MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2010, 62: 43-50 Patrycja Zalas-Więcek, Eugenia Gospodarek, Katarzyna Piecyk LEKOWRAŻLIWOŚĆ I WŁAŚCIWOŚCI ADHEZYJNE SZCZEPÓW ESCHERICHIA COLI IZOLOWANYCH Z MOCZU I Z KRWI Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu Kierownik: dr hab. n. med. E. Gospodarek, prof. UMK Stwierdzono, że pałeczki E. coli izolowane z moczu istotnie częściej niż izolowane z krwi wytwarzały beta-laktamazy typu ESBL i były wielolekooporne. Z kolei szczepy E. coli wyosobnione z krwi w wyższym odsetku adherowały do cewników lateksowych i cewników z polichlorku winylu. Zróżnicowanie czynników wirulencji, często kodowanych na ruchomych elementach genetycznych doprowadziło do powstania szczepów E. coli o odmiennej chorobotwórczości (1). Wśród patogennych szczepów E. coli wyróżnia się szczepy biegunkowe oraz szczepy odpowiedzialne za zakażenia pozajelitowe (Extraintestinal Pathogenic E. coli, ExPEC) (6), w tym szczepy wywołujące zakażenia układu moczowego (ZUM) i bakteriemię (Sepsis Associated E. coli, SEPEC). Spośród pałeczek Gram-ujemnych, pałeczki okrężnicy są najczęstszym etiologicznym czynnikiem ZUM, zarówno szpitalnych (około 50%), jak i pozaszpitalnych (70-95%) (9). Z kolei szczepy SEPEC są niedocenianą i słabo poznaną grupą bakterii z klinicznego i epidemiologicznego punktu widzenia. Stanowią one szczególne zagrożenie dla chorych z zaburzeniami układu immunologicznego (m. in. z chorobą nowotworową, poddawanych immunosupresji, po napromieniowaniu, po przeszczepach, dializowanych), z urazami wielonarządowymi oraz chorych z ranami pooparzeniowymi (5). Śledzińska i wsp. (13) analizowali częstość występowania bakteriemii i sepsy u chorych hospitalizowanych w okresie trzech lat. Najczęstszym drobnoustrojem w grupie pałeczek Gram-ujemnych izolowanych z łożyska naczyniowego u chorych z udokumentowaną mikrobiologicznie bakteriemią były pałeczki E. coli. Dane te są zgodne z doniesieniami innych autorów (7). Przypadki bakteriemii i/lub sepsy o etiologii E. coli związane są, m. in., z translokacją pałeczek okrężnicy z układu moczowo-płciowego lub pokarmowego (11). Celem pracy było porównanie lekowrażliwości i właściwości adhezyjnych szczepów E. coli izolowanych z krwi i z moczu.
