Wykorzystanie sekwencjonowania nowej generacji do poznania genomu ziemniaka

Podobne dokumenty
Wykorzystanie sekwencjonowania nowej generacji do poznania genomu ziemniaka

Metody odczytu kolejności nukleotydów - sekwencjonowania DNA

Mapowanie fizyczne genomów -konstrukcja map wyskalowanych w jednostkach fizycznych -najdokładniejszą mapą fizyczną genomu, o największej

Czy przedsiêbiorstwo, którym zarz¹dzasz, intensywnie siê rozwija, ma wiele oddzia³ów lub kolejne lokalizacje w planach?

Ethernet VPN tp. Twój œwiat. Ca³y œwiat.

3.2 Warunki meteorologiczne

Podatek przemysłowy (lokalny podatek od działalności usługowowytwórczej) :02:07

Og oszenie o przetargu nieograniczonym 1. Zamawiaj cy : Spó dzielnia Mieszkaniowa Pracowników Nauki Kraków, ul. Reymonta 42

Analizy wielkoskalowe w badaniach chromatyny

Zarządzenie Nr 0151/18/2006 Wójta Gminy Kornowac z dnia 12 czerwca 2006r.

OSZACOWANIE WARTOŚCI ZAMÓWIENIA z dnia roku Dz. U. z dnia 12 marca 2004 r. Nr 40 poz.356

Szczegółowy opis zamówienia

Transformacja pośrednia składa się z trzech etapów:

SPIS TREŒCI. Pismo w sprawie korzystania z pomocy finansowej ze œrodków funduszu restrukturyzacji banków spó³dzielczych.

Numer ogłoszenia: ; data zamieszczenia: OGŁOSZENIE O ZAMÓWIENIU - usługi

POWIATOWY URZĄD PRACY

TEST dla stanowisk robotniczych sprawdzający wiedzę z zakresu bhp

PROCEDURA NABORU PRACOWNIKÓW NA STANOWISKA URZĘDNICZE DO URZĘDU MIEJSKIEGO W KOWARACH

Bydgoszcz, dnia 4 maja 2016 r. Poz UCHWAŁA NR XIX/148/2016 RADY MIEJSKIEJ W SĘPÓLNIE KRAJEŃSKIM. z dnia 27 kwietnia 2016 r.

PODSTAWY BIOINFORMATYKI 2 SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW


DE-WZP JJ.3 Warszawa,

SYSTEMY CZASU PRACY. 1. PODSTAWOWY [art. 129 KP]

HAŚKO I SOLIŃSKA SPÓŁKA PARTNERSKA ADWOKATÓW ul. Nowa 2a lok. 15, Wrocław tel. (71) fax (71) kancelaria@mhbs.

UCHWAŁA NR XXX/263/2014 RADY GMINY PRZODKOWO. z dnia 31 marca 2014 r.

Warszawa, woj. mazowieckie, tel , faks

Sieć komputerowa grupa komputerów lub innych urządzeo połączonych ze sobą w celu wymiany danych lub współdzielenia różnych zasobów, na przykład:

Dziennik Ustaw Nr Poz ROZPORZÑDZENIE MINISTRA FINANSÓW. z dnia 12 grudnia 2002 r.

Warunki Oferty PrOmOcyjnej usługi z ulgą

Umowa w sprawie przyznania grantu Marie Curie 7PR Wykaz klauzul specjalnych

Politechnika Warszawska Wydział Matematyki i Nauk Informacyjnych ul. Koszykowa 75, Warszawa

Sekwencjonowanie, przewidywanie genów

1) w 1 pkt 4 otrzymuje brzmienie:

PREFABRYKOWANE STUDNIE OPUSZCZANE Z ŻELBETU ŚREDNICACH NOMINALNYCH DN1500, DN2000, DN2500, DN3200 wg EN 1917 i DIN V

Zapytanie ofertowe. Projekt realizowany przy współfinansowaniu ze środków Unii Europejskiej, w ramach Programu Operacyjnego Pomoc Techniczna

Podstawowej nr 3 im Bolesława Krzywoustego na osiedlu Piastowskim 27 w Poznaniu - IV zadania.

