Zastosowanie metody enzymoimmunologicznej do oznaczania kotyniny w moczu

PRACE ORYGINALNE Artur STANEK 1 Wojciech PIEKOSZEWSKI 2 Ewa FLOREK 1 Grzegorz H BRÊBOROWICZ 3 Andrzej ANHOLCER 3 Marek CHUCHRACKI 4,5 Ewa GOMÓ KA 6 Maksymilian KULZA 1 Hanna KÊDZIORA 1 Zastosowanie metody enzymoimmunologicznej do oznaczania kotyniny w moczu Application of the immunoassay for determination of cotinine in the urine 1 Laboratorium Badañ Œrodowiskowych, Katedra i Zak³ad Toksykologii, Uniwersytet Medyczny im Karola Marcinkowskiego w Poznaniu Kierownik: Prof dr hab Ewa Florek 2 Zak³ad Chemii Analitycznej, Uniwersytet Jagielloñski w Krakowie Kierownik: Prof dr hab Pawe³ Koœcielniak 3 Klinika Perinatologii i Ginekologii, Katedra Perinatologii i Ginekologii, Uniwersytet Medyczny im Karola Marcinkowskiego w Poznaniu Kierownik: Prof dr hab Grzegorz H Brêborowicz 4 Centralne Laboratorium Ginekologiczno- Po³o niczego Szpitala Klinicznego, Uniwersytet Medyczny im Karola Marcinkowskiego w Poznaniu Kierownik: Dr n farm Marek Chuchracki 5 Katedra i Klinika Zdrowia Matki i Dziecka, Uniwersytet Medyczny im Karola Marcinkowskiego w Poznaniu Kierownik: Prof dr hab Tomasz Opala 6 Zak³ad Toksykologii Analitycznej i Terapii Monitorowanej, Collegium Medicum, Uniwersytet Jagielloñski w Krakowie Kierownik: Dr Beatya Bystrowska Dodatkowe s³owa kluczowe: tytoñ kotynina mocz Additional key words: tobacco cotinine ELISE urine Adres do korespondencji: Prof dr hab Wojciech Piekoszewski Zak³ad Chemii Analitycznej Uniwersytet Jagielloñski ul R Ingardena 3 30-060 Kraków Tel: +48 12 663 20 88 Fax: +48 12 634 05 e-mail: wpiekosz@tlenpl Weryfikacja badañ ankietowych oceny nara enia na dym tytoniowy wymaga przeprowadzenia oznaczeñ biomarkerów w p³ynach ustrojowych To tego typu badañ konieczna jest szybka i prosta metoda analityczna Celem pracy by³o sprawdzenie przydatnoœci metody enzymoimmunologicznej () do rutynowych oznaczeñ kotyniny w moczu osób pal¹cych tytoñ i porównanie jej z metod¹ referencyjn¹, jak¹ jest wysokosprawna chromatografia cieczowa () W badaniach wziê³o udzia³ kobiet niepal¹cych i pal¹cych tytoñ W moczu pobranym od tych kobiet oznaczono kotyninê metod¹ i testem enzymoimmunologicznym Cotinine Direct Elisa Metoda enzymoimmunologiczna stosowana do analizy jakoœciowej kotyniny w moczu charakteryzowa³a siê du ¹ dok³adnoœci¹, czu³oœci¹ i specyficznoœci¹ potwierdzon¹ badaniami porównawczymi z referencyjn¹ metod¹ Iloœæ fa³szywie dodatnich wyników i fa³szywie ujemnych uzyskiwanych metod¹ nie przekracza- ³a 10% Wysoki wspó³czynnik korelacji, r=0,9056 miêdzy wynikami oznaczeñ kotyniny w moczu metod¹ i potwierdzi³ przydatnoœæ metody enzymoimmunologicznej w ocenie nara enia na dym tytoniowy Ró nice w stê eniach kotyniny wyznaczanych metod¹ i nie zale a³y od stê enia kotyniny w badanej próbce Pomimo wykazanych du ych zalet metody w wykrywaniu i oznaczaniu kotyniny nale y mieæ na uwadze, e otrzymane wyniki mog¹ byæ wy sze ni rzeczywiste i nie mo na wykluczyæ wyst¹pienia reakcji krzy owych z innymi ksenobiotykami obecnymi w moczu Wstêp Oznaczanie kotyniny w krwi, œlinie i moczu od wielu lat jest uznanym biomarkerem aktywnego palenia i nara enia na dym w œrodowisku (ETS environmental tobacco smoke) [1] Verification of the results of questionnaire studies of exposure to tobacco smoke require determination of the biomarkers in body fluids For performing such measurements the fast and simple method is needed The aim of this study was to estimate usefulness of enzyme-linked immunosorbent assay () in routine cotinine determination in urine of active smokers and compare it with reference high performance liquid chromatography method () In the study participated non smoking and smoking women In the urine of tese women cotinine concentration of cotinine was measured by the means of and methods The method, used in quantity measurement of cotinine in urine, is of great accuracy, sensitivity and specificity which were proved by comparison with high performance liquid chromatography () reference method Number of false positive and false negative results obtained by method did not exceed 10% A high correlation coefficient, r=0,9056, between results of determining cotinine in urine by means of and methods, confirmed the utility of method to estimate the tobacco smoke exposure The differences in cotinine concentration values obtained by and methods did not depend on cotinine concentrations in the urine samples Although numerous advantages of method used to detect and determine cotinine, it should be taken into consideration that results might be overestimated and cross-reactivity with other xenobiotics present in urine must be concern Na przestrzeni lat opracowano i wprowadzono do praktyki wiele metod analitycznych umo liwiaj¹cych oznaczanie kotyniny w materiale biologicznym Testy kolorymetryczne by³y opisywane i stosowane ju w latach 80 [2,3] Charakte- 734 Przegl¹d Lekarski 2007 / 64 / 10 A Stanek i wsp