44 P. Zalas-Więcek, E. Gospodarek, K. Piecyk Nr 1 MATERIAŁ I METODY Materiał. Materiał do badań stanowiło 169 szczepów pałeczek E. coli izolowanych w Katedrze i Zakładzie Mikrobiologii Szpitala Uniwersyteckiego nr 1 im. dr A. Jurasza Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu (SU CM UMK), w latach 2003-2006. Wybrano szczepy izolowane z moczu oraz z krwi, które pochodziły od chorych leczonych w klinikach i poradniach przyklinicznych SU CM UMK. Każdy szczep pochodził od innego chorego. Identyfikacja szczepów pałeczek E. coli. W identyfikacji szczepów uwzględniano następujące cechy: morfologię kolonii na podłożu MacConkey Agar (Becton Dickinson), zdolność fermentacji laktozy, wytrącanie dezoksycholanu sodu. W celu potwierdzenia zdolności wytwarzania tryptofanazy przy jednoczesnym wykluczeniu zdolności wytwarzania ureazy, wykorzystano podłoże z mocznikiem i L-tryptofanem (L-tryptofan 3 g/l, mocznik 2 g/l, KH 2 PO 4 2 g/l, czerwień krezolowa 0,2% r-r w 50% alkoholu etylowym, NaCl 5 g/l, pepton Difco 10 g/l, agar czysty 20 g/l, H 2 O destylowana). Dla szczepów laktozo-ujemnych przynależność gatunkową określano z użyciem kart do identyfikacji drobnoustrojów Gramujemnych (GNI+) (biomérieux), które odczytywano za pomocą automatycznego systemu VITEK (biomérieux). Oznaczanie lekowrażliwości pałeczek E. coli. Wrażliwość pałeczek E. coli na antybiotyki i chemioterapeutyki oceniano metodą krążkowo-dyfuzyjną na podłożu Mueller- Hinton 2 Agar (MHA) (Becton Dickinson). Stosowano krążki z następującymi antybiotykami i chemioterapeutykami: ampicylina (10 μg), tikarcylina (75 μg), piperacylina (100 μg) (Becton Dickinson), ampicylina z sulbaktamem (10/10 μg) (Mast Diagnostics), tikarcylina z kwasem klawulanowym (75/10 μg) (Oxoid), piperacylina z tazobaktamem (100/10 μg) (Mast Diagnostics), cefalotyna (30 μg), cefazolina (30 μg), cefoksytyna (30 μg), cefprozil (30 μg), cefuroksym (30 μg), cefoperazon (75 μg), cefpodoksym (10 μg), cefotaksym (30 μg), ceftazydym (30 μg) (Becton Dickinson), cefepim (30 μg) (Mast Diagnostics), aztreonam (30 μg), imipenem (10 μg) (Mast Diagnostics), gentamicyna (10 μg) (Becton Dickinson), tobramycyna (10 μg), amikacyna (30 μg) (Oxoid), netilmicyna (30 μg), tetracyklina (30 μg) (Mast Diagnostics), ofloksacyna (5 μg), ciprofloksacyna (5 μg) (Becton Dickinson), chloramfenikol (30 μg), fosfomycyna (200 μg) (Mast Diagnostics), nitrofurantoina (300 μg), trimetoprim/sulfametoksazol (1,25/23,75 μg) (Becton Dickinson). Krążki dobierano zgodnie z rekomendacjami Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów (KORLD) (3). Dodatkowo zastosowano krążki zawierające cefoperazon z sulbaktamem (30/75 μg) (Becton Dickinson). Inkubację prowadzono przez 18-20 godzin w temperaturze 35 C, w atmosferze tlenowej. Strefy zahamowania wzrostu bakterii wokół krążków z antybiotykami interpretowano jako wrażliwy, średnio wrażliwy, oporny zgodnie z obowiązującymi zaleceniami Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (10). W celu kontroli poprawności wykonania oznaczenia lekowrażliwości stosowano szczep wzorcowy z Amerykańskiej Kolekcji Kultur Typowych (ang. American Type Culture Collection, ATCC) E. coli ATCC 25922. Wykrywanie beta-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym typu ESBL.
