czynny. Procesy te są opisane w rozdziale 5.4. Do przeprowadzenia badań wykorzystano modułowy chromatograf Merck Hitachi, (Niemcy) serii LaChrom złożony z: pompy HPLS L-62 Intellligent Pump; dozownika Rheodyne; termostatu kolumny; kolumny chromatograficznej C 18 (Merck LiChrospher 1RP-18,) 25x4mm, Ø porów 5µm; detektora L-745A LaChrom UV-VIS/DAD (Merck Hitachi); interfejsu D-6 (Merck Hitachi); komputera z oprogramowaniem D-7 HSM. W oparciu o przeprowadzony przegląd literaturowy, a w szczególności o prace Hartig et al., wyznaczono warunki przeprowadzenia rozdziału [Hartig et al., 1999]. Rozdzielanie prowadzono w warunkach elucji izokratycznej tzn. rozdzielania ze stałym składem fazy ruchomej. Do przeprowadzenia analizy użyto wodę dejonizowaną, acetonitryl (ACN) oraz kwas trifluoroctowy (TFA). Wszystkie zastosowane podczas badania odczynniki posiadały czystość analityczną >99%. Warunki przeprowadzenia badań chromatograficznych przedstawia tabela 12. Fazę ruchomą (eluent) stanowiła mieszanina ACN:H 2 O o ustalonym eksperymentalnie stosunku objętościowym 4:6, z dodatkiem,5% TFA. Przygotowanie próbek do przeprowadzenia chromatografii cieczowej polegało na odparowaniu 2,5 ml próbki do uzyskania suchej pozostałości. Suchą pozostałość następnie rozpuszczano w 5 ml eluentu. Tak przygotowaną próbkę wstrzykiwano do kolumny chromatograficznej w ilości 2µl i w zadanych warunkach prowadzono rozdział. Pik SA występował przy długości fali 264 nm, pik SCM przy 273 nm, natomiast pik p-tsa przy długości 542 nm. Identyfikacja pików badanych sulfonamidów z rzeczywistych próbek oparta była na czasie retencji, który dla SA wynosił 3,12 min, dla SCM 3,49, a dla p-tsa 5,6 min. 72

Tab. 12 Warunki rozdziału i detekcji badanych próbek Kolumna LiChrospher 1RP-18 25x4mm d p =5 µm Eluent ACN:H 2 O 4:6 v/v +,5%TFA Temperatura 2 C Prędkość przepływu eluentu Ciśnienie Detektor Zakres długości fali,8 ml/min ~118 Ba L-745A LaChrom UV-VIS/DAD 2-4 nm W celu ilościowego oznaczenia sulfonamidów wykorzystano metodę wzorca zewnętrznego. Próbki wzorcowe przygotowano przez rozpuszczenie sulfonamidów w roztworze eluentu. Rysunek 14 przedstawia krzywe kalibracji, wykonane dla roztworów SA i SCM, natomiast rysunek 15 krzywą kalibracji dla p-tsa. Liniowe współczynniki korelacji (R 2 ) wynoszą,9994,,9996 oraz,9993 odpowiednio dla SA, SCM i p-tsa. powierzchnia piku 7 6 5 4 3 2 1 SA y = 15627x + 31894 SCM R 2 =,9994 y = 8912,7x + 16141 R 2 =,9996 1 2 3 4 5 Stężenie SA,SCM [mg/l] Rys. 14 Krzywe kalibracyjne do odczytu stężenia sulfonamidów SA i SCM 73

powierzchnia piku 6 5 4 3 2 1 y = 27341x + 157,3 R 2 =,9993 5 1 15 2 Stężenie p-tsa [mg/l] Rys. 15 Krzywa kalibracyjna do odczytu stężenia sulfonamidu p-tsa Przygotowanie próbek do przeprowadzenia analizy chromatograficznej polegało na odparowaniu do sucha 2,5 ml cieczy nadosadowej, pobranej z reaktorów, w których prowadzono badania długookresowego wpływu sulfonamidów na proces nitryfikacji (rozdz. 5.4). Następnie, suchą pozostałość rozpuszczano w 5 ml eluentu. Z tak przygotowanej próbki wstrzykiwano 2µl na kolumnę chromatograficzną i w zadanych warunkach prowadzono rozdział obecnych substancji. 4.2.2 Wyniki i dyskusja Na rysunku 16 przedstawiono przykładowe chromatogramy dla próbek zawierających SA. W tabelach 13 i 14 przedstawiono stężenia sulfonamidów, SA i SCM, oznaczone w ściekach modelowych, wprowadzanych i opuszczających reaktory po okresie 3 dni aklimatyzacji osadu czynnego do obecności wymienionych sulfonamidów (patrz, rozdz. 5.4). Jak widać z rys. 16, zarówno w ściekach modelowych jak i w ściekach oczyszczonych, oprócz SA znajdowały się substancje, które były wymywane po czasie od 2,1 do 2,65 min., a więc przed sulfonamidem. Substancji tych nie identyfikowano, a mogą to być inne składniki organiczne ścieków modelowych (patrz, tabela 26, rozdz. 5.4.1). Podobne piki występowały także na wszystkich chromatogramach próbek zawierających SCM. Ponadto, w ściekach oczyszczonych z procesów z udziałem SA znajdowały się dodatkowe substancje niezidentyfikowane (przy czasie retencji 5,8 min), które mogły pochodzić z biodegradacji bazowych związków organicznych. Podobne piki niezidentyfikowanych związków znajdowały się na wszystkich chromatogramach dla próbek zawierających SA, ale nie stwierdzono ich w próbkach z procesów z udziałem SCM. 74

Rys. 16 Przykładowe chromatogramy dla próbek z procesu z udziałem SA ( 2 mg/l); lewy - próbka na wejściu; prawy próbka na wyjściu Tab. 13 Wyniki próbek pochodzących z procesów z udziałem SA założone stężenie SA [mg/l] stężenie na wejściu [mg/l] substancje inne stężenie na wyjściu [mg/l] substancje inne SA przed SA za SA SA przed SA za SA - - - - 2 22,94 + + + + 4 47,2 + + + + 8 71,85 + + + + Tab. 14 Wyniki próbek pochodzących z procesów z udziałem SCM założone stężenie SCM [mg/l] stężenie na wejściu [mg/l] substancje inne stężenie na wyjściu [mg/l] substancje inne SCM przed SCM za SCM SCM przed SCM za SCM - - - - 2 23,94 + + + - 4 31,73 + + 9,9 + - 8 91,85 + + 2,27 + - Jak widać z tabeli 13, w ściekach oczyszczonych, pochodzących z procesów z udziałem SA, stwierdzono całkowity zanik tego związku we wszystkich seriach. Jednakże w każdej próbce ścieków, zarówno wprowadzanych jak i oczyszczonych, stwierdzano obecność innych substancji organicznych, o czasie retencji zarówno krótszym jak i dłuższym od czasu retencji SA. W przypadku rozdziału próbek pochodzących z procesów z udziałem SCM stwierdzono całkowity zanik SCM jedynie w procesie ze stężeniem 2 mg SCM/l, w pozostałych próbkach zidentyfikowano pewne ilości tego związku (tab. 14). Natomiast w tym przypadku nie stwierdzono w ściekach odprowadzanych obecności innych substancji o dłuższym czasie retencji. 75

W oparciu o wcześniej prezentowane wyniki badania stopnia biodegradacji SA i SCM, ocenianego na podstawie testu 31D (rozdz. 4.1), stwierdzono że oba związki są trudno biodegradowalne, a wyznaczone stopnie biodegradacji są podobne. Natomiast porównując wyniki z analiz HPLC z postępem biodegradacji można stwierdzić, że całkowity (w przypadku SA) zanik sulfonamidu nie jest równoznaczny z jego pełną biodegradacją (oznaczony stopień biodegradacji wynosił zaledwie kilka do kilkunastu procent). Oznacza natomiast zajście pierwszej fazy biodegradacji - utraty identyczności związku, co wykazuje analiza HPLC, a potwierdzeniem tego jest pojawienie się na chromatogramie nowych związków, prawdopodobnie produktów rozkładu. W przypadku SCM, zanik tego związku w dwóch seriach nie jest całkowity (tab.14), ale i tak jest znacznie większy niż oznaczony postęp biodegradacji, co także sugeruje tylko częściowy rozkład. Brak pików przy wyższych czasach retencji może świadczyć jedynie o tym, że produkty rozkładu obu sulfonamidów różnią się czasami retencji, a nie o braku takich produktów w przypadku SCM. Większy problem pojawił się w badaniach próbek zawierających p-tsa. Wyniki chromatograficznego rozdziału były trudne do zinterpretowania, ze względu na obecność znacznej liczby niezidentyfikowanych składników - prawdopodobnie produktów rozkładu biologicznego. Potwierdzeniem tego może być fakt, że związek ten, w porównaniu z pozostałymi sulfonamidami ulegał w najwyższym stopniu biodegradacji (do około 45%, rozdz. 4.1). Na podstawie przeprowadzonych analiz HPLC nie można wyciągnąć bardziej szczegółowych wniosków, odnośnie przemian sulfonamidów podczas biologicznego oczyszczania ścieków i powstających produktów biodegradacji. Konieczne jest opracowanie znacznie lepszych parametrów rozdziału i identyfikacji wszystkich substancji znajdujących się w próbkach badanych ścieków. Wychodziło to poza zakres tej pracy, a przeprowadzone badania potraktowano jako wstępne rozpoznanie. 76

5 Badanie wpływu sulfonamidów na proces nitryfikacji Celem badań w ramach tej części pracy było określenie wpływu wybranych sulfonamidów na aktywność osadu czynnego, zwłaszcza w odniesieniu do procesu nitryfikacji. Wyniki badań miały odpowiedzieć na następujące pytania: Czy badane sulfonamidy wpływają na kondycję mikroorganizmów osadu czynnego? Czy badane sulfonamidy mogą zakłócać proces nitryfikacji? Czy czas ekspozycji osadu czynnego na działanie sulfonamidów ma wpływ na zdolność mikroorganizmów do nitryfikacji, a więc czy są one zdolne zaadaptować się do ciągłej obecności wysokich stężeń sulfonamidów? Do oceny wpływu sulfonamidów na mikroorganizmy osadu czynnego wykorzystano trzy różne metody. Były to: testy szybkości zużycia tlenu (OUR), testy aktywności dehydrogenaz (TTC), oraz testy na hamowanie nitryfikacji przez te związki. Badania te pozwoliły określić wpływ sulfonamidów na proces nitryfikacji. Przebieg procesu nitryfikacji był badany podczas 3-dniowej ekspozycji mikroorganizmów osadu czynnego na działanie różnych stężeń wybranych sulfonamidów, a po zakończeniu procesu przeprowadzono ocenę aktywności bakterii osadu czynnego (testy OUR). Dodatkowo, przeprowadzono mikroskopową analizę osadu po tym procesie. 5.1 Badanie wpływu sulfonamidów na aktywność oddechową mikroorganizmów osadu czynnego 5.1.1 Sposób wykonania testów OUR Szybkość respiracji mikroorganizmów osadu czynnego była mierzona podczas testów OUR (Oxygen Uptake Rate). Testy OUR przeprowadzano w ten sposób, że do butelki Winklera o objętości 3 ml wprowadzano osad czynny oraz roztwór sulfonamidu w takich ilościach, by końcowa objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 28 ml. Następnie w butelce umieszczano elektrodę tlenową i szczelnie zamykano. Elektroda tlenowa CellOx 325 była podłączona do miernika wieloparametrowego WTW Multi 34i z odczytem on-line i rejestracją stężenia tlenu. Inhibitory reakcji NaClO 3 oraz ATU były dodawane przy użyciu strzykawek. Mieszadło magnetyczne zapewniało dokładne mieszanie mieszaniny reakcyjnej. Zestaw do pomiaru OUR został przedstawiony na rysunkach 17 i 18. 77

Rys. 17 Schemat zestawu do pomiaru OUR Rys. 18 Zestaw do prowadzenia testów OUR Do przeprowadzenia testów respirometrycznych OUR wykorzystywano nitryfikujący osad, pobrany z komory napowietrzania Oczyszczalni WSCHÓD w Gdańsku. Przed testem osad był napowietrzany przez ok. 8 godzin w celu usunięcia łatwo rozkładalnych substancji organicznych. Pojedynczy test OUR trwał 1 minut. Podczas testu odczytywano on-line co 5 sekund, wartości stężenia tlenu rozpuszczonego. Początkowo wyznaczano OUR całkowite (OUR całk.). Następnie kolejno dodawano do mieszaniny reakcyjnej w stałych odstępach czasowych (ok. 3 minut) specyficzne inhibitory procesu nitryfikacji, 5 ml NaClO 3 (stężenie roztworu 17 mm) oraz 5ml ATU (stężenie roztworu 43 μm). Inhibitory te hamuj ą poszczególne etapy nitryf ikacji: NaClO 3 hamuje utlenianie jonów NO - 2, natomiast ATU utlenianie jonów NH + 4. Po dodaniu kolejnych inhibitorów wyznaczano OUR1 (po dodaniu NaClO 3 ) i OUR 2 (po dodaniu ATU). Po kolejnych 4 minutach test był kończony, a następnie były oznaczane zawiesina, sucha pozostałość i pozostałość po prażeniu. W celu oznaczenia suchej masy organicznej (smo), obliczano różnicę miedzy suchą pozostałością a pozostałością po prażeniu według PN EN 12879:24. Na podstawie otrzymanych wyników sporządzano wykresy szybkości poboru tlenu w czasie. Schematyczny przebieg zużycia tlenu podczas testu OUR przedstawiono na rysunku 19 [Surmacz-Górska et al., 1996]. Szybkości poboru tlenu przez mikroorganizmy osadu czynnego wyznaczano z nachylenia linii trendu krzywej zużycia tlenu na odcinkach: przed dodaniem selektywnych inhibitorów, po dodaniu NaClO 3 oraz po dodaniu ATU. Współczynniki kierunkowe poszczególnych linii trendu ( a, c i e ) są miarą zużycia tlenu w czasie. Pierwszy odcinek na krzywej zależności zużycia tlenu w czasie odpowiada całkowitemu poborowi tlenu przez mikroorganizmy osadu czynnego (OUR całk linia różowa: y = -ax + b). Drugi odcinek wyraża zużywanie tlenu przez bakterie Nitrosomonas i heterotrofy po dodaniu inhibitora NaClO 3, który hamuje aktywność bakterii Nitrobacter (OUR 1 - linia niebieska: y -cx + d). Trzecia linia zaczyna się po dodaniu ATU, selektywnego inhibitora utleniania azotu amonowego i charakteryzuje zużywanie tlenu przez bakterie heterotroficzne (OUR 2 - linia zielona: y = -ex + f). 78

Rys. 19 Schematyczny przebieg zużycia tlenu podczas testu OUR Szybkość poboru tlenu przez bakterie Nitrobacter (OUR Nb ) wyznaczano z różnicy między OUR całkowitym a OUR 1. Natomiast różnica pomiędzy OUR 1 a OUR 2 wyraża zużywanie tlenu przez bakterie Nitrosomonas (OUR Ns ). Zmierzone OUR 2 odpowiada szybkości poboru tlenu przez heterotrofy (OUR Ht ). Z różnicy pomiędzy OUR całkowitym a OUR 2 wyznaczano szybkość zużywania tlenu przez bakterie nitryfikujące (OUR nitryf.) według równania 24. Wyznaczone zmiany stężenia tlenu w czasie były następnie przeliczane na jednostkę suchej biomasy (organicznej) i wyrażane w mg O 2 /g smo h. Równania 17-21 przedstawiają wyżej opisaną procedurę wyznaczania szybkości poboru tlenu przez określone grupy mikroorganizmów osadu czynnego. OUR całk = a (17) OUR Nb = OUR całk - OUR 1 = a c (18) OUR Ns = OUR 1 OUR 2 = c e (19) OUR Ht = OUR 2 = e (2) OUR nitryf = OUR całk OUR Ht = a-e (21) Ponadto, dokonano porównania między wartością OUR całk, wyznaczoną z krzywej zużycia tlenu przed dodaniem inhibitorów (równanie 17), a wartością uzyskaną po zsumowaniu szybkości zużycia tlenu dla poszczególnych grup mikroorganizmów (OUR suma, równanie 22). Podobnie porównano wartość OUR nitryf. wyznaczone z równania 21 z wartością uzyskaną jako sumę szybkości poboru tlenu przez bakterie Nitrosomonas (OUR Ns ) i Nitrobacter (OUR Nb ) według równania 23. OUR suma = OUR Ns + OUR Nb + OUR Ht (22) OUR (Ns+ Nb) = OUR Ns + OUR Nb (23) 79

