Tom XIX Rośliny Oleiste 1998 Instytut Genetyki Roślin PAN w Poznaniu Charakterystyka morfologiczna chromosomów Brassica trudności i nowe perspektywy Morphological characterization of Brassica chromosomes difficulties and new perspectives Chromosomy rodzaju Brassica są bardzo małe (ok. 2 µm), a ponadto w dużym stopniu ujednolicone co do wielkości oraz wyglądu w obrębie poszczególnych genomów. Poszukiwanie markerów morfologicznych dla metafazowych chromosomów mitotycznych Brassica, za pomocą klasycznych metod cytogenetycznych, było przez długi czas praktycznie nieskuteczne. Zastosowanie metod prążkowych nie przyniosło oczekiwanego rezultatu. Badania cytogenetyczne prowadzone w ostatnim czasie wykazały, że rozróżnianie chromosomów w pojedynczych genomach lub identyfikacja genomów w gatunkach alloploidalnych i materiale mieszańcowym jest częściowo możliwa dzięki analizie chromosomów mitotycznych w stadium prometafazy lub chromosomów mejotycznych w stadium diakinezy. Duże nadzieje pokładane są jednak w metodach cytogenetyki molekularnej. Sygnały hybrydyzacji in-situ na bardzo małych, metafazowych chromosomach mitotycznych Brassica mogą być w przyszłości jedynymi, precyzyjnymi markerami morfologicznymi, umożliwiającymi identyfikację poszczególnych chromosomów w obrębie genomu, jak i w obcym podłożu genetycznym (np. linie addytywne). Brassica chromosomes of the A, B and C genomes, are very small (2 µm) and, moreover, uniform in the size and apperance. Researches of morphological markers for mitotic metaphase chromosomes of Brassica genus, with the help of classical cytogenetic methods, were for the long time ineffective. Recently the cytogenetic studies showed that the differentiation between chromosomes in the individual genomes or the identification of the genomes in alloploid species and hybrid material is partly possible thanks to the analyses of mitotic chromosomes at prometaphase or meiotic chromosomes at diakinesis. The future prospects for identification of Brassica chromosomes are provided by the molecular cytogenetic methods. The hybridization signals could be probably the only precise morphological markers which will make possible the identification of individual chromosomes in single genomes and in alien genetic background (e.g. additive lines). Problem rozróżniania chromosomów w obrębie genomów roślinnych odgrywa bardzo ważną rolę w pracach hodowlanych. Umiejętność identyfikowania chromosomów umożliwia bowiem manipulowanie materiałem genetycznym oraz gwarantuje skuteczną selekcję pożądanych rekombinantów. Dla cytogenetyków,
24 chromosomy rodzaju Brassica są jednak trudnym materiałem badawczym, głównie ze względu na małe rozmiary chromosomów (ok. 2 µm) oraz brak istotnego zróżnicowania morfologicznego chromosomów w obrębie poszczególnych genomów. Z tej przyczyny rozróżnianie chromosomów w genomach A, B i C, a także identyfikowanie genomów w gatunkach amfidiploidalnych bądź w układach mieszańcowych stanowi od dawna najtrudniejsze zagadnienie w cytogenetyce Brassica. Pierwszą próbę charakterystyki morfologicznej chromosomów Brassica podjął Röbbelen (1960). Autor analizował chromosomy mejotyczne w stadium pachytenu u B. nigra (BB), B. oleracea (CC) i B. campestris (AA). Jak wiadomo specyficzną cechą chromosomów pachytenowych jest liczba oraz usytuowanie chromomerów, które stanowią paciorkowate skupienia silnie wybarwiającej się chromatyny. Dzięki temu Röbbelen mógł scharakteryzować poszczególne chromosomy i w efekcie ułożyć tzw. formułę genomową dla genomów A, B i C, wykazując jednocześnie podobieństwa w morfologii chromosomów, zarówno w obrębie genomów