WZÓR SKARGI EUROPEJSKI TRYBUNAŁ PRAW CZŁOWIEKA. Rada Europy. Strasburg, Francja SKARGA. na podstawie Artykułu 34 Europejskiej Konwencji Praw Człowieka

Gdynia: Księgowość od podstaw Numer ogłoszenia: ; data zamieszczenia: OGŁOSZENIE O ZAMÓWIENIU - usługi

U S T A W A. z dnia. o zmianie ustawy o ułatwieniu zatrudnienia absolwentom szkół. Art. 1.

Adres strony internetowej, na której Zamawiający udostępnia Specyfikację Istotnych Warunków Zamówienia:

Dr inż. Andrzej Tatarek. Siłownie cieplne

Rudniki, dnia r. Zamawiający: PPHU Drewnostyl Zenon Błaszak Rudniki Opalenica NIP ZAPYTANIE OFERTOWE

Metody analizy genomu

Firma Informatyczna JazzBIT

KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH. Wniosek DECYZJA RADY

Regulamin przyznawania stypendiów doktorskich pracownikom Centrum Medycznego Kształcenia Podyplomowego

Adres strony internetowej, na której Zamawiający udostępnia Specyfikację Istotnych Warunków Zamówienia:

Ogłoszenie o zwołaniu Nadzwyczajnego Walnego Zgromadzenia Spółki ELKOP S.A.

Automatyzacja pakowania

Piła: Prowadzenie obsługi bankowej Związku Numer ogłoszenia: ; data zamieszczenia: OGŁOSZENIE O ZAMÓWIENIU - usługi

Gie³da Papierów Wartoœciowych w Warszawie S.A.

Zasady rachunkowości i planu kont dla prowadzenia ewidencji podatków i opłat.

Regulamin Obrad Walnego Zebrania Członków Stowarzyszenia Lokalna Grupa Działania Ziemia Bielska

Adres strony internetowej, na której Zamawiający udostępnia Specyfikację Istotnych Warunków Zamówienia:

Procedura nadawania uprawnień do potwierdzania, przedłuŝania waŝności i uniewaŝniania profili zaufanych epuap. Załącznik nr 1

ZAPYTANIE OFERTOWE z dnia r

R O Z P O R ZĄDZENIE M I N I S T R A N A U K I I S Z K O L N I C T WA W YŻSZEGO 1) z dnia r.

Zintegrowane Systemy Zarządzania Biblioteką SOWA1 i SOWA2 SKONTRUM

SCENARIUSZ ZAJĘĆ SZKOLNEGO KOŁA NAUKOWEGO Z PRZEDMIOTU CHEMIA PROWADZONEGO W RAMACH PROJEKTU AKADEMIA UCZNIOWSKA

Warszawa: Dostawa kalendarzy na rok 2017 Numer ogłoszenia: ; data zamieszczenia: OGŁOSZENIE O ZAMÓWIENIU - dostawy

Egzamin gimnazjalny. Biologia. Także w wersji online TRENING PRZED EGZAMINEM. Sprawdź, czy zdasz!

USTAWA. z dnia 29 sierpnia 1997 r. Ordynacja podatkowa. Dz. U. z 2015 r. poz

Pokonać Ransomware. Grzegorz Ciołek Systems Engineer

Istotne Postanowienia Umowy

Adres strony internetowej, na której Zamawiający udostępnia Specyfikację Istotnych Warunków Zamówienia:

Adres strony internetowej, na której Zamawiający udostępnia Specyfikację Istotnych Warunków Zamówienia: bip.mazowia.eu/zamówienia-publiczne

Lekcja 173, 174. Temat: Silniki indukcyjne i pierścieniowe.

