Molekularna diagnostyka sepsy i sekwencjonowanie następnej generacji. (NGS) - czyli co możemy jeszcze zrobić? Dr hab.

Podobne dokumenty
Diagnostyka mikrobiologiczna zakażeń krwi Paweł Zwierzewicz

Diagnostyka molekularna w OIT

Sepsa, wstrząs septyczny, definicja, rozpoznanie

Zakład Mikrobiologii Klinicznej [1]

Nowoczesna diagnostyka mikrobiologiczna

HARMONOGRAM ZAJĘĆ dla studentów Uniwersyteckiego Centrum Medycyny Weterynaryjnej UJ-UR Mikrobiologia weterynaryjna II rok 2016/2017 semestr letni

OFERTA TEMATÓW PRAC DYPLOMOWYCH (MAGISTERSKICH) do zrealizowania w Katedrze MIKROBIOLOGII

Protokoły do zajęć praktycznych z mikrobiologii ogólnej i żywności dla studentów kierunku: Dietetyka

PROKALCYTONINA infekcje bakteryjne i sepsa. wprowadzenie

SHL.org.pl SHL.org.pl

Harmonogram zajęć z Mikrobiologii z parazytologią i Immunologii dla studentów II roku kierunku lekarskiego WL 2018/2019 GRUPA 5

S YLABUS MODUŁU (PRZEDMIOTU) I nformacje ogólne. Diagnostyka mikrobiologiczna. Nie dotyczy. 13 Wykłady: 30 h, ćwiczenia 120h;

Harmonogram zajęć z Mikrobiologii z parazytologią i Immunologii. dla studentów II roku kierunku lekarskiego Wydziału Lekarskiego 2016/2017

L.p. Nazwa badania. Czas oczekiwania na wynik. Pobranie materiału do badania BADANIA MIKROBIOLOGICZNE - POSIEWY

WYTYCZNE W-0018_001 WYTYCZNE WYDAWANIA RAPORTÓW Z BADAŃ MIKROBIOLOGICZNYCH. Data wprowadzenia:

S YL AB US MODUŁ U ( PRZEDMIOTU) I nforma cje ogólne. Mikrobiologia i immunologia

Gorączka Q epidemiologia, patogeneza oraz diagnostyka laboratoryjna. Wskazówki dla lekarzy weterynarii i hodowców

Odpowiedzi na zapytania nr 2 (wykonawcy, którzy złożyli zapytania; strona internetowa; tablica ogłoszeń)

Program ćwiczeń z mikrobiologii dla studentów III roku Oddziału Analityki Medycznej, rok akademicki 2014/2015 SEMESTR LETNI

Słowa kluczowe: żółć, złogi żółciowe, kamica żółciowa, zakażenie żółci, bakterie.

Opis przedmiotu zamówienia wraz z wymaganiami technicznymi i zestawieniem parametrów

Zastosowanie nowych technologii w diagnostyce mikrobiologicznej. Ireneusz Popławski

DIAGNOSTYKA BEZPOŚREDNIA. Joanna Kądzielska Katedra Mikrobiologii Lekarskiej Warszawski Uniwersytet Medyczny

HARMONOGRAM ZAJĘĆ dla studentów Uniwersyteckiego Centrum Medycyny Weterynaryjnej UJ-UR Mikrobiologia weterynaryjna II rok 2017/2018 semestr letni

- podłoża transportowo wzrostowe..

Laboratorium Wirusologiczne

ZASADY BADAŃ BAKTERIOLOGICZNYCH

Oporność na antybiotyki w Unii Europejskiej Dane zaprezentowane poniżej zgromadzone zostały w ramach programu EARS-Net, który jest koordynowany przez

X JUBILEUSZOWE OGÓLNOPOLSKIE SYMPOZJUM NAUKOWE

Rekomendacje diagnostyczne inwazyjnych zakażeń bakteryjnych nabytych poza szpitalem M. Kadłubowski, A. Skoczyńska, W. Hryniewicz, KOROUN, NIL, 2009

