Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie Wydział Nauk o Zwierzętach Anna E. Kosson, Piotr P. Kosson Zasady funkcjonowania jednostki hodowlano - doświadczalnej na przykładzie Środowiskowego Laboratorium Hodowli Zwierząt Genetycznie Modyfikowanych CMD-CePT The Laboratory for Genetically Modified Animals [CMD-CepT] operation principles. Praca podyplomowa na kierunku Zwierzęta Laboratoryjne: Hodowla, Utrzymanie i Użytkowanie Praca wykonana pod kierunkiem dr n. med. Marty Kuczeriszka Zakład Fizjologii Nerek i Płynów Ustrojowych IMDiK PAN, PolLASA Warszawa, rok 2016 1
2
3
Streszczenie Zasady funkcjonowania jednostki hodowlano - doświadczalnej na przykładzie Środowiskowego Laboratorium Hodowli Zwierząt Genetycznie Modyfikowanych CMD-CePT W odpowiedzi na wzrost udziału zwierząt genetycznie zmodyfikowanych w badaniach biomedycznych, w roku 2013 utworzone zostało Środowiskowe Laboratorium Hodowli Zwierząt Genetycznie Modyfikowanych. Jednostka ta wchodzi w zespół laboratoriów środowiskowych Centrum Medycyny Doświadczalnej CePT (CMD-CePT). Jako jednostka hodowlano - doświadczalna zapewnia bazę do utrzymania szeregu modeli zwierzęcych w warunkach o podwyższonym standardzie higienicznym oraz zaplecze techniczno - badawcze do przeprowadzania zabiegów w warunkach jałowych. Współpraca z wieloma ośrodkami naukowymi i podmiotami komercyjnymi sprawia, że rozwój laboratorium jest bardzo dynamiczny. W trosce o zachowanie dobrostanu zwierząt oraz zapewnienie miarodajnych wyników badań, w Środowiskowym Laboratorium Hodowli Zwierząt Genetycznie Modyfikowanych stosowane są humanitarne techniki prowadzenia badań z udziałem zwierząt, tzw. zasada 3R (Replacement- zastąpienie, Reduction- ograniczenie, Refinementudoskonalenie). Tematem pracy jest przedstawienie zasad funkcjonowania nowoczesnej jednostki hodowlano doświadczalnej na rynku usług badań biomedycznych. Słowa kluczowe: zwierzęta zmodyfikowane genetycznie, mysz, hodowla zwierząt laboratoryjnych, utrzymanie zwierząt laboratoryjnych Summary The Laboratory for Genetically Modified Animals [CMD-CepT] - Operation Principles Laboratory for Genetically Modified Animals was established in 2013 as a response to the increase of genetically modified animals field in biomedical research. This unit is a part of team labs of Preclinical Research Center and Technology (CMD-CePT). As a breedingexperimental unit, provides a base for the maintenance of a range of animal models in terms of a higher hygienic standard and technical facilities to carry out experiments under aseptic conditions. The cooperation with many Research Centers and commercial entities makes the lab development very dynamic. The 3R s principles are applied for the sake of animal welfare and ensure reliable test results. The aim of the work is to demonstrate the functioning of the Laboratory for Genetically Modified Animals on the biomedical research field. Keywords genetically modified animals, mouse, laboratory animals breeding, laboratory animals maintenance 4
5
6
Spis treści I. Wstęp II. Środowiskowe Laboratorium Hodowli Zwierząt Genetycznie Modyfikowanych 1. Układ pomieszczeń i wyposażenie 2. Zwierzęta 3. Warunki utrzymania zwierząt - standaryzacja środowiska 4. Wzbogacenie środowiska 5. Kadra III. Zasada 3R (ograniczenie, zastąpienie, udoskonalenie) IV. Współpraca V. Oferta VI. Podsumowanie VII. Piśmiennictwo 7