Wniosek o ustalenie warunków zabudowy

Uchwała Nr XV/83/15 Rady Gminy w Jeżowem z dnia r. w sprawie ustanowienia jednorazowej zapomogi z tytułu urodzenia dziecka.

Dotyczy: Odnowa centrum wsi śegiestów poprzez budowę oświetlenia ulicznego wzdłuŝ drogi powiatowej 1517K w śegiestowie

Regulamin konkursu na logo POWIATU ŚREDZKIEGO

INDATA SOFTWARE S.A. Niniejszy Aneks nr 6 do Prospektu został sporządzony na podstawie art. 51 Ustawy o Ofercie Publicznej.

KOMISJA NADZORU FINANSOWEGO

Objaśnienia do Wieloletniej Prognozy Finansowej na lata

Bezpieczna dzielnica - bezpieczny mieszkaniec

S I M P L E. E R P ZARZ DZANIE MA J TKIEM.

terapeutycznych w ramach projektu systemowego Szansa na rozwój realizowanego przez Miejski Ośrodek

Zapytanie ofertowe nr 3

UCHWAŁA NR./06 RADY DZIELNICY PRAGA PÓŁNOC M. ST. WARSZAWY

ZAPROSZENIE nr 55/2012 z dnia roku do złożenia oferty na zamówienie o wartości poniżej EURO

Warszawa, dnia 6 listopada 2015 r. Poz ROZPORZĄDZENIE MINISTRA ROLNICTWA I ROZWOJU WSI 1) z dnia 23 października 2015 r.

Regulamin przeprowadzania rokowań na sprzedaż lub oddanie w użytkowanie wieczyste nieruchomości stanowiących własność Gminy Wałbrzych

Kompleksowe ubezpieczenia majątkowe wraz z odpowiedzialnością cywilną, ubezpieczenia komunikacyjne i ubezpieczenie członków ochotniczej straży

1. Od kiedy i gdzie należy złożyć wniosek?

Adres strony internetowej, na której Zamawiający udostępnia Specyfikację Istotnych Warunków Zamówienia:

Adres strony internetowej, na której Zamawiający udostępnia Specyfikację Istotnych Warunków Zamówienia:

Regulamin Konkursu wiedzy o podatkach. Podatkowy zawrót głowy

Wójt Gminy Bobrowniki ul. Nieszawska Bobrowniki WNIOSEK O PRZYZNANIE STYPENDIUM SZKOLNEGO W ROKU SZKOLNYM 2010/2011

Adres strony internetowej, na której Zamawiający udostępnia Specyfikację Istotnych Warunków Zamówienia:

Prezentacja dotycząca sytuacji kobiet w regionie Kalabria (Włochy)

PROCEDURA OCENY RYZYKA ZAWODOWEGO. w Urzędzie Gminy Mściwojów

TABELA ZGODNOŚCI. W aktualnym stanie prawnym pracodawca, który przez okres 36 miesięcy zatrudni osoby. l. Pornoc na rekompensatę dodatkowych

socjalnego w Szkole Podstawowej Nr 2 w Miliczu

REGULAMIN WSPARCIA FINANSOWEGO CZŁONKÓW. OIPiP BĘDĄCYCH PRZEDSTAWICIELAMI USTAWOWYMI DZIECKA NIEPEŁNOSPRAWNEGO LUB PRZEWLEKLE CHOREGO

- Miejscowość Kod pocztowy Nr posesji Ulica Gmina

art. 488 i n. ustawy z dnia 23 kwietnia 1964 r. Kodeks cywilny (Dz. U. Nr 16, poz. 93 ze zm.),

UCHWAŁA NR VI/25/2015 RADY MIEJSKIEJ W KŁODAWIE. z dnia 30 stycznia 2015 r.

ZARZĄDZENIE NR 86/2013 WÓJTA GMINY WERBKOWICE. z dnia 6 grudnia 2013 r.