Sylabus Część A - Opis przedmiotu kształcenia Grupa szczegółowych efektów kształcenia Kod grupy A. Nazwa

1. Wykonanie preparatów bezpośrednich i ich ocena: 1a. Wykonaj własny preparat bezpośredni ze śliny Zinterpretuj i podkreśl to co widzisz:

Klub Młodego Wynalazcy - Laboratoria i wyposażenie. Pracownia genetyki

Spis treœci. 1. Wstêp... 1

Nazwa i typ aparatu:.. Lp. Opis parametru Kryterium Parametr wymagany

S YL AB US MODUŁ U ( PRZEDMIOTU) I nforma cje ogólne. Mikrobiologia i immunologia


SZCZEGÓŁOWY OPIS PRZEDMIOTU ZAMÓWIENIA

S YLABUS MODUŁU. I nformacje ogólne. Nie dotyczy. egzamin końcowy: testowy i praktyczny

FORMULARZ ASORTYMENTOWO CENOWY załącznik nr 7

Anna Durka. Opiekun pracy: Dr n. med. Waldemar Machała

Nowe wyzwania dla medycyny zakażeń w świetle zachodzących zmian w epidemiologii drobnoustrojów oraz demografii pacjentów

AmpliTest Salmonella spp. (Real Time PCR)

Diagnostyka wirusologiczna w praktyce klinicznej

Elżbieta Arłukowicz Streszczenie rozprawy doktorskiej

Sylabus modułu zajęć na studiach wyższych

Metody: PCR, MLPA, Sekwencjonowanie, PCR-RLFP, PCR-Multiplex, PCR-ASO

MATERIAŁY Z GÓRNYCH DRÓG ODDECHOWYCH - badanie bakteriologiczne + mykologiczne

Sylabus. Opis przedmiotu kształcenia. Nazwa modułu/przedmiotu MIKROBIOLOGIA/Microbiology Grupa szczegółowych efektów kształcenia

EWA HELWICH Instytut Matki i Dziecka w Warszawie

CZĘŚĆ TEORETYCZNA. Pseudomonas sp. Rodzaj Pseudomonas obejmuje 200 gatunków najważniejszy Pseudomonas aerugonosa.

SHL.org.pl SHL.org.pl

S YLABUS MODUŁU. I nformacje ogólne

1.1. PODSTAWOWE INFORMACJE O PRZEDMIOCIE/MODULE

Badanie mikrobiologiczne płynów z jam ciała

SYLABUS I II III IV X V VI X 8 X , w tym: 20 - wykłady, 10 - seminaria, 30 ćwiczenia, 15 fakultety

1. Zamawiający: 2. Opis przedmiotu zamówienia:

Ćwiczenie 1 Morfologia I fizjologia bakterii

WYNIKI PUNKTOWEGO BADANIA ZAKAŻEŃ SZPITALNYCH ZE SZCZEGÓLNYM UWZGLĘDNIENIEM ZAKAŻEŃ MIEJSCA OPEROWANEGO PRZEPROWADZONEGO 2013 ROKU W WSZZ W TORUNIU

ZLECANIE BADAŃ. WARUNKI POBRANIA I TRANSPORTU MATERIAŁU

Sylabus. Opis przedmiotu kształcenia MIKROBIOLOGIA i. efektów kształcenia MIKROBIOLOGICZNA. Ćwiczenia laboratoryjne (CL) Ćwiczenia w warunkach

SPRAWOZDANIE Z BADAŃ MIKROBIOLOGICZNYCH Nr 20005/11858/09

I. Wykaz drobnoustrojów alarmowych w poszczególnych jednostkach organizacyjnych podmiotów leczniczych.

KONSPEKTY DO ĆWICZEN Z MIKROBIOLOGII LEKARSKIEJ WYDZIAŁ LEKARSKO-DENTYSTYCZNY II ROK 2019/2020 CZĘŚĆ PRAKTYCZNA

ZAKRES AKREDYTACJI LABORATORIUM BADAWCZEGO Nr AB 448

Centrum Badań DNA - przykład start-up u w biotechnologii

Badanie na obecność pałeczek CPE Informacje dla pacjentów

ŚRODA 4 września 2013

Bielsko-Biała, dn r.