I. Wstęp Rozwój inżynierii genetycznej oraz opracowanie w 2002 roku genomu myszy otworzyło możliwość tworzenia modeli zwierzęcych odzwierciedlających schorzenia występujące u człowieka i wykazujących analogiczny mechanizm procesu chorobowego [1]. W odpowiedzi na dynamiczny wzrost udziału zwierząt genetycznie zmodyfikowanych w badaniach biomedycznych, utworzone zostało Środowiskowe Laboratorium Hodowli Zwierząt Genetycznie Modyfikowanych (LHZ). Jednostka ta wchodzi w skład innych laboratoriów środowiskowych Centrum Medycyny Doświadczalnej CMD-CePT. Tematem niniejszej pracy jest przedstawienie zasad funkcjonowania laboratorium i jego wkład w rozwój badań z udziałem zwierząt zmodyfikowanych genetycznie. II. Środowiskowe Laboratorium Hodowli Zwierząt Genetycznie Modyfikowanych Środowiskowe Laboratorium Hodowli Zwierząt Genetycznie Modyfikowanych zostało utworzone w lipcu 2013 roku w ramach konsorcjum CePT (Centrum Badań Przedklinicznych i Technologii), które tworzą takie ośrodki jak: Warszawski Uniwersytet Medyczny (WUM), który jest koordynatorem przedsięwzięcia, Uniwersytet Warszawski (UW), Politechnika Warszawska (PW) oraz 7 instytutów Polskiej Akademii Nauk: Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego (IBD PAN), Instytut Biochemii i Biofizyki (IBB PAN), Instytut Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej im. M. Mossakowskiego (IMDiK PAN), Międzynarodowy Instytut Biologii Molekularnej i Komórkowej (MIBMiK), Instytut Podstawowych Problemów Techniki (IPPT PAN), Instytut Wysokich Ciśnień (IWC PAN), Instytut Biocybernetyki i Inżynierii Biomedycznej (IBIB PAN). Celem projektu było utworzenie ośrodka naukowego, składającego się ze ściśle współpracujących ze sobą środowiskowych centrów badawczych, w których prowadzone będą badania dotyczące najczęściej występujących chorób cywilizacyjnych, w szczególności: chorób nowotworowych, neurologicznych, układu krążenia oraz schorzeń związanych z procesem starzenia. Zadaniem platformy badawczej CePT jest rozwój medycyny translacyjnej, której celem jest jak najszybsze wprowadzenie osiągnięć z zakresu badań przedklinicznych do medycyny praktycznej. Całkowity koszt realizacji projektu wyniósł 388 444 071,00 zł, w tym wydatki kwalifikowane 359 350 000,00 zł. Koszty kwalifikowane w wysokości 85% pokrywane były 8
ze środków Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego (EFRR), natomiast 15% stanowił wkład krajowy, który był zapewniony ze środków budżetu państwa. Projekt Centrum Badań Przedklinicznych i Technologii realizowany był w ramach Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka w latach 2007 2013. W Instytucie Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej PAN zostały utworzone cztery środowiskowe laboratoria badawcze: Środowiskowe Laboratorium Hodowli Zwierząt Genetycznie Modyfikowanych, Środowiskowe Laboratorium Badań Toksykologicznych, Środowiskowe Laboratorium Syntez Chemicznych, Środowiskowe Laboratorium Rezonansu Magnetycznego Małych Zwierząt, które zostały ulokowane w specjalnie do tego celu adaptowanych pomieszczeniach Zwierzętarni. Dnia 4 kwietnia 2014 roku odbyła się w IMDiK PAN konferencja promocyjna, uroczyście inaugurująca pracę wszystkich laboratoriów CMD - CePT. Środowiskowe Laboratorium Hodowli Zwierząt Genetycznie Modyfikowanych powstało z myślą o prowadzeniu badań in vivo zarówno we współpracy z jednostkami naukowymi jak i na zlecenie podmiotów komercyjnych. 