MATERIA Y CERAMICZNE /CERAMIC MATERIALS/, 67, 2, (2015), 127-131 www.ptcer.pl/mccm Wpływ procesu kierowanej krystalizacji na bioaktywność szkieł krzemianowo-fosforanowych z układu NaCaPO 4 -SiO 2 Aleksandra Wajda*, Katarzyna Bułat, Maciej Sitarz AGH Akademia Górniczo-Hutnicza im. S. Staszica w Krakowie, Wydział Inżynierii Materiałowej i Ceramiki, al. A. Mickiewicza 30, 30-059 Kraków *e-mail: wajdaola@gmail.com Streszczenie Szkła krzemianowo-fosforanowe z układu NaCaPO 4 -SiO 2 są znanymi materiałami bioaktywnymi, które mają zdolność do bezpośredniego łączenia się z tkankami żywymi. Jednakże ich kruchość ogranicza zakres zastosowania wykonanych z nich implantów. Jednym ze sposobów poprawy własności wytrzymałościowych szkieł jest wprowadzenie do składu odpowiednich dodatków (np. Al 3+ ), kolejnym zaś - przeprowadzenie ich częściowej krystalizacji, która pozwala otrzymać materiały szkło-krystaliczne. Proces ten jednak wymaga możliwie najlepszej kontroli, ponieważ pojawienie się i rozrost faz krystalicznych może powodować utratę bioaktywności. Przedmiotem badań w pracy były szkła krzemianowo-fosforanowe z układów: NaCaPO 4 -SiO 2 i NaCaPO 4 -SiO 2 -AlPO 4. Na podstawie pomiarów termicznych (DTA) wybranych szkieł dobrano parametry procesu kierowanej krystalizacji. Otrzymane materiały szkło-krystaliczne poddano badaniom strukturalnym (XRD). Natomiast w celu sprawdzenia ich bioaktywności wykonano testy in vitro w sztucznym osoczu, a następnie przeprowadzono obserwacje na elektronowym mikroskopie skaningowym (SEM +EDX) oraz badania ramanowskie. Uzyskane rezultaty pozwalają twierdzić, że odpowiednio kontrolowana dewitryfikacja badanych bioszkieł umożliwia uzyskanie bioaktywnych materiałów szkło-krystalicznych. Słowa kluczowe: szkła krzemianowo-fosforanowe, kierowana krystalizacja, bioaktywność, materiały szkło-krystaliczne INFLUENCE OF THE DIRECT CRYSTALLIZATION PROCESS ON BIOACTIVITY OF SILICATE-PHOSPHATE GLASSES FROM THE NaCaPO 4 -SiO 2 SYSTEM Silicate-phosphate glasses from the NaCaPO 4 -SiO 2 system are well-known bioactive materials, which are capable of forming direct bonds with living tissue. However, their brittleness limits the use of implants made of them. One of the ways to improve the mechanical properties of the glasses is to introduce proper additives (e.g. AI 3+ ) to their chemical composition. Another one is to carry out their partial crystallization that allows obtaining glass-crystalline materials. This process needs to be highly controlled because the appearance and growth of the crystalline phase may result in loss of the bioactivity. The subject of this paper concerns silicate-phosphate glasses from the NaCaPO 4 -SiO 2 and NaCaPO 4 -SiO 2 -AlPO 4 systems. Parameters of the direct crystallization process were adjusted on the basis of thermal analysis measurements (DTA) performed on selected glasses. The XRD method was used to study the structure of obtained glass-crystalline materials. In order to verify their bioactivity, the in vitro tests were done in simulated body fluid and the samples were analyzed on a scanning electron microscope (SEM+EDX) and Raman spectroscopy. The obtained results suggest that the properly controlled devitrification of the tested bioglasses may lead to the production of bioactive glass-crystalline materials. Keywords: Silicate-phosphate glass, Direct crystallization, Bioactivity, Glass-crystalline material 1. Wprowadzenie Bioaktywne szkła są stosowane w medycynie od około 40 lat jako implanty kości i korzeni zębów. W odróżnieniu od metali, węgla, polimerów czy tlenków, które pozostają obojętne biologicznie, szkła mają zdolność do modyfikacji powierzchni, tworząc warstwy aktywnego biologicznie