USTAWA. z dnia 26 czerwca 1974 r. Kodeks pracy. 1) (tekst jednolity)

Zarządzenie Nr 144/2015 Wójta Gminy Tczew z dnia r.

Transkrypt:

PRACE PRZEGL DOWE Wykorzystanie sekwencjonowania nowej generacji do poznania genomu ziemniaka Robert Gromadka Pracownia Sekwencjonowania DNA i Syntezy Oligonukleotydów, Instytut Biochemii i Biofizyki, Polska Akademia Nauk, Warszawa Application of next-generation sequencing method to decode potato genome Summary The last years have been a time of exponential progress of sequencing methods. The beginning of the 21 st closed a thirty-year domination of sequencing by the Sanger s method. Next generation technology resulted in a mass sequencing of the successive genomes. The time necessary to discover full genomes, as occurred for potato, was dramatically reduced. Key words: Sanger s sequencing, pyrosequencing, Potato Genome Sequencing Consortium, Next generation sequencing, National Project Sequencing of Potato Genome. Adres do korespondencji Robert Gromadka, Pracownia Sekwencjonowania DNA i Syntezy Oligonukleotydów, Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, ul. Pawiñskiego 5A, 02-106 Warszawa. 4 (91) 69 75 2010 1. Wstêp Kiedy w roku 1977 ukaza³a siê praca Sangera i Alana (1,2), nast¹pi³ pierwszy krok w kierunku uproszczenia i przyspieszenia techniki sekwencjonowania DNA (3). Metoda Sangera dominowa³a przez kolejne trzy dekady. Metoda ta oparta na syntezie de novo nici DNA z wykorzystaniem dideoksyrybonukleotydowych terminatorów podlega³a ci¹g³ym usprawnieniom. Pocz¹tkowo stosowano izotopowo znakowane deoksyrybonukleotydy i sekwencjonowanie przeprowadzano w czterech niezale nych mieszaninach reakcyjnych. Do ka dej mieszaniny dodawano niewielk¹

Robert Gromadka iloœæ jednego rodzaju dideoksyrybonukleotydu (ddatp, ddctp, ddgtp lub ddttp), o który zatrzymywa³y przebieg syntezy nowej nici. Po rozdziale elektroforetycznym na niezale nych œcie kach w elach poliakrylamidowych pozycjê fragmentów DNA ustalano przez naœwietlenie kliszy rentgenowskiej (autoradiografia). Obecnie bazuje siê na znacznikach fluorescencyjnych do³¹czonych do dideoksyrybonukleotydowych terminatorów. Do ka dego rodzaju do³¹czany jest barwnik emituj¹cy œwiat³o o innej d³ugoœci fali po wzbudzeniu laserem. Pozwala to ca³y proces przeprowadziæ w jednej probówce. Kolejna istotna zmiana nast¹pi³a wraz z pojawieniem siê aparatury nowej generacji (NG, ang. Next Generation). Zapowiedzi¹ jej by³ m.in. artyku³ w Nature w roku 2005 o masywnym równoleg³ym sekwencjonowaniu na p³ytce w do³kach o objêtoœci pikolitrowej, opisuj¹cy now¹ technikê sekwencjonowania przez syntezê z wykorzystaniem aparatu firmy 454 (obecnie w³asnoœæ Roche) (4). W tym czasie na rynku pojawi³y siê sekwenatory Solex firmy Illumina i aparat Solid firmy Applied Biosystems. Pierwsze aparaty 454 generowa³y ponad 50 razy wiêcej sekwencji DNA ni powszechnie stosowany 96-kapilarny Applied Biosystems 3730XL i to za jedn¹ szóst¹ kosztów. Pomimo tak obiecuj¹cych wyników naukowcy podchodzili do nich bardzo sceptycznie. Pewien wp³yw na to móg³ mieæ fakt, e du e centra sekwencjonowania zainwestowa³y ogromne sumy w sekwencjonowanie technik¹ kapilarn¹. Przejœcie na korzystanie z aparatów NG widaæ wyraÿnie po zmianach iloœci projektów dotycz¹cych sekwencjonowania ca³ych genomów realizowanych w kolejnych latach (rys. 1). Obecnie, jak wypowiedzia³ siê Adam Lowe, dyrektor marketingowy Illuminy (5), u ytkownicy ich systemu tygodniowo otrzymuj¹ tysi¹ce miliardów nukleotydów sekwencji, co odpowiada 20-krotnej iloœci sekwencji zgromadzonych w GenBanku w roku 2005. Rys. 1. Liczba zsekwencjonowanych genomów w kolejnych latach (http://www.genomesonline.org/ GOLD Genomes OnLine Database v.3.0). 70 PRACE PRZEGL DOWE