5.1.2 Wykonanie testów OUR dla próbek świeżego osadu czynnego Za pomocą testów OUR zbadano wpływ trzech sulfonamidów (p-tsa, SA, SCM) na kondycję osadu czynnego, pobranego z oczyszczalni Wschód w Gdańsku. Dla każdego sulfonamidu wykonano po trzy serie doświadczeń, każde doświadczenie dla innego stężenia sulfonamidu:, 1, 1, 1 oraz 1 mg/l. Wykonano po trzy powtórzenia w każdej serii, używając za każdym razem innej próbki osadu. Łącznie użyto 9 różnych próbek osadu (oznaczone kolejno numerami od 1 do 9). W tekście pracy zamieszczono tylko przykładowe wyniki, po jednej serii dla każdego sulfonamidu (pozostałe wyniki znajdują się w załączniku 1A), natomiast wnioski zostały wyciągnięte na podstawie wszystkich wyników. Testy w obecności p-tsa Na rysunku 2 przedstawiono zmiany szybkości poboru tlenu przez poszczególne grupy mikroorganizmów osadu czynnego 2, użytego w doświadczeniach z p-tsa. Poszczególnymi kolorami oznaczono powtórzenia analizy OUR. Na rysunkach 21 23 przedstawiono zmiany szybkości poboru tlenu przez poszczególne grupy mikroorganizmów osadu czynnego 2, w zależności od stężenia p-tsa. Średnie wartości aktywności oddechowej (z trzech analiz), uzyskane dla bakterii Nitrosomonas, Nitrobacter i mikroorganizmów heterotroficznych w osadzie 2 wyniosły odpowiednio:,63; 1,15; 5,22 mg O 2 /g smo h (rys. 23, oraz załącznik 1A). Bakterie Nitrobacter wykazały wyższą aktywność niż bakterie Nitrosomonas, a najwyższe wartości poboru tlenu stwierdzono u heterotrofów (rys. 23). Podobną zależność stwierdzono dla wszystkich użytych osadów czynnych (osady 1, 2 i 3), z tym, że wartości OUR w każdym przypadku były różne. Wyniki te znajdują się w załączniku 1A. ptsa= 1 2 3 6, szybkość poboru tlenu [ mg O2/gVSS*h] 5, 4, 3, 2, 1,, Ns Nb Ht Rys. 2 Aktywność oddechowa mikroorganizmów osadu czynnego 2 użytego w serii 2 (próba kontrolna) 8

OUR Ns [mg O 2 /g VSS] 1,2 1,8,6,4,2 1 1 1 1 Stężenie p-tsa [mg/l] Rys. 21 Aktywność oddechowa bakterii Nitrosomonas w osadzie 2 w obecności p-tsa 2 OUR Nb [mg O 2 /g VSS] 1,6 1,2,8,4 1 1 1 1 Stężenie p-tsa [mg/l] Rys. 22 Aktywność oddechowa bakterii Nitrobacter w osadzie 2 w obecności p-tsa. OUR Ht [mg O 2 /g VSS] 7 6 5 4 3 2 1 1 1 1 1 Stężenie p-tsa [mg/l] Rys. 23 Aktywność oddechowa heterotrofów w osadzie 2 w obecności p-tsa Na podstawie wyników uzyskanych dla osadu 2 stwierdzono, że obecność p-tsa powoduje spadek aktywności zarówno bakterii Nitrosomonas, jak i Nitrobacter, przy czym w stosunku do próby kontrolnej był on większy dla bakterii Nitrobacter. Ze wzrostem stężenia p-tsa wartości OUR niezbyt zmieniały się, a różnice były w zakresie błędu (rys. 21, 22). Z kolei nie stwierdzono wpływu p-tsa na aktywność oddechową heterotrofów (rys. 23). Na rysunku 24 porównano wartości aktywności oddechowej wszystkich mikroorganizmów osadu czynnego, wyznaczone dwoma metodami. Szybkość poboru tlenu przez wszystkie mikroorganizmy osadu czynnego wyznaczono przed dodaniem inhibitorów jako tzw. OUR całk (według wzoru 17, zaznaczone kolorem zielonym), oraz obliczono jako sumę wartości OUR dla bakterii Ns, Nb oraz Ht, tzw. OUR suma (zgodnie ze wzorem 22, kolor czerwony). Wszystkie obliczenia zamieszczono w tabelach 4 i 5 w załączniku 1A. 81

OURcałk. [mgo2/gvss*h] 8 7 6 5 4 3 2 1 zmierzony przed dodaniem inhibitorów OUR Ns + OUR Nb + OUR Ht 1 1 1 1 stężenie ptsa (mg/l) Rys. 24 Aktywność oddechowa mikroorganizmów osadu czynnego 2 w zależności od stężenia p-tsa wyznaczona przed dodaniem inhibitorów oraz metodą sumowania (według wzorów 17 i 22) Średnia szybkość poboru tlenu przez mikroorganizmy osadu czynnego 2 na odcinku przed dodaniem inhibitorów (OUR całk ) w próbie kontrolnej wyniosła 6,47 mg O 2 /g smo h (tab. 15), przy czym wartości średnie OUR uzyskane dla Ns, Nb, Ht wyniosły odpowiednio,63; 1,15; 5,22 mg O 2 /g smo h (tab. 2, zał. 1A) co po zsumowaniu daje OUR suma = 7, mg O 2 /g smo h. Podobne różnice obserwowano dla prób z sulfonamidami, przy czym zwykle wartości OUR całk są niższe. Różnice między OUR całk i OUR suma, odniesione do wartości OUR suma, wynoszą 2,6 do 11,2%. Wartości te zestawiono w tabeli 15. Tab. 15 Zestawienie wartości średnich OUR całk. osadu czynnego 2 w zależności od stężenia p-tsa wyznaczone przed dodaniem inhibitorów i metodą sumowania OUR [mgo 2 /g smo h] stężenie p-tsa [mg/l] 1 1 1 1 OUR suma 7, 7,17 6,14 6,26 7,51 OUR całk 6,47 6,98 5,52 5,55 7,22 różnica (OUR suma - OUR całk.),53,19,62,7,29 Różnica [%] 7,57 2,65 1,1 11,18 3,86 Testy w obecności SCM Rysunki 25-27 prezentują zmiany szybkości poboru tlenu (średnie wartości) przez bakterie Ns, Nb i Ht w zależności od stężenia SCM, uzyskane w badaniach na osadzie czynnym 6. Na rysunku 28 porównano wartości aktywności oddechowej wszystkich mikroorganizmów osadu czynnego, wyznaczone dwoma metodami (według wzoru 17 i 22, patrz, tabele 9 i 1, zał. 1A). 82

OUR Ns [mg O 2 /g VSS] 1,2 1,8,6,4,2 1 1 1 1 Stężenie SCM [mg/l] Rys. 25 Aktywność oddechowa bakterii Nitrosomonas w osadzie 6 w obecności SCM 1 OUR Nb [mg O 2 /g VSS],8,6,4,2 1 1 1 1 Stężenie SCM [mg/l] Rys. 26 Aktywność oddechowa bakterii Nitrobacter w osadzie 6 w obecności SCM. OUR Ht [mg O 2 /g VSS] 6, 5, 4, 3, 2, 1,, 1 1 1 1 Stężenie SCM [mg/l] Rys. 27 Aktywność oddechowa heterotrofów w osadzie 6 w obecności SCM OURcałk. [mgo2/gvss*h] 7 6 5 4 3 2 1 zmierzone przed dodaniem inhibitorów OUR Ns + OUR Nb + OUR Ht 1 1 1 1 stężenie SCM (mg/l) Rys. 28 Aktywność oddechowa mikroorganizmów osadu czynnego 6 w zależności od stężenia SCM wyznaczona przed dodaniem inhibitorów (rów. 17) oraz metodą sumowania (rów. 22) 83

Na podstawie uzyskanych wyników dla osadu 6 widać znaczny spadek aktywności oddechowej bakterii nitryfikujących wskutek dodania SCM, przy czym wzrost stężenia tego sulfonamidu nie powoduje wyraźnego dalszego obniżania wartości OUR (rys. 25 i 26). Równocześnie, podobnie jak w przypadku p-tsa nie widać wpływu SCM na szybkość zużycia tlenu przez mikroorganizmy heterotroficzne (rys. 27). Z rys. 28 widać, że całkowity OUR obniża się stopniowo, wraz ze wzrostem stężenia SCM od około 6 mg O 2 /g smo h do około 4,5 mg O 2 /g smo h i to niezależnie od metody obliczania. Testy w obecności SA Na rysunkach 29-31 przedstawiono szybkości poboru tlenu (średnie wartości) przez bakterie Ns, Nb i Ht w zależności od stężenia SA, uzyskane dla osadu czynnego 9, zaś na rysunku 32 porównano wartości aktywności oddechowej wszystkich mikroorganizmów osadu czynnego, wyznaczone dwoma metodami (według wzoru 17 i 22, patrz, zał. 1, tabele 14 i 15). OUR Ns [mg O 2 /g VSS] 2, 1,8 1,6 1,4 1,2 1,,8,6,4,2, 1 1 1 1 Stężenie SA [mg/l] Rys. 29 Aktywność oddechowa bakterii Nitrosomonas w osadzie 9 w obecności SA OUR Nb [mg O 2 /g VSS] 3,5 3, 2,5 2, 1,5 1,,5, 1 1 1 1 Stężenie SA [mg/l] Rys. 3 Aktywność oddechowa bakterii Nitrobacter w osadzie 9 w obecności SA 84

OUR Ht [mg O 2 /g VSS] 12, 1, 8, 6, 4, 2,, 1 1 1 1 Stężenie SA [mg/l] Rys. 31 Aktywność oddechowa heterotrofów w osadzie 9 w obecności SA OURcałk. [mgo2/gvss*h] 14 12 1 8 6 4 2 zmierzone przed dodaniem inhibitorów OUR Ns + OUR Nb + OUR Ht 1 1 1 1 stężenie SA (mg/l) Rys. 32 Aktywność oddechowa mikroorganizmów osadu czynnego 9 w zależności od stężenia SA wyznaczona przed dodaniem inhibitorów (rów. 17) oraz metodą sumowania (rów. 22) Na podstawie wyników uzyskanych dla osadu 9 stwierdzono znaczne obniżenie aktywności oddechowej bakterii nitryfikujących (Ns i Nb) po dodaniu SA (rys. 29 i 3). Ponadto widać, że w przypadku SA bardziej wrażliwe są bakterie Nitrosomonas niż Nitrobacter, przeciwnie niż w przypadku p-tsa i SCM. Z kolei dla bakterii Nitrobacter obserwuje się wyraźną tendencję spadkową aktywności oddechowej wraz ze wzrostem stężenia SA. Również inaczej niż dla p-tsa i SCM przebiega zmiana wartości OUR dla bakterii heterotroficznych, gdyż SA powoduje znaczne obniżenie ich aktywności, od 9,5 do 6,8 mg O 2 /g smo h (rys. 31). Taka sama tendencja jest obserwowana dla całkowitego OUR, spadek od wartości około13 do około 8 mg O 2 /g smo h. Z powyższych wyników można wnioskować, że najbardziej szkodliwy wpływ na aktywność osadu czynnego może wywierać sulfanilamid (SA). Potwierdzają to pozostałe wyniki, zamieszczone w załączniku. Należy także pamiętać, że udział bakterii heterotroficznych w poborze tlenu jest dominujący i waha się od około 8% do około 9% całkowitego poboru tlenu. Tak więc wrażliwość bakterii Ht na poszczególne sulfonamidy będzie decydowała o zmianie całkowitej aktywności oddechowej osadu pod wpływem sulfonamidów, co można zauważyć porównując np. rysunki 23 i 24 oraz 31 i 32. Konieczne jest jednak uwzględnienie faktu, że początkowa aktywność poszczególnych 85

próbek osadu była różna (od 4,54 do 14,57 mg O 2 /l). Porównując rysunki 22 i 58 widać, że im wyższa była początkowa aktywność osadu, tym bardziej był on wrażliwy na wpływ sulfonamidów. Toteż przeprowadzono obliczenia inhibicji aktywności oddechowej mikroorganizmów, spowodowanej przez sulfonamidy, dla wszystkich próbek osadu czynnego. 5.1.3 Inhibicja aktywności oddechowej mikroorganizmów osadu czynnego w obecności sulfonamidów Inhibicję aktywności oddechowej wyrażano jako procent obniżenia wartości OUR w stosunku do próby kontrolnej i wyznaczano ze wzoru 24 [Massone, 1996]: % OUR - OUR = OUR 1% sulf inhibicji (24) gdzie: OUR szybkość zużycia tlenu przez osad czynny w próbie kontrolnej, OUR sulf. szybkość zużycia tlenu przez osad czynny w obecności sulfonamidu. Inhibicję aktywności oddechowej, spowodowaną dodaniem poszczególnych sulfonamidów, obliczono dla poszczególnych grup bakterii osadu czynnego, a wyniki przedstawiono w tabelach 16-18. W tabelach podano też wartości OUR całk dla poszczególnych osadów, uzyskane w testach kontrolnych. Tab. 16 Zestawienie wartości inhibicji aktywności oddechowej Ns, Nb, Ht pod wpływem różnych stężeń p-tsa uzyskanych dla osadów 1, 2 i 3. Hamowanie aktywności oddechowej [%] Bakterie Stężenie p-tsa [mg/l] 1 1 1 1 Osad 1 (OUR - 14,57 mgo 2 /g smo * h) Ns 54 25 48 45 Nb 9 25 31 26 Ht 16 1 25 Osad 2 (OUR - 6,99 mgo 2 /g smo * h) Ns 21 29 16 53 Nb 49 46 39 36 Ht 3 4 Osad 3 (OUR - 17,5 mgo 2 /g smo * h) Ns 17 17 51 35 Nb 21 5 32 41 Ht 6 7 86

Na podstawie wyników przedstawionych w tabeli 16 widać, że nie ma wyraźnej zależności między obniżeniem szybkości poboru tlenu przez osad czynny a stężeniem p-tsa. Wartości inhibicji były bardzo zróżnicowane i we wszystkich seriach pomiarów wahały się od do 54%. Najbardziej wrażliwe okazały się bakterie Nitrosomonas (16 54 % inhibicji), nieznacznie mniej - bakterie Nitrobacter (9 5 % inhibicji). Ponadto, we wszystkich seriach nie stwierdzono istotnego wpływu p-tsa na OUR heterotrofów ( 25 % inhibicji). Tab. 17 Zestawienie wartości inhibicji aktywności oddechowej Ns, Nb, Ht pod wpływem różnych stężeń SCM uzyskanych dla osadów 4, 5 i 6. Bakterie Hamowanie aktywności oddechowej [%] Stężenie SCM [mg/l] 1 1 1 1 Osad 4 (OUR 9,93 mgo 2 /g smo * h) Ns 69 53 1 93 Nb 66 52 53 41 Ht 7 Osad 5 (OUR 6,72 mgo 2 /g smo * h) Ns 62 83 84 91 Nb 79 74 8 57 Ht 1 4 Osad 6 (OUR - 6,5 mgo 2 /g smo * h) Ns 56 47 82 68 Nb 67 84 67 7 Ht 9 Znacznie silniejsze zahamowanie aktywności oddechowej bakterii nitryfikujących, Ns i Nb, zaobserwowano dla wszystkich badanych osadów po dodaniu SCM (tab. 17). Obniżenie OUR Ns i OUR Nb wyniosło odpowiednio od 47 do 1 % oraz od 41 do 84 %. Natomiast w przypadku heterotrofów stwierdzono niewielką inhibicję aktywności oddechowej ( 9 % inhibicji). Dla żadnego z osadów czynnych nie stwierdzono też wyraźnej zależności między obniżeniem wartości OUR a stężeniem dodanego sulfonamidu, SCM (podobnie jak w przypadku p-tsa). W przypadku SA znaczny wpływ na aktywność oddechową we wszystkich stosowanych stężeniach stwierdzono dla bakterii Nitrosomonas (16 88% inhibicji) i Nitrobacter (36 77% inhibicji), a znacznie mniejszy dla mikroorganizmów heterotroficznych ( 31% inhibicji, tabela 18). Jednak względem bakterii Ht jest to najsilniejszy efekt hamujący w porównaniu z pozostałymi sulfonamidami. 87