ryzuj¹ siê niskimi kosztami i co umo liwia ich stosowanie na szerok¹ skalê Specyficznoœæ tych testów nie jest du a i obok kotyniny na wynik oznaczeñ wp³ywaj¹ inne metabolity nikotyny (trans-3 -hydroksykotynina, kwas nikotynowy i kotyninowy) [4] Ponadto, w wybranej grupie badawczej oprócz cukrzycy wystêpowa³y choroby towarzysz¹ce, co powodowa³o, i chorzy przyjmowali wiele leków Jako standard zastosowano kwas kotyninowy Ma³a specyficznoœæ mo e wynikaæ z faktu, e testy kolorymetryczne bazuj¹ na reakcji Koeniga, polegaj¹cej na kondensacji z kwasem dietylotiobarbiturowym, charakterystycznej dla wszystkich pirydyn Dlatego te w grupie osób lecz¹cych siê na ró ne schorzenia (cukrzyca, nadciœnienie, inne choroby sercowo-naczyniowe) przyjmowane leki i ich metabolity mog³y wp³ywaæ na wyniki testu Modyfikacja metody polegaj¹ca na zmianie odczynnika kondensuj¹cego na kwas barbiturowy poprawia jej specyficznoœæ [5] Kolejn¹ grup¹ metod stosowanych do oznaczeñ kotyniny s¹ metody chromatograficzne Chromatografia gazowa (GC) umo liwia oznaczenie zarówno nikotyny, jak i jej metabolitów, ale ze wzglêdu na termolabilnoœæ tych zwi¹zków obecnie rzadko jest stosowana [6,7] Ze wzglêdu na swoj¹ du ¹ czu- ³oœæ i selektywnoœæ w badaniach nadal stosowana jest chromatografia gazowa sprzêgniêta ze spektrometri¹ mas lub tandemow¹ spektrometri¹ mas [8] Najczêœciej stosowana w oznaczaniu metabolitów nikotyny w celu oceny nara enia na dym tytoniowy jest wysokosprawna chromatografia cieczowa Metodê t¹ stosowano w wielu badaniach do oznaczeñ nikotyny i jej metabolitów w moczu, œlinie i krwi [9-11] Wysoka czu³oœæ tej metody analitycznej pozwala na oznaczanie kotyniny na poziomach spotykanych nie tylko u aktywnych, ale i biernych palaczy [12] Wysokosprawna chromatografia cieczowa umo liwia identyfikacjê nie tylko nikotyny i kotyniny, ale równie 7 innych metabolitów w moczu i w krwi [13] Metody chromatograficzne cechuj¹ce siê du ¹ czu³oœci¹ i specyficznoœci¹ w wiêkszoœci przypadków wymagaj¹ d³ugotrwa³ego przygotowania próbek do analizy i zastosowania kosztownego sprzêtu analitycznego Jest to jedna z przeszkód do zastosowania oznaczania biomarkerów w badaniach epidemiologicznych Niedogodnoœci te mog¹ byæ ominiête dziêki zastosowaniu metod immunologicznych Obecnie dostêpne testy radioimmunologiczne (RIA) stosuje siê do oznaczania kotyniny jedynie w moczu [14] Wyniki dotychczasowych badañ z zastosowaniem testów RIA ze wzglêdu na ich du ¹ korelacjê z deklarowanym nara eniem na dym tytoniowy i wynikami oznaczeñ kotyniny we w³osach Testy RIA podobnie jak metody kolorymetryczne nie s¹ metodami swoistymi, na uzyskiwane przy ich pomocy wyniki oznaczeñ kotyniny wp³ywa zawarta we krwi i moczu trans-3'-hydroksykotynina [] Szersze zastosowanie w oznaczaniu kotyniny ni metody RIA zyska³y sobie metody enzymoimmunologiczne, a szczególnie metoda (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Testy wykorzystywane s¹ do oznaczeñ kotyniny w moczu, w œlinie i w surowicy krwi Przydatnoœæ tych testów do oceny nara enia na dym tytoniowy przez porównanie ich z metodami chromatograficznymi przeprowadzano ju wielokrotnie [16,17] Badania te wykaza³y wysok¹ korelacjê (r = 0,92 i r = 0,94) pomiêdzy metodami, GC i dla kotyniny w moczu Natomiast korelacja pomiêdzy kotynin¹ oznaczon¹ w œlinie tymi metodami by³a prawie 3-krotnie ni sza (r = 0,37 oraz r = 0,33) Dziêki tej korelacji metoda umo liwia klasyfikacjê na palaczy, osoby nara one na ETS i niepal¹cych w oparciu o oznaczenia kotyniny w moczu i krwi [18] Wiêkszoœæ badañ nad przydatnoœci¹ metod oznaczania kotyniny w celu oceny nara enia na dym tytoniowy ogranicza siê do wykazania korelacji pomiêdzy wynikami uzyskiwanymi tymi metodami a metodami chromatograficznymi nie poddaj¹c tej zale - noœci szerszej ocenie statystycznej Celem pracy by³o sprawdzenie przydatnoœci metody enzymoimmunologicznej (ELI- SA) do badañ jakoœciowych (wykrywanie) i iloœciowych (oznaczanie) kotyniny w moczu w oparciu o porównanie jej z metod¹ referencyjn¹, jak¹ jest wysokosprawna chromatografia cieczowa Rycina 1 Rozdzia³ chromatograficzny kotyniny - próba moczu od kobiety pal¹cej Chromatographic separation of cotinine - the urine sample from smoking women Materia³ i metody Grupê badana stanowi³o 30 pacjentek ( pal¹cych i niepal¹cych) Oddzia³u Porodowego Ginekologiczno Po³o niczego Szpitala Klinicznego Uniwersytetu Medycznego im Karola Marcinkowskiego