77/PNP/SW/2015 Dostawa implantów Załącznik nr 1 do SIWZ

Metody biologii molekularnej w diagnostyce mikrobiologicznej (32h) r. KURS DOFINANSOWANY PRZEZ:

Analiza genetyczna w niepowodzeniach ciąży i badaniach prenatalnych

OCENA rozprawy naukowej na stopień doktora nauk medycznych lek. Julii Macias

S YL AB US MODUŁ U ( PRZEDMIOTU) I nforma cje ogólne. Lekarsko-Stomatologiczny (WLS)

[1ZKO/KII] Mikrobiologia skóry

Pozaszpitalne zapalenia płuc u dzieci

AmpliTest Chlamydia/Chlamydophila (Real Time PCR)

SPRAWOZDANIE Z BADAŃ MIKROBIOLOGICZNYCH Nr 20006/11859/09

Kurs pt. " MOLEKULARNE METODY BADAŃ W MIKROBIOLOGII I WIRUSOLOGII "

OGÓLNY PLAN ĆWICZEŃ I SEMINARIÓW Z MIKROBIOLOGII OGÓLNEJ dla studentów STOMATOLOGII w roku akademickim semestr zimowy Seminarium 1.

Załącznik nr 2 do procedury opracowywania i okresowego przeglądu programów kształcenia II WYDZIAŁ LEKARSKI. Rok: IV.

Zapalenia płuc u dzieci

PRZEWODNIK PO PRZEDMIOCIE. stacjonarne. I stopnia. Aleksandra Zyska. ogólnoakademicki. podstawowy WYKŁAD ĆWICZENIA LABORATORIUM PROJEKT SEMINARIUM

Program ćwiczeń z mikrobiologii dla studentów III roku Oddziału Analityki Medycznej, rok akademicki 2018/2019 SEMESTR LETNI

Czas w medycynie laboratoryjnej. Bogdan Solnica Katedra Biochemii Klinicznej Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum Kraków

1.1. PODSTAWOWE INFORMACJE O PRZEDMIOCIE/MODULE

Ćwiczenie 1. Ekosystem jamy ustnej

Zalecenia rekomendowane przez Ministra Zdrowia. KPC - ang: Klebsiella pneumoniae carbapenemase

10) istotne kliniczne dane pacjenta, w szczególności: rozpoznanie, występujące czynniki ryzyka zakażenia, w tym wcześniejsza antybiotykoterapia,

Etiologia, obraz kliniczny i diagnostyka zakażeo wywołanych bakteriami beztlenowymi (40h)

Prezentacja Pracowni Ekologii Drobnoustrojów w Katedry Mikrobiologii UJCM

Zestawy do izolacji DNA i RNA

FLUORESCENCYJNA HYBRYDYZACJA IN SITU W DETEKCJI INFEKCYJNYCH POWIKŁAŃ PRZEWLEKŁEJ STYMULACJI SERCA BADANIA PILOTAŻOWE

Poradnia Immunologiczna

Wyroby medyczne jako wsparcie w kontroli zakażeń na sali operacyjnej Endotoksyny w rękawicach chirurgicznych

w kale oraz innych laboratoryjnych markerów stanu zapalnego (białka C-reaktywnego,

AmpliTest GMO screening-nos (Real Time PCR)

Krakowska Akademia im. Andrzeja Frycza Modrzewskiego. Karta przedmiotu. obowiązuje studentów, którzy rozpoczęli studia w roku akademickim 2016/2017

Testy dla kobiet w ciąży. Zakażenie HIV i AIDS u dzieci.