Tab. 18 Zestawienie wartości inhibicji aktywności oddechowej Ns, Nb, Ht pod wpływem różnych stężeń SA uzyskanych dla osadów 7, 8 i 9 Bakterie Hamowanie aktywności oddechowej [%] Stężenie SA [mg/l] 1 1 1 1 Osad 7 (OUR 14,55 mgo 2 /g smo * h) Ns 16 81 84 7 Nb 63 57 6 48 Ht 14 1 31 Osad 8 (OUR 4,54 mgo 2 /g smo * h) Ns 5 5 51 52 Nb 53 59 77 43 Ht 4 7 7 3 Osad 9 (OUR 13,31 mgo 2 /g smo * h) Ns 74 68 88 54 Nb 36 6 56 72 Ht 11 21 28 29 Na rysunkach 33-35 porównano w sposób graficzny wpływ sulfonamidów na poszczególne grupy mikroorganizmów osadu czynnego. Widać wyraźnie, że najbardziej hamowana była aktywność oddechowa bakterii Nitrosomonas (nawet do 9%, rys. 33), zaś najmniej bakterii heterotroficznych (najwyższa wartość hamowania to 2%, rys. 35). Hamowanie aktywności oddechowej Ns [%] 11 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 p-tsa SCM SA 1 1 1 1 Stężenie sulfonamidu [mg/l] Rys. 33 Hamowanie aktywności oddechowej bakterii Nitrosomonas przez sulfonamidy Hamowanie aktywności oddechowej Nb [%] 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 p-tsa SCM SA 1 1 1 1 Stężenie sulfonamidu [mg/l] Rys. 34 Hamowanie aktywności oddechowej bakterii Nitrobacter przez sulfonamidy 88

Hamowanie aktywności oddechowej Ht [%] 45 4 35 3 25 2 15 1 5 p-tsa SCM SA 1 1 1 1 Stężenie sulfonamidu [mg/l] Rys. 35 Hamowanie aktywności oddechowej bakterii heterotroficznych przez sulfonamidy Reasumując, można stwierdzić, że największe obniżenie aktywności oddechowej bakterii nitryfikujących, zarówno Nitrosomonas jak i Nitrobacter, spowodował sulfacetamid, SCM (odpowiednio 47 1% oraz 41 84%). Równocześnie ten sam sulfonamid wywołał najniższą inhibicję aktywności oddechowej bakterii heterotroficznych ( 9%). Najmniejsze zmiany aktywności oddechowej Ns i Nb stwierdzono w obecności p-tsa. Największe hamowanie aktywności oddechowej bakterii heterotroficznych powodował sulfanilamid, SA. Tak więc można sulfonamidy uszeregować według wzrastającego wpływu hamującego aktywność oddechową bakterii w sposób następujący: p-tsa < SA < SCM (hamowanie aktywności oddechowej nitryfikatorów) SCM < p-tsa < SA (hamowanie aktywności oddechowej heterotrofów) Pomimo licznych niedoskonałości metody OUR takich jak zależność od składu i kondycji osadu, sposobu przeprowadzania obliczeń, małej dokładności w przypadku niskich wartości OUR (dużego błędu), jest ta metoda dobrym narzędziem do oceny wpływu różnych substancji na bakterie osadu czynnego. Potwierdzają to późniejsze badania nad procesem nitryfikacji, gdzie obserwowane efekty były zgodne z tymi, przewidzianymi na podstawie testów OUR. 89

5.2 Badanie wpływu sulfonamidów na aktywność dehydrogenaz osadu czynnego za pomocą testu TTC Ocena aktywności osadu czynnego może być przeprowadzona także poprzez badanie aktywności dehydrogenaz, czyli enzymów katalizujących utlenianie substancji organicznych. Najbardziej przydatną do tego jest metoda z wykorzystaniem chlorku 2,3,5-trifenylotetrazoliowego (TTC), który w reakcjach katalizowanych przez dehydrogenazy ulega redukcji do TTCH 2 trifenyloformazanu, (TF), (równanie 8) [Buraczewski, 1973]. Jako miarę aktywności dehydrogenaz przyjmuje się stężenie wytworzonego TF. Celem tej części pracy było zbadanie wpływu sulfonamidów SA, SCM oraz p-tsa na aktywność dehydrogenaz osadu czynnego przy zastosowaniu testu TTC [PN-82/C-4616.8]. Metodykę prowadzenia testu uzyskano z Politechniki Śląskiej, Katedry Biotechnologii Środowiskowej kierowanej przez Prof. Mikscha. Doświadczenia przeprowadzono przy stężeniach sulfonamidów,1, 2, 3, 4, 6, 8, 1 mg/l. Zakres pracy obejmował wstępne badanie aktywności dehydrogenaz osadu czynnego bez dodatku sulfonamidów, a następnie wpływu tych farmeceutyków na aktywność dehydrogenaz. Wyznaczono również stopień toksyczności badanych sulfonamidów. 5.2.1 Metodyka badawcza Materiały Do przeprowadzenia testów TTC używano osadu czynnego z oczyszczalni Wschód oraz odpowiednich odczynników chemicznych. Ilości i stężenia odczynników sporządzone zostały na podstawie normy PN-82/C-4616.8. Najważniejsze z nich to: a) roztwór chlorku trifenylotetrazoliowego(c 19 H 15 Cl) TTC o stężeniu,2 %; b) roztwór siarczynu sodowego o stężeniu,36%.; c) trifenyloformazan (TF) - Roztwor wzorcowy podstawowy o stężeniu,25 %.; d) trifenyloformazan, roztwór wzorcowy roboczy o stężeniu 1mM; e) woda buforowana przygotowywana przez zmieszanie roztworu I i II. Roztwór I: woda destylowana 5 cm 3 ortofosforan jednopotasowy (KH 2 PO 4 ) 4,54 g Roztwór II: woda destylowana ` 5 cm 3 ortofosforan dwusodowy (Na 2 HPO 4 2H 2 O) 5,94 g 9

Następnie zmieszano: wodę destylowaną - 95 cm 3 roztwór I - 13,7 cm 3 ph wody buforowanej wynosiło około 7,2. Osad czynny był przemywany 3-krotnie wodą buforowaną w celu regulacji ph osadu. Przemyty osad rozcieńczano wodą destylowaną i poddawano homogenizacji, w celu rozbiciu komórek mikroorganizmów i uwolnieniu dehydrogenaz. W tabeli 19 podano najważniejsze parametry próbek osadów użytych w doświadczeniach, oraz średnie wartości i odchylenia standardowe, obliczone dla wszystkich próbek. Tab. 19 Charakterystyka osadów czynnych użytych w testach TTC Próbka osadu NH 4 -N [mg/l] NO 3 -N [mg/l] NO 2 -N [mg/l] ChZT [mg/l] 1 2,3 2,8,84 91 2,56 2 1,6 1,9,24 93 2,31 3 2,4 3,21,97 111 2,9 4 2,8 3,7,15 12 2,4 5 2,5 3,,77 97 2,29 6 2,9 3,18,14 116 2,44 7 1,85 2,73,98 13 2,22 8 3,4 4,7,212 13 2,6 9 2,73 3,55,136 14 2,35 1 2,15 2,34,87 124 2,15 11 1,89 2,65,112 132 2,43 12 1,65 3,9,89 116 2,36 Wartość średnia 2,3 3,1,1 111,4 2,4 Odchylenie standardowe,6,7, 13,9,2 Zawiesina [g/l] Sporządzenie krzywej kalibracyjnej Krzywą wzorcową przygotowano na podstawie normy PN-82/C-4616.8. Do siedmiu cylindrów Nesslera o pojemności 5 cm 3 odmierzono kolejno:,5; 1,; 2,; 4,; 6,; 8,; 1, cm 3 roztworu wzorcowego roboczego TF (trifenyloformazanu) i uzupełniono alkoholem metylowym do objętości 5 cm 3. Tak przygotowane wzorce zawierają odpowiednio:,1;,2;,4;,8; 1,2; 1,6; 2, μmola TF. Dla każdego wzorca zmierzono absorbancję przy długości fali 49 nm, stosując jako odnośnik alkohol metylowy. Otrzymaną krzywą wzorcową przedstawia rysunek 36. 91

Rys. 36 Krzywa wzorcowa przedstawiająca zależność absorbancji od stężenia TF Dobór stężenia osadu W pierwszej kolejności wykonano testy TTC dla osadu bez dodatku sulfonamidów w celu określenia ilości TTC i ilości osadu niezbędnego do przeprowadzenia testu. W tym celu próbkę osadu rozcieńczano dwu- lub czterokrotnie (w proporcji 1:1 i 1:3). Przygotowany osad oraz pozostałe reagenty wprowadzano do oznakowanych probówek wirówkowych w objętościach podanych w tabeli 2. W tabeli podane są również stężenia TTC (w μmol/1 ml), odpowiadające dodawanym objętościom. Dla każdego stężenia sulfonamidu wykonano po dwie próby. Tab. 2 Objętości reagentów dodawane do probówek dla przeprowadzenia testu TTC [ml] Reagent Probówka 1 2 3 4 5 6 7 8 Roztwór Na 2 SO 3 1 1 1 1 1 1 1 1 Roztwór TTC [ml] [μmol],1,72,2,144,3,216,4,288,6,36,8,54 H 2 O 1,9,8,7,6,4,2 - Osad czynny 8 8 8 8 8 8 8 8 1,72 Osad czynny był dodawany do probówek jako ostatni, gdyż jego wprowadzenie inicjuje proces odwodorowania TTC. Siarczyn sodu jest stosowany, jako substancja odtleniająca. Po napełnieniu, probówki były wytrząsane w celu wymieszania reagentów, a następnie poddawane 3 minutowej inkubacji w ciemności, w temperaturze ºC, 37 zapewniającej optymalne warunki rozwoju mikroorganizmów [PN-82/C-4616.8]. Po inkubacji, próbki były odwirowywane przez 2 minuty przy częstotliwości 5 obr./min. w temperaturze 23 ºC, a ciecz nadosadowa by ła odrzucana. Następnie, do probówek wprowadzano po 8 ml metanolu. Po wytrząśnięciu zawartości probówek ponownie je odwirowywano, tym razem przez 6 min. Pobierano próbkę cieczy znad osadu i badano jej absorbancję na spektrofotometrze przy długości fali 49 nm. Po wykonaniu testu, dla każdego badanego osadu oznaczano smo (sucha masa organiczna). Na podstawie zmierzonej na 92

spektrofotometrze absorbancji odczytywano stężenie TF z krzywej kalibracyjnej i przeliczano na jednostkę masy osadu. Na rys. 37 przedstawiono przykładowy wykres z wynikami testów dla osadu rozcieńczonego 2 i 4 krotnie. Przedstawione stężenia TF to uśrednione wartości z dwóch równoległych pomiarów dla każdego stężenia TTC. Rys. 37 Zależność stężenia TF od stężenia TTC dla osadu czynnego nr 1 bez dodatku sulfonamidów. Powyższe wyniki testów TTC sugerują, że rozcieńczenie osadu czynnego ma wpływ na oznaczoną wartość aktywności jego dehydrogenaz, gdyż przy mniejszym rozcieńczeniu otrzymano wyższe wartości TF (rys. 37). Oznacza to, że im więcej biomasy osadu, tym więcej bakterii zdolnych do redukcji TTC do TF. W związku z tym, dalsze badania, mające na celu ocenę wpływu sulfonamidów na aktywność dehydrogenaz przeprowadzano dla 2-krotnego rozcieńczenia osadu, gdyż zapewnia ono wytworzenie większej ilości TF, co z kolei umożliwia dokładniejszą ocenę wpływu sulfonamidów na aktywność dehydrogenaz badanego osadu. Dobór stężenia TTC Istotne też było określenie ilości TTC, niezbędnej dla uzyskania rzetelnych wyników. W tabeli 21 przedstawiono uśrednione wartości oznaczonego stężenia TF, otrzymane dla osadu 1 i osadu 2, przy różnych ilościach dodanego TTC. Jak widać z tabeli 21, stężenie dodanego TTC nie powinno wpływać na ilość powstającego TF, o ile nie będzie go zbyt mało w stosunku do ilości osadu czynnego. Już od stężenia,144 μmol TTC aż do,72 μmol TTC, ilość powstającego TF była zbliżona (około 1,2-1,3 μmol/gsmo). Jedynie przy najniższym dodatku TCC (,72 μmol), stężenie TF było niższe. 93

Tab. 21 Średnie stężenie TF dla osadu czynnego 1 i 2 przy rozcieńczeniu 1:1 TTC [μmol/1 ml] TF [μmol/g smo],72,984,144 1,253,216 1,22,288 1,191,36 1,169,54 1,219,576 1,312,72 1,359 Ostatecznie zdecydowano, że w testach TTC do oznaczania toksyczności sulfonamidów będą stosowane najwyższe z przebadanych stężenia TTC (dodatek 1 ml do probówki testowej). Wykonanie testów TTC w obecności sulfonamidów Testy TTC z dodatkiem sulfonamidów wykonano przy siedmiu różnych stężeniach sulfonamidów. Do oznaczeń stosowano osad o rozcieńczeniu 1:1. W tabeli 22 zestawiono objętości reagentów dodawane do probówek testowych. Dla każdego stężenia sulfonamidu wykonano po dwie próby. Tab. 22 Objętości reagentów użyte w teście TTC do oznaczania toksyczności sulfonamidów [ml]. Reagent Probówka 1 2 3 4 5 6 7 8 Roztwór Na 2 SO 3 1 1 1 1 1 1 1 1 Roztwór TTC 1 1 1 1 1 1 1 1 Roztwór sulfonamidu -,1,2,3,4,6,8 1 H 2 O 1,9,8,7,6,4,2 Osad 7 7 7 7 7 7 7 7 Po napełnieniu probówek dalsza procedura wykonania testu była identyczna, jak w przypadku badań osadu bez sulfonamidów. Stężenie sulfonamidów w roztworze wyjściowym wynosiło 1g/l. Po wyznaczeniu wartości TF, obliczano aktywność dehydrogenaz (AD) na podstawie wzoru 25: AD TF TF gdzie: TF 2 stężenie TF po 3 minutach inkubacji [mgtf/l], TF 1 stężenie TF po 5 minutach inkubacji [mgtf/l], T 1 - czas równy 5 min [h], T 2 - czas równy 3 minut [h]. 2 1 = (25) T2 T1 94

Wartość AD obliczana jest dla każdego stężenia sulfonamidu (1, 2, 3, 4, 6, 8, 1) (AD 1, AD 2 ). Procentowy spadek aktywności dehydrogenaz pod wpływem sulfonamidów był obliczany na podstawie uproszczonego wzoru 26 (we wszystkich pomiarach zachowano ten sam czas inkubacji 3 min): % hamowania = [(TF - TF S ) / TF ] x 1% (26) gdzie: TF - stężenie TF dla osadu bez sulfonamidów, TF S - stężenie TF dla osadu z sulfonamidami. Hamowanie aktywności dehydrogenaz po dodaniu jakiejś substancji świadczy o toksyczności tej substancji. Stopień toksyczności (ST) zależy od stężenia substancji toksycznej i można go obliczyć wg. wzoru 27: ST = (AD - AD T ) / AD (27) gdzie: AD jest aktywnością dehydrogenaz przy braku sulfonamidu, AD T jest aktywnością dehydrogenaz przy różnych stężeniach sulfonamidu, np. AD 1, AD 2. Aby wyznaczyć wartość maksymalnego stopnia toksyczności ST max., czyli wartości, do której asymptotycznie zmierzają wartości stopnia toksyczności badanych substancji wraz ze wzrostem ich stężenia, sporządzono wykres zleżności 1/ST od 1/C dla każdego badanego sulfonamidu i przeprowadzono regresję liniową. Schematyczny przebieg takiego wykresu przedstawia rysunek 38. Punkt przecięcia prostej z osią rzędnych, to wartość 1/ST max. Mając tę wartość można wyznaczyć ST max. Y = Ax + 1/STmax. 1/ST 1/STmax. 1/C Rys. 38 Schematyczny przebieg zależności 1/ST od 1/C 95