w Poznaniu Zgodê na przeprowadzenie badañ wyda³a Komisja Bioetyczna przy Uniwersytecie Medycznym im Karola Marcinkowskiego w Poznaniu Do badañ zakwalifikowano pacjentki, które wyrazi- ³y zgodê na udzia³ w badaniach Od pacjentek, pobrano próbki moczu w iloœci 10 ml w celu oznaczenia kotyniny i kreatyniny Mocz do czasu analizy przechowywano w temperaturze -18 C Kotyninê oznaczano dwoma metodami: wysokosprawn¹ chromatografi¹ cieczow¹ z detekcj¹ spektrofotometryczn¹ po uprzedniej ekstrakcji z wykorzystaniem techniki ciecz-ciecz i enzymoimmunologiczn¹ () Oznaczanie kotyniny w moczu metod¹ Kotyninê w moczu oznaczono metod¹ wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detekcj¹ spektrofotometryczn¹ (Merck-Hitachi, Diode Array Detector L-7455 Interface D-7000, prekolumna i kolumna Supelcosil LC- 8 (Supelco)) z u yciem norefedryny jako wzorca wewnêtrznego, po uprzedniej ekstrakcji z wykorzystaniem techniki ciecz-ciecz [19] Metoda by³a liniowa w zakresie stê eñ 5-1000 ng/ml, granica wykrywalnoœci wynosi³a 3 ng/ml, a oznaczalnoœci 5 ng/ml Wspó³czynnik zmiennoœci oznaczeñ kotyniny w stê eniu 50 i 500 ng/ml by³ poni ej 10% Stê enie kotyniny w moczu przeliczono na mg kreatyniny Kreatyninê oznaczono metod¹ spektrofotometryczn¹ Przyk³adowy rozdzia³ chromatograficzny przedstawiono na rycinie 1 Oznaczanie kotyniny w moczu metod¹ Oznaczenie kotyniny w moczu przeprowadzono za pomoc¹ bezpoœredniego testu Cotinine Direct Elisa firmy BioQuant Test oparty jest na kompetycyjnym przy³¹czaniu nieznakowanego antygenu do enzymatycznie znakowanego przeciwcia³a Rozcieñczon¹ próbkê badanego moczu w iloœci 10 ml inkubowano ze 100 ml roztworu enzymatycznie znakowanej pochodnej kotyniny w tzw studzienkach, czyli w otworach znajduj¹cych siê na p³ytce Otwory te s¹ pokryte unieruchomionymi, oczyszczonymi przeciwcia- ³ami poliklonalnymi, które charakteryzuj¹ siê wysokim powinowactwem wobec badanego substratu, jakim jest kotynina W trakcie inkubacji nastêpuje kompetycyjne przy³¹czanie kotyniny z próbki badanej oraz znakowanej pochodnej do przeciwcia³ wyœcie³aj¹cych wnêtrze studzienek Po wymyciu reagentów, które nie po³¹czy³y siê z przeciwcia³ami, dodawano substratu, który generuje barwê przeciwcia³ Gdy nast¹pi³o rozwiniêcie barwy do studzienek dodawano rozcieñczony roztwór o kwaœnym odczynie, który jest inhibitorem procesu powstawania barwnego produktu Nastêpnie badano intensywnoœæ powsta³ego koloru, która jest odwrotnie proporcjonalna do stê enia badanej substancji Walidacja metody Informacje na temat czu³oœci, specyficznoœci i reakcji krzy owych przyjêto zgodnie z tymi podanymi przez producenta testu Za granicê wykrywalnoœci przyjêto 1 ng/ml w oparciu o deklaracje producenta Dok³adnoœæ metody: badanie dok³adnoœci testu przeprowadzono zgodnie z procedur¹ podan¹ przez producenta testu W tym celu zebrano próbek moczu od osób pal¹cych, w których znajdowa³y siê ró ne iloœci kotyniny i od osób deklaruj¹cych nie palenie We wszystkich próbkach wykazano obecnoœæ metabolitu na poziomie wy szym ni 500 ng/ml W adnej z próbek moczu pobranych od osób niepal¹cych nie wykryto obecnoœci kotyniny Testem zbadano równie 3 próbki moczu pobrane od osób biernie nara onych na dym w okresie 30 dni; uzyskane wyniki, po ekstrapolacji krzywej dawka odpowiedÿ, mieœci³y siê w granicach 5 10 mg kotyniny/ml moczu Specyficznoœæ metody: w celu okreœlenia specyficznoœci zbadano wp³yw zwi¹zków o podobnej strukturze do kotyniny na uzyskiwane wyniki oznaczeñ Badaniu podano nikotynê, kwas nikotynowy i nikotynamid Wykazano, e zwi¹zki te w stê eniu 100 ng /ml daj¹ mniejsz¹ odpowiedÿ ni kotynina w stê eniu 100 ng/ml Reakcja krzy owa: w badaniach przeprowadzonych przez producenta wykazano, e miêdzy innymi takie zwi¹zki jak: kofeina, kwas acetylosalicylowy, ampicylina, barbital, kokaina, amfetamina, witamina C, chloropromazyna, dekstrometorfan, estriol, estradiol, ibuprofen, niacynamidn, chinina i tetracyklina w stê eniu 500 ng/ml nie wp³ywaj¹ na wyniki oznaczania kotyniny Przegl¹d Lekarski 2007 / 64 / 10 735