jak i pomiędzy nimi. Podobne badania przeprowadzone zostały przez Venkateswarlu i Kamala (1971) oraz Kamala (1976). Metoda analizy chromosomów mejotycznych w stadium pachytenu jest jednak zbyt trudna, aby można ją było polecać jako rutynową procedurę dla analizy chromosomów Brassica. Chromosomy pachytenowe są bowiem bardzo długie, tworzą strukturę splątanych nici w jądrze komórkowym, co sprawia, że bardzo trudno wyodrębnić pojedynczy chromosom w celu dokonania jego charakterystyki. Metody prążkowe Tak jak u innych gatunków roślin, większość badań cytogenetycznych w rodzaju Brassica mających na celu charakterystykę morfologiczną chromosomów, przeprowadzano w stadium metafazy mitotycznej. Maksymalnie skrócone chromosomy metafazowe można bowiem łatwo zmierzyć, a tym samym wyznaczyć pozycję centromeru, określić typ chromosomu oraz dokonać ostatecznej klasyfikacji konstruując kariotyp danego genomu. Rozróżnianiu i klasyfikowaniu chromosomów w genomie sprzyja obecność markerów cytogenetycznych, do których należą między innymi prążki uzyskiwane w wyniku barwienia różnicowego chromatyny. Metafazowe chromosomy Brassica są ekstremalnie wrażliwe na procedurę stosowaną w tzw. metodach prążkowych. Ponadto na tak krótkich chromosomach trudno uzyskać prążki, które byłyby wystarczającym markerem morfologicznym, ułatwiającym ich rozróżnianie. Stosując różne techniki barwienia, na chromosomach Brassica próbowano uzyskać prążki typu C, G i N.
Charakterystyka morfologiczna chromosomów Brassica... 25 Prążki typu C, które stanowią ciemno wybarwioną heterochromatynę konstytutywną uzyskał Wang (1987) u B. oleracea i B. alboglabra. Olin-Fatih i Heneen (1992) otrzymali C-prążki u B. oleracea, B. campestris i B. napus na chromosomach w stadium późnej profazy. Klasyfikacje chromosomów u B. oleracea przedstawione przez Wang'a (1987) oraz Olin-Fatih i Heneen'a (1992) nie były jednak zgodne, jakkolwiek pozwalały na rozróżnienie par chromosomów homologicznych w genomie C. Ponadto charakterystyka chromosomów profazalnych przeprowadzana przez Olin-Fatih i Heneen'a nie umożliwiła rozróżnienia genomów A i C w gatunku amfidiploidalnym B. napus. Odmianą metody C-prążkowej jest barwienie indukujące tzw. N-prążki. Różnice uzyskane w obrazie prążkowym w obu metodach wynikają jedynie ze stosowania zmodyfikowanych technik barwienia, lecz w istocie zarówno prążki typu C jak i prążki typu N prezentują heterochromatynę konstytutywną. Wang (1989) otrzymał N-prążki na chromosomach metafazowych genomu C B. oleracea, co pozwoliło mu uszeregować chromosomy w pary homologiczne. Trzecim rodzajem prążków jaki uzyskano na chromosomach Brassica były prążki typu G, które wizualnie stanowią odwrócenie prążków typu C, a ich ekspresja wynika ze stosowania specjalnej techniki barwienia. Nishibayasahi (1992) uznał jako prążki typu G jasno barwione rejony centromeryczne na chromosomach metafazowych genomu A u B. campestris. Uzyskane obrazy nie umożliwiły jednak autorowi dokładnej klasyfikacji chromosomów oraz rozróżnienia par chromosomów homologicznych. O prążkach typu G na chromosomach metafazowych Brassica donosiła również Olin-Fatih (1994). Pomimo tego, iż autorka zidentyfikowała pary chromosomów homologicznych w genomach A i C B. campestris i B. oleracea, nie dokonała rozróżnienia obu genomów u B. napus. Jak widać obrazy uzyskiwane w wyniku barwienia prążkowego małych chromosomów Brassica były na ogół słabo czytelne i nie zawsze jednoznaczne. Rozbieżności powstające podczas klasyfikowania chromosomów wynikały najprawdopodobniej z różnego pochodzenia materiału badawczego oraz z faktu, iż chromosomy mitotyczne nie