S YL AB US MODUŁ U ( PRZEDMIOTU) I nforma cje ogólne. Lekarsko-Stomatologiczny (WLS)

Transkrypt:

Molekularna diagnostyka sepsy i sekwencjonowanie następnej generacji Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum Wydział Lekarski (NGS) - czyli co możemy jeszcze zrobić? Katedra Mikrobiologii Zakład Molekularnej Mikrobiologii Medycznej Dr hab. Tomasz Gosiewski

SEPSA Sepsa (dawniej posocznicą) jest częstym i niejednorodnym zespołem klinicznym, który definiuje się jako całokształt zjawisk patofizjologicznych określanych mianem ogólnoustrojowej reakcji zapalnej (systemic inflammatory response syndrome SIRS), wywołanych zakażeniem Sepsa jest stanem zagrażającym życiu, który powstaje, gdy reakcja organizmu na zakażenie uszkadza własne tkanki i narządy SOFA (sequential organ failure assessment score)

Postacie sepsy ze względu na patogenezę SEPSA drobnoustroje toksemia DNAemia bakteriemia fungemia

Czy sepsa nadal jest poważnym problemem? Antybiotyki, chemioterapeutyki diagnostyka Zaawansowana chirurgia Technologie terapeutyczne

Sepsa czy to nadal istotny problem?

Skuteczna walka z sepsą Podejrzenie - SOFA (klinika) diagnostyka (laboratorium) leczenie

Diagnostyka sepsy tzw. klasyczna. Do tej pory tzw. złotym standardem diagnostycznym są hodowle krwi prowadzone na specjalnych podłożach, najlepiej w systemach hodowli automatycznej. Do zalet tych metod należy ich prostota oraz względnie niski koszt wykonania badania. Słabą stroną metody opartej na hodowli krwi jest jej czasochłonność, sięgająca nawet 5 dni (do czasu wydania wyniku badania) oraz niska czułość, która powoduje że jedynie w ok. 15-30% hodowli udaje się uzyskać wzrost mikroorganizmów. KOMÓRKI MIKROORGANIZMÓW MUSZĄ CHCIEĆ SIĘ HODOWAĆ

Aparat BACTEC 9050 (Becton-Dickinson)

Aparat BacT/ALERT oraz podłoża

Źródła infekcji w sepsie

Mikrobiom człowieka Powszechnie znane nisze ekologiczne http://advisoranalyst.com/glablog/2013/11/25/thehuman-microbiome.html

Czy pozostałe rejony ciała są rzeczywiście fizjologicznie jałowe? Dolne drogi oddechowe (drzewo oskrzelowe)? Płyn owodniowy w macicy i łożysko? Centralny układ nerwowy (PMR)? Łożysko naczyniowe (krew)?

Drzewo oskrzelowe The lung microbiota in early rheumatoid arthritis and autoimmunity. Scher JU, Joshua V, Artacho A, Abdollahi-Roodsaz S, Öckinger J, Kullberg S, Sköld M, Eklund A, Grunewald J, Clemente JC, Ubeda C, Segal LN, Catrina AI. Microbiome. 2016 Nov 17;4(1):60.

Płyn owodniowy i łożysko Maternal microbiome - A pathway to preterm birth. Vinturache AE, Gyamfi-Bannerman C, Hwang J, Mysorekar IU, Jacobsson B; Preterm Birth International Collaborative (PREBIC).Semin Fetal Neonatal Med. 2016 Apr;21(2):94-9. doi: 10.1016/j.siny.2016.02.004. Epub 2016 Feb 28. Review.

Centralny układ nerwowy (PMR) 48 próbek PMR pacjenci z MS; 30 próbek zdrowi (kontrola) Cerebrospinal Fluid in a Small Cohort of Patients with Multiple Sclerosis Was Generally Free of Microbial DNA. Jovel J, O'keefe S, Patterson J, Bording-Jorgensen M, Wang W, Mason AL, Warren KG, Wong GK. Front Cell Infect Microbiol. 2017 Jan 6;6:198. doi: 10.3389/fcimb.2016.00198. ecollection 2016.

Centralny układ nerwowy (PMR) W dwóch próbkach: 3C i 26MS wykryto duże ilości DNA bakteryjnego DOWÓD NA ISTNIENIE MIKROBIOTA PMR???