Tok oznaczania Do studzienek dodano standardy i roztwory do krzywej kalibracyjnej, (po 10 ml negatywnej próby kontrolnej moczu, pozytywnej próby kontrolnej kotyniny, roztwór kotyniny 5 ng/ml, roztwór kotyniny 10 ng/ml, roztwór kotyniny 25 ng/ml, roztwór kotyniny 50 ng/ml, roztwór kotyniny 100 ng/ml), a nastêpnie dodano po 10 ml badanej próbki moczu Wszystkie oznaczenia powtarzano dwukrotnie W kolejnym etapie do wszystkich studzienek dodano po 100 ml enzymatycznie znakowanego przeciwcia- ³a i ca³oœæ inkubowano przez godzinê w temperaturze pokojowej, w ciemnoœci Po inkubacji p³ytkê 6 krotnie przep³ukiwano wod¹ destylowan¹, 350 ml wody, a nastêpnie przewrócono p³ytkê i energicznie po³o ono na ligninê Do studzienek dodano po 100 ml substratu generuj¹cego barwê przeciwcia³, wymieszano i inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej, w ciemnoœci Po inkubacji dodano 100 ml roztworu inhibitora reakcji rozwiniêcia barwy Po up³ywie minut dokonano pomiaru absorbancji przy d³ugoœci fali 450 i 650 nm Analiza statystyczna wyników badañ Badane parametry opisano œredni¹ arytmetyczn¹ i odchyleniem standardowym oraz wartoœciami minimaln¹ i maksymaln¹ Opis metody obliczania parametrów wykorzystanych do oceny korelacji jakoœciowej i iloœciowej miêdzy wynikami uzyskanymi metod¹ i przedstawiono w czêœci dotycz¹cej wyników oznaczenia Tabela I Stê enie kotyniny wyznaczone metod¹ i w moczu kobiet niepal¹cych Concentration of cotinine in the urine of non smoking women measured by HPLS and methods Stê enie kotyniny w moczu kobiet niepal¹cych Numer pacjentki 1 2 53, 5 0 3 4 0 2, 8 5 6 7 0, 2 8 9 124, 7 1, 6 10 11 12 13 14 Tabela III Stê enie kotyniny wyznaczone metod¹ I w moczu kobiet pal¹cych Concentration of cotinine in the urine of smoking women measured by HPLS and methods Stê enie kotyniny w moczu kobiet ciê arnych pal¹cych Numer pacjentki 1 308, 7 56, 9 2 12, 7 12, 4 3 4007, 4 3267, 1 4 4007, 4 4176, 1 5 62, 2 220, 4 6 196, 1 146, 3 7 62, 2 145, 2 8 196, 1 210, 1 9 324, 6 295, 2 10 374, 2 1302, 2 11 355, 7 396, 2 12 1166, 5 2297, 4 13 1341, 0 2391, 7 14 374, 2 456, 7 3020, 8 3099, 3 Tabela II Œrednie stê enie kotyniny w moczu kobiet niepal¹cych i pal¹cych wyznaczone metod¹ i Mean concentration of cotinine in the urine of non smoking and smoking women Parametr Kobiety Stê enie kotyniny niepal¹ce Kobiety pal¹ce Œrednia 11,88 1,39 1130,71 1231,56 ± SD 34,12 3,91 1237,93 1426, 6 Zakres 0,0-124, 7 0,0-, 2 12,7-4007, 4 12,4-3267, 1 Ca³kowita liczba oznaczeñ Liczba oznaczeñ dodatnich* 2 3 * Stê enie powy ej granicy oznaczalnoœci Tabela IV Zgodnoœæ wyników oznaczeñ kotyniny w moczu metod¹ i Compliance of the measurements of cotinine concentration obtained by and methods Parametr Wyniki prawdziwie dodatnie Wyniki prawdziwie ujemne Wyniki fa³szywie dodatnie Wyniki fa³szywie ujemne n 16 11 2 1 % 53, 3 36, 7 6, 7 3, 3 Wyniki W badaniach wykorzystano próby moczu pobrane od 30 kobiet, które zg³osi³y siê do porodu, do Ginekologiczno-Po³o niczego Szpitala Klinicznego Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu Pacjentki wyrazi³y zgodê na udzia³ w badaniach i z³o y³y deklaracje dotycz¹ce nara enia na dym tytoniowy Wœród badanych pacjentek kobiet deklarowa³o nie palenie i brak nara enia na ETS oraz kobiet, które deklarowa³y palenie tytoniu w ca³ym okresie trwania ci¹ y Iloœæ wypalanych przez badane kobiety papierosów by³a zró nicowana (od 1 do kilkunastu papierosów dziennie), co zapewnia³o szerokie spektrum stê eñ kotyniny w ich moczu Wyznaczone z zastosowaniem metody wysokosprawnej chromatografii cieczowej stê enie kotyniny w moczu kobiet niepal¹cych waha³o siê od 0,0 do 124,7 ng/mg kreatyniny (tabela I), a wartoœæ stê enia wynosi³a 11,88 ±34,12 ng/mg kreatyniny (tabela II) Wœród kobiet ciê arnych pal¹cych tytoñ ( osób) stê enie kotyniny mieœci³o siê w granicach od 12,7 do 4007,4 ng/mg kreatyniny (tabela III) ze œredni¹ wartoœci¹ 1130,71 ±1237,93 ng kotyniny/mg kreatyniny (Tabela II) Stosuj¹c metodê uzyskano w grupie kobiet niepal¹cych stê enie kotyniny w moczu wynosz¹ce 1,39±3,91 ng/mg kreatyniny, a zakres stê eñ wynosi³ 0,0-,2 ng/mg kreatyniny (tabela I, II) W grupie pacjentek pal¹cych stê enie kotyniny w moczu waha³o siê od 12,4 do 3267,1 ng/mg kreatyniny, a œrednie stê enie tego metabolitu nikotyny wynosi³o 1231,56±21,27 ng/mg kreatyniny (tabela II, III) Uzyskane wyniki oznaczeñ wykorzystano do oceny korelacji jakoœciowej pomiêdzy oznaczeniami kotyniny wykonanymi metod¹ enzymoimunologiczn¹ i referencyjn¹ metod¹ W pierwszym etapie tych badañ oceniono czêstotliwoœæ otrzymywania metod¹ ELI- SA wyników: prawdziwie dodatnich - powy ej czu³oœci obu metod, prawdziwie ujemnych poni ej czu³oœci obu metod, fa³szywie dodatnich poni ej czu³oœci metody, a powy ej, fa³szywie ujemnych powy ej czu³oœci metody a poni ej Wyniki tej oceny przedstawiono w tabeli IV Przeprowadzone oznaczenia kotyniny metodami i by³ zgodne w 90% W dalszej ocenie korelacji jakoœciowej wykorzystanych metod obliczono dok³adnoœæ (accuracy), czu³oœæ (sensitivity), specyficznoœæ (specificity), zdolnoœæ przewidywania wyników dodatnich (positive predictive value PPV) i zdolnoœæ przewidywania wyników ujemnych (negative predictive value NPV) zgodnie z metod¹ zaproponowan¹ przez Haung i wsp [20] Uzyskane wyniki obliczeñ przedstawia tabela V Przeprowadzone obliczenia porównania metod i wykaza³y, e metoda oznaczania kotyniny w moczu cechuje siê dok³adnoœci¹ 90%, czu³oœci¹ 94,1% i specyficznoœci¹ 84,6% Zdolnoœæ tej metody do przewidywania zarówno wyników dodatnich, jak i ujemnych jest bardzo du a, a obliczone wskaÿniki PPV i NPV wynosz¹ odpowiednio 0,8887 i 0,9262 W celu wykazania korelacji miêdzy wynikami oznaczeñ kotyniny w moczu przy 736 Przegl¹d Lekarski 2007 / 64 / 10 A Stanek i wsp