hydroksyapatytu (Hap), stanowiącego naturalne połączenie implantu z żywą tkanką kostną [1-6]. Stosowanie bioaktywnego szkła do produkcji implantów jest ułatwione dzięki wykorzystaniu wielu wyjątkowych cech stanu szklistego, tj. możliwości formowania praktycznie dowolnego kształtu przy użyciu różnorodnych metod jego wytwarzania, łatwości zmiany właściwości przez odpowiedni dobór składu chemicznego oraz izotropowości wszystkich własności. Głównymi wadami bioaktywnych szkieł jest ich kruchość oraz niska wytrzymałość, które znacząco ograniczają zastosowanie tych materiałów na implanty poddawane dużym obciążeniom. Poprawę własności mechanicznych szkieł można osiągnąć, dodając Al 2 O 3 lub B 2 O 3 do ich składu. Niestety dodatek tych tlenków może obniżyć aktywność biologiczną szkieł oraz w przypadku jonów glinu powodować ich kancerogenność [7, 8]. Lepszym sposobem poprawy własności mechanicznych szkieł jest przeprowadzenie ich częściowej dewitryfikacji (kierowanej krystalizacji) w celu otrzymania materiałów szkło-krystalicznych. Materiały te powinny cha- 127
A. Wajda, K. Bułat, M. Sitarz rakteryzować się drobnokrystaliczną mikrostrukturą, gdyż ta gwarantuje im dużą wytrzymałość i odporność na pękanie, przy jednoczesnym zachowaniu bioaktywności. Dlatego przy otrzymywaniu materiałów szkło-krystalicznych należy mieć pełną kontrolę nad wielkością i ilością krystalizujących faz. Aby prawidłowo przeprowadzić kierowaną krystalizację należy też szczegółowo poznać strukturę, mikrostrukturę oraz właściwości termiczne danego szkła [9, 10]. 2. Preparatyka i metody pomiarowe Do badań wytypowano szkła z układów NaCaPO 4 -SiO 2 i NaCaPO 4 -SiO 2 -AlPO 4 o składach podanych w Tabeli 1, oznaczone jako 3Na i 3AlNa. Szkła otrzymano metodą zol- -żel w celu uzyskania jak najlepszej homogeniczności zestawu. Jako surowców wprowadzających poszczególne tlenki użyto: TEOS (SiO 2 ), H 3 PO 4 (P 2 O 5 ), Na 3 PO 4 12H 2 O (Na 2 O), Ca(NO 3 ) 2 4H 2 O (CaO) i Al(NO 3 ) 3 9H 2 O (Al 2 O 3 ); wszystkie cz.d.a. Otrzymane żele wysuszono, a następnie stopiono w tyglach platynowych w temp. 1730 C, uzyskując nieprzezroczyste (likwacyjne) szkła. Amorficzność otrzymanych materiałów potwierdzono badaniami rentgenowskimi (XRD). Badania XRD wykonano metodą proszkową na aparacie X Pert Pro firmy Philips. Warunki pomiaru: krok 0,008º, czas zliczeń 50 s. Do określenia właściwości termicznych szkieł, rozdrobnione próbki ogrzewano z szybkością 10 C/min w atmosferze azotu do temperatury 1100 C. Do pomiarów wykorzystano aparat DTA-7 firmy Perkin Elmer w celu przeprowadzenia termicznej analizy różnicowej (DTA). Krystalizację wybranych szkieł poprowadzono metodą gradientową. Próbki wygrzewano w piecu gradientowym przez 2 godziny. Najwyższą temperaturę dla środka pieca określono na podstawie krzywej DTA badanego szkła. Otrzymane materiały poddano powtórnie analizie rentgenowskiej w celu określenia ich krystaliczności. Wyjściowe szkła oraz materiały wygrzane w różnych temperaturach umieszczono w roztworze stymulującym płyn fizjologiczny (SBF), a następnie zbadano zmiany powierzchni przy pomocy skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) oraz spektroskopii Ramana, aby sprawdzić ich bioaktywność. Badania mikroskopowe z mikroanalizą rentgenowską (EDX) wykonano za pomocą elektronowego mikroskopu skaningowego Nova NanoSEM 200 z mikroanalizatorem rentgenowskim EDS. Do badań ramanowskich wykorzystano spektrometr Horiba LabRAM HR z wiązką lasera o długości fali 532 nm i mocy około 15 mw, z czasem akumulacji 2300 sekund i ilości zliczeń równej 2. 