Łożysko naczyniowe (krew) Sepsa nierozłącznie wiąże się z pojęciem bakteriemii lub toksemii Fizjologiczna bakteriemia Dogmat o tzw. fizjologicznej jałowości krwi w warunkach fizjologicznej homeostazy czy prawdziwy czy może podtrzymywany niedoskonałością klasycznej metody diagnostycznej opartej o hodowlę krwi (złoty standard)?

Metody biologii molekularnej KOMÓRKI MIKROORGANIZMÓW NIE MUSZĄ CHCIEĆ SIĘ HODOWAĆ

Zalety metod molekularnych w diagnostyce mikrobiologicznej Znaczne zwiększenie czułości wykrywania patogenu Możliwość wykrywania obecności bakterii nienamnażających się lub martwych - antybiotykoterapia Skrócenia czasu oczekiwania na wyniki badania do nawet kilku godzin.

Na rynku obecne są bardzo nieliczne zestawy diagnostyczne stosowane w molekularnej diagnostyce sepsy, takie jak np. SeptiFast (Roche), Magicplex Sepsis Real-time Test. Umożliwiają one detekcję wybranych gatunków lub grup drobnoustrojów, co umożliwia jedynie potwierdzenie zakażenia, lecz nie pozwala na jego wykluczenie

SeptiFast (Roche)

Magicplex Sepsis Real-time Test

Możliwe jest także alternatywne podejście, które polega na wykrywaniu wszystkich drobnoustrojów, (potwierdzenie, jak i wykluczenie sepsy) - pozwala na ogólne identyfikowanie drobnoustrojów jako Gram ujemnych i Gram dodatnich bakterii oraz grzybów drożdżowych i pleśniowych. Opracowanie skutecznych molekularnych metod wykrywania obecności bakterii i grzybów we krwi jest wciąż problemem wymagającym prac badawczych

Materiały: W badaniu wykorzystano krew od pacjentów wykazujących kliniczne objawy sepsy (n=62) oraz zdrowych wolontariuszy (n=23). Próbki pochodziły od pacjentów hospitalizowanych Krakowskim Szpitalu Specjalistyczny im. Jana Pawła II Projekt MNiSW (2010-2013) N N401 006739 Zgoda Komisji Bioetycznej UJ: KBET/94/B/2009

Opracowane metody molekularnej diagnostyki sepsy: 1. Wydajna metoda izolacji DNA drobnoustrojów z krwi 2. Detekcja DNA drobnoustrojów za pomocą Nestedmultipleks-PCR w czasie rzeczywistym (nmpcr). 3. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w pełnej krwi (FISH). 4. Sekwencjonowanie następnej generacji (NGS)

FISH Kontrola negatywna krew od zdrowej osoby Grupa badana pacjent z klinicznymi objawami sepsy

Grupa badana pacjent z klinicznymi objawami sepsy Grupa badana pacjent z klinicznymi objawami sepsy

Czy nie byłoby dobrze wykrywać wszystkie bakterie we krwi jednocześnie określając ich szczegółową taksonomię? Sekwencjonowanie następnej generacji NGS (Next-Generation Sequencing)

Izolacja DNA Próbka krwi Oczyszczone DNA sekwencjonowanie Sekwencjonowanie bibliotek 16S Namnożone regiony V4 i V3 16rRNA

Taksonomia bakterii Sekwencjonowanie NGS 16S umożliwia uzyskanie wiarygodnych wyników składu taksonomicznego bakterii do poziomu RODZAJU (genus). Różnicowanie na poziomie gatunków (species) jest mniej dokładne.

Metodyka

Metodyka Izolacja DNA bakteryjnego z próbek krwi Przygotowanie biblioteki

Sekwencjonowanie metodą NGS (sekwencjonowanie mostkowe przez syntezę z odwracalną terminacją) platforma MiSeq

Analiza danych QIIME

Rezultaty sekwencjonowania ngs 16S próbek krwi

Wyniki 1. W wyniku posiewu i hodowli krwi wykazano 30,6% pozytywnych próbek 2. Metoda NGS pozwoliła uzyskać potwierdzenie obecności DNA bakteryjnego we wszystkich badanych próbkach krwi (100%). 3. Bakteryjne DNA wykryto także w 100 % próbek krwi pobranych od osób zdrowych!!!