1. Układ pomieszczeń i wyposażenie Pomieszczenia dla zwierząt laboratoryjnych muszą spełniać kryteria zapewniające właściwe dla danego gatunku warunki utrzymania, regulowane przez Dyrektywę 2010/63/UE [2], Ustawę z dnia 15 stycznia 2015 o ochronie zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych i edukacyjnych [3], oraz Rozporządzenie Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 10 marca 2006 w sprawie szczegółowych warunków utrzymania zwierząt laboratoryjnych w jednostkach doświadczalnych, w jednostkach hodowlanych i u dostawców [4]. Wytyczne dotyczące utrzymania zwierząt wykorzystywanych do celów doświadczalnych i innych celów naukowych i opieki nad tymi zwierzętami zostały także zawarte w Zaleceniach Komisji Europejskiej z dnia 18 czerwca 2007 r [5]. Środowiskowe Laboratorium Hodowli Zwierząt Genetycznie Modyfikowanych mieści się na I piętrze budynku Zwierzętarni Instytutu Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej PAN, co uniemożliwia dostęp osób trzecich (dostęp autoryzowany) oraz wtargnięcie zwierząt postronnych lub ucieczkę zwierząt. Powstało w wyniku adaptacji pomieszczeń wcześniej przeznaczonych do hodowli królików. Zgodnie z wyżej wymienionymi wytycznymi powierzchnie pomieszczeń hodowlano- doświadczalnych laboratorium wykonane zostały z 9
materiałów bezpiecznych dla zwierząt, łatwo zmywalnych, i odpornych na techniki czyszczenia i odkażania. Hodowla gryzoni laboratoryjnych (myszy, szczurów) prowadzona jest w warunkach o podwyższonym standardzie higienicznym SPF (ang. specified pathogen free) za barierą sanitarną. Powierzchnia laboratorium to 250m 2, obejmująca sterylizatornię, korytarz czysty i brudny, dwa pokoje hodowlane, pokój zabiegowy, śluzy oraz zmywalnię (Ryc.1). Ryc.1. Układ pomieszczeń Środowiskowego Laboratorium Hodowli Zwierząt Genetycznie Modyfikowanych. (Kosson P.) Podwyższony standard higieniczny panujący po stronie czystej bariery obliguje eksperymentatorów, jak i personel obsługujący zwierzęta do przebierania się w sterylną odzież ochroną: dwuczęściowy strój roboczy lub kombinezon oraz maskę, czepek, rękawiczki i obuwie (Fot.1, Fot. 2, Fot. 3). Kolejnym etapem jest przejście przez prysznic powietrzny z naprzemiennie ryglowanymi drzwiami, w którym strumień powietrza przepuszczony przez filtry HEPA o odpowiedniej prędkość, zmywa ewentualne zanieczyszczenia ze stroju ochronnego (Fot.3). Pracownicy jak i sprzęt poruszają się systemem śluz i korytarzy. Do pokojów hodowlanych i zabiegowego prowadzi korytarz czysty. W celu zminimalizowania ryzyka kontaminacji wejście do pomieszczeń hodowlanych poprzedzone jest śluzami, co stanowi kolejną barierę sanitarną. Dwa pokoje hodowlane o powierzchni 36m 2 każdy, wyposażone są w system klatek indywidualnie wentylowanych (ang. IVC- Individually Ventilated Cages) (Fot.7). 10
Wymiana klatek odbywa się w stacji wymiany klatek z przepływem laminarnym powietrza, wyposażonej dodatkowo w podajnik paszy i dozownik środka dezynfekcyjnego (Fot.7). Fot.1. Stacja wymiany klatek; odzież ochronna dla personelu obsługującego zwierzęta (Kosson P.) Fot.2. Komora laminarna II klasy bezpieczeństwa; przykładowy zestaw odzieży ochronnej dla eksperymentatora (Kosson P.) Sala zabiegowa do przeprowadzenia zabiegów chirurgicznych w warunkach aseptycznych wyposażona jest w lodówkę, zamrażarkę, system pooperacyjnego utrzymania zwierząt (ang. recovery), komorę laminarną kl. II bezpieczeństwa mikrobiologicznego (ang. BSL II- Biosafety Level II) (Fot.2), zestaw do narkozy wziewnej. Transport zwierząt i materiałów odbywa się przez okienko podawcze znajdujące się na korytarzu czystym. Klatki i brudny sprzęt transportowane są do zmywalni korytarzem brudnym. Korytarz czysty nie styka się z korytarzem brudnym, co zapobiega krzyżowaniu się szlaków. Zmywalnia wyposażona jest w stację usuwania ściółki (Fot.4), zmywarkę klatek, butelek, zlewy, autoklaw przelotowy. Zarówno sprzęt (butelki, klatki z wiórami), elementy wzbogacające środowisko jak odzież ochronna w formie pakietów podlegają procesom sterylizacji w przelotowym autoklawie parowym. W Środowiskowym Laboratorium Hodowli Zwierząt Genetycznie Modyfikowanych panuje ścisły reżim sanitarny. Przed wejściem do szatni i tuż przed prysznicem powietrznym ułożone są maty dezynfekujące, a wszystkie powierzchnie płaskie oraz sprzęt poddawane są regularnym zabiegom dezynfekcyjnym. Sprzęt serwisowany jest przez wyspecjalizowane firmy zewnętrze, autoryzowane przez producenta sprzętu. 11