3. Wyniki i dyskusja We wcześniejszych badaniach wykazano, że otrzymane szkła są w pełni amorficzne (obecność jedynie podniesionego tła na rentgenogramach oraz brak wyraźnych pasm na widmach w dalekiej podczerwieni). Ich obserwacje na elektronowym mikroskopie skaningowym pozwoliły stwierdzić istnienie zjawiska odmieszania fazowego (likwacji) na zdjęciach widoczne kuliste, amorficzne inkluzje statystycznie Tabela 1. Składy otrzymanych szkieł. Table 1. Composition of obtained glasses. Szkło Układ Skład [% mol.] 3Na NaCaPO 4 -SiO 2 70% SiO 2, 30% NaCaPO 4 3AlNa NaCaPO 4 -SiO 2 - AlPO 4 25% NaCaPO 4, 70% SiO 2, 5% AlPO 4 rozmieszczone w amorficznej matrycy [11, 12]. Dowiedziono także, że wprowadzenie jonów Al 3+ do struktury szkieł krzemianowo-fosforanowych, poprawia homogenizację ich mikrostruktury znacznie zmniejsza się ilość inkluzji przy jednoczesnym zwiększeniu ich wymiarów [11]. Z badań EDX wynika, że inkluzje w szkłach z układu NaCaPO 4 -SiO 2 są praktycznie czystą fazą krzemianowowapniową, natomiast matryca jest wzbogacona w znaczne ilości jonów fosforu, wapnia i sodu. Skład chemiczny inkluzji i matrycy dla szkła 3AlNa jest praktycznie identyczny jak w szkłach nie zawierających jonów glinu (np. 3Na) [12]. Wytypowane szkła poddano badaniu bioaktywności wedle instrukcji opisanej przez Kokubo [13]. Próbki po 28 dniach termostatowania w SBF-ie obserwowano pod mikroskopem skaningowym (SEM) z przystawką EDX oraz przeprowadzono dla ich pomiary ramanowskie. Na podstawie uzyskanych zdjęć oraz widm EDX (Rys. 1a) stwierdzono, że szkło 3Na wykazuje się dużą bioaktywnością. Świadczy o tym widoczna na jego powierzchni charakterystyczna kalafiorowata skorupka, która pokrywa cały materiał. Bazując na analizie składu chemicznego powstałej warstwy, zidentyfikowano powłokę, jako fazę fosforanowowapniową typu hydroksyapatytu. Jej widmo EDX w każdym punkcie jest jednakowe, co oznacza, że cała powierzchnia szkła pokryta jest warstwą hydrokysapatytu. Niewielki dodatek jonów glinu (5% mol. AlPO 4 ) do struktury szkieł z układu NaCaPO 4 -SiO 2 sprawia, że materiał traci właściwości bioaktywne. Na zdjęciu SEM szkła 3AlNa (Rys. 1b) nie odnotowano powstania warstwy fazy fosforanowej. Powierzchnia i skład szkieł po termostatowaniu są takie same jak szkieł wyjściowych [14, 15]. Badania metodą spektroskopii Ramana (Rys. 1c) potwierdziły obserwacje mikroskopowe. Na widmach szkła 3Na po termostatowaniu widoczne są wyraźne pasma charakterystyczne dla hydroksyapatytu (około 1100-1020 cm -1, 960 cm -1, 610-570 cm -1 i 450-400 cm -1 ) [16]. Natomiast na widmie szkła 3AlNa nie są widoczne pasma w zakresie 1100-1020 cm -1. Do przeprowadzenia procesu kierowanej krystalizacji potrzebne jest, oprócz znajomości mikrostruktury i struktury, poznanie własności termicznych szkła. Jak wykazano na zdjęciach SEM i widmach EDX, szkła charakteryzują się występowaniem zjawiska likwacji. Inkluzje i matryca posiadają różny skład chemiczny, a co za tym idzie powinny mieć różne temperatury dewitryfikacji. W celu ich wyznaczenia wykonano badania termiczne DTA szkieł krzemianowo-fosforanowych. Krzywa DTA szkła 3Na (Rys. 2a) posiada dwa oddzielne piki egzotermiczne (821 C i 889 C), z czego wynika, że 128 MATERIA Y CERAMICZNE /CERAMIC MATERIALS/, 67, 2, (2015)
Wpływ procesu kierowanej krystalizacji na bioaktywność szkieł krzemianowo-fosforanowych krystalizacja przebiega dwuetapowo. Właściwości termiczne oraz różnice składu chemicznego inkluzji i matrycy oraz charakteru lokalnego uporządkowania wskazują na to, że krystalizują dwie różne fazy. Szkło 3AlNa na wykresie DTA (Rys. 2b) pokazuje tylko jeden egzotermiczny pik krystalizacja jednostopniowa. Dodatek jonów Al 3+ do struktury szkła sprawił, jak wcześniej wspomniano, że mikrostruktura ulega homogenizacji, a ilość Rys. 1. Zdjęcia SEM oraz widma EDX szkieł po termostatowaniu w płynie SBF: a) 3Na, b) 3AlNa; c) widma ramanowskie termostatowanych szkieł. Fig. 1. SEM microphotographs and EDX spectra of glasses after thermostating in SBF: a) 3Na, b) 3AlNa; c) Raman spectroscopy spectra of the thermostated glasses. Rys. 2. DTA szkieł: a) 3NA, b) 3AlNa. Fig. 2. DTA of glasses: a) 3NA, b) 3AlNa. a) b) a) b) Rys. 3. Dyfraktogramy XRD szkieł wygrzanych we wskazanych temperaturach: a) 3Na, b) 3AlNa. Fig. 3. X-ray diffraction patterns of glasses after annealing at indicated temperatures: a) 3Na, b) 3AlNa. MATERIA Y CERAMICZNE /CERAMIC MATERIALS/, 67, 2, (2015) 129
A. Wajda, K. Bułat, M. Sitarz inkluzji jest znacznie mniejsza, co może być wytłumaczeniem zmiany charakteru krzywych DTA [15]. Na podstawie wykonanych badań DTA dobrano adekwatne parametry wygrzewania w piecu gradientowym w celu przeprowadzenia kierowanej krystalizacji wybranych szkieł krzemianowo-fosforanowych. Otrzymane materiały poddano badaniom rentgenograficznym (XRD), aby określić ich stopień przekrystalizowania oraz wskazać krystalizujące fazy. Rys. 3a przedstawia rentgenogramy próbki szkła 3Na wygrzewanego w następujących temperaturach: 800 C, 820 C, 870 C i 890 C. W tym przypadku udało się stwierdzić, że w pierwszej kolejności krystalizują fazy fosforanowe, a w późniejszych okresach wygrzewania - krystobalit (wyraźne refleksy w temperaturze 890 C). Uwzględniając wcześniejsze badania EDX wywnioskowano, że inkluzje i matryca krystalizują osobno. Matryca jest fazą krzemianowo-fosforanowo-wapniową i ona krystalizuje jako pierwsza, Rys. 4. Zdjęcia SEM oraz widma EDX materiałów szkło-krystalicznych po termostatowaniu w płynie SBF: a) 3Na, b) 3AlNa; c) widma ramanowskie termostatowanych materiałów. Fig. 4. SEM microphotographs and EDX spectra of glass-crystalline materials after thermostating in SBF: a) 3Na, b) 3AlNa; c) Raman spectroscopy spectra of the termostated materials. Rys. 5. Zdjęcia SEM oraz widma EDX materiałów krystalicznych po termostatowaniu w płynie SBF: a) 3Na, b) 3AlNa; c) widma ramanowskie termostatowanych materiałów. Fig. 5. SEM microphotograph and EDX spectra of crystalline materials after thermostating in SBF: a) 3Na, b) 3AlNa; c) Raman spectroscopy spectra of the thermostated materials. 130 MATERIA Y CERAMICZNE /CERAMIC MATERIALS/, 67, 2, (2015)
Wpływ procesu kierowanej krystalizacji na bioaktywność szkieł krzemianowo-fosforanowych zaś inkluzje to praktycznie czysta faza krzemianowa, której krystalizacja zachodzi w późniejszym etapie [17]. Natomiast jedyną fazą krystalizującą w szkle 3AlNa jest fosforan sodowo-wapniowy (Rys. 3b). Wszystkie materiały wygrzane w wybranych temperaturach w piecu gradientowym poddano testom na bioaktywność w płynie SBF. Na postawie analizy SEM i EDX oraz spektroskopii ramanowskiej porównano jak przeprowadzona dewitryfikacja wpłynęła na ich bioaktywność. Materiały szkło-krystaliczne z grupy 3Na, podobnie jak wyjściowe szkło, posiadają kalafiorowatą skorupkę fosforanowo-wapniową (Rys. 4a). Natomiast przeprowadzenie częściowej krystalizacji szkła 3AlNa nadało mu własności bioaktywne. Na Rys. 4b wyraźnie widać grubą warstwę typu hydroksyapatytu. Najprawdopodobniej jest to spowodowane krystalizacją faz zawierających jony glinu. Faz takich nie stwierdzono na podstawie badań XRD, ale należy pamiętać o bardzo małej zawartości jonów glinu w badanych materiałach. Obserwacje mikroskopowe znajdują swoje potwierdzenie w wykonanych pomiarach metodą spektroskopii Ramana (Rys. 4c). Widma otrzymanych materiałów szkło-krystalicznych odpowiadają widmu hydroksyapatytu. W przypadku materiałów w pełni krystalicznych z obu badanych układów mamy do czynienia z całkowitą utratą bioaktywności. Przekrystalizowanie szkieł sprawiło, że materiały stają się biologicznie inertne. Nie obserwujemy żadnych wytrącających się faz na ich powierzchni (Rys. 5a i 5b). Odzwierciedlają to również badania ramanowskie - brak pasm charakterystycznych dla hydroksyapatytu (Rys. 5c). 