Wykorzystanie sekwencjonowania nowej generacji do poznania genomu ziemniaka 2. Polski Narodowy Projekt Sekwencjonowania Genomu Ziemniaka Ziemniak nale y do rodziny Solanace, do której zalicza siê równie wiele innych gatunków roœlin istotnych ekonomicznie, takich jak pomidor, tytoñ, bak³a an czy pieprz. Jest on uprawiany na du ¹ skalê w Europie i Ameryce od drugiej po³owy XIX w. i zajmuje trzecie miejsce po ry u i pszenicy wœród Ÿróde³ pokarmu dla ludzi. Polska znajduje siê na 6. miejscu wœród œwiatowych producentów ziemniaka (6). Na œwiecie uprawianych jest wiele odmian ziemniaka (7), które stanowi¹ potencjalne Ÿród³o do tworzenia nowych odmian odpornych na choroby czy szkodniki (wirusy, zaraza ziemniaka, rak ziemniaka, mokra i sucha zgnilizna, czarna nó ka, parch zwyk³y, bakterioza pierœcieniowa). Poznanie sekwencji genomu ziemniaka (oko³o 840 milionów par zasad) powinno dostarczyæ nowoczesne narzêdzie do wprowadzania na rynek kolejnych odmian odpornych na pestycydy i choroby, jak równie charakteryzuj¹ce siê wiêksz¹ tolerancj¹ na suszê czy niskie temperatury. Zastosowanie nowych metod genetyki molekularnej skróci czas wytwarzania nowych odmian, obecnie trwaj¹cy oko³o 10-12 lat, i jednoczeœnie obni y koszty prowadzonych badañ. W celu poznania pe³nej sekwencji genomu ziemniaka i sporz¹dzenia anotacji znajduj¹cych siê w nim genów powsta³o miêdzynarodowe Konsorcjum The Potato Genome Sequencing Consortium (PGSC). Instytut Biochemii i Biofizyki PAN w Warszawie zosta³ zaproszony do udzia³u w tym Konsorcjum. Polski udzia³ w realizacji projektu mia³ miêdzy innymi dotyczyæ sekwencjonowania jednego z dwunastu chromosomów genomu ziemniaka. Celem projektu by³o nie tylko proste poznanie sekwencji nukleotydowej. Mia³a ona pos³u yæ w kolejnym etapie do analiz porównawczych z innymi genomami, jak równie ustalenia lokalizacji poszczególnych genów. Niektóre cechy fenotypowe by³y powi¹zane tylko z regionami chromosomów, teraz pojawi³a siê mo liwoœæ po szczegó³owej analizie przypisania ich do konkretnych otwartych ramek odczytu. 3. Za³o enia Konsorcjum Pierwotnie zamierzano sekwencjonowaæ bibliotekê chromosomalnego DNA sklonowanego w BAC (ang. Bacterial Artificial Chromosome) z heterozygotycznego genotypu diploidalnego ziemniaka RH89-039-16 (RH). Koordynator projektu, Centre for Biosystems Genomics w Wageningen, Holandia, przygotowa³ 78 000 klonów nios¹cych wstawki genomowego DNA o œredniej d³ugoœci 120 Kb. Na podstawie analizy restrykcyjnej klony zosta³y po³¹czone w grupy i przyporz¹dkowane do ~7000 fizycznie zmapowanych kontigów. Równoczeœnie zosta³y one przekazane do firmy biotechnologicznej Keygene Inc., Wageningen Holandia (8). Opieraj¹c siê na w³asnej technologii AFLP (9) (ang. Amplified Fragment Length Polymorphism) w Keygene zmapowano 30 000 klonów BAC na ultra-gêstej mapie zawieraj¹cej wzajemn¹ pozycjê 10 000 unikatowych markerów AFLP przypisanych do wszystkich 12 chromosomów BIOTECHNOLOGIA 4 (91) 69-75 2010 71