zawsze analizowano w tym stadium. Analiza chromosomów mitotycznych w stadium prometafazy oraz analiza chromosomów mejotycznych w stadium diakinezy Nowe perspektywy dla rozróżniania chromosomów Brassica stworzyła analiza chromosomów mitotycznych w stadium prometafazy oraz analiza chromosomów mejotycznych w stadium diakinezy. W obu tych stadiach nieskrócone do końca chromosomy ujawniają specyficzną cechę zróżnicowanej kondensacji i barwienia chromatyny. Analogiczna sytuacja obserwowana była wcześniej u innych gatunków roślin, takich jak: Nicotiana otophora (Merrit i Burns 1974)
26 i Oryza sativa (Iijima i in. 1991). Zjawisko zróżnicowanej kondensacji i barwienia chromatyny tłumaczone jest zróżnicowanym procesem skracania się chromosomów segmenty proksymalne zaczynają skracać się wcześniej, stąd też prędzej osiągają stan bardziej skondensowany niż dystalne części ramion. Klasyfikacja chromosomów prometafazowych wykonana przez Cheng'a i in. (1995) w genomach A i C, wydaje się być najbardziej precyzyjną klasyfikacją chromosomów mitotycznych, jaką do tej pory przeprowadzono w rodzaju Brassica. Analiza konfiguracji mejotycznych w stadium diakinezy traktowana jest z kolei jako nowe podejście do rozwiązywania problemu identyfikacji i rozróżniania chromosomów w genomach A, B i C (Cheng i in. 1995; Heneen i in. 1995). Barwienie różnicowe chromosomów diakinezowych jest prostsze od barwienia prążkowego chromosomów mitotycznych, a skuteczność obu metod jest porównywalna. Wyraźna różnica w sposobie wybarwiania chromosomów diakinezowych genomów A i C sprawia, iż oba genomy mogą być rozróżnialne w gatunku amfidiploidalnym B. napus. Chromosomy diakinezowe B. oleracea barwią się prawie jednolicie w stadium diakinezy, dlatego też nie można dokonać dokładnego rozróżnienia poszczególnych par chromosomów homologicznych w obrębie genomu C. Chromosomy genomu A prezentują natomiast wyraźne, różnicowe barwienie ciemno wybarwiony obszar perycentryczny oraz jasno barwione ramiona (Heneen i in. 1995). Analogicznie do genomu A barwią się chromosomy genomu B Brassica nigra. Dzięki różnicowemu barwieniu scharakteryzowano poszczególne pary chromosomów homologicznych oraz skonstruowano kariotyp mejotyczny genomu B (Maćkowiak dane nie opublikowane). Ze względu na różny sposób barwienia analiza chromosomów diakinezowych może być w pełni przydatna dla rozróżniania genomów A i C oraz B i C, zarówno w gatunkach amfidiploidalnych jak i w układach mieszańcowych. Niestety, odróżnianie genomów A i B jest jednak ograniczone ze względu na analogiczną morfologię oraz sposób barwienia niektórych biwalentów diakinezowych. Należy podkreślić fakt, że charakterystyka prometafazowych chromosomów mitotycznych genomów A i C, jak i chromosomów diakinezowych genomu A, umożliwiła identyfikowanie obcych, pojedyncznych chromosomów w monosomicznych liniach addytywnych B. campestris alboglabra (Cheng i in. 1994, 1995; Heneen i in. 1995). Cytogenetyka molekularna u Brassica technika hybrydyzacji in situ Nowe perspektywy dla identyfikowania chromosomów rodzaju Brassica stwarzają metody cytogenetyki molekularnej. Dzięki fizycznej lokalizacji specyficznych sekwencji DNA na chromosomach, identyfikacja poszczególnych