Fot.3. Prysznic powietrzny; przykładowy zestaw odzieży ochronnej dla eksperymentatora (Kosson P.) Fot. 4. Stacja bezpyłowego usuwania ściółki (Kosson P.) Zwierzęta pochodzące z nadwyżek hodowlanych, wycofane z hodowli lub po eksperymencie poddawane są humanitarnej eutanazji w komorze do eutanazji, mieszaniną tlenu z dwutlenkiem węgla (Fot.5). Wzrastające stężenie CO 2 przy jednoczesnym spadku stężenia O2, powoduje w pierwszej fazie oszołomienie zwierząt i zniesienie stresu. W drugiej fazie procesu eutanazji, wysokie stężenie CO2 doprowadza do depresji ośrodka oddechowego i śmierci zwierząt, wcześniej pozbawionych świadomości. Komora znajduje się w osobnym pomieszczeniu poza laboratorium, piętro niżej, z ograniczonym dostępem dla osób trzecich. Możliwość zaprogramowania urządzenia umożliwia skuteczną eutanazję w zależności od gatunku gryzoni, ilości zwierząt i ich masy ciała, zgodnie z wytycznymi zawartymi w Dyrektywie 2010/63/UE. Zwłoki zwierząt przechowywane są w zamrażarce opisanej jako odpady kat. I, do czasu aż odbierze je firma zewnętrzna, z którą Instytut ma podpisaną umowę na odbiór i utylizację odpadów biologicznych. Dostęp do zamrażarki na odpady biologiczne jest ograniczony dla osób postronnych. 12
Fot.5. Komora do eutanazji zwierząt mieszaniną tlenu i dwutlenku węgla (Kosson P.) Wszystkie pomieszczenia laboratorium wchodzą w skład Zakładu Inżynierii Genetycznej, spełniając tym samym normy utrzymania/hodowania organizmów genetycznie modyfikowanych [6]. 2. Zwierzęta Zwierzęta utrzymywane lub hodowanie w Środowiskowym Laboratorium Hodowli Zwierząt Genetycznie Modyfikowanych to głównie myszy zmodyfikowane genetycznie. Istnieje też zaplecze do hodowli/utrzymywania szczurów. Obecnie prowadzona jest hodowla myszy linii/szczepów transgenicznych i knockout, będących modelem chorób takich jak szpiczak, pląsawica Huntingtona, astma, czy też chorób neurodegeneracyjnych lub z deficytami odporności. Systemy kojarzeń stosowane w hodowli zwierząt to w zależności od instrukcji eksperymentatora, kojarzenia wsobne, losowe, lub kojarzenia z unikaniem pokrewieństwa. Każde zwierzę jest oznakowane poprzez nacięcia na uszach, co umożliwia jego identyfikacje oraz analizę pochodzenia. Wszystkie informacje na temat każdego zwierzęcia są zapisywane w kartach hodowlanych i przekazywane eksperymentatorowi w formie okresowych raportów. Oprócz zwierząt hodowlanych, w jednostce utrzymywane są zwierzęta w eksperymencie. Są to zwierzęta zmodyfikowane genetycznie np. myszy nude z obniżoną odpornością lub zwierzęta pochodzące ze szczepów podstawowych takie jak BALB/c, czy C57BL/6J. Zwierzęta wprowadzane za barierę pochodzą z renomowanych hodowli takich jak Charles River Laboratories, The Jackson Laboratory lub z hodowli własnej IMDiK PAN. Przed sprowadzeniem zwierząt z ośrodków zewnętrznych wymagane jest przedstawienie certyfikatów zdrowia wprowadzanych zwierząt. 13
