WYSTĘPOWANIE W MATERIALE KLINICZNYM I LEKOWRAŻLIWOŚĆ SZCZEPÓW STENOTROPHOMONAS MALTOPHILIA

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2010, 62: 127-134 Karolina Hankiewicz-Ziołkowska, Agnieszka Mikucka, Eugenia Gospodarek WYSTĘPOWANIE W MATERIALE KLINICZNYM I LEKOWRAŻLIWOŚĆ SZCZEPÓW STENOTROPHOMONAS MALTOPHILIA Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu Kierownik: dr hab. E. Gospodarek, prof. UMK Celem pracy była ocena częstości występowania i lekowrażliwości szczepów Stenotrophomonas maltophilia w materiale pobranym od chorych hospitalizowanych w Szpitalu Uniwersyteckim nr 1 im. dr. A. Jurasza w Bydgoszczy w okresie trzech lat. Najczęściej pałeczki S. maltophilia izolowano od chorych Kliniki Anestezjologii i Intensywnej Terapii z Pododdziałem Kardioanestezjologii oraz Kliniki Chirurgii Dziecięcej. Najwięcej (95,7%) szczepów wykazywało wrażliwość na lewofloksacynę i trimetoprim/sulfametoksazol (71,2%). Stenotrophomonas maltophilia to Gram-ujemne oportunistyczne pałeczki, które izolowane są od chorych z obniżoną odpornością, w szczególności od pacjentów z chorobami nowotworowymi. Nie stanowią one naturalnej mikroflory człowieka. Występują w wilgotnym środowisku naturalnym, w glebie, ściekach, wodzie, kale zwierząt, na powierzchni roślin (zboże, tytoń, cytrusy), w produktach spożywczych (mleko, jaja, surowe ryby) (3). W warunkach szpitalnych mogą występować w środowisku wilgotnym w preparatach dezynfekcyjnych zawierających chlorheksydynę, respiratorach, nawilżaczach, kranach, zlewach, prysznicach (3). Są to prototrofy o niewielkich wymaganiach odżywczych. Rozkładają glukozę i maltozę w procesie oksydacji. Nie wytwarzają oksydazy cytochromowej oraz dekarboksylazy lizyny. Pałeczki te mają słabo poznane czynniki zjadliwości. Są to, między innymi, fimbrie typu 1, endotoksyna oraz enzymy takie, jak nukleazy, lipaza, proteaza, elastaza (3). Ponadto, mogą kolonizować biomateriały tworząc na nich biofilm (3, 6). Pałeczki S. maltophilia wykazują naturalną oporność na wiele grup antybiotyków, chemioterapeutyków i środków dezynfekcyjnych. Naturalna oporność na karbapenemy warunkowana jest wytwarzaniem beta-laktamaz L1 o charakterze karpapenemaz (3, 11). Wytwarzają cefalosporynazy L2 hydrolizujące penicyliny, monobaktamy oraz cefalosporyny I-III generacji. Wykazują oporność na aminoglikozydy jako efekt wytwarzania enzymów modyfikujących strukturę antybiotyku, tj. N-acetylotransferazy i O- nukleotydylotransferazy. Oporność na chinolony S. maltophilia uwarunkowana jest zmianami białek błony zewnętrznej, co wiąże się ze zmniejszeniem przepuszczalności osłon komórkowych dla tych leków