Robert Gromadka Rys. 2. Gêstoœæ i po³o enie markerów AFLP na dwunastu chromosomach ziemniaka. Markery zaznaczono na ciemno. ziemniaka. Mapê opracowa³ holenderski zespó³ z Wageningen (Plant Breeding Group) i (10). Mapa genetyczna (rys. 2) wskazuje istniej¹ce zagêszczenia markerów AFLP w ró nych chromosomach ziemniaka. Do ka dego chromosomu zosta³o na tej podstawie przypisane od 50 do 150 BAC. Ich po³o enie zosta³o zweryfikowane przez hybrydyzacjê fluorescencyjn¹ 72 PRACE PRZEGL DOWE

Wykorzystanie sekwencjonowania nowej generacji do poznania genomu ziemniaka in situ DNA BAC z chromosomami. Mia³y staæ siê one miejscami startu do sekwencjonowania metod¹ BAC-to-BAC. Kiedy powstawa³ projekt podstawow¹ metod¹ sekwencjonowania by³y techniki oparte na metodzie Sangera z dideoksyrybonukleotydami terminuj¹cymi reakcje polimeryzacji nowo powstaj¹cej nici DNA. W zale noœci od firmy dostarczaj¹cej aparaty do sekwencjonowania stosowano ró ne rozwi¹zania techniczne. Najbardziej wydajny by³ system firmy Applied Biosystem oparty na czterech ró nych barwnikach fluorescencyjnych i rozdziale elektroforetycznym w polimerze, odpowiedniku elu poliakrylamidowego, umieszczonym w kapilarze. Dziêki automatyzacji procesu mo liwe by³o równoczesne odczytywanie 96 matryc i automatyczne, po zakoñczeniu jednego odczytu, podstawianie kolejnej porcji reakcji do analizy. W ten sposób mo na by³o uzyskaæ ponad 1000 odczytów o œredniej d³ugoœci 600-800 pz w ci¹gu doby na jednym aparacie. W trakcie trwania projektu powszechnie dostêpne sta³y siê sekwenatory nowej generacji, tzw. sekwenatory genomowe. W roku 2008 Instytut Biochemii i Biofizyki PAN zakupi³ jedno z takich urz¹dzeñ GS FLX (454) firmy Roche. Umo liwia ono równoczesny odczyt oko³o 100 milionów fragmentów DNA o œredniej d³ugoœci 250 nukleotydów. Zastosowanie tego aparatu zmieni³o radykalnie podejœcie do poznania pe³nej sekwencji genomu ziemniaka. Sekwencjonowanie metod¹ Sangera sta³o siê pomocniczym, u ywanym g³ównie do wyjaœnienia miejsc w¹tpliwych w sekwencji, zamykania przerw miêdzy kontigami czy rozwi¹zywaniem problemów zwi¹zanych z powtórzeniami w sekwencji. Z powodu powolnego postêpu prac nad sekwencjami genotypu RH zwi¹zanych z ograniczeniami spowodowanymi heterozygotycznoœci¹ i dostêpem do aparatury nowej generacji, Konsorcjum zdecydowa³o siê na równoleg³e prowadzenie sekwencjonowania drugiego genotypu, homozygoty (monoploida) DM1-3 516R44. 4. Strategia sekwencjonowania metod¹ Sangera DNA genomowe ziemniaka zosta³o pofragmentowane przez niepe³ne trawienie enzymami restrykcyjnymi EcoRI i HinDIII, a nastêpnie fragmenty o d³ugoœci 100-150 kpz sklonowano w BAC. Tak przygotowana biblioteka zosta³a udostêpniona cz³onkom Konsorcjum. Korzystaj¹c z oprogramowania przygotowanego przez holenderskiego koordynatora i udostêpnionego cz³onkom Konsorcjum, na podstawie mapy fizycznej wytypowano BACi przypisane do chromosomu VII. Mia³ to byæ wyjœciowy materia³ do sekwencjonowania metod¹ Sangera. Wyizolowane DNA BAC zosta³o ponownie pofragmentowane na odcinki d³ugoœci 2-3 tysiêcy par zasad i sklonowane w wektorze pbluscript. Taka strategia wymaga tworzenia kolejno dwóch bibliotek i selekcji klonów nios¹cych DNA genomu ziemniaka. Z powodu niezupe³nie losowego fragmentowania DNA przez niepe³ne trawienie du a czêœæ sekwencji w kolejnych BAC siê powtarza. W niektórych przypadkach nawet do BIOTECHNOLOGIA 4 (91) 69-75 2010 73