3. Warunki utrzymania zwierząt standaryzacja środowiska Dla uzyskania miarodajnych i powtarzalnych wyników badań niezbędne jest jak najdalej idące ujednolicenie warunków hodowli zwierząt [7]. Parametry środowiskowe w pomieszczeniach hodowlano- doświadczalnych są stale monitorowane poprzez radiowy system monitoringu temperatury, wilgotności i ciśnienia atmosferycznego. Standard warunków środowiskowych jest zapewniony poprzez systemy wentylacyjno-kanalizacyjne utrzymujące nadciśnienie w pokojach hodowlanych, liczbę wymian powietrza na poziomie 20 x/h, ruch powietrza nieprzekraczający 0,3 m/s a temperaturę na poziomie 22 0 C+/-2 0 C. W klatkach IVC ilość wymian powietrza jest zwiększona do 80x/h. Wilgotność powietrza jest ustalona no poziomie 55%+/-5%. Zegar sterujący z programatorem dobowym automatycznie włącza i wyłącza oświetlenie w pokojach hodowlanych, gdzie dzień świetlny wynosi 13/11 h, a natężenie oświetlenia nie przekracza 400 lx. Wymianę klatek prowadzi się nie rzadziej niż raz w tygodniu; jako ściółka stosowane są drobno zmielone, odpylone wióry z drzew liściastych. Woda i pasza podawane są ad libitum. Woda pochodzi ze specjalnie zaprojektowanej stacji uzdatniania wody, z ujęciem czerpalnym po stronie czystej bariery (Fot.6). Butelki z wodą są wymieniane dwa razy w tygodniu. Zwierzęta karmione są pełnoporcjową paszą hodowlaną, sterylizowaną promieniami gamma (sniff). Warunki środowiska i jego parametry spełniają kryteria regulowane przez Dyrektywę 2010/63/UE, Ustawę z dnia 15 stycznia 2015 o ochronie zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych i edukacyjnych, Rozporządzenie Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 10 marca 2006 w sprawie szczegółowych warunków utrzymania zwierząt laboratoryjnych w jednostkach doświadczalnych, jednostkach hodowlanych i u dostawców, oraz Zalecenie Komisji Europejskiej z dnia 18 czerwca 2007 r w sprawie wytycznych dotyczących utrzymania zwierząt wykorzystywanych do celów doświadczalnych i innych celów naukowych i opieki nad tymi zwierzętami. 14
Fot.6. Stacja uzdatniania wody umieszczona po stronie brudnej. Ujęcie czerpalne wyprowadzone po stronie czystej bariery. (Kosson P.) Fot.7. System regałów z klatkami indywidualnie wentylowanymi (ang. IVC- Individually Ventilated Cages) oraz stacja wymiana klatek z przepływem laminarnym powietrza, podajnikiem na środek dezynfekcyjny i podajnikiem paszy. (Kosson P.) 4. Wzbogacenie środowiska Znajomość wzorca behawioralnego oraz biologii gatunku dają wytyczne do sposobu przygotowania miejsca bytowania zwierząt w celu zaspokojenia ich naturalnych potrzeb. Optymalne warunki bytowania mogą zostać zapewnione tylko przy znajomości potrzeb gatunkowych: u myszy np. kopanie nor, wspinanie się, gryzienie, chowanie się [8]. Ubogie środowisko, w którym przebywają zwierzęta ma negatywny wpływ na kondycję psychofizyczną zwierząt laboratoryjnych. Brak bodźców ze środowiska powoduje nudę i prowadzi do zachowań stereotypowych, anormalnych i patologicznych takich jak: ogryzanie wibrysów, agresywność, samookaleczenia czy kanibalizm [9,10]. W celu poprawienia samopoczucia zwierząt i ich kondycji psychofizycznej, w Środowiskowym Laboratorium Hodowli Zwierząt Genetycznie Modyfikowanych stosowane są elementy wzbogacające środowisko. Elementy wzbogacenia środowiska pomagają zwierzętom w realizowaniu własnych, naturalnych potrzeb takich jak eksploracja, poszukiwanie schronienie w jamach, norach, posługiwanie się tigmotaksją, budowa gniazda. W Środowiskowym Laboratorium Hodowli Zwierząt Genetycznie Modyfikowanych jako wzbogacenia środowiska stosowane są domki dla myszy i materiały gniazdowe w formie bawełnianych podkładek i bawełnianych płatków kosmetycznych. Wykorzystuje się trzy rodzaje domków: małe domki z poliwęglanów oraz domki z tworzywa sztucznego w dwóch 15