wykorzystaniu metody i przeprowadzono analizê regresji Wyniki uzyskanej analizy przedstawiono na rycinie 2 Zale noœæ miêdzy stê eniem kotyniny wyznaczonym metod¹ i opisuje równanie regresji: C = 88,81 + C x 0,9901 Zarówno wspó³czynniki równania regresji, jak i wysoki wspó³czynnik korelacji, r = 9056 œwiadcz¹ o bardzo wysokiej korelacji miêdzy badanymi metodami W celu dalszego porównania metody i oznaczania kotyniny w moczu obliczono wzglêdn¹ ró nicê pomiêdzy wynikami uzyskanymi porównywanymi metodami Obliczenia tego wspó³czynnika przeprowadzono przez odjêcie od wyniku uzyskanego metod¹ wyniku uzyskanego metod¹ i podzieleniu otrzymanej ró nicy przez stê enie uzyskane metod¹ Na rycinie 3 przedstawiono zale noœæ wzglêdnej ró nicy stê enia kotyniny wyznaczonego metod¹ i od stê enia kotyniny wyznaczonego metod¹ Uzyskane wyniki wskazuj¹ na brak zale noœci wzglêdnej ró nicy stê eñ od stê- enia kotyniny w badanym zakresie Tabela V Jakoœciowe porównanie metod i oznaczania kotyniny w moczu Qualitative comparison of and methods for determination of cotinine in the urine Dok³adnoœæ (accuracy) Czu³oœæ (sensitivity) Specyficznoœæ (specificity) Parametr Zdolnoœæ przewidywania wyników dodatnich (positive predictive value - PPV) Zdolnoœæ przewidywania wyników ujemnych (negative predictive value - NPV) Stê enie kotyniny w moczu wyznaczane metod¹ 4500,0 4000,0 3500,0 3000,0 2500,0 2000,0 00,0 1000,0 500,0 0,0 Wartoœæ 90,0% 94,1% 84,6% 0,8087 0,9262 Metoda obliczania [(liczba wyników prawdziwie ujemnych + liczba wyników prawdziwie ujemnych) / ca³kowita liczba pomiarów] x 100 [(liczba wyników prawdziwie dodatnich) / (liczba wyników prawdziwie dodatnich + liczba wyników fa³szywie ujemnych)] x 100 [(liczba wyników prawdziwie ujemnych) / (liczba wyników prawdziwie ujemnych + liczba wyników fa³szywie dodatnich)] x 100 (czu³oœæ x procent wyników dodatnich) / [(100 - specyficznoœæ) x (100 - procent wyników pozytywnych) + (czu³oœæ x procent wyników pozytywnych] [specyficznoœæ x (100 - procent wyników dodatnich)] / [(100 - czu³oœæ) x procent wyników pozytywnych + specyficznoœæ x (100 - procent wyników pozytywnych)] r = 0,9056 0 500 1000 00 2000 2500 3000 3500 4000 4500 Stê enie kotyniny w moczu wyznaczane metod¹ Rycina 2 Zale noœæ miêdzy stê eniem kotyniny w moczu wyznaczonym metod¹ i (dla wszystkich przeprowadzonych oznaczeñ) Linia ci¹g³a jest najlepszym dopasowaniem wyników do modelu liniowego, a linia przerywana - 95% przedzia³ ufnoœci Relationship between concentration of cotinine measured by the means of and (for all performed determinations) Solid line is the best fitting of linear model to the data dash line - 95% of coefficient interval Dyskusja W badaniach toksykologicznych metody oparte na reakcjach enzymoimmunologicznych s¹ stosowane od wielu lat, a ich przydatnoœæ jako metod skryningowych (przesiewowych) zosta³a wielokrotnie potwierdzona [21,22] Wzrost zainteresowania metodami immunologicznymi zwi¹zany jest z coraz wiêksz¹ iloœci¹ badañ dotycz¹cych przyjmowania substancji uzale niaj¹cych, szczególnie przez przedstawicieli niektórych zawodów np kierowców, pilotów, czy kolejarzy Grupy objête badaniem substancji uzale niaj¹cych w miejscu pracy (workplace drug testing) na ca³ym œwiecie stale wzrastaj¹ [23] Metody enzymoimmunologiczne znalaz³y równie zastosowanie w diagnostyce ostrych zatruæ i terapii monitorowanej stê- eniem leku, gdzie od lat stanowi¹ podstawowe metody wykrywania i oznaczania ksenobiotyków w materiale pobranym od ludzi ywych [24,25] Prostota wykonania oraz szybkoœæ uzyskania wyniku jest zalet¹ metod enzymoimmunologicznych stosowanych w tego typu badaniach Metodami tymi z regu³y nie oznacza siê jednego konkretnego zwi¹zku, a ze wzglêdu na reakcje krzy owe oznacza siê wszystkie zawarte w badanej próbce zwi¹zki o zbli onej budowie chemicznej Nale y jednak zwróciæ uwagê na to, e czu³oœæ tych metod w stosunku do ró nych zwi¹zków z tej samej grupy jest zró nicowana Czu³oœæ metod dla metabolitów oznaczanego zwi¹zku lub zwi¹zków o podobnych do niego strukturach jest od kilku do kilkuset razy ni sza Ocena aktywnego palenia tytoniu i nara enia na dym w œrodowisku najczêœciej prowadzona jest w oparciu o metody ankietowe, szczególnie wtedy, gdy badaniem objêta jest du a grupa