128 K. Hankiewicz-Ziołkowska, A. Mikucka, E. Gospodarek Nr 2 oraz zmianą sekwencji aminokwasów gyrazy i topoizomerazy IV (3, 12). Wielolekooporne szczepy S. maltophilia mają zazwyczaj kilka mechanizmów oporności takich, jak ograniczenie przepuszczalności osłon komórkowych, wytwarzanie enzymów inaktywujących lek oraz zdolność do aktywnego usuwania antybiotyku (1, 12). Liczne mechanizmy naturalnej oporności na różne antybiotyki i chemioterapeutyki sprzyjają występowaniu S. maltophilia w warunkach szpitalnych. Jak dotychczas udokumentowano ich udział w zakażeniach układu oddechowego, moczowo-płciowego, pokarmowego, ośrodkowego układu nerwowego, krwi, skóry i tkanki łącznej oraz narządu wzroku. Kolonizują układ oddechowy u chorych na mukowiscydozę (3, 5, 6). Celem badania była ocena częstości występowania i lekowrażliwości szczepów S. maltophilia w materiale pobranym od chorych hospitalizowanych w Szpitalu Uniwersyteckim nr 1 im. dr. A. Jurasza w Bydgoszczy w okresie trzech lat. MATERIAŁ I METODY Badaniem objęto 80 szczepów S. maltophilia izolowanych od chorych leczonych w Szpitalu Uniwersyteckim nr 1 im. dr. A. Jurasza w Bydgoszczy w okresie trzech lat. Szczepy hodowano na podłożu MacConkey Agar (Becton Dickinson) w temperaturze 37 C przez 20-24 godziny. Identyfikację do gatunku przeprowadzono na podstawie wyników reakcji biochemicznych ujętych w testach API 20NE (bio Mérieux), których odczytu dokonano w systemie komputerowym ATB Expression (bio Mérieux) z zastosowaniem bazy danych wersji V 2.4.7. Ocenę wrażliwości wykonano dla 19 antybiotyków i chemioterapeutyków: trimetoprimu/ sulfametoksazolu (1,25/23,75 μg), tikarcyliny z kwasem klawulanowym (75/10 µg), piperacyliny (100 μg), piperacyliny z tazobaktamem (100/10 µg), aztreonamu (30 µg), cefotaksymu (30 µg), cefoperazonu (75 µg), ceftazydymu (30 µg), cefepimu (30 µg), tetracykliny (30 µg), doksycykliny (30 µg), tigecykliny (15 μg), gentamicyny (10 µg), amikacyny (30 µg), netylmicyny (30 µg), tobramicyny (10 µg), kolistyny (50 µg), ciprofloksacyny (5 µg) i lewofloksacyny (5 µg). Dla lewofloksacyny ocenę wrażliwości wykonano metodą krążkowo-dyfuzyjną, a dla pozostałych leków - metodą Etest (AB Biodisc) oceniając wartość najmniejszego stężenia hamującego (ang. Minimal Inhibitory Concentration, MIC). Interpretację wyników przeprowadzono zgodnie z kryteriami CLSI (ang. Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI) i KORLD (Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów, KORLD) (10, 11). W interpretacji wartości uzyskanych dla tigecykliny posłużono się wytycznymi British Society for Antimicrobial Chemotherapy (2), proponowanymi dla Acinetobacter sp. ze względu na brak powyższych informacji w zaleceniach CLSI i KORLD (10, 11). WYNIKI Spośród 80 szczepów S. maltophilia 39 (48,8%) izolowano od chorych leczonych w Klinice Anestezjologii i Intensywnej Terapii z Pododdziałem Kardioanestezjologii, 19 (23,8%) w Klinice Chirurgii Dziecięcej, trzy szczepy w Klinice Dermatologii, po dwa szcze-

Nr 2 Lekowrażliwość S. maltophilia 129 py wyosobniono od chorych hospitalizowanych w Klinice Endokrynologii i Diabetologii, Klinice Neurologii, Klinice Transplantologii i Chirurgii Ogólnej, Klinice Chirurgii Ogólnej i Endokrynologicznej oraz Klinice Kardiochirurgii. Od chorych Kliniki Chirurgii Ogólnej i Naczyń oraz Neurochirurgii izolowano po jednym szczepie S. maltophilia (Ryc. 1). Ryc. 1. Pochodzenie szczepów S. maltophilia (n=80) Ryc. 2. Rodzaj materiału, z którego izolowano szczepy S. maltophilia (n=80)

130 K. Hankiewicz-Ziołkowska, A. Mikucka, E. Gospodarek Nr 2 Spośród 7 (8,8%) szczepów wyhodowanych z próbek materiału pobranego od pacjentów Poradni Przyklinicznych, trzy wyosobniono od chorych Poradni Kardiochirurgicznej (Ryc. 1). Spośród 80 badanych szczepów S. maltophilia 30 (37,5%) izolowano z popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelikowych (ang. broncho-alveolar lavage, BAL), 19 (23,8%) - z wymazów z miejsca operowanego i owrzodzeń oraz 10 (12,5%) - z wymazu ze stomii (Ryc. 2). Szczepy S. maltophilia wyhodowano w 50% monokulturze oraz w 50% w hodowli mieszanej. Gatunki najczęściej towarzyszące S. maltophilia zestawiono w tab. I. Materiałem, z którego najczęściej wyosobniono szczepy S. maltophilia w monokulturze, jak i w hodowli mieszanej były próbki BAL (Tabela I). Tabela I. Mikroflora towarzysząca izolacji szczepów S. maltophilia Gatunek Częstość izolacji mikroflory towarzyszącej w hodowli mieszanej Rodzaj materiału Pałeczki Gram-ujemne niefermentujące: Pseudomonas aeruginosa (n=10) Acinetobacter baumannii (n=4) Candida sp.: C. albicans (n=9) C. glabrata (n=1) C. krusei (n=1) C. parapsilosis (n=1) Enterococcus sp.: E. faecalis (n=9) E. faecium (n=1) Enterobacteriaceae: Enterobacter cloacae (n=3) Citrobacter freundii (n=2) Escherichia coli (n=2) Klebsiella planticola (n=1) Serratia odorifera (n=1) Staphylococcus sp.: S. aureus (n=3) S. epidermidis (n=1) 35,0% 30,0% 25,0% 22,5% 10,0% BAL Wydzielina z dróg oddechowych Wymaz z przetoki BAL Wydzielina z dróg oddechowych Wymaz ze stomii Cewnik naczyniowy Dren Wymaz ze stomii Wydzielina z dróg oddechowych BAL Spośród 80 badanych szczepów 67 (95,7%) wykazywało wrażliwość na lewofloksacynę, 57 (71,2%) - na trimetoprim/sulfametoksazol, 47 (58,7%) - na gentamicynę oraz 35 (51,5 %) - na tigecyklinę (Tabela II). Najwięcej szczepów wykazywało oporność na tetracyklinę - 74 (94,9%), po 75 (93,8%) - na aztreonam, piperacylinę i cefotaksym, 70 (87,5 %) - na cefepim, 69 (86,3%) - na piperacylinę z tazobaktamem oraz 47 (85,5%) szczepów na cefoperazon. Na tikarcylinę z kwasem klawulanowym oporność wykazywały 34 (42,5%) szczepy, a na trimetoprim/ sulfametoksazol - 23 (28,8%).