Nr 1 Lekowrażliwość i właściwości adhezyjne E. coli 45 Test dwóch krążków. W celu określenia zdolności wytwarzania beta-laktamaz typu ESBL (Extended Spectrum Beta-Lactamases) wykorzystano, tzw. test dwóch krążków (Double-Disc Synergy Test, DDST) według Jarliera i wsp. (4), stosując krążki z cefotaksymem (30 μg) i ceftazydymem (30 μg) (Becton Dickinson). W celu zwiększenia czułości testu zastosowano krążek z cefpodoksymem (10 μg) (Becton Dickinson). Z 18-godzinnej hodowli bakteryjnej na agarze krwawym (Trypcase Soy Agar, TSA, z dodatkiem 5% krwi baraniej, AK, Becton Dickinson) wykonywano zawiesinę o gęstości 0,5 według skali MacFarlanda w 0,9% NaCl i rozprowadzano na podłożu MHA. Krążki z cefalosporynami układano w odległości 2 cm (pomiędzy środkami) od krążka z amoksycyliną z kwasem klawulanowym (20/10 μg) (Oxoid). Inkubację prowadzono 18 godzin w temperaturze 35 C. Powstanie i/lub asymetryczne powiększenie strefy zahamowania wzrostu bakterii wokół krążków z cefalosporynami od strony krążka z inhibitorem beta-laktamazy uznawano za wynik dodatni, a szczep kwalifikowano jako wytwarzający beta-laktamazę typu ESBL(+). Test potwierdzający. Dla każdego szczepu, który uznano za ESBL(+) w teście DDST, wykonano test potwierdzający zgodnie z zaleceniami CLSI (10). Zastosowano krążki z cefotaksymem (30 μg) i ceftazydymem (30 μg) (Becton Dickinson) oraz ich połączenia z kwasem klawulanowym: cefotaksym z kwasem klawulanowym (30/10 μg) i ceftazydym z kwasem klawulanowym (30/10 μg) (Becton Dickinson). Jeśli szczep wytwarzał ESBL, to średnica strefy zahamowania wzrostu bakterii wokół krążka z cefalosporyną i kwasem klawulanowym była większa o 5 mm lub więcej od średnicy strefy zahamowania wzrostu bakterii wokół krążka z samą cefalosporyną. Jako kontrolę w ocenie wytwarzania beta-laktamazy typu ESBL u badanych szczepów stosowano szczep K. pneumoniae ATCC 700603 ESBL (+) oraz szczep E. coli ATCC 25922 nie wytwarzający tego enzymu.. Ocena adhezji wybranych szczepów E. coli do cewników moczowych wykonanych z różnych materiałów syntetycznych. Na podstawie wyników uzyskanych we wstępnym badaniu zdolności adhezyjnych pałeczek E. coli wybrano 74 szczepy, które uwzględniono w badaniu adhezji do cewników moczowych, wykonanych z różnych materiałów syntetycznych: cewnik Foley a (lateks, L), cewnik Foley a (lateks silikonowany, LS), cewnik Nelaton (polichlorek winylu, PCV). Ocenę adhezji pałeczek E. coli do wymienionych polimerów wykonano stosując metodę opisaną przez Richardsa i wsp. (wg 2) w modyfikacji własnej. Z 20-godzinnej hodowli na podłożu MacConkey Agar wykonywano zawiesinę o gęstości 0,5 według skali MacFarlanda w jałowym bulionie mózgowo-sercowym (ang. Brain Heart Infusion Broth, BHI, Becton Dickinson). Następnie umieszczano w niej 1,5-centymetrowy fragment jałowego cewnika moczowego i inkubowano 24 godziny w temperaturze 37 C. Cewnik przemywano dwukrotnie PBS o ph 7,2, przenoszono do 3 ml jałowego podłoża BHI i dodawano jedną kroplę 1% wodnego roztworu chlorku 2,3,5 trójfenylotetrazoliowego (TTC, Sigma). Po dwóch godzinach inkubacji w temperaturze 37 C oceniano obecność czerwonego formazanu powstającego w reakcji redukcji TTC prowadzonej przez aktywne metabolicznie drobnoustroje. Przyjęto następującą skalę umowną: brak adhezji brak zmiany zabarwienia cewnika, słaba adhezja lekkie punktowe zaróżowienie powierzchni cewnika, średnia adhezja zaróżowienie powierzchni cewnika, silna adhezja silne zaczerwienienie powierzchni cewnika. Kontrolę stanowiły jałowe cewniki moczowe umieszczone w jałowym podłożu BHI, z którymi postępowano tak, jak z próbą badaną.
