Wiesław Krumrych WPŁYW WYSIŁKU FIZYCZNEGO NA METABOLIZM TLENOWY NEUTROFILÓW ORAZ POTENCJAŁ ANTYOKSYDACYJNY KRWI KONI ROZPRAWA HABILITACYJNA Zakład Chorób Koni Państwowego Instytutu Weterynaryjnego Państwowego Instytutu Badawczego w Puławach RECENZENCI: - prof. dr hab. Tomasz Janowski - prof. dr hab. Mirosław Kleczkowski - prof. dr hab. Włodzimierz Kluciński - prof. dr hab. Zygmunt Kuleta Słowa kluczowe: konie, wysiłek fizyczny, chemiluminescencja neutrofilów, antyoksydanty, stres oksydacyjn
STRESZCZENIE Celem pracy była ocena aktywności metabolizmu tlenowego neutrofilów oraz potencjału antyoksydacyjnego krwi w warunkach standardowego wysiłku fizycznego różnych grup użytkowych koni. Badania przeprowadzono na 114 klinicznie zdrowych koniach, reprezentujących różne grupy użytkowe: zwierzęta hodowlane (27), rekreacyjne (22) oraz sportowe (65). W skład grupy koni sportowych weszły: konie wyścigowe (11), kłusaki (15), konie skokowe (25) oraz zaprzęgowe (14). Wymienione grupy koni były zróżnicowane pod względem rasy, wieku oraz udziału poszczególnych płci. Badania dotyczyły typowych obciążeń wysiłkowych, których forma, intensywność i czas trwania były uwarunkowane, w przypadku koni wyczynowych, rodzajem dyscypliny sportowej. Wysiłek koni rekreacyjnych sprowadzał się do ok. 1-godz. jazdy pod siodłem z młodzieżą uczącą się jazdy konnej. Grupą odniesienia (kontrola) były zwierzęta hodowlane, których aktywność fizyczna ograniczała się do przebywania na przystajennych pastwiskach. Materiał do badań stanowiła krew obwodowa, którą pobierano z żyły szyjnej zewnętrznej, trzykrotnie: przed wysiłkiem, bezpośrednio po nim, oraz po 30-minutowym odpoczynku. W próbkach krwi oceniano m.in. aktywność metabolizmu tlenowego neutrofilów przy użyciu metody chemiluminescencji (CL) oraz wartości enzymatycznych i nieenzymatycznych wskaźników antyoksydacyjnych. Badania wykazały, że wysiłek koni sportowych powoduje przejściową intensyfikację procesów wolnorodnikowych manifestującą się wzrostem aktywności CL neutrofilów krwi obwodowej. Wielkość tej reakcji była uzależniona od intensywności i czasu trwania obciążenia wysiłkowego, czego potwierdzeniem była zmienność wartości oznaczonych wskaźników hematologicznych i biochemicznych krwi, a także liczby oddechów i uderzeń serca. Największy powysiłkowy wzrost aktywności metabolizmu tlenowego neutrofilów stwierdzono u koni zaprzęgowych, poddanych największym obciążeniom wysiłkowym, podczas gdy u zwierząt użytkowanych rekreacyjnie, relatywnie niewielki wysiłek nie indukował podobnej reakcji. Konsekwencją intensyfikacji procesów wolnorodnikowych była mobilizacja mechanizmów antyoksydacyjnych przejawiająca się, zwłaszcza u intensywnie trenowanych koni wyczynowych, powysiłkowym wzrostem wartości związków enzymatycznych i nieenzymatycznych. Wykazano, że spośród oznaczonych antyoksydantów, aktywność peroksydazy glutationowej (GPx) w największym stopniu podlegała powysiłkowej zmienności, co wskazuje na duże znaczenie tego enzymu w ochronie organizmu przed zwiększonym generowaniem reaktywnych form tlenu (ROS). Analiza wyników badań przedwysiłkowych wykazała wyraźnie większe, spoczynkowe wartości CL neutrofilów, a także głównych enzymów antyoksydacyjnych (GPx, dysmutazy ponadtlenkowej i katalazy) oraz całkowitego statusu antyoksydacyjnego u koni regularnie i intensywnie trenowanych, aniżeli u zwierząt o niewielkiej aktywności ruchowej. Rezultat ten świadczy o korzystnym wpływie treningu zarówno na tlenowozależną aktywność bakteriobójczą neutrofilów, jak również na potencjał antyoksydacyjny krwi u koni.