rozmiarach. Domki są bardzo chętnie wykorzystywane przez zwierzęta zarówno do odchowu młodych, odpoczynku, snu lub jako toaleta (Fot.13). Ponadto domki są także platformą, po której zwierzęta mogą się przemieszczać, wspinać i obserwować otoczenie z podwyższenia (Fot.15, Fot.16). Dodatkowo, domki są elementem zwiększającym powierzchnię klatki o ok. 60cm2. Budowa oka myszy sprawia, że czerwone domki są postrzegane jako czarne obiekty zachęcające do ukrycia się. Obserwacje własne nie wykazały preferencji w doborze koloru domku. Myszy z taką samą częstotliwością jak i chęcią zasiedlały domki czerwone, niebieskie, fioletowe czy białe. Fot.8. Gniazdo z noworodkami myszy, zbudowane z wiórów i bawełnianych włókien pochodzących z płatków kosmetycznych. (Kosson A.) Fot.9. Ściółka w połączeniu z włóknami bawełny z płatków kosmetycznych umożliwia myszom zagrzebywanie się w podłożu, żłobienie tuneli oraz tworzenie jamek czy nor (Kosson A.) Włókna bawełniane bardzo dobrze wiążę się ze ściółką, co umożliwia zwierzętom budowę gniazd, jam i nor (Fot.8, Fot.9, Fot.14). Zaobserwowano, że myszy w różny sposób wykorzystują materiały gniazdowe. Jedne budują gniazda z poszarpanych elementów bawełnianych (myszy szczepu BALB/c i C57BL/6J) a inne wykorzystują nienaruszone płatki kosmetyczne do ukrycia młodych lub do budowy namiotów, pod którymi mogą się schronić (myszy szczepu FVB i DBA2/J) (Fot.8, Fot.10, Fot.14). Czas adaptacji do zastosowanych elementów wzbogaceń jest różny u poszczególnych szczepów myszy. Myszy BALB/c i C57BL/6 oraz ich mutanty od razu korzystają z materiałów gniazdowych, natomiast myszy FVB potrzebują znacznie więcej czasu (ok. 3 tygodni) zanim zaczną budować gniazda lub legowiska z dostarczonych materiałów. Młode, odchowane w warunkach wzbogaconych o domki i materiały gniazdowe, po odsadzeniu od rodziców, potrafią od razu wykorzystać bawełniane płatki do budowy gniazda i nie boją się domku, co jest wynikiem obserwacji i 16
uczenia się od starszych osobników. Młode, odchowane w warunkach bez wzbogaceń, są nieufne w stosunku do domku, który jest dla nich czymś obcym i proces adaptacji do nowego środowiska jest dłuższy, ale krótszy niż u osobników dorosłych przy pierwszej prezentacji elementów wzbogacenia środowiska. Zastosowane elementy wzbogacenia środowiska znacznie obniżyły poziom agresji u samców BALB/c, ale nie u samców FVB, które w pewnym okresie życia zaczynają walczyć o dostęp do domku. Fot.10. Przykład wykorzystania przez samicę myszy płatków kosmetycznych do ukrycia młodych (Kosson A.) Fot.11. Wykorzystanie elementów wzbogacenia środowiska przez myszy (Kosson A.) Elementy wzbogacenia środowiska stosowane są w hodowli i u zwierząt utrzymywanych w eksperymencie, jeżeli procedura zatwierdzona przez LKE nie stanowi inaczej. Fot.12. Wzbogacenia środowiska. Domek imitujący norę oraz materiał gniazdowy w postaci bawełnianych płatków kosmetycznych (Kosson A.) Fot.13. Przykład wykorzystania przez mysz elementów wzbogacenia środowiska do odchowu młodych. Bawłniane płatki kosmetyczne wykorzystane do budowy gniazda w domku imitującym norę (Kosson A.) 17