osób Z wczeœniej przeprowadzonych badañ wynika, e odpowiedzi udzielane w ankietach czêsto s¹ niezgodne z prawd¹ Ma to szczególnie miejsce w przypadku, gdy badaniem objête s¹ osoby z grupy wysokiego ryzyka Tak¹ na przyk³ad stanowi¹ kobiety ciê arne pal¹ce tytoñ [26-29] W wielu badaniach do takiej oceny wykorzystuje siê oznaczanie najlepszego markera aktywnego i biernego palenia tytoniu, jakim jest kotynina przy zastosowaniu pracoch³onnej i wymagaj¹cej specjalistycznej aparatury wysokosprawnej chromatografii cieczowej [30-32] Z tego powodu istnieje du e zainteresowanie metodami analitycznymi, które w szybki, prosty i tani sposób umo liwiaj¹ wykonanie badañ w du ej populacji i weryfikuj¹ nimi np odpowiedzi uzyskane w ankietach Wszystkie wymienione wymagania spe³nia metoda enzymoimmunologiczna Dlatego cel, jaki realizowano w pracy, czyli sprawdzenie przydatnoœci metody enzymoimmunologicznej do oceny nara- enia na dym tytoniowy poprzez porównanie jej z referencyjn¹ metod¹ wysokosprawnej chromatografii cieczowej wydaje siê w pe³ni uzasadniony W badaniach epidemiologicznych ze wzglêdu na koniecznoœæ oznaczeñ znacznych iloœci prób liczy siê prostota wykonywanych analiz, lecz nie mo e odbywaæ siê to kosztem czu³oœci metody, czy znacznego obni enia jej specyficznoœci Dlatego w badaniach w³asnych porównano wyniki uzyskane z zastosowaniem Testu i referencyjnej metody wysokosprawnej chromatografii cieczowej W badaniach wykorzystano mocz pobrany od 30 kobiet Piêtnaœcie z nich deklarowa³o brak nara enia na dym tytoniowy Pozosta³e, by³y osobami pal¹cymi, o zró nicowanej iloœci wypalanych dziennie papierosów Porównanie Przegl¹d Lekarski 2007 / 64 / 10 737

Wzglêdna ró nica stê enia kotyniny w moczu wyznaczonego metod¹ i 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0-1,0-2,0 Ryc 3 Zale noœæ wzglêdnej ró nicy stê enia kotyniny wyznaczonego metod¹ i od stê enia kotyniny wyznaczonego metod¹ Relationship between relative differences of concentration of cotinine measured my means of and ELISE methods and concentration of cotinine measured by means of method metod rozpoczêto od zbadania korelacji jakoœciowej miêdzy nimi Zaadoptowana do badañ w³asnych metoda charakteryzowa³a siê bardzo du ¹ dok³adnoœci¹ wynosz¹c¹ 90% W badaniach substancji uzale niaj¹cych z grupy amfetamin, opiatów oraz takich zwi¹zków jak kwas tetrahydrokanabinolowy, benzoiloekgonina i fencyklidyna z zastosowaniem szeœciu ró nych testów opartych na reakcjach immunologicznych (Syva Rapid Test, Syva Rapid Cup, Roch Test Cup, Biosite Triage, Casco-Nerl microline, Syva ETS) wykazano, e dok³adnoœæ analiz waha siê od 50% dla kwasu tetrahydrokanabinolowego oznaczanego testem Biosite Triage do 93% dla benzoiloekgoniny oznaczanej testem Syva Rapid Test [33] Wykorzystany w oznaczaniu kotyniny test Cotinine Direct Elisa firmy BioQuant cechowa³ siê specyficznoœci¹ 84,6% i jeszcze wiêksz¹ czu³oœci¹, wynosz¹c¹ 94,1% Test ten charakteryzowa³ siê równie du ¹ zdolnoœci¹ do przewidywania wyników dodatnich i ujemnych Wspó³czynnik PPV (positive predictive value) wynosi³ 0,8084, natomiast NPV (negative predictive value) 0,9262 Stosuj¹c wykorzystane w badaniach podejœcie do statystycznej oceny wyników analiz jakoœciowych Ferrara i wsp wykazali du ¹ przydatnoœæ testów enzymoimmunologicznych do wykrywania w moczu takich substancji uzale niaj¹cych jak: kwas tetrahydrokanabinolowy, benzoiloekgonina, fencyklidyna, metadon, benzodiazepiny i barbiturany [34] W niniejszej pracy oceniany test do oznaczeñ kotyniny w moczu da³ tylko 0 500 1000 00 2000 2500 3000 3500 4000 4500 Stê enie kotyniny w moczu wyznaczane metod¹ 6,7% wyników fa³szywie dodatnich, czyli wskazywa³ na obecnoœæ kotyniny w badanym materiale biologicznym, co nie zosta³o potwierdzone referencyjn¹ metod¹ wysokosprawnej chromatografii cieczowej Jeszcze mniejsza by³a iloœæ wyników fa³szywie ujemnych, czyli nie wykazanie obecnoœci kotyniny, pomimo, e metoda potwierdza³a jej obecnoœæ, która wynosi³a 3,3% Korelacjê iloœciow¹ miêdzy wynikami oznaczeñ kotyniny metod¹ i prowadzono najczêœciej stosowan¹ metod¹ regresji liniowej, dopasowuj¹c model regresji liniowej do uzyskanych wyników oznaczeñ Korelacja miêdzy oznaczeniami kotyniny przeprowadzonymi metod¹ z zastosowaniem testu Cotinine Direct Elisa firmy BioQuant a specyficzn¹ metod¹ by³a bardzo wysoka, a wspó³czynnik korelacji wynosi³ 0,9056 Równanie opisuj¹ce tê zale noœæ mia³o postaæ C = 88,81 + C x 0,9901 Na uwagê zas³uguje zbli ony do jednoœci - 0,9901, wspó³czynnik a w równaniu regresji (y = ax + b) wskazuj¹cy na du ¹ zgodnoœæ wyników uzyskiwanych dwoma metodami oraz stosunkowo niski wspó³czynnik b, punkt przeciêcia prostej regresji z osi¹ Y