5.2.2 Wyniki aktywności dehydrogenaz w obecności sulfonamidów Wykonano szereg testów TTC w celu zbadania wpływu sulfonamidów na aktywność dehydrogenaz. Rysunek 39 przedstawia zestawienie zmian aktywności dehydrogenaz osadu czynnego pod wpływem różnych stężeń badanych sulfonamidów. Natomiast rysunek 4 przedstawia hamowanie aktywności dehydrogenaz osadu czynnego przez badane sulfonamidy, obliczone według wzoru 26. Wyniki to wartości średnie, uzyskane dla trzech (lub czterech) różnych próbek osadów czynnych, użytych w doświadczeniach z każdym sulfonamidem.,3 p-tsa SCM SA Stężenie TF [,25,2,15,1,5, 1 2 3 4 6 8 1 Stężenie sulfonamidu [mg/l] Rys. 39 Zmiany aktywności dehydrogenaz osadu czynnego pod wpływem sulfonamidów Hamowanie aktywności dehydrogenaz [%] 7 6 5 4 3 2 1 p-tsa SCM SA 1 2 3 4 6 8 1 Stężenie sulfonamidu [mg/l] Rys. 4 Hamowanie aktywności dehydrogenaz osadu czynnego przez sulfonamidy Na podstawie uzyskanych wyników zaobserwowano tendencję spadkową aktywności dehydrogenaz wraz ze wzrostem stężenia SA. Sulfanilamid w stężeniu 1 mg/l obniżał aktywność dehydrogenaz średnio o 2,77 1-2 μmola TF/g smo (spadek aktywności o 39%) względem aktywności dehydrogenaz, uzyskanej w próbie kontrolnej. Wyraźne obniżanie aktywności dehydrogenaz obserwowano również w przypadku wzrostu stężenia p-tsa. W tym przypadku średnie obniżenie aktywności w próbie zawierającej 1 mg p-tsa/l wynosiło 3,87 1-2 μmola TF/g smo, czyli 96

obniżenie o 37% względem próby kontrolnej. Powyższej tendencji nie zaobserwowano w przypadku SCM. W obecności tego sulfonamidu, otrzymane wartości wykazywały duże wahania. Hamowanie aktywności dehydrogenaz przez badane sulfonamidy, wyrażone w procentach, wahało się od 5 do około 4% i było tym wyższe im wyższe stężenie sulfonamidów stosowano (rys.4). Największe hamowanie wykazywał p-tsa, i to w prawie całym zakresie stężeń. Mogło jednak to wynikać z faktu, że aktywność dehydrogenaz osadu w próbie kontrolnej była najwyższa, co w wyniku obliczeń dało wyższe wartości % hamowania. Należy także zwrócić uwagę na duży rozrzut wyników w metodzie TTC, co obrazują duże przedziały ufności zaznaczone na rysunkach 39 i 4. Toteż wydawało się, że łatwiej będzie można wyciągnąć wnioski na podstawie wyznaczonego stopnia toksyczności. 5.2.3 Wyznaczenie stopnia toksyczności sulfonamidów Uzyskane wyniki pomiaru aktywności dehydrogenaz użyto do wyznaczenia stopnia toksyczności (ST) badanych sulfonamidów względem mikroorganizmów osadu czynnego, stosując równanie 27. Przykładowe wykresy zależności 1/ST od 1/C dla testów z poszczególnymi sulfonamidami pokazano na rys. 41-43. Obliczone maksymalne wartości stopnia toksyczności dla badanych sulfonamidów wobec dehydrogenaz osadu czynnego zawiera tabela 23. Rys. 41 Zależność 1/ST od 1/C sulfanilamidu wobec dehydrogenaz bakterii osadu czynnego nr 4. y = 395 x + 1,451; R 2 =,96; 1/ST max. = 1,451; ST max. =,9568 97

Rys. 42 Zależność 1/ST od 1/C sulfacetamidu wobec dehydrogenaz bakterii osadu czynnego nr 6. y = 29,14 x + 1,659; R 2 =,85; 1/ST max. = 1,659; ST max. =,657 Rys. 43 Zależność 1/ST od 1/C para-toluenosulfonamidu wobec dehydrogenaz bakterii osadu czynnego nr 12. y = 26,219 x + 2,4339; R 2 =,94; 1/ST max. = 2,4339; ST max. =,419 Tab. 23 Stopień toksyczności sulfonamidów wobec dehydrogenaz osadu czynnego Osad czynny Sulfonamid 1/ST max. ST max. Średnia ST max 3 1,15,87 4 SA 1,45,957 5 1,75,588 6 1,651,66 7 SCM 1,36,965 8 2,239,446 9 2,434,411 1 p-tsa 2,215,451 11 4,578,218 12 1,954,512,85,672,398 98

Porównanie wartości stężenia powstałego TF w próbie kontrolnej i w obecności sulfonamidów pokazało, że p-tsa i SA znacząco obniżają aktywność dehydrogenaz wraz ze wzrostem ich stężenia w próbce. SCM również obniża stężenie TF w próbce, lecz trudno określić tendencję wyników. Natomiast wyznaczone maksymalne wartości stopni toksyczności (ST max ) wskazują, że najbardziej toksycznym spośród badanych związków jest sulfanilamid. Sulfacetamid ma nieco niższą wartość ST max, natomiast toksyczność p-tsa jest prawie o połowę mniejsza (tab. 23). Nie pokrywa się to z obliczonymi wynikami hamowania aktywności (rys. 4). Tak więc, szeregi sulfonamidów według wzrastającego stopnia toksyczności są następujące: SA SCM < p-tsa (hamowanie aktywności dehydrogenaz, TF) p-tsa << SCM < SA (toksyczność wobec osadu czynnego, ST max ) Jednak wartości ST max wydają się być bardziej przydatne niż wartość aktywności dehydrogenaz czy też procent hamowania tej aktywności, gdyż pozwalają na uśrednienie wyników uzyskanych dla osadów o różnych właściwościach. 99

5.3 Badanie inhibicji nitryfikacji przez sulfonamidy w krótkookresowych testach 5.3.1 Metodyka badań Badanie hamowania nitryfikacji z udziałem mikroorganizmów osadu czynnego przez sulfonamidy SCM, SA, oraz p-tsa, przeprowadzono zgodnie z wytycznymi normy PN-EN ISO 95 9.1. Metoda ta polega na przeprowadzeniu procesu nitryfikacji przy zastosowaniu ścieków syntetycznych o wysokim stężeniu azotu amonowego (56 mg NH 4 -N/l). W badaniach użyto następujące roztwory podstawowe: - roztwór azotu amonowego (2,65 g/l siarczanu amonu oraz 5,4 g/l wodorowęglanu sodu), - roztwór inhibitora wzorcowego, allilotiomocznika (ATU) (1,16 g/l ATU), - roztwory podstawowe sulfonamidów (1 g/l). Dobrze nitryfikujący osad czynny, użyty w doświadczeniach, został pobrany z oczyszczalni ścieków Wschód w Gdańsku. Przed użyciem, z nad osadu została odrzucona ciecz nadosadowa, a pozostały osad przemyto równoważną objętością wody destylowanej, a następnie 1-krotną objętością roztworu podstawowego azotu amonowego tak, aby ostatecznie uzyskać wymagane stężenie zawiesin równe 3 g/l). W celu wykonania badania przygotowano serie mieszanin bez dodatku i z dodatkiem badanych sulfonamidów, jak również mieszaninę z inhibitorem wzorcowym. Sposób przygotowania serii dla każdego związku przedstawiono w tabeli 24. Tab. 24 Przygotowanie próbek do badania hamowania nitryfikacji Próba 1 (kontrolna) 2 3 4 5 6 7 Roztwór podstawowy 25 25 25 25 25 25 25 azotu amonowego [ml] Osad czynny [ml] 125 125 125 125 125 125 125 Roztwór inhibitora wzorcowego ATU [ml] Woda destylowana [ml] - - - - - - 2,5 1 99,75 99,2 97,5 92 75 97,5 Roztwór podstawowy -,25,8 2,5 8, 25 - sulfonamidów [ml] Stężenie sulfonamidów 1 3,2 1 32 1 [mg/l] Objętość całkowita 25 25 25 25 25 25 25 1

Tak przygotowane próbki napowietrzano w stałej temperaturze (około 24 o C) przez okres 4 godzin, utrzymując stężenie tlenu na poziomie nie niższym niż 2 mg/l. Po zakończeniu procesu mieszaninę filtrowano, a w przesączu oznaczano formy azotu nieorganicznego: azotanowego (V) (wg PN-82/C-4576.8), azotanowego (III) (wg PN 73/C-4576.3) i amonowego (wg PN 94/C- 4576.2). Następnie, na podstawie wyznaczonych stężeń poszczególnych form azotu obliczano procent hamowania procesu nitryfikacji. Obliczenia prowadzono w dwojaki sposób: jako hamowanie procesu tworzenia się utlenionych form azotu, NO x -N (NO x -N obliczane było jako suma stężeń NO 2 -N oraz NO 3 -N) oraz jako hamowanie procesu usuwania azotu amonowego NH 4 -N. Hamowanie tworzenia się utlenionych form azotu, NO x -N obliczano ze wzoru 28: Cc Ct % hamowania = 1% C C gdzie: C c stężenie NO x -N w próbie kontrolnej po inkubacji (próba 1), [mg/l], C t - stężenie NO x -N w próbie zawierającej sulfonamid po inkubacji (próby 2-6), [mg/l], C b - stężenie NO x -N w próbie zawierającej ATU po inkubacji (próba 7), [mg/l]. c b (28) Hamowanie usuwania azotu amonowego w % obliczano ze wzoru 29: % hamowania Ci = C C C e e 1% gdzie: C i stężenie NH 4 -N w próbie z sulfonamidem po inkubacji (próby 2-6), [mg/l], C e stężenie NH 4 -N w próbie kontrolnej po inkubacji (próba 1), [mg/l], C o początkowe stężenie NH 4 -N [mg/l]. (29) Badania inhibicji procesu nitryfikacji wywołanej przez sulfonamidy: SA, SCM oraz p-tsa przeprowadzono z użyciem różnych próbek osadu czynnego. W każdej serii doświadczeń została użyta próbka świeżego osadu czynnego (osady oznaczone literami A, B, C, D, E, F, G). Na rysunkach 44-49 przedstawiono wyniki wyznaczonej inhibicji, obliczonej dwojako, jako hamowanie usuwania azotu amonowego (obliczane z równania 29) oraz jako hamowanie tworzenia utlenionych form azotu (obliczane z równania 28). Każdy punkt reprezentuje średnią wartość uzyskaną z trzech niezależnych doświadczeń, wykonanych przy użyciu tego samego osadu czynnego. 11

5.3.2 Inhibicja usuwania azotu amonowego Na rysunku 44-46 zostały przedstawione wyniki inhibicji nitryfikacji, wyrażone jako % hamowania usuwania NH 4 -N (obliczone z równania 29). Można zauważyć znaczne różnice efektu inhibicyjnego wywołanego przez każdy z sulfonamidów w przypadku użycia różnych partii osadu czynnego. % Inhibicji nitryfikacji 5 45 4 35 3 25 2 15 1 5 osad C osad D osad G,5 1 1,5 2 2,5 log C Rys. 44 Hamowanie przez SA procesu usuwania azotu NH 4 -N (wyznaczone z równania 29); stężenie SA (C) w mg/l % inhibicji nitryfikacji 5 45 4 35 3 25 2 15 1 5 osad A osad B osad G,5 1 1,5 2 2,5 Rys. 45 Hamowanie przez SCM procesu usuwania azotu NH 4 -N (wyznaczone z równania 29); stężenie SCM (C) w mg/l log C % inhibicji nitryfikacji 5 45 4 35 3 25 2 15 1 5 osad E osad F osad G,5 1 1,5 2 2,5 log C Rys. 46 Hamowanie przez p-tsa procesu usuwania azotu NH 4 -N (wyznaczone z równania 29); stężenie p-tsa (C) w mg/l 12

Na podstawie uzyskanych wyników widać, że efekt inhibicji procesu nitryfikacji rośnie wraz ze wzrostem stężenia sulfonamidów i przy stężeniu równym 1 mg/l osiąga wartości 33-46% (SA, rys. 44), 24-37 % (SCM, rys. 45) oraz 25-3% (p-tsa, rys. 46). Tak więc najmniej szkodliwy okazał się p- TSA, zaś najbardziej szkodliwy SA. Należy zaznaczyć, że w równolegle prowadzonych doświadczeniach, inhibitor referencyjny ATU wykazywał znacznie wyższą toksyczność względem mikroorganizmów osadu czynnego, gdyż hamowanie usuwania NH 4 -N wynosiło od 62 do 89%, w zależności od użytego osadu czynnego (wartości użyte tylko do obliczeń inhibicji sulfonamidów). 5.3.3 Inhibicja tworzenia azotanów i azotynów Na rysunkach 47-49 zostały zaprezentowane wyniki inhibicji procesu tworzenia form utlenionych azotu, NO x -N. Należy dodać, że we wszystkich testach końcowe stężenie jonów NO - 3 było co najmniej dziesięciokrotnie wyższe niż stężenie jonów NO - 2. % inhibicji nitryfiakcji 5 45 4 35 3 25 2 15 1 5 osad C osad D osad G osad H,5 1 1,5 2 2,5 log C Rys. 47 Hamowanie przez SA procesu tworzenia form NO x -N (wyznaczone z równania 28); stężenie SA (C) w mg/l % inhibicji nitryfikacji 5 45 4 35 3 25 2 15 1 5 osad A osad B osad G osad H,5 1 1,5 2 2,5 log C Rys. 48 Hamowanie przez SCM procesu tworzenia form NO x -N (wyznaczone z równania 28); stężenie SCM (C) w mg/l 13

% inhibicji nitryfikacji 5 45 4 35 3 25 2 15 1 5 osad E osad F osad G osad H,5 1 1,5 2 2,5 log C Rys. 49 Hamowanie przez p-tsa procesu tworzenia form NO x -N (wyznaczone z równania 28); stężenie p-tsa (C) w mg/l Jak można zauważyć, inhibicja procesu tworzenia form utlenionych azotu NO x -N przez poszczególne sulfonamidy zachodziła w podobnym stopniu jak inhibicja usuwania NH 4 -N, wyznaczona dla tych samych osadów czynnych. Sulfonamidy w stężeniu 1 mg/l hamowały tworzenie NO x -N o 23-32% (SA, rys. 47), 27-34% (SCM, rys. 48) oraz 22-29% (p-tsa, rys. 49). Różnice efektywności inhibicji obliczone z równań 12 i 13 są w przypadku p-tsa i SCM niewielkie, rzędu 1-3%, natomiast w przypadku SA hamowanie usuwania azotu amonowego jest o około 4-5% wyższe (rys. 44) niż hamowanie tworzenia utlenionych form azotu (rys. 47). 5.3.4 Ocena wyników inhibicji procesu nitryfikacji Oceniając wyniki inhibicji procesu nitryfikacji i obserwowane różnice w zależności od sposobu wyrażenia stopnia inhibicji, należy zdawać sobie sprawę z tego, jakie procesy wiążą się z obserwowanymi zmianami stężeń azotu amonowego i azotu azotanowego. O ile tworzenie NO x -N opiera się jedynie na utlenianiu azotu amonowego (nitryfikacji), to usuwanie NH 4 -N łączy w sobie różne procesy, głównie proces nitryfikacji i syntezy biomasy. Z drugiej strony, proces odwrotny, taki jak rozkład materii organicznej oraz następujący po nim proces amonifikacji może prowadzić do wzrostu stężenia azotu amonowego. Toteż dla zrozumienia nie bilansujących się wyników niektórych doświadczeń konieczna byłaby analiza wszystkich form azotu, także azotu związanego organicznie, w tym również w biomasie osadu. Zaobserwowane różnice między wynikami uzyskanymi dla poszczególnych sulfonamidów mogą wynikać z różnej kondycji osadu czynnego pobranego do wykonania doświadczeń. W niektórych przypadkach wyniki różniły się nawet o ok. 1% (np. rys. 44). Toteż, aby możliwe było porównanie efektów powodowanych przez różne sulfonamidy, wykonano jedną serię testów dla wszystkich sulfonamidów przy użyciu tej samej próbki osadu czynnego (osad G). Wyniki te zostały przedstawione na rysunku 5 (hamowanie usuwania NH 4 -N) i rysunku 51 (hamowanie tworzenia NO x -N). Porównując wyniki przedstawione na rysunkach 5 i 51 można zauważyć większe różnice w przypadku wyników obliczanych z równania 29 niż obliczonych z równania 28. Jak już wspomniano wcześniej, może to 14

wynikać z faktu, że usuwanie azotu amonowego jest bardziej złożone (obejmuje utlenianie NH 4 -N i jego biokumulację w nowych komórkach biomasy osadu). Jest prawdopodobne, że biosynteza nowej biomasy jest bardziej wrażliwa na obecność i rodzaj inhibitorów, tak więc może bardziej zależeć od rodzaju sulfonamidu. Jak widać na rysunku 51, w odniesieniu do tworzenia form utlenionych azotu nie zaobserwowano jednoznacznych różnic, związanych z użytym sulfonamidem. % inhibicji nitryfikacji 35 3 25 2 15 1 SCM osad G SA osad G p-tsa osad G 5,5 1 1,5 2 2,5 log C Rys. 5 Hamowanie przez sulfonamidy procesu usuwania azotu NH 4 -N (wyznaczone z równania 29); stężenie sulfonamidów (C) w mg/l % inhibicji nitryfikacji 35 3 25 2 15 1 SCM osad G SA osad G p-tsa osad G 5,5 1 1,5 2 2,5 log C Rys. 51 Hamowanie przez sulfonamidy procesu tworzenia form NO x -N (wyznaczone z równania 28); stężenie sulfonamidów (C) w mg/l Podsumowując, należy stwierdzić, że efekt inhibicyjny badanych sulfonamidów w odniesieniu do procesu nitryfikacji zwiększa się wraz ze wzrostem stężeń i jest znaczący dopiero przy stosunkowo wysokich stężeniach. Użyte w doświadczeniach sulfonamidy można uszeregować w kolejności malejącego inhibicyjnego wpływu na proces nitryfikacji. SA > SCM > p-tsa (usuwanie NH 4 -N) SCM SA > p-tsa (powstawanie NO x -N) Jak widać, najmniej inhibitującym dla procesu nitryfikacji związkiem jest p-tsa, a przy tym jest substancją, która wykazuje najwyższą podatność na biodegradację i jednocześnie niższy efekt inhibicji aktywności dehydrogenaz oraz aktywności oddechowej. Można więc przypuszczać, że negatywny efekt p-tsa na środowisko naturalne będzie mniejszy niż efekt powodowany przez SA i SCM. 15