Robert Gromadka 20-30 kpz. Ponadto niektóre sekwencje z ró nych powodów takich jak toksycznoœæ czy odmienna zawartoœæ par G/C, okaza³y siê trudne do klonowania w bakteriach lub niestabilne. Tych sekwencji brakowa³o w trakcie sk³adania konsensusu. 5. Strategia sekwencjonowania nowej generacji W nowej technologii sekwencjonowania ca³ych genomów pomija siê wstêpne etapy klonowania i tworzenia bibliotek w bakteriach. Dziêki temu nie ma wad zwi¹zanych z nietolerancj¹ bakterii na informacjê przenoszon¹ przez badany DNA czy sk³ad nukleotydowy. Technologia ta ma te minusy wynikaj¹ce z du ej iloœci uzyskiwanych informacji, która musi zostaæ poddana analizie przy sk³adaniu konsensusu. Pewnym problemem s¹ te krótsze, pojedyncze odczyty, chocia w marcu 2010 r. mo na ju by³o odczytywaæ oko³o 500 pz, co zaczyna byæ porównywalne do sekwencjonowania metod¹ Sangera. Pomimo e nowa technologia wymaga wiêkszej liczby odczytów, 30-krotne pokrycie w porównaniu z 8-10-krotnym pokryciem wymaganym przy metodzie Sangera, koszt uzyskania konsensusu jest znacz¹co ni - szy. W celu wykorzystania ju istniej¹cej biblioteki BAC do sekwencjonowania zosta³a zastosowana technika tzw. MID (ang. Multiplex IDentifier). Standardowo DNA po fragmentowaniu do odcinków d³ugoœci œrednio 800 pz jest przygotowywany do przy³¹czenia na koñcach dwuniciowych adapterów niezbêdnych do amplifikacji materia³u przed sekwencjonowaniem. Sekwencje adapterowe s³u ¹ równie jako miejsca przy³¹czenia startera do sekwencjonowania. W technice MID adaptery s¹ dodatkowo przed³u one o specyficzne 10-nukleotydowe sekwencje, inne dla ka dego BAC-a, które pozwol¹ póÿniej je rozró niæ i przypisaæ do poszczególnych klonów BAC przez program komputerowy (np. sfffile firmy Roche). Dziêki tej metodzie jest mo liwe równoleg³e sekwencjonowanie kilku BAC-ów jednoczeœnie w trakcie jednego przebiegu reakcji w genomowym sekwenatorze. 6. Sekwencjonowanie BAC dwoma metodami W trakcie wdra ania nowego systemu sekwencjonowania przeprowadziliœmy dla porównania ponowne sekwencjonowanie jednego z wczeœniej wybranych BAC, którego konsensus zosta³ ustalony metod¹ Sangera. Powtórne sekwencjonowanie na aparacie GS FLX (454) wygenerowa³o konsensus zgodny z wczeœniej otrzymanym. Jednak ró nica w czasie i nak³adzie si³ i œrodków by³a nieporównywalna na korzyœæ aparatu nowej generacji. Podczas gdy przygotowanie banku DNA klonu BAC RH200P15 do sekwencjonowania zajê³o ponad dwa tygodnie i wymaga³o mudnej selekcji klonów nios¹cych wstawki DNA, a nastêpnie zabezpieczenia ich w postaci zamro onych hodowli na p³ytkach 96-do³kowych. W drugim przypadku wyizolowany DNA klonu BAC RH200P15 by³ wprost u yty do sekwencjonowania. W ci¹gu jed- 74 PRACE PRZEGL DOWE