Wspó³czynnik korelacji na poziomie 0,9 wykazali równie w swoich badaniach Galanti i wsp Autorzy porównywali wyniki oznaczeñ kotyniny w moczu przeprowadzone metod¹ z zastosowaniem testu Coti- Tracq EIA firmy Serex Inc z oznaczeniami metod¹ [35] Na inny, bardzo wa ny aspekt stosowania testów enzymoimmunologicznych w oznaczaniu ksenobiotyków w materiale biologiczny zwrócili uwagê Kuo i wsp Jest nim stosowanie testów opracowanych dla oznaczeñ w moczu do oznaczeñ w innym medium np w œlinie, czy surowicy [16] Wykazali oni wysok¹ korelacjê miêdzy metod¹ enzymoimmunologiczn¹ a chromatografi¹ gazow¹ z detektorem NFID dla oznaczeñ kotyniny w moczu (r=0,9200), dla której test zosta³ opracowany Natomiast prowadz¹c oznaczenia w œlinie wspó³czynnik korelacji wynosi³ zaledwie 0,3300 Porównuj¹c wyniki otrzymane metodami i obserwuje siê tendencje do otrzymywania wy szych wyników stosuj¹c metodê enzymoimmunologiczn¹ w porównaniu z referencyjn¹ metod¹ wysokosprawnej chromatografii cieczowej Piêæ wyników oznaczeñ kotyniny metod¹ by³o poza 95% przedzia³em ufnoœci dla zale noœci oznaczeñ metod¹ i Z tego 3 wyniki oznaczeñ metod¹ by³y znacznie wy sze ni te otrzymane metod¹, a dwa nieznacznie ni sze ni zakres przedzia³u ufnoœci Jest to zgodne z oczekiwaniami Fakt ten mo na t³umaczyæ nieca³kowit¹ swoistoœci¹ metody ELI- SA i wp³ywem na wyniki innych ksenobiotyków wspó³obecnych z kotynin¹ w moczu, jakkolwiek stê enia innych metabolitów nikotyny wystêpuj¹ce w moczu nawet osób pal¹cych znaczne iloœci papierosów s¹ poni ej wartoœci mog¹cej wp³ywaæ na wyniki oznaczeñ kotyniny zastosowan¹ metod¹ Potencjalny wp³yw innych leków mog¹cych wystêpowaæ w krwi osób pal¹cych tytoñ lub nara onych na ETS nie ma praktycznego znaczenia, poniewa stê enia daj¹ce mierzalne reakcje krzy owe s¹ stê eniami spotykanymi przy ostrych zatruciach lub w przypadku zatruæ œmiertelnych Nale y jednak zwróciæ uwagê na to, e zawy enie wyników przez metodê nie jest du e, a jego wielkoœæ nie zale y od stê- enia kotyniny w moczu w szerokim zakresie stê eñ od 12 do ponad 4000 ng/mg kreatyniny Wskazuje na to równomierne roz- ³o enie wzd³u linii zerowej wzglêdnej ró - nicy stê eñ wyznaczonych metod¹ i na wykresie jej zale noœci od stê enia kotyniny wyznaczonego metod¹ Przeprowadzona ocena metody i porównanie jej z metod¹ wykaza³a, e w analizie jakoœciowej jest to bardzo wiarygodna metoda daj¹ca tylko 10% wyników niezgodnych z tymi uzyskanymi metod¹, w tym 3,3% wyników fa³szywie negatywnych i 6,7% wyników fa³szywie pozytywnych Wysoki wspó³czynnik korelacji miêdzy wynikami uzyskiwanymi dwoma metodami i brak wp³ywu stê enia obecnej w moczu kotyniny na wielkoœæ w ró nicach tych wyników œwiadczy o przydatnoœci metody enzymoimmunologicznej do analiz iloœciowych kotyniny w moczu Metoda ta mo e byæ szczególnie przydatna w przypadku koniecznoœci uzyskania wyników oznaczeñ kotyniny w materiale biologicznym na cito lub badania du ej iloœci próbek Niew¹tpliw¹ zalet¹ metody obok krótkiego czasu analizy jest nieznaczna iloœæ materia³u konieczna do przeprowadzenia analizy Jest to mo e mniej wa ne w przypadku oznaczeñ u osób doros³ych, ale ma kluczowe znaczenie w przypadku oceny nara enia noworodków na dym tytoniowych, w której zazwyczaj do 738 Przegl¹d Lekarski 2007 / 64 / 10 A Stanek i wsp

dyspozycji jest niewielka iloœæ pierwszego moczu noworodka Piœmiennictwo 1 Piekoszewski W, Florek E: Markery nara enia na dym tytoniowy (ed) Akademia Medyczna, Poznañ, 2001 2 Barlow RD, Stone RB, Wald NJ: The direct barbituric acid assay for nicotine metabolites in urine: a simple colorimetric test for routine assessment of smoking status and cigarette smoke intake Clin Chim Acta 1987, 165, 45 3 Peach H, Ellard GA, Jenner PJ: A simple, inexpensive urine test of smoking Thor 1985, 40, 351 4 Philipou G, James SK, Seaborn ChJ: Assessment of a simple colorimetric procedure to determine smoking status in diabetic subjects Clin Chem 1994, 40, 1296 5 Smith RF, Mather HM, Ellard GA: Assessment of simple colorimetric procedures to deterine smoking status of diabetic subjects Clin Chem 1998, 44, 275 6 Jarvis MJ, Phil M, Russell MAH: Elimination of cotinine from body fluids: implications for noninvasive measurement of tobacco smoke exposure AJPH 1988, 6, 696 7 Pojer R, Whitfield JB, Poulos V: Carboxyhemoglobin, cotinine and thiocyanate assay compared for distinguishing smokers from non smokers Clin Chem 1984, 30, 1377 8 Benowitz NL, Peyton J, Fong I: Nicotine metabolic profile in man: comparison of cigarette smoking and transdermal nicotine J Pharmacol Experim Therap 1993, 1, 296 9 Bentley MC, Abrar M, Kelk M: Validation of an assay for the determination of cotinine and 3- hydroxycotinine