Charakterystyka morfologiczna chromosomów Brassica... 27 chromosomów, a nawet ich segmentów będzie realna. Do tej pory zastosowanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in-situ (FISH) w rodzaju Brassica obejmowało lokalizowanie sekwencji powtarzających się rdna oraz sekwencji centromerycznych na chromosomach metafazowych (Iwabuchi i in. 1991, Małuszyńska i Heslop-Harrison 1993 a i b, Harrison i Heslop-Harrison 1995). Chromosomowa lokalizacja sygnałów hybrydyzacji nie była jednak zupełnie jednoznaczna, bowiem duże skondensowanie chromosomów metafazowych sprawiało, że ich rozróżnianie było trudne lub wręcz niemożliwe. Snowdon i in. (1997) jako pierwsi lokalizowali sygnały FISH na chromosomach prometafazowych w genomach A i C. Zróżnicowanie morfologiczne chromosomów w stadium prometafazy umożliwiło lokalizację loci rdna na identyfikowalnych parach chromosomów homologicznych u B. oleracea, B. rapa i B. napus. W przyszłości duże znaczenie może mieć fizyczne lokalizowanie unikalnych sekwencji DNA będących jednocześnie precyzyjnymi markerami dla poszczególnych genomów A, B i C rodzaju Brassica. Literatura Cheng B. F., Heneen W. K., Chen B. Y. 1994. Meiotic studies on a Brassica campestris alboglabra monosomic addition line and derived B. campestris primary trisomics. Genome 37: 584-589. Cheng B. F., Heneen W. K., Chen B. Y. 1995. Mitotic karyotypes of Brassica campestris and Brassica alboglabra and identification of the B. alboglabra chromosome in an addition line. Genome 38: 313-319. Harrison G. E., Heslop-Harrison J. S. 1995. Centromeric repetitive sequences DNA in the genus Brassica. Theor. Appl. Genet., 90: 157-165. Heneen W. K., Chen B. Y., Cheng B. F., Jonsson A., Simonsen V., Jorgensen R. B., Davik J. 1995. Characterization of the A and C genomes of Brassica campestris oleracea. Theor. Appl. Genet. 81: 221-226. Iijima K., Kakeda K., Fukui K. 1991. Identification and characterization of somatic rice chromosomes by imaging methods. Theor. Appl. Genet. 81: 597-605. Iwabuchi M., Itoh K., Shimamoto K. 1991. Molecular and cytological characterization of repetitive DNA sequences in Brassica. Theor. Appl. Genet. 81: 349-355. Kamala T. 1976. Interspecific hybrids in Brassica. Cytologia 41: 407-415. Małuszyńska J., Heslop-Harrison J. S. 1993a. Molecular cytogenetics of the genus Arabidopsis: in situ localization of rdna sites, chromosome numbers and diversity in centromeric heterochromatin. Ann. Bot. London, 71: 479-484. Małuszyńska J., Heslop-Harrison J. S. 1993b. Physical mapping of rdna loci in Brassica species. Genome 36: 774-781. Merrit J. F., Burns J. A. 1974. Chromosome banding in Nicotiana otophora without denaturation and renaturation. The Journal of Heredity 65: 101-103. Nishibayasahi S. 1992. Banding in mitotic chromosomes of Brassica campestris var. pekinensis with a tripsin-giemsa method. Genome 35: 899-901.
28 Olin-Fatih M. 1994. A new method for differential staining of Brassica metaphase chromosomes, and karyotypes of B. campestris, B. oleracea and B. napus. Hereditas 120: 253-259. Olin-Fatih M. 1996. The morphology, cytology and C-banded karyotypes of Brassica campestris, B. oleracea and B. napus plants regenerated from protoplasts. Theor. Appl. Genet. 93: 414-420. Olin-Fatih M., Heneen W. K. 1992. C-banded karyotypes of B. campestris, B. oleracea and B. napus. Genome 35: 583-589. Röbbelen G. 1960. Beiträge zur Analyse des Brassica Genomes. Chromosoma 11: 205-228. Snowdon R. J., Köhler W., Köhler A. 1997. Chromosomal localization and characterization of rdna loci in the Brassica A and C genomes. Genome 40: 582-587. Venkateswarlu J., Kamala T. 1971. Pachytene chromosomes complements and genome analysis in Brassica. J. Indian. Bot. Soc. 50A: 442-449. Wang X. H., Luo P., Shu J. J. 1989. Giemsa N-banding pattern in cabbage and Chinese kale. Euphytica 41: 17-21. Wang X., Luo P. 1987. Studies on the karyotypes and C-banding patterns of Chinese kale (Brassica alboglabra) and cabbage (B. oleracea var. capitata). Acta Botanica Sinica 29: 149-155.