Powysiłkowy wzrost metabolizmu tlenowego neutrofilów dodatnio korelował z wartościami kinazy kreatynowej (CK), co wskazuje na udział ROS w uszkodzeniach komórek mięśniowych w wyniku peroksydacji błon lipidowych. Związek ten potwierdziła analiza regresji wieloczynnikowej w grupie koni charakteryzujących się wyższą, w porównaniu z pozostałymi zwierzętami, powysiłkową aktywnością CK. Wykazała ona, że wraz ze wzrostem metabolizmu tlenowego neutrofilów oraz upośledzeniem potencjału antyoksydacyjnego, wyrażającego się spadkiem wartości GPx i bilirubiny całkowitej, wzrasta stopień uszkodzenia mięśni. Rezultat ten stanowi potwierdzenie związku uszkodzeń mięśni szkieletowych z zaburzeniami równowagi prooksydacyjno-antyoksydacyjnej (tzw. stres oksydacyjny). Jakkolwiek zjawisko to wcześniej obserwowano u koni rajdowych, poddawanych wyczerpującym obciążeniom wysiłkowym, uzyskane wyniki wskazują na niebezpieczeństwo wystąpienia podobnych zagrożeń również w przebiegu standardowego wysiłku treningowego koni sportowych, zwłaszcza reprezentujących dyscyplinę powożenia zaprzęgami oraz wyścigowych. Badania wykazały przydatność oznaczania aktywności chemiluminescencyjnej neutrofilów oraz statusu antyoksydacyjnego krwi do oceny zdrowia i dobrostanu koni sportowych objętych programem treningowym. THE EFFECT OF PHYSICAL EXERCISE ON OXYGEN METABOLISM OF NEUTROPHILS AND ANTIOXIDATIVE POTENTIAL OF BLOOD IN HORSES WIESŁAW KRUMRYCH Department of Horse Diseases, National Veterinary Research Institute in Pulawy Key words: horses, physical exercise, chemiluminescence of neutrophils, antioxidants, oxidative stress SUMMARY The aim of the study was to evaluate the activity of oxygen metabolism of neutrophils and antioxidative potential of blood during standard physical exercise of different groups of horses.
The study included 114 clinically healthy horses representing different groups: breeding horses (27), recreation horses (22) and sport horses (65). The group of sport horses consisted of race horses (11), trotters (15), jumping horses (25) and driving horses (14). The above mentioned groups of horses differed in breed, age and gender. The study was carried out basing on typical exercise workload. Its form, intensity and duration depended, in case of competitive horses, on the type of sport. The exercise of recreation horses came down to about one hour of saddle rides with school children learning to horse ride. The control group comprised breeding horses whose physical activity was limited to staying on grazing land. The study used peripheral blood collected from an external jugular vein three times: before exercise, immediately after exercise and after 30-minute rest. Blood samples were examined, among others, for the activity of oxygen metabolism of neutrophils using chemiluminescence (CL) and the values of enzymatic and nonenzymatic antioxidative indices. The study demonstrated that exercise in sport horses causes a temporary intensification of free radical processes manifested by an increase in CL activity of neutrophils in peripheral blood. The size of this reaction depended on the intensity and duration of the exercise workload, which was confirmed by changes in the value of haematological and biochemical blood indices and the heart rate. The highest post-exercise increase in the activity of oxygen metabolism of neutrophils was demonstrated in driving horses subject to the greatest exercise workload, whereas in animals used for recreation purposes relatively small exercise did not result in a similar reaction. The consequence of the intensification of free radical processes was mobilization of antioxidative mechanisms manifested by, especially in case of intensively trained competitive horses, a post-exercise increase in the values of enzymatic and nonenzymatic complexes. It was demonstrated that among the determined antioxidants the activity of glutathione peroxidase (GPx) was subject to post-exercise changeability, which suggests a great importance of this enzyme in the protection of the organism from the increased generation of reactive oxygen species (ROS). The analysis of the results of pre-exercise examination demonstrated clearly higher, rest CL values of neutrophils as well as main antioxidative enzymes (GPx, superoxide dismutase and catalase) and total antioxidant status in horses trained regularly and intensively than in animals of small physical activity. This result proves a positive influence of training both on oxygen-dependent bactericidal activity of neutrophils and also antioxidative potential of blood in horses. A post-exercise increase of oxygen metabolism of neutrophils positively correlated with the values of creatine kinase (CK), which suggests a participation of ROS in the damage of muscle cells as a result of peroxidation of lipid membranes. This relationship was confirmed by the analysis of multifactorial regression in the group of horses characterized by a higher, in comparison with the other animals, post-exercise CK activity. It demonstrated that together with an increase of oxygen metabolism of neutrophils and impairment of antioxidative potential, marked by a decrease in the values of GPx and total bilirubin, there is an increase in the level of muscle damage. This result confirms the relationship between skeletal muscle damage and disturbances of prooxidant-antioxidant balance (so-called oxidative stress). Although this phenomenon was earlier observed in race horses subject to
exhausting exercise, the obtained results show that there is a risk of similar danger also in case of standard training exercise of sport horses, especially driving and race horses. The study demonstrated the usefulness of chemiluminescence activity assay of neutrophils and antioxidative status of blood to evaluate the health and welfare of sport horses involved in a training programe.