46 P. Zalas-Więcek, E. Gospodarek, K. Piecyk Nr 1 M e t o d y s t a t y s t y c z n e. W celu zbadania zależności między dwiema zmiennymi zastosowano: test χ 2 (gdy liczebność próby była większa od 40 oraz wszystkie oczekiwane liczebności były nie mniejsze niż 5), test χ 2 z poprawką Yatesa (gdy liczebność próby była większa od 40 oraz którakolwiek z oczekiwanych liczebności była mniejsza od 5) (8). Celem stwierdzenia istnienia różnic między dwiema zmiennymi skorzystano z testu dwóch wskaźników struktury (8, 12). Wszystkie testy przeprowadzono przy ustalonym poziomie istotności α=0,05. WYNIKI 0,0% 20,0% 40,0% 60,0% 80,0% 100,0% Ampicylina Piperacylina Tikarcylina Amoksycylina/kwas klawulanowy Ampicylina/sulbaktam Piperacylina/tazobaktam Tikarcylina/kwas klawulanowy Cefalotyna Cefazolina Cefoksytyna Cefprozil Cefuroksym Cefotaksym Cefoperazon Ceftazydym Cefpodoksym Cefepim Cefoperazon/sulbaktam Aztreonam Imipenem Gentamicyna Tobramycyna Amikacyna Netilmicyna Tetracyklina Ofloksacyna Ciprofloksacyna Chloramfenikol Fosfomycyna Nitrofurantoina Trimetoprim/sulfametoksazol Ryc. 1. wrażliwy średniowrażliwy oporny Wrażliwość na antybiotyki i chemioterapeutyki szczepów E. coli (n=71) izolowanych z krwi
Nr 1 Lekowrażliwość i właściwości adhezyjne E. coli 47 Ocena wrażliwości na antybiotyki i chemioterapeutyki pałeczek E. coli. Żaden z badanych szczepów nie był oporny na imipenem. Wszystkie szczepy izolowane z krwi charakteryzowały się wrażliwością na połączenie cefoperazonu z sulbaktamem i nitrofurantoinę. Wśród szczepów izolowanych z moczu wrażliwość na te leki stwierdzono odpowiednio, u 95,9% i 94,9% szczepów (Ryc. 1 i 2). Szczepy wyosobnione z krwi były istotnie częściej niż szczepy izolowane z moczu wrażliwe na ampicylinę (p=0,026), tikarcylinę (p=0,020), amoksycylinę z kwasem klawulanowym (p=0,037), cefalosporyny, z wyjątkiem cefoksytyny (wartość p wynosiła od 0,002 do 0,022), aztreonam (p=0,013), aminoglikozydy, z wyjątkiem amikacyny (wartość p wynosiła od 0,000 do 0,005) i trimetoprim/sulfametoksazol (p=0,002) (Ryc. 1 i 2). Szczepy 0,0% 20,0% 40,0% 60,0% 80,0% 100,0% Ampicylina Piperacylina Tikarcylina Amoksycylina/kwas klawulanowy ampicylina/sulbaktam Piperacylina/tazobaktam Tikarcylina/kwas klawulanowy Cefalotyna Cefazolina Cefoksytyna Cefprozil Cefuroksym Cefotaksym Cefoperazon Ceftazydym Cefpodoksym Cefepim Cefoperazon/sulbaktam Aztreonam Imipenem Gentamicyna Tobramycyna Amikacyna Netilmicyna Tetracyklina Ofloksacyna Ciprofloksacyna Chloramfenikol Fosfomycyna Nitrofurantoina Trimetoprim/sulfametoksazol Ryc. 2. wrażliwy średniowrażliwy oporny Wrażliwość na antybiotyki i chemioterapeutyki szczepów E. coli (n=98) izolowanych z moczu
48 P. Zalas-Więcek, E. Gospodarek, K. Piecyk Nr 1 izolowane z moczu istotnie częściej niż szczepy izolowane z krwi wytwarzały betalaktamazy typu ESBL (p=0,003) i były definiowane jako wielolekooporne (p=0,000) (Tabela I). Wytwarzanie betalaktamaz wśród tych szczepów wykazano na podstawie wyników uzyskanych w teście DDST i co najmniej jednego testu potwierdzającego. Krew Mocz 100,0% 80,0% 60,0% 79,3% 34,5% 69,0% 68,9% 46,7% 55,6% 40,0% 20,0% 20,7% 65,5% 31,0% 31,1% 53,3% 44,4% 0,0% Cewnik L Cewnik LS Cewnik z PCV Cewnik L Cewnik LS Cewnik z PCV Ryc. 3. brak adhezja Adhezja do cewników moczowych szczepów E. coli izolowanych z krwi (n=29) i moczu (n=45) Cewnik L 7 6 10 Cewnik LS 1 4 5 6 19 Krew Cewnik z PCV 2 8 9 10 Cewnik L 8 7 16 14 Cewnik LS 3 2 16 24 Mocz Cewnik z PCV 4 10 11 20 0,0% 20,0% 40,0% 60,0% 80,0% 100,0% Ryc. 4. brak słaba średnia silna Adhezja do cewników moczowych szczepów E. coli izolowanych z krwi (n=29) i z moczu (n=45) z uwzględnieniem stopnia adhezji