Fot.14. Przykład wykorzystania przez myszy materiałów gniazdowych do wymoszczenia wnętrza domku (Kosson A.) Fot.15,16. Domek jako platforma zwiększająca powierzchnię klatki (Kosson A.) 5. Kadra Środowiskowe Laboratorium Hodowli Zwierząt Genetycznie Modyfikowanych zatrudnia 4 pracowników. Jest to kierownik z wykształceniem weterynaryjnym, starszy specjalista ds. hodowli, technik opiekun zwierząt, oraz robotnik wysoko wykwalifikowany pracownik zmywalni. Wszyscy pracownicy mają jasno określone obowiązki pracy: prowadzenie wpisów w kartach hodowlanych zwierząt hodowanych w jednostce, ocena stanu zwierząt, zmiana klatek i wody oraz obsługa zmywalni. Pracownicy są zobowiązani do przestrzegania przepisów BHP i zasad higieny. Wszelkie odstępstwa od normy a także istotne obserwacje są zgłaszane, zapisywane i korygowane. Wszystkie osoby są odpowiednio przygotowane do pracy ze zwierzętami, przeszły szkolenie dla osób planujących procedury, uczestniczących w procedurach uśmiercania zwierząt, nadzorujących, przeprowadzających procedury i posiadają 18
właściwe wyznaczenia zgodnie z ustawą z dnia 15 stycznia 2015 roku o ochronie zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych lub edukacyjnych. Dwóch pracowników będących jednocześnie autorami niniejszego opracowania jak i promotor pracy, wchodzą w skład zespołu doradczego ds. dobrostanu zwierząt przy IMDiK PAN. III. Zasada 3R (ograniczenie, zastąpienie, udoskonalenie) Postęp w badaniach naukowych z zakresu medycyny, biologii czy farmacji powoduje zwiększone zapotrzebowanie na wykorzystanie zwierząt laboratoryjnych. Zasady humanitarnego prowadzenia badań z udziałem zwierząt, zaproponowane zostały po raz pierwszy w 1959 roku przez W.M.S. Russel a i R.L. Burch a [11]. Idea znana jako zasada 3 R (od. ang. Replacement, Reduction, Refinement) czyli zastąpienie, zmniejszenie i udoskonalenie, stanęła u podstaw dyrektyw unijnych, wyznaczając trendy w zastępowaniu zwierząt metodami in vitro lub zwierzętami o niższym rozwoju ewolucyjnym, zmniejszeniu liczby wykorzystanych zwierząt, udoskonalaniu warunków utrzymania zwierząt i procedur eksperymentalnych w celu poprawy ich dobrostanu i ograniczeniu bólu, strachu i cierpienia. Zgodnie z tymi zaleceniami w Środowiskowym Laboratorium Hodowli Zwierząt z powodzeniem stosowana jest zasada ograniczenia i udoskonalenia, jednakże w związku z charakterem działalności jednostki wdrożenie zasady zastąpienia nie jest możliwe. Zasada udoskonalenia wyraża się poprzez standaryzację i doskonalenie warunków utrzymania zwierząt, tj. wzbogacenie środowiska, podwyższony reżim sanitarny i monitoring ich zdrowia. Zasada ograniczenia realizowana jest poprzez opracowanie metod hodowli i planów hodowlanych w celu otrzymania zwierząt o pożądanym genotypie a ograniczenie ilości zwierząt o genotypie niepożądanym, ograniczenie stresu i bólu podczas przeprowadzania procedur. Standaryzacja genetyczna i środowiskowa minimalizują zmienność wyników badań i sprawiają, że są one powtarzalne. Ponadto pracownicy są stale dokształcani poprzez udział w szkoleniach, konferencjach. Biorą też udział w programach samokształcenia się jak studia podyplomowe czy studia licencjackie z zakresu hodowli zwierząt laboratoryjnych. Istnieje też ścisła współpraca między personelem obsługującym zwierzęta, zarówno na poziomie hodowca-eksperymentator czy opiekun zwierząt-eksperymentator. Dzięki temu procedury mogą przebiegać sprawnie a hodowla jest stale i sprawnie monitorowana. 19
IV. Współpraca Celem Środowiskowego Laboratorium Hodowli Zwierząt Genetycznie Modyfikowanych było stworzenie zaplecza hodowlano-doświadczalnego do pracy ze zwierzętami zmodyfikowanymi genetycznie dla IMDiK PAN, Campusu Ochota a także innych klientów. Dotychczas podjęta została współpraca z instytutami naukowymi Campusu Ochota takimi jak Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, Warszawski Uniwersytet Medyczny, Międzynarodowy Instytut Biologii Molekularnej i Komórkowej oraz Instytut Biotechnologii i Antybiotyków, Karolinska Insytutet, firmy komercyjne jak OncoArendii Therapeutics. Laboratorium współpracuje także z pozostałymi