4. Generalnie obserwowano różnice w ilościowym składzie taksonomicznym między grupą zdrowych i pacjentów z sepsą 5. Bakterie z gromady Actinobacteria (głównie beztlenowe, Gram dodatnie) były bardziej liczne w grupie zdrowych niż w grupie z sepsą (od 76,3% do 31,0%) (P<0,001) 6. Podczas gdy liczebność Proteobacteria (głównie tlenowe pałeczki, Gram ujemne) wzrastała (zdrowi 16,4%, sepsa 60,1%); P<0,001)

Różnorodność bakterii na poziomie gromady w dwóch grupach pacjentów Gram ujemne tlenowe pałeczki Gram dodatnie tlenowe i beztlenowe ziarniaki i laseczki Gram dodatnie beztlenowe

Różnorodność bakterii na poziomie gromady w poszczególnych próbkach krwi

7. W grupie zdrowych osób istotnie dominowały bakterie beztlenowe (76,2%), z których większość należała do rzędu Bifidobacteriales (73,0%). 8. W grupie z sepsą, większość bakterii wywodziła się z grupy tlenowych i mikroaerofilnych mikroorganizmów (75,1%), t.j. Pseudomonadales, Rhizobiales, Enterobacteriales, Aeromonadales, Bacillales and Sphingomonadales i Cellulosimicrobium

Różnorodność bakterii na poziomie rzędu w dwóch grupach pacjentów

Zróżnicowanie taksonomiczne było istotnie różne (p = 0,002) Ocena stopnia a zróżnicowania taksonomicznego (w ramach grup badanych pacjentów) na podstawie wykresu PD whole tree. Czerwony kolor - próbki krwi zdrowych wolontariuszy; niebieski kolor - próbki krwi pacjentów z sepsą.

Zróżnicowanie taksonomiczne między grupami było istotnie różne (p < 0,001) Ocena stopnia β zróżnicowania taksonomicznego (pomiędzy badanymi grupami pacjentów) na podstawie wykresu PCoA (Principal Coordinates Analysis). Czerwony kolor - próbki krwi zdrowych wolontariuszy; niebieski kolor - próbki krwi pacjentów z sepsą.

Zastosowano kontrolę negatywną (NTC) w postaci próbki jałowej soli fizjologicznej. Jej celem było stwierdzenie, czy dochodzi do kontaminacji próbek krwi i odczynników w trakcie prowadzenia prac laboratoryjnych. Na żelu widoczne są wyniki amplifikacji bibliotek 16S uzyskanych z próbek krwi oraz negatywny wynik z kontroli NTC

Wnioski 1. Nasze badania wykazały, że we wszystkich próbkach występowało DNA bakteryjne (DNAemia).

PCT/IB2015/056715 zgłoszenie patentowe 2. Nasze badania przy wykorzystaniu metody NGS sugerują, że mikrobiota jelitowa w sposób ciągły może przedostawać się do krwi, na drodze translokacji, co ma miejsce u zdrowych osób (dominacja beztlenowców). 3. W grupie pacjentów z sepsą dominują tlenowe mikroorganizmy, co może wskazywać na zaburzenia układu immunologicznego, który nie eliminuje egzogennych czynników etiologicznych lub zwiększenie przepuszczalności śródbłonka. 3. Być może w sepsie mamy do czynienia z polietiologicznym zakażeniem, które nie jest wykrywane za pomocą obecnie stosowanych metod diagnostycznych.

Jałowa krew u pacjentów z sepsą i u zdrowych osób prawda czy mit?

Zespół badawczy Dr Dominika Salamon Mgr Agnieszka Sroka-Oleksiak Dr Paweł Wołkow Dr Agnieszka Ludwig-Gałęzowska Prof. Małgorzata Bulanda Prof. Rafał Drwiła Lek. Agnieszka Flis