Nr 1 Lekowrażliwość i właściwości adhezyjne E. coli 49 Ocena adhezji do cewników moczowych wybranych szczepów E. coli izolowanych z moczu i z krwi. Wśród pałeczek E. coli wyosobnionych z krwi stwierdzono wyższy odsetek szczepów adherujących do cewników L i cewników z PCV niż w grupie pałeczek E. coli wyosobnionych z moczu (odpowiednio, 79,3% vs 68,9% i 69,0% vs 55,6%) (Ryc. 3 i 4). Nie wykazano znamienności statystycznej tych różnic. Wśród pałeczek E. coli wyosobnionych z krwi i z moczu najwyższe odsetki szczepów wykazujących silną adhezję, obserwowano w grupie adherujących do cewników PCV (odpowiednio, 34,5% i 22,2%). DYSKUSJA Pałeczki E. coli mają istotne znaczenie zarówno w zakażeniach szpitalnych, jak i pozaszpitalnych. Odpowiadają za 70-95% przypadków pozaszpitalnych i około 50% szpitalnych ZUM (9). Są również najczęściej, spośród bakterii Gram-ujemnych, izolowane od chorych z bakteriemią (7, 13). Większość przypadków ZUM u chorych hospitalizowanych związana jest ze stosowaniem cewników moczowych (11). Pałeczki E. coli biorą udział w tych zakażeniach. Zatem, sugeruje to zależność pomiędzy zakażeniami o etiologii pałeczek E. coli, a zdolnością adhezji tych bakterii do polimerów. W dostępnym piśmiennictwie jest wiele prac, których autorzy poddają ocenie biologiczne właściwości szczepów E. coli izolowanych od chorych z ZUM. Brak natomiast informacji na temat właściwości szczepów E. coli izolowanych od chorych z bakteriemią oraz wyników badań porównujących te dwie grupy szczepów. W badaniach własnych stwierdzono, że szczepy izolowane z moczu istotnie częściej niż z krwi wytwarzały beta-laktamazy typu ESBL i były wielolekooporne. Śledzińska i wsp. (13) oceniali lekowrażliwość szczepów E. coli izolowanych od chorych z bakteriemią. Wrażliwość tych szczepów na cefalosporyny II, III i IV generacji wahała się od 83,9 do 97,2%, co pośrednio może świadczyć, że wśród badanych szczepów niewiele wytwarzało beta-laktamazy typu ESBL. Szczepy E. coli wyosobnione z krwi w wyższym odsetku adherowały do cewników L i cewników z PCV. Trudno jednak podjąć dyskusję wobec braku w dostępnym piśmiennictwie prac, w których porównywano właściwości adhezyjne i lekowrażliwość szczepów E. coli odpowiedzialnych za ZUM i bakteriemię. W przyszłości należałoby poświęcić temu zagadnieniu więcej uwagi. P. Zalas-Więcek, E. Gospodarek, K. Piecyk ANTIMICROBIAL SENSITIVITY AND ADHESIVE PROPERTIES OF ESCHERICHIA COLI STRAINS ISOLATED FROM URINE AND BLOOD SAMPLES SUMMARY The aim of this study was comparison of the antimicrobial sensitivity and adhesive properties of E. coli strains isolated from urine and blood samples. This study included 169 of E. coli strains isolated in the Clinical Microbiology Department of dr. A. Jurasz University Hospital in 2003-2006. E.