in human saliva using automated solid-phase extraction and liquid chromatography with tandem mass spectrometric detection J Chromatogr B 1999, 723, 185 10 Byrd GD, Chang KM, Greene JM: Evidence for urinary excretion of glucuronide conjugates of nicotine, cotinine and trans-3«-hydroxycotinine in smokers Drug Metabol Dispos 1991, 20, 192 11 Lea RA, Dickson S, Benovitz NL: Within- subject variation of the salivary 3HC/COT ratio in regular daily smokers: prospects for estimating CYP2A6 enzyme activity in large- scale surveys of nicotine metabolic rate J Analyt Toxicol 2006, 30, 386 12 Grimaldi F, Oddoze C, Viala A: Determination nicotine and its main metabolites in urine by highperformance liquid chromatography J Chromatogr 1993, 612, 302 13 Kyerematen GA, Morgan ML, debethizy JD: Disposition of nicotine and eight metabolites in smokers and nonsmokers: Identification in smokers of two metabolites that are longer lived than cotinine Clin Pharmacol Ther 1990, 48, 641 14 Nafstad P, Botten G, Hagen JA: Comparison of three methods for estimating environmental tobacco smoke exposure among children aged between 12 and 36 months Internat J Epidemiol 1995, 24, 88 Zuccaro P, Pichini S, Altieri I: Interference of nicotine metabolites in cotinine determination by RIA Chem Clin 1997, 43, 180 16 Kuo HW, Yang JS, Chiu MC: Determination of urinary and salivary cotinine using gas and liquid chromatography and enzyme-linked immunosorbent assay J Chromatogr B 2002, 768, 297 17 Langone JJ, Cook G, Bjercke RJ: Monoclonal antibody for cotinine in saliva and urine of active and passive smokers J Immunol Meth 1988, 114, 73 18 Ziegler UE, Kauczok J, Dietz UA: Clinical correlation between the consumption of nicotine and cotinine concentrations in urine and serum by competitive enzyme-linked immunosorbent assay Pharmacol 2004, 72, 254 19 Florek E, Piekoszewski W, Kornacka MK, Szmañko A: Ocena nara enia na wielopierœcieniowe wêglowodory aromatyczne kobiet ciê arnych pal¹cych tytoñ Przegl Lek 2005, 65, 1013 20 Haung MH, Liu RH, Chen Y, Rhodes SI: Correlation of drug testing results immunoassay versus gas chromatography-mass spectrometry Forensic Sci Rev 2006, 18, 10 21 George S: Position of immunological techniques in screening in clinical toxicology Clin Chem Lab Med 2004, 42, 1288 22 Hammett-Stabler CA, Pesce AJ, Cannon DJ: Urine drug screening in the medical setting Clin Chim Acta 2002, 3, 125 23 Wong R: The current status of drug testing in the US workforce Am Clin Lab 2002, 21, 14 24 Hammond KB: Drugs and children: methods for therapeutic monitoring Clin Toxicol 1977, 10, 9 25 Piekoszewski W, Florek E: Rola laboratorium toksykologicznego w toksykologii medycznej Przegl Lek 2005, 62, 954 26 Cummings KM, Markello SJ, Mahoney M, Bhargava AK, McElroy PD, Marshall JR: Measurement of current exposures to environmental tobacco smoke Arch Environ Health 1990, 45, 74 27 Florek E, Piekoszewski W, Brêborowicz GH, Pach D, Pasich A: Ocena ankietowa i biochemiczna palenia tytoniu przez kobiety rodz¹ce Przegl Lek 2004, 61, 345 28 Florek E, Piekoszewski W, Rybakowski, Moczko J: Using the questionnaire and cotinine concentration in urine for study smoking habit and exposure to ETS of pregnant women Przegl Lek 2004, 61, 993 29 Perez-Stable EJ, Martin G, Martin BV, Benowitz NL: Misclassification of smoking status by self-reported cigarette consumption Am Rev Respiratory Dispos 1992, 145, 53 30 Florek E, Kornacka MK, Hubert A, Wilimowska J, Basior A: Poziom kotyniny w moczu i ³o ysku kobiet pal¹cych tytoñ i nara onych na ETS w czasie ci¹ y Przegl Lek 2004, 61, 1090 31 Oruc EE, Kocyigit-Kaymakcioglu B, Yilmaz- Demircan F, et al: A high performance liquid chromatographic method for the quantification of cotinine in the urine of preschool children Pharmacy 2006, 61, 823 32 Rabbaa-Khabbaz L, Abi DR, Karam-Sarkis DJ: A simple, sensitive, and rapid method for the determination of cotinine in urine by high-performance liquid chromatography with UV detection Chromatogr Sci 2006, 44, 535 33 Kadehjian IJ: Performance of five-non-instrumented urine drug testing devices with challenging near-cutoff specimens J Anal Toxicol 2001, 25, 670 34 Ferrara SD, Tedeschi I, Frison G, et al: Drug of abuse testing in urine Statistical approach and experimental comparison of immunochemical and chromatographic techniques J Anal Toxicol 1994, 18, 278 35 Galanti LM, Dell Omo J, Vanbeckbergen D, Dubois P, Masson PL, Cambiaso CL: Particle counting immunoassay for urinary cotinine Comparison with chromatography, enzyme-linked immunoassay and fluorescence polarization immunoassay Clin Chem Lab Med 1999, 37, 729 Przegl¹d Lekarski 2007 / 64 / 10 739