środowiskowymi laboratoriami działającymi w ramach platformy CMD-CePT przy IMDiK PAN. Ryc.2. Ośrodki współpracujące ze Środowiskowym Laboratorium Hodowli Zwierząt Genetycznie Modyfikowanych. V. Oferta Środowiskowe Laboratorium Hodowli Zwierząt Genetycznie Modyfikowanych powstało z myślą o prowadzeniu badań in vivo zarówno we współpracy z jednostkami naukowymi jak i na zlecenie podmiotów komercyjnych i oferuje: - hodowlę zwierząt zmodyfikowanych genetycznie (znakowanie, pobieranie materiału genetycznego, genotypowanie po uprzednim dostarczeniu protokołu genotypowania); - utrzymanie zwierząt w eksperymencie; - doradztwo merytoryczne przy konstruowaniu badania (dobór modelu zwierzęcego, szacowanie liczby zwierząt, składanie wniosku do Lokalnej Komisji Etycznej); - przeprowadzanie zabiegów chirurgicznych; 20
- pobieranie materiału biologicznego do analiz; - podawanie substancji (iv, ip, im, it, po); - immunizacja myszy; - eutanazję zwierząt z zastosowaniem mieszaniny CO 2 i O 2; - i inne usługi na życzenie klienta w ramach pozwolenia Lokalnej Komisji Etycznej. Fot. 17. Sposób podania substancji do żyły ogonowej u myszy. (Kosson P.) VI. Podsumowanie Środowiskowe Laboratorium Hodowli Zwierząt Genetycznie Modyfikowanych to odpowiedź na stale rosnący udział zwierząt genetycznie zmodyfikowanych w badaniach biomedycznych. Jako laboratorium hodowlano- doświadczalne zapewnia bazę do utrzymania szeregu modeli zwierzęcych w warunkach o podwyższonym standardzie zoohigenicznym oraz zaplecze techniczne do prowadzenie eksperymentów z udziałem zwierząt. Współpraca z wieloma ośrodkami naukowymi oraz podmiotami komercyjnymi sprawia, że rozwój Środowiskowego Laboratorium Hodowli Zwierząt Genetycznie Modyfikowanych jest bardzo dynamiczny. W trosce o zachowanie dobrostanu zwierząt oraz zapewnienie miarodajnych wyników badań, Środowiskowe Laboratorium Hodowli Zwierząt Genetycznie Modyfikowanych w swojej działalności kieruje się zasadami 3R. VII. Piśmiennictwo 1. Waterston RH i wsp. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 5;420(6915):520-62, 2002. 2. Dyrektywa Parlamentu Europejskiego i Rady 2010/63/UE z dnia 22 września 2010 r. w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych 3. Ustawa z dnia 15 stycznia 2015 o ochronie zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych i edukacyjnych. 4. Rozporządzenie Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 10 marca 2006 w sprawie szczegółowych warunków utrzymania zwierząt laboratoryjnych w jednostkach doświadczalnych, jednostkach hodowlanych i u dostawców 21
5. Zalecenie Komisji Europejskiej z dnia 18 czerwca 2007 r w sprawie wytycznych dotyczących utrzymania zwierząt wykorzystywanych do celów doświadczalnych i innych celów naukowych i opieki nad tymi zwierzętami. 6. Ustawa z dnia 22 czerwca 2001 r. o mikroorganizmach i organizmach genetycznie zmodyfikowanych 7. Brylińska J., Kwiatkowska J., Zwierzęta labolatoryjne: metody hodowli i doświadczeń, Towarzystwo Autorów i Wydawców Prac Naukowych Universitas, Kraków 1996 8. Kokocińska A., Kaleta T., Znaczenie etologii w naukach o dobrostanie zwierząt, Roczniki Naukowe Polskiego Towarzystwa Zootechnicznego, 2016 9. Ganszczyk K., Zachowania samouszkadzające o podłożu psychogennym u zwierząt analiza przyczyn w kontekście możliwości leczenia, Życie Weterynaryjne, 2010 10. Kaleta T., Zachowanie stereotypowe - jego charakterystyka i rola w dobrostanie zwierząt. Życie Weterynaryjne, 2003 11. Russell W.M.S, Burch RL., The Principles of Humane Experimental Technique Wheathampstead (UK): Universities Federation for Animal Welfare. 1959 22