5.4 Badanie wpływu sulfonamidów na efektywność nitryfikacji podczas długookresowych testów Celem tej części badań było sprawdzenie czy badane sulfonamidy mogą zakłócać proces nitryfikacji przy ciągłym dopływie tych substancji, a także czy mikroorganizmy osadu czynnego są zdolne zaadaptować się do ciągłej obecności wysokich stężeń sulfonamidów. Zakres pracy obejmował przeprowadzenie 3-dniowych doświadczeń, w obecności sulfanilamidu (SA), sulfacetamidu (SCM) oraz p-toluenosulfonamidu (p-tsa), przy ich stężeniach, 2, 4, 8 mg/l. Do oceny wpływu tych sulfonamidów na mikroorganizmy osadu czynnego wykorzystano wyniki efektywności procesu nitryfikacji oraz testy aktywności oddechowej (testy szybkości zużycia tlenu, OUR). 5.4.1 Sposób prowadzenia badań Badania były prowadzone z użyciem świeżego osadu czynnego pobieranego z komory nitryfikacyjnej Oczyszczalni Ścieków Komunalnych WSCHÓD w Gdańsku. Charakterystyka próbek osadu czynnego, obejmująca zawartość różnych form azotu, ChZT, zawiesin i suchej pozostałości, przedstawiona jest w tabeli 25. Do prowadzenia badań wpływu sulfonamidów na proces nitryfikacji wykorzystano ścieki modelowe, sporządzone na bazie pożywki rekomendowanej przez Fux [Fux, 23]. Skład chemiczny pożywki przedstawia tabela 26. Do pożywki dodawano glukozę jako źródło węgla organicznego, a także odpowiednie ilości sulfonamidów (opis poniżej). Proces nitryfikacji prowadzony był w siedmiu szklanych reaktorach o pojemności 7 l, każdy przedzielony szklaną płytką na dwie komory, nitryfikacyjną o objętości 6 l oraz sedymentacyjną o objętości 1 l (rys. 52). Zbiorniki pracowały w systemie ciągłym, bez recyrkulacji osadu czynnego. Ścieki doprowadzane były do górnej części komory nitryfikacyjnej, a odpływały z górnej części komory sedymentacyjnej. W każdym z reaktorów umieszczona została także pochyła płytka szklana, dzięki której osad po procesie sedymentacji zsuwał się do komory nitryfikacyjnej. Każdy z reaktorów zaopatrzony był w system napowietrzania, składający się z pompy zapewniającej mieszanie zawartości komory oraz pompy tłoczącej powietrze. Założone warunki prowadzenia procesu zostały przedstawione w tabeli 27. 16

Tab. 25 Charakterystyka osadu czynnego użytego do badania wpływu sulfonamidów na proces nitryfikacji Próbka osadu czynnego NH 4 -N [mg/l] NO 3 -N [mg/l] NO 2 -N [mg/l] N Kjel. [mg/l] ChZT [mg/l] Zawiesina [g/l] Sucha pozostałość [mg/l] Testy z użyciem SA 1 4,25 4,15 4,34 164 6,936 374,3 2 4,5 37,5,125 4,68 179 6,888 378 3 4,5 4,15 4,63 157 6,882 376,2 Testy z użyciem SCM 1 3,9 42,6 4,23 123 2,76 331, 2 3,54 47,98 3,96 115 2,98 323,2 3 3,66 38,63 4,6 127 2,36 Testy z użyciem p-tsa 326,6 1 2, 42,6 3,72 92 2,76 325,6 2 2,4 47,98 3,9 15 2,98 334,7 3 2,6 38,63 3,79 91 2,36 315,3 Tab. 26 Skład pożywki użytej do sporządzania ścieków modelowych [Fux, 23] Związki chemiczne Ilość [g/l] * [ml] 1 Roztwór NH 4 HCO 3 56,47 1-2 2 podstawowy NaNO 2 64,7 1-2 3 Na 2 HPO 4 2H 2 O 17,5 1-3 4 KH 2 PO 4 13,9 1-3 5 Roztwór pierwiastków śladowych 1,1 ml 6 Roztwór NTA (Nitrilo Triacetic Acid) 1,1 7 pierwiastków MgSO 4 7H 2 O 14,46 8 śladowych 1 CaCl 2 2H 2 O 3,33 9 (NH 4 ) 6MoO 24 9,8 1-3 1 FeSO 4 H 2 O 99,3 1-3 11 Roztwór pierwiastków śladowych 2 1ml 12 Roztwór EDTA 12,5 13 pierwiastków ZnSO 4 7H 2 O 54,5 14 śladowych 2 FeSO 4 45,7 15 MnSO 4 H 2 O 7,7 16 CuSO 4 5H 2 O 1,97 17 CoCl 2 6H 2 O 1,3 18 Na 2 B 4 O 7 1H 2 O,89 2 NiCl 2 6H 2 O 2,5 21 H 2 SO 4,5* 17

Rys. 52 Schemat i zdjęcie bioreaktora do prowadzenia procesu nitryfikacji Tab. 27 Założone warunki prowadzenia procesu nitryfikacji Objętość zbiornika 7 l Objętość komory nitryfikacyjnej 6 l Objętość komory sedymentacyjnej 1 l Czas zatrzymania 2-3 doby Tlen rozpuszczony >3 mg/l Zakres ph 6,5 8 Zakres temperatury 23-25ºC W celu przeprowadzenia doświadczenia mieszano osad czynny ze ściekami modelowymi w takich proporcjach, aby uzyskać stężenie osadu czynnego ok. 3 g smo/l. Następnie, przez 3 dni reaktory zasilano w sposób ciągły ściekami. Reaktory 1 i 2 były zasilane tylko ściekami modelowymi (tab. 26), zaś ścieki modelowe z dodatkiem odpowiedniej ilości badanego sulfonamidu były doprowadzane do reaktorów 3-7. Przebieg procesu nitryfikacji kontrolowany był poprzez pomiar ph, temperatury, oraz stężenia tlenu rozpuszczonego. Początkowe stężenia azotu amonowego, glukozy (źródło węgla, dodawane do ścieków modelowych) oraz sulfonamidów, użyte w doświadczeniach, przedstawia tabela 28. 18

Tab. 28 Początkowe stężenia substratów procesu nitryfikacji oraz sulfonamidu Reaktor R1 / R2 R3 / R4 R5 R6 / R7 Próba kontroln SA/ SCM / p-tsa SA/SCM/p-TSA SA/SCM/p-TSA Stężenie sulfonamidu [mg/l] 2 4 8 Stężenie NH 4 -N [mg/l] 15 15 15 15 Glukoza [g/l] 1 1 1 1 5.4.2 Kontrola parametrów procesu nitryfikacji Proces nitryfikacji był monitorowany poprzez kontrolę parametrów procesu takich jak, ph, temperatura i stężenie tlenu rozpuszczonego (DO). W tabeli 29 podano średnie wartości tlenu rozpuszczonego w komorach podczas trwania procesu. Tabela 3 przedstawia średnie wartości ph na wejściu i wyjściu z reaktorów, a tabela 31 średnie wartości temperatury utrzymywane w trakcie prowadzenia procesów. Tab. 29 Stężenie tlenu rozpuszczonego w bioreaktorach Stężenie sulfonamidu [mg/l] 2 4 8 DO [mgo 2 /l] SA 3,7±,14 3,14±,13 3,28±,8 3,2±,9 SCM 3,6±,87 4,97±,47 4,56±,55 4,7±,53 p-tsa 5,84±,44 5,79±,57 5,96±,4 6,±.7 Tab. 3 Wartości ph ścieków na wejściu i wyjściu Stężenie sulfonamidu [mg/l] 2 4 8 PH wejście SA 7,21±,22 7,7±,21 7,15±,2 7,21±,19 SCM 7,72±,11 7,54±,8 7,52±,13 7,54±,15 p-tsa 7,75±,1 7,8±,9 7,73±,8 7,74±,1 PH wyjście SA 7,19±,1 7,18±,9 7,26±,7 7,1±,12 SCM 8,±,19 8,2±,18 8,2±,15 8,8±,14 p-tsa 8,15±,22 8,11±,18 7,92±,14 8,9±,25 Tab. 31 Wartości temperatury w trakcie trwania procesów nitryfikacji Stężenie sulfonamidu [mg/l] 2 4 8 Temperatura [ C] SA 21,3±1,1 21,3±1,1 21,4±1,1 21,3±1,1 SCM 24,2±,4 24,4±,4 24,5±,3 24,2±,4 p-tsa 23,8±,4 23,9±,5 24,1±,6 23,9±,5 19

5.4.3 Efektywność procesu nitryfikacji Do przeprowadzenia analizy przebiegu procesu nitryfikacji pobierano próbkę dwa razy na tydzień na wejściu oraz wyjściu z każdego reaktora. Natychmiast po pobraniu próbek przesączano je przez filtr,45µm, a następnie oznaczano obecne w próbce formy azotu, azot amonowy, azotanowy (III), azotanowy (V) oraz azot Kjeldahla. W tabelach 32-34 została przedstawiona zawartość poszczególnych form azotu nieorganicznego oraz całkowitego azotu nieorganicznego oznaczonych na wejściu i wyjściu z bioreaktorów. Wyniki dotyczą ostatniego dnia procesów, gdy były one już ustabilizowane. Nie przedstawiono wartości azotu Kjeldahla, gdyż stężenia azotu organicznego były bardzo niskie i w dalszych badaniach zrezygnowano z tej analizy. Tab. 32 Stężenie azotu amonowego na wejściu i na wyjściu z reaktorów Stężenie sulfonamidu [mg/l] Stężenie NH 4 -N [mg/l] 2 4 8 Na wejściu SA 146,9 156,4 139,3 146,5 SCM 143,5 138,7 144, 142,1 p-tsa 138,9 146,3 145,4 143,5 Na wyjściu SA 29,4 42,1 55,7 55,7 SCM 25,8 27,7 46,1 52,5 p-tsa 2,8 3,7 53,8 51,7 Tab. 33 Stężenie azotu azotanowego (III) + (V) na wejściu i na wyjściu Stężenie sulfonamidu [mg/l] 2 4 8 Stężenie NO 2 -N + NO 3 -N (wejście do reaktora), [mg/l] SA 1,3 1,4 1,4 1,2 SCM 2,5 3,7 2,9 2,8 p-tsa 3,6 3,5 3,4 3,6 Stężenie NO 2 -N + NO 3 -N (wyjście z reaktora), [mg/l] S.A. 5,7 98,9 93,2 87,4 SCM 41,5 43,9 52,8 66,2 p-tsa 59,5 51,6 61,8 79,8 Z wyników przedstawionych w tabelach 32-34 widać, że spadek zawartości azotu amonowego zależał od stężenia sulfonamidów i był tym mniejszy, im wyższe było to stężenie, przy czym najgorszy efekt obserwowano w obecności SA. Z kolei przyrost stężenia azotu azotanowego nie jest tak wyraźnie zależny od stężenia sulfonamidów, a najsłabszy efekt obserwowano w przypadku SCM a nie SA. 11

W tabeli 34 przedstawiono stężenie całkowitego azotu nieorganicznego, a także różnice jego wartości na wejściu i wyjściu (ΔN total ). Tab. 34 Stężenie całkowitego azotu nieorganicznego (N total ) na wejściu i na wyjściu Stężenie sulfonamidu [mg/l] 2 4 8 Stężenie N total (wejście do reaktora), [mg/l] SA 148,2 157,8 14,7 147,7 SCM 146, 142,4 146,9 144,9 p-tsa 142,5 149,8 148,8 147,1 Stężenie N total (wyjście z reaktora), [mg/l] S.A. 8,1 141, 148,9 143,1 SCM 67,3 71,6 98,9 118,7 p-tsa 8,3 82,3 115,6 131,5 Różnica stężeń, ΔN total, [mg/l] SA 68,1 16,8-8,2 4,6 SCM 78,7 7,8 48, 26,2 p-tsa 62,2 67,5 33,2 15,6 Jak widać, ΔN total (N total (wejście) -N total (wyjście) ) przy braku sulfonamidów jest znacznie wyższe niż przy ich obecności, co może świadczyć o większej ilości azotu organicznego, a więc większym wchłanianiu azotu amonowego w procesie biosyntezy. W dalszych rozdziałach przeanalizowano (przedyskutowano) zmiany, dotyczące usuwania azotu amonowego i przyrostu azotu azotanowego, zachodzące w czasie 3 dni trwania procesu. Usuwanie azotu amonowego Na podstawie uzyskanych wyników stężeń różnych form azotu wyznaczano efektywność procesu nitryfikacji, którą wyrażano m.in. jako procentową wydajność usunięcia azotu amonowego (obliczoną w oparciu o równanie 3). ( N NH ) wej ( N ( N + + 4 NH 4 NH + 4 ) wej ) wyj 1 % (3) gdzie: (NH 4 N) wej stężenie azotu amonowego na wejściu do reaktora, (NH 4 N) wyj stężenie azotu amonowego na wyjściu do reaktora. Uzyskane wyniki zostały naniesione na wykresy zależności zmian wydajności usuwania azotu amonowego w czasie (rys.53-55). 111

Wydajność usuwania azotu [%] stężenie SA [mg/l]: 2 4 8 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 5 1 15 2 25 3 Czas [dni] Rys. 53 Wydajność usuwania NH 4 -N w obecności S.A. 12% stężenie SCM [mg/l]: 2 4 8 wydajność usuwania azotu 1% 8% 6% 4% 2% % 5 1 15 2 25 3 czas [dni] Rys. 54 Wydajność usuwania NH 4 -N w obecności SCM 12% stężenie p-tsa [mg/l]: 2 4 8 wydajność usuwania azotu 1% 8% 6% 4% 2% % 5 1 15 2 25 3 czas [dni] Rys. 55 Wydajność usuwania NH 4 -N w obecności p-tsa Jak można zaobserwować na powyższych rysunkach największe zaburzenia procesu nitryfikacji jest powodowane obecnością SA. Jednak załamanie procesu nitryfikacji w reaktorach zasilanych ściekami zawierającymi SA w stężeniach 2 i 4 mg/l nastąpiło dopiero po 13-15 dniach, podczas gdy przy 8 mg SA/l już po 8 dniach widać znaczny spadek wydajności nitryfikacji. W obecności p-tsa 112

oraz SCM efekt jest nieco mniejszy, przy czym istnieje wyraźna zależność wydajności procesu od stężenia badanych sulfonamidów. Zmiany zawartości azotu azotynowego i azotanowego Dla oceny przebiegu procesu nitryfikacji niezbędna jest również analiza zmian stężenia utlenionych form azotu, azotynów i azotanów. W pracy przedstawione zostały wybrane wyniki dotyczące jedynie procesów z użyciem najbardziej szkodliwego sulfanilamidu, SA. Nie zamieszczono wyników dla procesów z użyciem SCM i p-tsa. Na wykresach 56-59 przedstawiono wartości sumy stężeń azotu azotanowego (III) oraz azotu azotanowego (V) od czasu. 9 8 SA= wej wyj 7 stężenie NOx [mg/l] 6 5 4 3 2 1 1 7 9 14 16 21 23 28 3 czas [dni] Rys. 56 Zmiany sumy stężeń azotu azotynowego oraz azotanowego w reaktorze 1; stężenie SA = SA=2 9 8 7 wej wyj stężenie NOx [mg/l] 6 5 4 3 2 1 1 7 9 14 16 21 23 28 3 czas [dni] Rys. 57 Zmiany sumy stężeń azotu azotynowego oraz azotanowego w reaktorze 3; stężenie SA = 2 mg/l 113