4. Wnioski Szkła z układu NaCaPO 4 -SiO 2 charakteryzują się wysokim stopniem bioaktywności. Dodatek Al 3+ do szkieł krzemianowo-fosforanowych sprawia, że materiał staje się biologicznie inertny. Szkło 3Na po dokonaniu częściowej dewitryfikacji nie traci bioaktywności. Dopiero całkowita krystalizacja zmienia je w materiał biologicznie obojętny. Częściowa krystalizacja szkła 3AlNa, które początkowo nie wykazywało cech bioaktywności sprawia, że na jego powierzchni po kontakcie z płynem SBF zaczynają krystalizować fosforany wapnia. Całkowicie krystaliczny materiał ponownie traci bioaktywność. Odpowiednio przeprowadzony proces kierowanej krystalizacji szkieł krzemianowo-fosforanowych umożliwia otrzymanie bioaktywnych materiałów szkło-krystalicznych. Częściowa dewitryfikacja w określonych przypadkach, poprzez rodzaj krystalizującej fazy, może zmienić nawet materiał inertny w bioaktywny. Podziękowanie Projekt został sfinansowany ze środków Narodowego Centrum Nauki przyznanych na podstawie decyzji numer DEC-2011/01/N/ST8/07425. Literatura [1] Hench, L. L., Splinter, R. J., Greenlee, T. K., Allen, W. C.: Bonding mechanisms at the interface of ceramic prosthetic materials, J. Biomed. Res. Symp., 2, (1971), 117. [2] Piotrowski, G., Hench, L. L., Allen, W. C.: Mechanical studies of the bone bioglass interfacial bond, J. Biomed. Res., 9, (1975), 47. [3] Hench, L. L., Paschall, H. A.: Direct chemical bond of bioactive glass-ceramic materials to bone and muscle, J. Biomed. Res. Symp., 4, (1973), 25. [4] Rawlings, R. D.: Bioactive glasses and glass-ceramics, Clinical Mater., 14, (1993), 155. [5] Li, P., Kangasniemi, I., Groot, K., Kokubo, T., Yli-Urpo, A. U.: Apatite crystallization from metastable calcium phosphate solution on sol-gel-prepared silica, J. Non-Cryst. Solids, 168, (1994), 281. [6] Oliveira, J. M., Correia, R. N., Fernandes, M. H.: Biomaterials, 23, (2002), 371. [7] Gross, U., Strunz, V.: J. Biomem. Res., 19, (1985), 251. [8] Andersson, O. H., Karlsson, K. H., Kagasniemi, K., Yli-Urpo, A.: Glasstech. Ber., 61, (1988), 300. [9] Cao, W., Hench, L. L.: Bioactive materials, Ceram. Int., 22, (1996), 493-507. [10] Bonfield, W., Wang, M., Tanner, K. E.: Interfaces in analogue biomaterials, Acta Mater., 46, (1998), 2509-2018. [11] Sitarz, M., Fojud, Z., Olejniczak, Z.: The aluminium effect on the structure of silico-phosphate glasses studied by NMR and FIR, J. Mol. Struct., 924-926, (2009), 107. [12] Sitarz, M.: Influence of modifying cations on the structure and texture of silicate-phosphate glasses, J. Mol. Struct., 887, (2008), 237-248. [13] Kokubo, T., Takadama, H.: How useful is SBF in predicting in vivo bone bioactivity?, Biomaterials, 27, (2006), 2907. [14] Sitarz, M., Bułat, K., Szumera, M.: Aluminium influence on the crystallization and bioactivity of silico-phosphate glasses from NaCaPO 4 -SiO 2 system, J. Non-Cryst. Solids, 356, (2010), 224. [15] Handke, M., Sitarz, M., Rokita, M., Galuskin, E. W.: J. Mol. Struct., 651-653, (2003), 39. [16] Jastrzębski, W., Sitarz, M., Rokita, M., Bułat, K.: Infrared spectroscopy of different phosphates structures, Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 79, (2011), 722-727. [17] Sitarz, M., Bułat, K., Wajda, A., Szumera, M.: Direct crystallization of silicate-phosphate glasses of NaCaPO 4 -SiO 2 system, J. Therm. Anal. Calorim., 113, (2013), 1363-1368. Otrzymano 3 listopada 2014, zaakceptowano 23 lutego 2015. MATERIA Y CERAMICZNE /CERAMIC MATERIALS/, 67, 2, (2015) 131