Wykorzystanie sekwencjonowania nowej generacji do poznania genomu ziemniaka nego tygodnia zosta³o zakoñczone sekwencjonowanie klonu RH200P15 i mo na by³o analizowaæ otrzymane sekwencje, które z³o y³y siê w konsensus o d³ugoœci 149532 pz. 7. Podsumowanie Gwa³towny rozwój nowych technologii pozwala wierzyæ, e genomika personalna to nie odleg³a przysz³oœæ, ale w³aœciwie ju teraÿniejszoœæ. Sekwencjonowanie pierwszego genomu cz³owieka trwa³o ponad 10 lat i poch³onê³o kwotê ponad 3 bilionów dolarów. Obni enie kosztów i skrócenie czasu generowania sekwencji sta³o siê punktem wyjœciowym og³oszenia w 2007 r. projektu Projekt 1000 genomów (The 1000 Genome Project), w którym mamy poznaæ genomy ludzi z ró nych czêœci œwiata. W styczniu 2010 r. firma Illumina poda³a, e maj¹cy wejœæ do u ycia ich nowy sekwenator HiSeq2000 powinien zsekwencjonowaæ równoczeœnie dwa genomy ludzkie za równowartoœæ 10 tysiêcy USD z 30-krotnym pokryciem (11). Du e zainteresowanie budzi równie, maj¹cy w tym roku wejœæ do powszechnego u ycia, nowy system sekwencjonowania w czasie rzeczywistym pojedynczej cz¹steczki DNA firmy Pacific Bioscences (12). Opracowanie powsta³o w ramach realizacji projektu badawczego finansowanego przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wy szego: 47/PGS/2006/01. Literatura 1. Sanger F., Air G. M., Barrell B. G., Brown N. L., Coulson A. R., Fiddes J. C., Hutchison C. A., Slocombe P. M., Smith M., (1977), Nature, 265, 687-695. 2. Sanger F., Nicklen S., Coulson A. R., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467. 3. Sanger F., Coulson A. R. J., (1975), Mol. Biol., 94, 441-448. 4. Margulies M., et al., (2005), Nature, 437 (7057), 376-380. 5. Perkel J. M., (2009), Science Magazin, 324, (5924), 275-279. 6. FAO Crops statistics database http://faostat.fao.org/ 7. Spooner D. M., Hijmans R. J., (2001), American Journal of Potato Research, 78, 237-2268. 8. http://www.keygene.com/ 9. Vos P., Hogers R., Bleeker M., et al., (1995), Nucleic Acids Res., 23 (21), 4407-4414. 10. Isidore E., et al., (2003), Genetics, 165, 2107-2116. 11. Press Release Source: Illumina, Inc. On Tuesday January 12, (2010), 2:50 pm EST. 12. http://www.pacificbiosciences.com/ BIOTECHNOLOGIA 4 (91) 69-75 2010 75