9 8 SA=4 wej wyj 7 stężenie NOx [mg/l] 6 5 4 3 2 1 1 7 9 14 16 21 23 28 3 czas [dni] Rys. 58 Zmiany sumy stężeń azotu azotynowego oraz azotanowego w reaktorze 5; stężenie SA=4 mg/l SA=8 9 8 7 wej wyj stężenie NOx [mg/l] 6 5 4 3 2 1 1 7 9 14 16 21 23 28 3 czas [dni] Rys. 59 Zmiany sumy stężeń azotu azotynowego oraz azotanowego w reaktorze 6; stężenie SA=8 mg/l Na podstawie wykresów 56-59 zauważono w pierwszym dniu procesów znaczny wzrost sumarycznego stężenia azotu azotynowego oraz azotanowego na wyjściu z reaktorów, w porównaniu z wartościami na wejściu do reaktorów. Świadczy to o tym, iż proces nitryfikacji przebiegał w sposób prawidłowy, czyli że osad czynny zachował swoją pierwotną aktywność a przyrost stężenia azotanów jest wyraźny, nawet przy najwyższym stężeniu SA (rys. 59). Może to świadczyć o tym, że czas kontaktu mikroorganizmów z sulfonamidem był zbyt krótki aby wywołać negatywny efekt. Jednak bardzo wyraźnie widać szybki spadek aktywności bakterii nitryfikujących w obecności sulfonamidów, gdyż np. po 7 dniu stężenie NO - x na wlocie i wylocie są zbliżone, a więc nie ma przyrostu azotanów. Dopiero po około 9 dniach zaczyna stopniowo wzrastać stężenie azotanów w ściekach odprowadzanych w porównaniu ze stężeniem w ściekach doprowadzanych, a od około 2 dnia ten wzrost jest znaczny, nawet wyższy niż pierwszego dnia, osiągając po około 3 dniach wartości zbliżone do tych, które były obserwowane w procesach bez dodatku sulfonamidu (rys. 56). Może to świadczyć o aklimatyzowaniu się bakterii osadu czynnego do obecności sulfonamidu. Należy też podkreślić, że brak jest wyraźnego wpływu stężenia SA na wzrost stężenia azotu azotanowego. 114

Równocześnie, jak widać z rysunkach 53-55, usuwanie azotu amonowego przebiega od początku w ilościach 1-2%, a w 7 dniu osiąga około 4% (rys. 53). Jest to efektywność znacznie wyższa niż efektywność tworzenia się form utlenionych azotu. Może to oznaczać, że w tym okresie azot amonowy był usuwany ze ścieków nie poprzez nitryfikację, a dzięki biosyntezie nowych komórek mikroorganizmów osadu czynnego. Aby sprawdzić kondycję bakterii po ich długotrwałym kontakcie z sulfonamidami, przeprowadzono badania ich aktywności oddechowej. 5.4.4 Ocena wpływu sulfonamidów na aktywność oddechową aklimatyzowanego osadu czynnego Ocenę wpływu sulfonamidów na aktywność oddechową mikroorganizmów osadu czynnego przeprowadzono wcześniej dla osadów świeżych (rozdz. 5.1.2) i jak stwierdzono, najmniej zakłócał tę aktywność p-tsa, zaś najbardziej SA (w odniesieniu do heterotrofów) lub SCM (w odniesieniu do bakterii nitryfikujących). W tym rozdziale przedstawione są wyniki podobnych badań, ale dla osadów wcześniej aklimatyzowanych do obecności poszczególnych sulfonamidów. Osady pobrano po zakończeniu 3-dniowych procesów nitryfikacji, (opisanych w rozdz. 5.4.1-5.4.3). Badania aktywności oddechowej mikroorganizmów osadu wykonywano analogicznie jak poprzednio (opis w rozdz. 5.1.1), wykonując testy szybkości zużycia tlenu (OUR) dla samych osadów lub z dodatkiem sulfonamidu. Do osadu dodawano taki sulfonamid, jaki był używany w procesie aklimatyzacji i takie samo jego stężenie. Ponadto, wykonano testy OUR dla próbek tych samych osadów przed poddaniem ich procesowi aklimatyzacji. Miało to pozwolić na porównanie wpływu sulfonamidów na aktywność oddechową osadów nieaklimatyzowanych i aklimatyzowanych. Badania wpływu sulfonamidów na szybkość poboru tlenu przez mikroorganizmy osadu czynnego wykonano w seriach, po 3 powtórzenia dla każdego stężenia sulfonamidu:, 2, 4 oraz 8 mg/l. Tabele z wynikami zawiera załącznik 1B. Na rysunku 6 przedstawiono średnie wartości szybkości zużycia tlenu przez osad czynny nieaklimatyzowany, a na rys. 61 wyniki OUR dla osadu aklimatyzowanego. Na podstawie przeprowadzonych testów OUR dla osadów nieaklimatyzowanych (rys. 6) można stwierdzić, że podobnie jak w poprzednich badaniach (rozdz. 5.1.2), wszystkie badane sulfonamidy hamują aktywność oddechową poszczególnych grup funkcyjnych osadu czynnego. W porównaniu z pozostałymi sulfonamidami, p-tsa wywarł najmniejszy wpływ, zarówno na bakterie nitryfikujące jak i heterotrofy. Z pozostałych sulfonamidów, SA najbardziej obniżał wartości OUR heterotrofów, zaś SCM najbardziej bakterii AOB i NOB. Nie stwierdzono jednak wyraźnego obniżenia aktywności oddechowej mikroorganizmów heterotroficznych wraz ze wzrostem stężenia stosowanych 115

sulfonamidów (za wyjątkiem wyraźnego wpływu stężenia SA). Jednak ze wzrostem stężenia sulfonamidów widać wyraźne obniżanie aktywności oddechowej bakterii Nitrosomonas i Nitrobacter. 7, 6, SA SCM ptsa OUR [mg O 2 /(g VSS*h)] 5, 4, 3, 2, 1,, Ns Nb Ht Ns Nb Ht Ns Nb Ht Ns Nb Ht 2 4 8 Stężęnie [mg/l] Rys. 6 Szybkość zużycia tlenu przez mikroorganizmy osadu nieaklimatyzowanego w obecności sulfonamidów 7, 6, SA SCM ptsa OUR [mg O 2 /(g VSS*h)] 5, 4, 3, 2, 1,, Ns Nb Ht Ns Nb Ht Ns Nb Ht Ns Nb Ht Stężęnie [mg/l] Rys. 61 Szybkość zużycia tlenu przez różne grupy mikroorganizmów w obecności sulfonamidów po okresie adaptacji Analizując wartości OUR dla osadów aklimatyzowanych widać że są one nieco niższe niż dla osadów świeżych, ale przebieg zmian jest podobny. Można też stwierdzić, że bakterie heterotroficzne nabyły pewnej odporności na sulfonamidy, co jest widoczne najwyraźniej w przypadku SA, gdyż wartości OUR dla osadów aklimatyzowanych są wyższe niż dla osadów nieaklimatyzowanych, zwłaszcza przy wyższych stężeniach SA (4 i 8 mg/l). Najmniejszy efekt adaptacyjny (a właściwie jego brak) zaobserwowano w przypadku bakterii nitryfikujących. 116

5.5 Mikroskopowe badanie osadu czynnego Celem mikroskopowych badań była ocena struktury kłaczków osadu, co związane jest z jego kondycją. Obserwacje mikroskopowe można prowadzić dla próbek tzw. przyżyciowych lub próbek barwionych. Barwienie jest szczególnie przydatne do identyfikacji mikroorganizmów. 5.5.1 Sposób przygotowania próbek Przygotowanie preparatów do badań mikroskopowych obejmuje następujące czynności: wykonanie rozmazu, utrwalenie i barwienie preparatu. Najczęściej stosowaną metodą barwienia jest barwienie złożone metodą Grama, która różnicuje bakterie na dwie grupy, wykazujące inne struktury i właściwości błony komórkowej. Są to bakterie Gram dodatnie, G (+), barwiące się na fioletowo i Gram ujemne, G (-), barwiące się na czerwono. Procedura wybarwiania jest powszechnie stosowana, więc nie została tu opisana [Grosman et al., 24]. Badaniu mikroskopowemu poddano aklimatyzowane osady czynne po 3 dniowej ekspozycji na obecność sulfonamidu SA. Próbki osadu czynnego pobrano w ostatnim dniu prowadzenia procesu. Obserwacjom poddano osad czynny aklimatyzowany do różnych stężeń sulfanilamidu (SA), a także próbki osadu nie aklimatyzowanego. Obserwacje mikroskopowe prowadzono dla próbek przyżyciowych (nie barwionych) oraz dla próbek barwionych. 5.5.2 Wyniki mikroskopowych badań osadu czynnego aklimatyzowanego do obecności SA Na rys. 63-69 pokazano wybrane zdjęcia próbek osadów barwionych jak i niebarwionych, pobranych z reaktorów 1-7 po zakończeniu procesu aklimatyzacji do obecności SA (rozdz. 5.4). W preparatach barwionych bakterie nitkowate są bardziej widoczne niż w obrazie preparatów nie barwionych, co jest efektem obkurczania się bakterii kłaczkujących w trakcie suszenia preparatu przed barwieniem. Zdjęcia na rysunku 63 pokazują mikroorganizmy nieaklimatyzowanego osadu czynnego. Na zdjęciu widoczne są liczne skupiska bakteryjne tworzące uformowane podłużne kłaczki. Osad wydaje się być w dobrej kondycji. Preparat barwiony przedstawia liczne skupiska tworzące duże kłaczki. Są one zabarwione na kolor czerwony, co wskazuje na znaczną przewagę bakterii Gram ujemnych. Bardzo nieliczne są bakterie nitkowate. Proces nitryfikacji w tym reaktorze przebiegał bez zakłóceń, obserwowano dobrą przemianę azotu amonowego w formy azotanowe. 117

Rys. 63 Mikroskopowy obraz drobnoustrojów osadu czynnego z reaktora 1 (bez dodatku SA) a) niebarwionego, b) barwionego Rys. 64 Mikroskopowy obraz drobnoustrojów osadu czynnego z reaktora 2 (bez dodatku SA) a) niebarwionego, b) barwionego Rys. 65 Mikroskopowy obraz drobnoustrojów osadu czynnego z reaktora 3 (z dodatkiem 2 mg SA/l) a) niebarwionego, b) barwionego 118

Rys. 66 Mikroskopowy obraz drobnoustrojów osadu czynnego z reaktora 4 (z dodatkiem 2 mg SA mg/l) a) niebarwionego, b) barwionego Rys. 67 Mikroskopowy obraz drobnoustrojów osadu czynnego z reaktora 5 (z dodatkiem 4 mg SA mg/l) a) niebarwionego, b) barwionego Rys. 68 Mikroskopowy obraz drobnoustrojów osadu czynnego z reaktora 6 (z dodatkiem 8 mg SA mg/l)a) niebarwionego, b) barwionego 119

Rys. 69 Mikroskopowy obraz drobnoustrojów osadu czynnego z reaktora 7 (z dodatkiem 8 mg SA mg/l) a) niebarwionego, b) barwionego Rysunek 64 przedstawia zdjęcia mikroorganizmów z reaktora 2. Skupiska bakteryjne są tu mniej liczne, kłaczki znacznie mniejsze. Widać bakterie nitkowate. Proces nitryfikacji w tym reaktorze przebiegał z niższą wydajnością. W trakcie prowadzenia procesu nastąpiło zakłócenie napowietrzania, a więc niedotlenienie osadu czynnego. W mikroskopowym obrazie mikroorganizmów pochodzących z reaktora 3 (rys. 65) widać nieliczne skupiska bakterii. Kłaczki są małe i oddalone od siebie. Widać również znaczną liczbę bakterii nitkowatych. Test OUR dla tego osadu wskazywał na niską aktywność bakterii nitryfikujących. Usuwanie azotu zachodziło z małą wydajnością. Na rysunku 66 widać nieliczne skupiska bakterii tworzących kłaczki osadu czynnego i sporo drobnych skupisk. Preparat zabarwił się na czerwono, co wskazuje na obecność bakterii Gram ujemnych. Widać również bakterie nitkowate. Test OUR wykazał zanik aktywności bakterii nitryfikujących. Osad czynny był zdegradowany. Zdjęcie mikroskopowe osadu czynnego na rysunku 67 pokazuje osad w złej kondycji. Widać przewagę form nitkowatych i nieliczne skupiska innych kolonii bakteryjnych. Jak wynika również z testu OUR aktywność bakterii nitryfikujących była bardzo niska. Obraz na rysunku 68 przestawia dużą kolonię bakteryjną. W preparacie barwionym dają się zauważyć liczne bakterie nitkowate. Proces nitryfikacji w tym osadzie przebiegał z wysoką wydajnością. Kłaczki osadu czynnego pochodzącego z rektora 7 (rys. 69) odznaczają się zwartą strukturą. Widać liczne kolonie bakteryjne. W preparacie barwionym, (kolor czerwony świadczy o obecności bakterii Gram ujemnych), można zauważyć obecność bakterii nitkowatych. Na podstawie testów OUR stwierdzono niską aktywność bakterii nitryfikujących. Podsumowując, można stwierdzić, że osad we wszystkich badanych próbkach nie tworzył dużych, zwartych kłaczków, co świadczyłoby o jego dobrej kondycji. Nie można też jednoznacznie ocenić wpływu sulfanilamidu na strukturę kłaczków osadu, gdyż obserwowane zmiany ze stężeniem 12

SA nie są jednoznaczne. Wydaje się, że w najgorszej kondycji był osad z reaktorów, w których stężenie SA wynosiło 2 lub 4 mg/l, a nie najwyższe, 8 mg/l. Jednak przy ocenie właściwości osadu trzeba uwzględniać przede wszystkim efektywność procesów biochemicznych oraz właściwości sedymentacyjne, zaś mikroskopowe obserwacje należy traktować jako narzędzie pomocnicze. 121

6 Badanie wpływu sulfonamidów na proces Anammox Celem tej części pracy było zbadanie wpływu wybranych sulfonamidów: sulfanilamidu (SA), sulfacetamidu (SCM) oraz p-toluenosulfonamidu (p-tsa) na proces Anammox, oraz ocena zdolności aklimatyzacyjnych mieszanej kultury Anammox do tych związków. Zakres pracy obejmował prowadzenie długookresowej ekspozycji bakterii kultury Anammox na sulfonamidy, podczas której oceniano ich wpływ na wydajność usuwania azotu. Oceniano również skuteczność adaptacji tych mikroorganizmów do obecności badanych sulfonamidów. Ponadto, badano wpływ różnych stężeń sulfonamidów na szybkość usuwania azotu w krótkookresowych testach porcjowych. Szybkość usuwania azotu badano dla kultury bakterii Anammox nieaklimatyzowanej i aklimatyzowanej do obecności sulfonamidów. Badania wpływu sulfonamidów na proces Anammox prowadzono w Polsce (w Politechnice Gdańskiej) i w Szwecji (KTH). W badaniach zastosowano metodykę prowadzenia i kontroli tego procesu, opracowaną w Królewskiej Politechnice w Sztokholmie [Szatkowska et al., 24]. 6.1 Ścieki modelowe użyte do badań Do badań wpływu sulfanilamidu (SA) na proces Anammox pobierano wody osadowe (pochodzące z odwodnienia na wirówkach osadu przefermentowanego), zasilające stację pilotażową do badania procesu deamonifikacji na oczyszczalni ścieków Himmerfjärden (Szwecja). Wody osadowe poddano wstępnej filtracji przez sączki bibułowe, a następnie przechowywano w temperaturze + 4 C. Natomiast do wykonania badania wpływu SCM oraz p-tsa na proces Anammox oraz prowadzenia procesu Anammox w reaktorach kontrolnych użyto odciek z wirówek odwadniania osadu przefermentowanego, który został pobrany z oczyszczalni ścieków bytowo-gospodarczych Wschód w Gdańsku. Charakterystykę wód osadowych, wykorzystanych do przygotowania ścieków modelowych przedstawiają tabele 35, 36 i 37. Ścieki modelowe przygotowywano przez odpowiednie rozcieńczenie odcieku z wirówek, który stanowił źródło azotu amonowego (NH 4 -N), a następnie wzbogacano odpowiednią ilością roztworu NaNO 2 jako źródła azotu azotynowego (NO 2 -N) oraz w zależności od doświadczenia, dodawano wodnego roztworu badanego sulfonamidu tak, by uzyskać wymagane stężenie sulfonamidu, od 2 do 1 mg/l. 122