50 P. Zalas-Więcek, E. Gospodarek, K. Piecyk Nr 1 coli strains isolated from urine samples revealed statistically higher production of Extended Spectrum Beta-Lactamases and multidrug resistance than strains isolated from blood samples. Stains isolated from the blood adhered to latex and PCV catheters more frequently when compared with strains isolated from urine. PIŚMIENNICTWO 1. Adler B, Sasakawa C, Tobe T, Makino S, Komatsu K, Yoshikawa M. A dual transcriptional activation system for the 230 kb plasmid genes coding for virulence-associated antigens of Shigella flexneri. Mol Microbiol 1989; 3: 627-35 2. Gallimore B, Gagnon RF, Subang R. Natural history of chronic Staphylococcus epidermidis foreign body infection in a mouse model. J Infect Dis 1991; 164: 1220-3 3. Hryniewicz W, Sulikowska A, Szczypa K, Gniadkowski M, Skoczyńska A. Rekomendacje doboru testów do oznaczania wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki. Post Mikrobiol 2005; 44: 175-92 4. Jarlier V, Nicolas M, Fourier G, Philippon A. Extended broad-spectrum ß-lactamases conferring transferable resistance to newer ß-lactam agents in Enterobacteriaceae: hospital prevalence and susceptibility patterns. Rev Infect Dis 1988; 10: 867-78 5. Johnson JR, Russo TA. Extraintestinal pathogenic Escherichia coli: the other bad E. coli. J Lab Clin Med 2002; 139: 155-62 6. Kaper JB, Nataro JP, Mobley HL. Pathogenic Escherichia coli. Nat Rev Microbiol 2004; 2: 123-40 7. Kądzielska J, Kot K, Sawicka-Grzelak A, Rokosz A. Drobnoustroje izolowane z krwi hospitalizowanych pacjentów. Zakażenia 2004; 2: 108-10 8. Krysicki W, Bartos J, Dyczka W, Królikowska K, Wasilewska M. Rachunek prawdopodobieństwa i statystyka matematyczna w zadaniach cz. II. Statystyka matematyczna. Warszawa: PWN 2002 9. Kucheria R, Dasgupta P, Sacks SH, Khan MS, Sheerin NS. Urinary tract infections: new insights into a common problem. Postgrad Med J 2005; 81: 83-6 10. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; fifteenth informational suplement 2005; CLSI/NCCLS M100-S15 (M2-A8 and M7-A6) 11. Rokosz A, Bednarska A, Łuczak M. Bakteryjne czynniki zakażeń układu moczowego u hospitalizowanych pacjentów oraz ich wrażliwość na leki przeciwbakteryjne. Urol Pol 2005; 58: 119-24 12. Stanisz A. Przystępny kurs statystyki w oparciu o program STATISTICA PL na przykładach z medycyny. Kraków: StatSoft Polska 2001 13. Śledzińska A, Samet A, Bronk M, Rybak B, Kur J, Krawczyk B, Nowicki B. Escherichia coli zapomniany patogen posocznic. Przegl Epidemiol 2006; 60: 27-34 Otrzymano: 11 I 2010 r. Adres Autora: 85-094 Bydgoszcz, ul. M. Curie-Skłodowskiej 9, Katedra i Zakład Mikrobiologii, Collegium Medicum im. Rydygiera w Bydgoszczy, Uniwersytet M. Kopernika w Toruniu