Tab. 35 Charakterystyka wód osadowych użytych do przygotowania ścieków modelowych do badań z SA Porcja NH 4 -N [mg/l] NO 2 - N [mg/l] NO 3 - N [mg/l] ChZT [mg/l] 1 361,5 6,63 3 2 35 4,3 12,7 297 3 342 3,7 17,8 296 4 332 4,1 19,5 298 Tab. 36 Charakterystyka wód osadowych użytych do przygotowania ścieków modelowych do badań z SCM Porcja NH 4 -N [mg/l] NO 2 - N [mg/l] NO 3 - N [mg/l] ChZT [mg/l] 1 763 8,4 23,1 46 2 65 5,3 16,2 433 3 873 1,5 13,2 482 4 724 13,6 16,3 451 Tab. 37 Charakterystyka wód osadowych użytych do przygotowania ścieków modelowych do badań z p-tsa Porcja ChZT NH 4 -N [mg/l] NO 2 - N [mg/l] NO 3 - N [mg/l] [mg/l] 1 685 6,4 15,3 428 2 7 9,2 16,4 439 3 635 4,7 1,4 415 Podczas prowadzania badań wpływu sulfonamidów na proces Anammox w testach krótkookresowych wykorzystane zostały ścieki syntetyczne zawierające 15 mg/l NH 4 -N oraz 6 mg/l NO 2 -N, natomiast podczas długookresowych testów użyto ścieków syntetycznych zawierających 15 mg/l NH 4 -N i 195 mg/l NO 2 -N. 123

6.2 Kontrolny proces Anammox bez obecności sulfonamidów Proces kontrolny prowadzono w celu kontroli i zapewnienia prawidłowego działania kultury Anammox w warunkach laboratoryjnych, gdyż ta kultura była używana do dalszych badań nad wpływem sulfonamidów na przebieg procesu Anammox. W badaniach użyto kultury Anammox, wcześniej pobranej z instalacji pilotażowej w oczyszczalni ścieków Himmerfjärden w Szwecji, gdzie miała ona kontakt z wodą osadową o innych parametrach niż planowana do stosowania w niniejszych badaniach woda osadowa z Oczyszczalni Wschód. Toteż, przed rozpoczęciem badań konieczna była adaptacja bakterii do nowych warunków. 6.2.1 Sposób wykonania badań Długookresowy kontrolny proces Anammox prowadzono w warunkach laboratoryjnych w specjalnie skonstruowanych reaktorach biologicznych, imitujących pracę instalacji oczyszczających ścieki. Schemat zestawu badawczego używanego do prowadzenia procesu przedstawiono na rysunku 7. Rys. 7 Schemat zestawu badawczego do wykonywania długookresowych testów procesu Anammox 1 termostat, 2 reaktor, 3, 4 mieszadła mechaniczne, 5 grzałka elektryczna, 6 zbiornik ścieków modelowych, 7 pompa, 8 odpływ ścieków oczyszczonych, 9 odbieralnik ścieków oczyszczonych Proces kontrolny był prowadzony równolegle w dwóch reaktorach o objętości 15 l każdy, wyposażonych w mieszadła. Reaktory były wypełnione do połowy objętości pierścieniami Kaldnes z rozwiniętą kulturą bakterii Anammox (tab. 38). Reaktory zasilano w sposób ciągły ściekami syntetycznymi, o założonym stężeniu azotu amonowego i azotynowego odpowiednio 1 mg/l NH 4 -N i 15 mg/l NO 2 -N. Przez cały czas zawartość reaktorów była bardzo powoli mieszana. Przez pierwsze 3 miesiące proces Anammox był stabilizowany. W tym czasie nie pobierano kultury bakterii do badań. 124

Tab. 38 Warunki prowadzenia kontrolnego procesu Anammox PARAMETR WARTOŚĆ Objętość reaktora [l] 15 Objętość nasypowa pierścieni Kaldnes [l] 7,5 Objętość ścieków modelowych [l] 12,6 Hydrauliczny czas zatrzymania [doba] 2 Tlen rozpuszczony [mg/ l],7-,34 Zakres ph 6,55-8,75 Zakres temperatury [ C] 29,5 ±,5 Następnie, kontrolny proces Anammox prowadzono przez 1 miesięcy, stosując do zasilania ścieki modelowe bez dodatku sulfonamidów. W tym okresie z reaktora kontrolnego pobierano pierścienie Kaldnes w ilościach niezbędnych do przeprowadzenia badań nad wpływem sulfonamidów na proces Anammox (procesów długo- i krótkookresowych). Ze względu na dużą wrażliwość mikroorganizmów Anammox na warunki tlenowe, sposób poboru kultury bakterii powinien ograniczyć kontakt mikroorganizmów z tlenem atmosferycznym. W związku z tym pierścienie Kaldnes były pobierane z reaktora kontrolnego pod powierzchnią cieczy (bez wynurzania). Również napełnianie reaktorów do krótko- i długookresowych testów odbywało się w ten sam sposób. 6.2.2 Wyniki procesu kontrolnego Celem prowadzenia kontrolnego procesu Anammox było utrzymanie dobrej jakości kultury bakteryjnej do badań przez cały okres trwania doświadczeń. Proces był prowadzony w stałej temperaturze około 3 C przez okres 1 miesięcy. W okresie tym był regularnie monitorowany poprzez kontrolę parametrów procesu takich jak ph i stężenie tlenu rozpuszczonego (DO). Zmiany tych parametrów w czasie zostały przedstawione na rysunku 71. ph 1 9.5 9 8.5 8 7.5 7 6.5 6 5.5 ph R1 ph na wejściu ph R2 DO R1 DO R2 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1.8.6.4.2 DO [mgo2/l] 5 3 6 9 12 15 18 21 24 27 3 Czas [dni] Rys. 71 Zmiany ph oraz stężenia tlenu rozpuszczonego (DO) w reaktorze kontrolnym procesu Anammox 125

Na rysunkach 72 i 73 przedstawiono zmiany stężenia jonów amonowych i azotynowych na wejściu i wyjściu z reaktorów kontrolnych, zaś wydajności usuwania azotu nieorganicznego (N tot = suma NH 4 -N, NO 2 -N, NO 3 -N ) przedstawiono na rysunku 74. Rys. 72 Zmiany stężenia jonów amonowych w ściekach na wejściu i wyjściu z reaktorów kontrolnych Rys. 73 Zmiany stężenia jonów azotynowych w ściekach na wejściu i wyjściu z reaktorów kontrolnych Wydajność usuwania N tot [%] 12 1 8 6 4 2 R1 R2 4 9 15 33 4 47 54 61 87 13 134 173 222 236 257 272 Czas [dni] Rys. 74 Wydajności usuwania całkowitego azotu nieorganicznego w czasie kontrolnego procesu Anammox 126

Jak widać z rysunku 74, podczas 1 miesięcy badań uzyskiwano bardzo wysoką wydajność usuwania azotu nieorganicznego (średnio powyżej 96%), co świadczy o tym, że proces Anammox przebiegał w sposób stabilny. Prawidłowe warunki prowadzenia procesu w reaktorze kontrolnym zapewniały właściwy stan błony biologicznej, którą wykorzystywano do dalszych badań, z udziałem sulfonamidów. Kondycję kultury bakterii utrzymywanej w reaktorze kontrolnym oceniano wykorzystując testy porcjowe, w których badano szybkość usuwania azotu nieorganicznego oraz badając aktywność dehydrogenaz. Wyniki tych badań przedstawiono w rozdziałach 6.3.2.1 i 6.4.2. 127

6.3 Badanie wpływu sulfonamidów na mikroorganizmy Anammox podczas długookresowej ekspozycji 6.3.1 Sposób wykonania badań Podczas prowadzenia testu długookresowej ekspozycji kultury bakterii Anammox na sulfonamidy użyto 5 reaktorów przepływowych o objętości 1 m 3 każdy. Zestaw badawczy używany podczas wykonywania badań tych testówbył taki sam jak zestaw użyty w procesie kontrolnym, różnił się jedynie rozmiarami reaktorów (rys. 5). Każdy z reaktorów został wypełniony w połowie objętości pierścieniami Kaldnes z dobrze rozwiniętą błoną biologiczną Anammox. Do każdego z reaktorów pompowane były ścieki syntetyczne o ustalonym stężeniu sulfonamidu z odpowiedniego zbiornika buforowego. We wszystkich bioreaktorach kontrolowano parametry procesowe tj. stężenie tlenu rozpuszczonego, ph oraz temperaturę, jak również monitorowano zmiany stężeń wszystkich form azotu nieorganicznego i azotu ogólnego. Proces Anammox był prowadzony w stałej temperaturze (3±2 C). Wszystkie reaktory pracowały w systemie ciągłym. Mieszanie zapewniało jednorodność warunków w całym reaktorze. W celu utrzymania stałej temperatury reaktory zostały umieszczone w łaźni wodnej, natomiast w celu zachowania beztlenowych warunków reaktory były przykryte, a mieszanie prowadzono w taki sposób aby nie powodować napowietrzania mieszaniny reakcyjnej. Warunki prowadzenia procesu Anammox przedstawiono w tabeli 39. Tab. 39 Założone warunki prowadzenia procesu Anammox podczas testów długookresowych Parametr Wartość Objętość reaktora [l] 1 Objętość nasypowa pierścieni Kaldnes [l],5 Objętość ścieków modelowych [l],84 Hydrauliczny czas zatrzymania [dni] 2 Tlen rozpuszczony [mg/l],1-,4 Zakres ph 7,5 8,3 Zakres temperatury [ C] 3 ± 2 Badanie długookresowego wpływu sulfonamidów na proces Anammox było każdorazowo prowadzone przez 9 dni. Badania prowadzono przy stężeniach sulfonamidów: 2, 4, 8, 1 mg /l. Ponadto, we wszystkich seriach prowadzono procesy bez dodatku sulfonamidów. We wszystkich doświadczeniach w pierwszym tygodniu reaktory były zasilane ściekami syntetycznymi bez dodatku sulfonamidu. Po okresie wstępnego wpracowania procesu rozpoczęto dozowanie sulfonamidów (tab. 4). 128

Tab. 4 Zawartość substratów procesu Anammox oraz sulfonamidów w ściekach modelowych Proces kontrolny SA SCM p-tsa Stężenie sulfonamidu [mg/l] 2-1 2-1 2-1 Stężenie NH 4 -N [mg/l] 15 1 * Stężenie NO 2 -N [mg/l] 195 15 * * - pierwsze 65 dni ** - kolejne 25 dni 15 ** 15 15 195 ** 195 195 W ramach kontroli procesu codziennie prowadzono pomiary ph, temperatury, stężenia tlenu rozpuszczonego oraz dwukrotnie w tygodniu była mierzona przewodność właściwa na wejściu i wyjściu z każdego reaktora. Ponadto, raz w tygodniu oznaczano chemiczne zapotrzebowanie na tlen (ChZT). Próbki ścieków, zarówno modelowych (wejście) jak i ścieków oczyszczonych (wyjście) były pobierane dwa razy w tygodniu. Natychmiast po ich pobraniu były przesączane przez filtr,45µm, a następnie oznaczano zawarte w próbkach formy azotu: azot amonowy (NH 4 -N), azotynowy (NO 2 -N) i azotanowy (NO 3 -N). Azot ogólny oznaczano jedynie na początku badań, ale gdy okazało się, że zawartość azotu organicznego jest znikoma (zwykle poniżej 1 mg/l), poprzestano na oznaczaniu form nieorganicznych azotu i zamiast azotu ogólnego wykorzystywano w dyskusji całkowity azot nieorganiczny. Zarówno przed rozpoczęciem jak i po zakończeniu doświadczeń długookresowych wykonywano testy porcjowe, na podstawie których określano zmianę szybkości usuwania azotu w zależności od stężenia sulfonamidu, dodanego do testów porcjowych (rozdz. 6.3 i 6.4) Podczas badania wpływu SA na proces Anammox początkowo stosowano ścieki modelowe, które zawierały 1 mg NH 4 -N/l oraz 15 mg NO 2 -N/l (pierwsze 65 dni prowadzenia procesu, tab. 27). W okresie tym we wszystkich reaktorach obserwowano prawie całkowite zużycie jonów azotynowych i amonowych oraz wysoką produkcję jonów azotanowych. Zjawisku temu towarzyszyło jednoczesne usuwanie azotu ogólnego świadczące o tym, że zachodził proces Anammox, jednakże jego przebieg był ograniczony niedoborem substratów. Toteż zdecydowano się zwiększyć ich stężenia o około 5% i tak ostatecznie stężenie azotu azotynowego oraz amonowego wynosiło odpowiednio, 195 mg NO 2 -N/l oraz 15 mg NH 4 -N/l. Prowadzenie procesu kontynuowano przez dalsze 25 dni zachowując metodykę kontroli procesu. Na tej podstawie zdecydowano również, że wyższe stężenia początkowe obu form azotu zostaną zastosowane podczas późniejszych badań z użyciem SCM oraz p-tsa (195 mg NO 2 -N/l oraz 15 mg NH 4 -N/l). 129

6.3.2 Kontrola parametrów procesu Anammox W tabelach 41-44 przedstawiono średnie wartości operacyjnych parametrów procesu tj. stężenie tlenu rozpuszczonego oraz ph ścieków syntetycznych (ph wejście) oraz ph ścieków oczyszczonych (ph wyjście), mierzonych w poszczególnych reaktorach, zasilanych ściekami z dodatkiem sulfonamidów. Tab. 41 Charakterystyka parametrów procesu Anammox w obecności SA podczas I okresu prowadzenia procesu (65 dni) Parametr Stężenie SA [mg/l] 2 4 1 DO [mg O 2 /l],29±,9,33±,9,45±,54,33±,6 ph wejście 7,95±,24 7,99±,15 7,9±,24 7,98±,18 ph wyjście 8,1±,24 7,87±,22 7,72±,24 7,68±,31 Tab. 42 Charakterystyka parametrów procesu Anammox w obecności SA podczas II okresu (od 66 do 9 dnia) Parametr Stężenie SA [mg/l] 2 4 1 DO [mg O 2 /l],31±,4,33±,3,46±,18,35±,5 ph wejście 7,76±,19 7,75±,8 7,9±,24 7,86±,14 ph wyjście 8,29±,21 7,63±,3 7,72±,24 7,33±,2 Tab. 43 Charakterystyka parametrów procesu Anammox w obecności SCM (9 dni) Parametr Stężenie SCM [mg/l] 2 4 8 1 DO [mg O 2 /l],19±,6,2±,7,19±,6,21±,7,19±,6 ph wejście 7,25±,2 7,35±,22 7,32±,21 7,35±,25 7,33±,28 ph wyjście 8,12±,14 8,9±,14 8,13±,16 8,14±,14 7,83±,33 Tab. 44 Charakterystyka parametrów procesu Anammox w obecności p-tsa (9 dni) Parametr Stężenie p-tsa [mg/l] 2 4 8 1 DO [mg O 2 /l],21±,2,21±,5,22±,8,2±,3,21±,4 ph wejście 7,63±,6 7,64±,7 7,71±,9 7,8±,17 7,76±,18 ph wyjście 7,93±,8 8,2±,15 8,±,15 8,3±,32 7,74±,11 Wcześniejsze badania procesu Anammox wykazały, że stężenie tlenu rozpuszczonego (DO) jest jednym z krytycznych czynników warunkujących prawidłowy przebieg procesu Anammox. Podczas 13

badania długoterminowej ekspozycji mikroorganizmów procesu Anammox na sulfonamidy udało się utrzymać, prawidłowe i stabilne warunki tlenowe (,19-,22 mg O 2 /l). Jedynie podczas prowadzenia procesu w obecności SA, obserwowano zaburzenia wartości DO w bioreaktorach. Optymalna wartość ph dla prawidłowego przebiegu procesu Anammox wynosi 8 [Egli et al., 21]. Podczas badania wpływu SA, SCM oraz p-tsa obserwowano nieco niższe niż 8 wejściowe wartości ph, odpowiednio 7,68-8,1; 7,25-7,35; oraz 7,63-7,8. ph w reaktorach nie było korygowane w trakcie prowadzenia procesu. Hydrauliczny czas zatrzymania (HRT) podczas prowadzenia procesu Anammox w obecności badanych sulfonamidów SA, SCM, oraz p-tsa wynosił odpowiednio 2,1, 2,2 oraz 2,2 doby. 6.3.3 Efektywność usuwania azotu w obecności sulfonamidów Sulfanilamid (SA) Procesy w obecności SA obejmowały dwa etapy różniące się stężeniem substratów. W pierwszym etapie (65 dni) stężenie azotu amonowego wynosiło 1 mg/l, a azotu azotynowego 15 mg/l, natomiast w drugim okresie (od 66 do 9 dnia) stężenia te były odpowiednio równe 15 i 195 mg N/l (tab. 41 i 42). W tabeli 45 przedstawiono średnie zawartości całkowitego azotu nieorganicznego w poszczególnych reaktorach podczas prowadzenia procesu Anammox w obecności SA, a na rysunku 75 przedstawiono wydajności usuwania azotu. W tekście rozprawy nie zamieszczono wartości stężeń poszczególnych form azotu, a jedynie sumaryczne stężenie azotu nieorganicznego (tab. 45). Natomiast stężenia poszczególnych form azotu zamieszczono w załączniku 2. Tab. 45 Stężenie całkowitego azotu nieorganicznego (N tot ) w procesie Anammox w obecności SA Stężenie SA [mg/l] Parametr 2 4 1 I etap (65 dni) N tot wej [mg/l] 235,6±21,9 228,9±24,4 229,3±23,5 236,4±21, N tot wyj [mg/l] 96,9±19,1 99,±15,3 12,3±18,5 142,7±31,7 II etap (25 dni N tot wej [mg/l] 367,7±11,8 357,9±8,9 384,1±51,9 364,7±1,9 N tot wyj [mg/l] 62,6±9,95 73,7±15,5 17,9±19,9 24,±45,5 Na rysunku 75 przedstawiono zmiany wydajności usuwania całkowitego azotu nieorganicznego (suma NH 4 -N, NO 2 -N, NO 3 -N ) w czasie. 131

12 1 mg SA/l 2 mg SA/l 4 mg SA/l 1 mg SA/l Wydajność usuwania Ntot [%] 8 6 4 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Czas [dni] Rys. 75 Wydajność usuwania azotu nieorganicznego ze ścieków o różnej zawartości SA Jak widać z rysunku 75 podczas I etapu prowadzenia procesu wydajność usuwania azotu całkowitego oscylowała w zakresie od 45 do 65% dla ścieków z SA w stężeniu 2 i 4 mg SA/l. Jedynie w reaktorze zasilanym ściekami modelowymi zawierającymi 1 mg SA/l wydajność procesu była niższa, a po 4 dniu prowadzenia procesu gwałtownie spadła do 3%. W tym czasie wydajność usuwania azotu w reaktorze kontrolnym (bez SA) była wyższa (powyżej 8%), ale z upływem czasu obserwowano wyraźną tendencję spadkową (po 45 dniach do poniżej 6%). Powyższe obserwacje świadczą o zakłóceniu procesu Anammox. Analizując zmiany stężenia poszczególnych form azotu widać, że w pierwszym etapie doświadczenia następowało całkowite zużycie NO 2 -N oraz NH 4 -N ale równocześnie znaczna produkcja NO 3 -N (zał. 2, tab. 34, 36, 38, 4, 42). W reaktorze kontrolnym (bez SA) produkcja azotanów ustaliła się na poziomie ok. 22% azotu ogólnego, natomiast w reaktorach zasilanych ściekami zawierającymi SA w ilościach 2, 4, oraz 1 mg SA/l produkcja azotanów wynosiła odpowiednio 34%, 31% oraz 42%. Biorąc pod uwagę reakcję procesu Anammox (równanie 7) teoretyczna produkcja azotu azotanowego nie powinna przekraczać 11,2 % początkowego stężenia całkowitego azotu nieorganicznego. Na podstawie otrzymanych wyników stwierdzono, że wydajności procesu Anammox są niższe niż oczekiwane (także w procesie kontrolnym, bez SA), zaś nadmierna ilość tworzących się azotanów świadczy o znacznym udziale procesu nitratacji. Powyższe obserwacje potwierdzały przypuszczenie o zakłóceniu procesu Anammox. Sądzono, że przyczyną może być zbyt niskie stężenie substratów dla tego procesu (były one dobrane na podstawie wcześniejszych badań, z uwzględnieniem toksycznych właściwości azotu amonowego względem bakterii Anammox) [Szatkowska et al., 23]. Toteż, ze względu na obserwowane zakłócenia, do dalszego prowadzenie procesu zwiększono ilości azotu amonowego i azotynowego o około 5%. Po zmianie wejściowych stężeń NO 2 -N (do 195 mg/l) oraz NH 4 -N (do 15 mg/l), wydajność procesu Anammox gwałtownie wzrosła we wszystkich reaktorach, osiągając powyżej 8% usunięcia azotu. Jedynie przy stężeniu SA równym 1 mg/l wydajność ta wzrosła tylko do 58% (rys. 75). Podczas tego etapu ścieki na wyjściu z reaktorów zawierały jeszcze pewną ilość substratów. I tak stężenie pozostałego azotu amonowego wynosiło około 13, 16, 13 i aż 1 mg NH 4 -N/l dla procesów przy stężeniu SA równym odpowiednio, 2, 4 i 1 132

mg SA/l, zaś stężenie pozostałego azotu azotynowego wynosiło odpowiednio około 19, 26, 32 i 96 mg NO 2 -N/l (zał. 2, tab. 35, 37, 39, 41,43). Po zwiększeniu stężeń substratów (II etap), proces Anammox był stabilny do końca prowadzenia badań jedynie w reaktorze kontrolnym. Natomiast w obecności sulfanilamidu stwierdzono stopniowe zakłócanie procesu w czasie, tym większe im wyższa była zawartość SA. I tak, w ostatnim dniu procesu wydajność usuwania azotu była niższa niż w reaktorze kontrolnym odpowiednio o 4%, 11% i aż o 49% przy stężeniach 2, 4 i 1 mg SA/l. Ponadto, procesowi Anammox towarzyszył proces nitratacji a stężenie powstających azotanów było tym wyższe im wyższa była zawartość SA, np. 98 mg NO 3 -N/l przy 1 mg SA/l (zał. 2, tab. 39) W tym przypadku produkcja azotu azotanowego wynosiła ok. 22%. W pozostałych reaktorach produkcja azotu azotanowego nie przekroczyła 11%, a więc była zgodna ze stechiometryczną ilością, wynikającą z reakcji zachodzących w procesie Anammox (reakcja 7). Reasumując, należy stwierdzić, że zastosowanie wyższych stężeń NO 2 -N (195 mg/l) oraz NH 4 - N (15 mg/l) spowodowało wyraźne obniżenie udziału procesu nitratacji w przemianach azotu. Na podstawie oznaczonych stężeń poszczególnych form azotu można zaobserwować, że proces Anammox zachodził prawidłowo, choć wydajności były niższe od oczekiwanych. Jedynie w reaktorze zawierającym 1 mg SA/l procesowi Anammox wyraźnie towarzyszyła nitratacja - produkcja azotanów wynosiła około 4%. Wniosek ten potwierdza również znaczny spadek ph w tym reaktorze (tab. 42). Sulfacetamid (SCM) Procesy w obecności SCM prowadzono również przez 9 dni, ale bez zmiany stężeń substratów. Założone stężenia początkowe azotu amonowego i azotu azotynowego były odpowiednio równe 15 i 195 mg N/l. Na podstawie otrzymanych wyników zaobserwowano wzrost ph w reaktorze kontrolnym oraz w reaktorach zawierających SCM w stężeniach: 2, 4, 8 oraz 1 mg/l odpowiednio o,87;,74;,81 oraz o,5 (tab. 43). Jednocześnie zaobserwowano obniżenie wydajności usuwania związków azotu ze ścieków. W tabeli 46 przedstawiono średnie wartości całkowitego azotu nieorganicznego w poszczególnych reaktorach podczas prowadzenia procesu Anammox w obecności SCM., zaś zmiany stężeń poszczególnych form azotu zamieszczono w załączniku 2 (tab. 15-17). Tab. 46 Stężenie całkowitego azotu nieorganicznego podczas procesu Anammox w obecności SCM Stężenie SCM [mg/l] Parametr 2 4 8 1 N tot wej [mg/l] 362,8±2,3 38,3±37,7 389,6±36,8 387,9±33,5 369,9±33,6 N tot wyj [mg/l] 25,8±2,5 36,6±2,3 51,5±29,2 57,6±39,7 57,5±34,6 133

Ścieki oczyszczone na wyjściu z reaktora kontrolnego zawierały średnio 8 mg NH 4 -N/l oraz 9 mg NO 2 -N/l, podczas gdy ścieki na wyjściu z reaktorów zasilanych ściekami modelowymi z 2 i 4 mg SCM/l zawierały odpowiednio po 15 mg NH 4 -N/l każdy oraz odpowiednio 7 mg NO 2 -N/l i 29 mg NO 2 -N/l. W reaktorach zasilanych ściekami zawierającymi 8 mg SCM/l oraz 1 mg SCM/l obserwowano zaburzenie usuwania azotu, gdyż na wyjściu z tych reaktorów stężenia NH 4 -N/l i mg NO 2 -N/l były znacznie wyższe niż na wyjściu z reaktora kontrolnego. Wynosiły one dla reaktora z 8 mg SCM/l odpowiednio, 2 mg NH 4 -N/l i 35 mg NO 2 -N/l oraz 38 mg NH 4 -N/l i 19 mg NO 2 -N/l dla reaktora z 1 mg SCM/l. Sytuację tę obrazuje rysunek 76. Wydajność usuwania Ntot [%] 12 1 8 6 4 2 O mg SCM/l 2 mg SCM/l 4 mg SCM/l 8 mg SCM/l 1 mg SCM/l 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Czas [dni] Rys. 76 Wydajność usuwania azotu nieorganicznego ze ścieków o różnej zawartości SCM Jak widać z rysunku 76, w reaktorze kontrolnym wydajność procesu była stabilna i wynosiła ok. 9-94% przez cały okres doświadczenia. W reaktorach z sulfacetamidem wydajność procesu Anammox wynosiła początkowo ok. 8-9% i po pierwszych 2 dniach prowadzenia procesu ustabilizowała się na poziomie ok. 9-95% przy stężeniach 2, 4 i 8 mg SCM/l. Jedynie w przypadku stężenia równego 1 mg SCM/l wydajność procesu była znacznie niższa i przez cały czas trwania doświadczenia systematycznie spadała, a w ostatnim dniu procesu wynosiła 41%. Pod koniec procesu obniżenie wydajności zostało również zaobserwowane w przypadku niższych stężeń SCM. W 9 dniu procesu Anammox w obecności różnych stężeń SCM (2-8 mg SCM/l) wydajność usuwania azotu wynosiła 85-73% (rys. 76). Jednakże w okolicy 4 dnia widoczne jest zakłócenie procesu Anammox we wszystkich reaktorach. Wynika ono prawdopodobnie z wahań stężenia substratów w ściekach modelowych doprowadzanych do reaktorów (zał. 2, rys. 19-23). Po skorygowaniu stężeń substratów do właściwego poziomu (zał. 2) wydajność procesu po około 5 dniach wzrosła (rys. 76). Jest to dowód na ogromną wrażliwość bakterii Anammox na jakiekolwiek odchylenia od optymalnych parametrów, co stwarza trudności w prowadzeniu tego procesu. 134

p-toluenosulfonamid ( p-tsa) Podczas długookresowego procesu Anammox w obecności p-toluenosulfonamidu zaobserwowano wzrost ph w ściekach. Wprowadzane ścieki syntetyczne charakteryzowały się średnimi wartościami ph w przedziale 7,63 7,8. W reaktorach zawierających sulfonamid o stężeniach 2, 4 i 8 mg p-tsa/l, oraz w próbie kontrolnej obserwowano wzrost wartości ph o,18 -,38 w porównaniu z wartością ph ścieków wprowadzanych. Jedynie w reaktorze, w którym stężenie p-tsa wynosiło 1 mg/l średnia wartość ph ścieków uległa niewielkiemu obniżeniu podczas prowadzenia procesu (o,2, tab. 44). Tabela 47 przedstawia średnią zawartość azotu całkowitego nieorganicznego w ściekach modelowych na wejściu oraz ściekach oczyszczonych w poszczególnych doświadczeniach. Tab. 47 Stężenie azotu całkowitego procesu Anammox w obecności p-tsa Parametr Stężenie p-tsa [mg p-tsa/l] 2 4 8 1 N tot wej [mg/l] 319,1±24,1 318,7±18,4 318,9±22,7 317,±24,3 315,4±26,2 N tot wyj [mg/l] 39,3±1, 4,7±12,8 38,7±12,9 39,±11,3 63,8±15,4 Ścieki oczyszczone na wyjściu z reaktorów o zawartości p-tsa równej, 2, 4, 8 i 1 mg/l zawierały odpowiednio 8, 9, 8,7, 9 i 36 mg NH 4 -N/l, a zawartość azotu azotynowego wynosiła odpowiednio około 3, 4, 4, 4,5 oraz 8 mg NO 2 -N/l (zał. 2, tab. 15-18). Średni poziom produkcji azotanów we wszystkich reaktorach był stały i mieścił się w zakresie 2-28 mg NO 3 -N/l (zał. 2, tab. 19, 2). Rysunek 77 przedstawia zmiany wydajności usuwania azotu nieorganicznego w procesie Anammox, prowadzonym w obecności p-tsa. 12 Wydajność usuwania Nt ot [%] 1 8 6 4 2 2 mg p-tsa/l 4 mg p-tsa/l 8 mg p-tsa/l 1 mg p-tsa/l mg p-tsa/l 15 3 45 6 75 9 Czas [dni] Rys. 77 Wydajność usuwania azotu nieorganicznego ze ścieków o różnej zawartości p-tsa 135

W przypadku gdy do ścieków modelowych było dodawane p-tsa, różnice w wydajności usuwania azotu nie były duże i od wartości początkowych 65-7% wzrosły do poziomu 85-9% na koniec eksperymentu (rys. 77). I co ważniejsze, również najwyższe stężenie p-tsa (1 mg/l) pozwalało na uzyskanie wydajności procesu Anammox jedynie o 5-15 % niższych niż wydajności obserwowane przy pozostałych stężeniach p-tsa. W okresie prowadzenia eksperymentów z p-tsa procesowi Anammox towarzyszył proces nitratacji, ponieważ zaobserwowano wzrost stężenia azotanów znacznie większy niż przy obecności pozostałych sulfonamidów (od około 5-7 do około 2-28 mg NO 3 -N/l, zał. 2, tab. 19, 2,) Porównanie wpływu poszczególnych sulfonamidów Na podstawie uzyskanych wyników dokonano analizy porównawczej wpływu trzech badanych sulfonamidów: SA, SCM oraz p-tsa. Przeliczono końcowe wydajności procesów (po 9 dniach) z udziałem sulfonamidów względem wydajności uzyskanych w próbach kontrolnych (przyjmując za 1% wydajności przy braku sulfonamidów). Wyniki przedstawiono na rysunku 78. Jak widać z rysunku 78 wydajność procesu Anammox najbardziej maleje pod wpływem SA i to tym bardziej, im większa była dawka sulfonamidu. W reaktorach zasilanych ściekami zawierającymi 2 i 4 mg SA/l obniżenie wydajności procesu wynosiło ok. 1 i 17% względem procesu kontrolnego (bez SA). Najwyższe zaobserwowane dla sulfanilamidu obniżenie wydajności procesu wynosiło ok. 45 % (przy 1 mg SA/l). Obecność SCM w ściekach w zakresie stężeń 2 do 8 mg/l powodowała obniżenie wydajności procesu Anammox o 6 do 8%, a pod wpływem 1 mg SCM/l wydajność procesu była niższa niż w próbie kontrolnej o 34%. Rys. 78 Wydajność procesu Anammox w obecności sulfonamidów w odniesieniu do procesów kontrolnych Natomiast wpływ p-tsa na proces Anammox był nieznaczny i przy stężeniach do 8 mg/l spadek wydajności wynosił zaledwie,5%, co mieści się w granicach błędu. Jedynie w reaktorze zasilanym ściekami modelowymi z 1 mg p-tsa/l zaobserwowano wyraźny efekt, ale wydajność procesu była niższa niż w próbie kontrolnej zaledwie o 7,5%. Najmniej szkodliwy efekt p-tsa jest 136