Nr 2 Lekowrażliwość S. maltophilia 131 Wielolekoopornością, która definiowana jest jako oporność szczepu na przynajmniej trzy grupy antybiotyków (11) charakteryzowało się 48 (60,0%) szczepów (Tabela II). Tabela II. Lekowrażliwość szczepów S. maltophilia na wybrane antybiotyki i chemioterapeutyki Antybiotyk/chemioterapeutyk Liczba szczepów Szczepy Oporne Średniowrażliwe Wrażliwe liczba % liczba % liczba % Trimetoprim/sulfametoksazol 80 23 28,8 0 0 57 71,2 Tikarcylina/kw. klawulanowy 80 34 42,5 22 27,5 24 30 Piperacylina 80 75 93,8 5 6,2 0 0 Piperacilina/tazobaktam 80 69 86,3 7 8,7 4 5 Aztreonam 80 75 93,8 1 1,2 4 6 Cefotaksym 80 75 93,8 4 5 1 1,2 Cefoperazon 55 47 85,5 2 3,6 6 10,9 Ceftazydym 80 55 68,8 5 6,2 20 25 Cefepim 80 70 87,5 8 10 2 2,5 Kolistyna 69 36 52,3 5 7,2 28 40.5 Tetracyklina 78 74 94,9 0 0 4 5,1 Doksycyklina 80 41 51,3 26 32,5 13 16,2 Tigecyklina 68 24 35,3 9 13,2 35 51,5 Gentamicyna 80 23 28,8 10 12,5 47 58,7 Tobramicyna 80 36 45 9 11,3 35 43,7 Amikacyna 80 32 40 14 17,5 34 42,5 Netylmicyna 80 28 35 12 15 40 50 Ciprofloksacyna 80 33 41,3 14 17,5 33 41,2 Lewofloksacyna 70 3 4,3 0 0 67 95,7 DYSKUSJA Pałeczki S. maltophilia najczęściej izolowano od chorych leczonych w Klinice Anestezjologii i Intensywnej Terapii z Pododdziałem Kardioanestezjologii oraz w Klinice Chirurgii Dziecięcej. Może to wynikać ze specyfiki Klinik Anestezjologii i Intensywnej Terapii oraz Chirurgii Dziecięcej, w której leczeni są chorzy w ciężkim stanie ogólnym, po rozległych zabiegach operacyjnych, których stan niejednokrotnie wymaga stosowania szerokozakresowej antybiotykoterapii. Wielolekoopornością charakteryzowało się 60% izolowanych szczepów S. maltophilia. Z piśmiennictwa (13) wynika, że jest to następstwo nadużywania przede wszystkim antybiotyków beta-laktamowych. Ponad 71% badanych szczepów wykazywało wrażliwość wobec trimetoprimu/sulfametoksazolu, który jest lekiem z wyboru w leczeniu zakażeń o etiologii S. maltophilia. Zgodnie z danymi z badania SENTRY z lat 1997-1999 (4), odsetek szczepów S. maltophilia opornych na trimetoprim/sulfametoksazol wynosił 2% w Kanadzie i Ameryce Łacińskiej, natomiast w Europie - 10%. Szczepy w badaniu SENTRY najczęściej izolowano z materiału z dolnych dróg oddechowych. Podobnie w badaniach własnych najwyższy odsetek szczepów izolowano z próbek BAL.

132 K. Hankiewicz-Ziołkowska, A. Mikucka, E. Gospodarek Nr 2 Prawie wszystkie badane szczepy wykazywały wrażliwość na lewoflokascynę. Ponadto, ponad 50% szczepów było wrażliwych na gentamicynę, netylmicynę, kolistynę. Natomiast poniżej 50,0% szczepów było wrażliwych na tobramicynę, amikacynę oraz ciprofloksacynę. Według Muder i wsp. (8) możliwość zastosowania leków innych niż leki pierwszego wyboru, zwiększa szansę przeżycia chorego. Zgodnie z uzyskanymi wynikami w badaniu własnym, mogą to być leki takie, jak kolistyna czy tigecyklina. Udowodniono, że na wzrost śmiertelności chorych, od których izolowano S. maltophilia wpływa wcześniejsze leczenie antybiotykami o szerokim zakresie działania, wydłużający się czas hospitalizacji, leczenie w oddziale intensywnej terapii, ciężka choroba podstawowa, wcześniejsza terapia karbapenemami, neutropenia, obecność linii centralnych oraz zakażenia mieszane (1). Morrison i wsp. (7) wykazali, że od zmarłych w 50% oprócz S. maltophilia wyosobniono mikroflorę towarzyszącą, a tylko w 30% szczepy S. maltophilia w monokulturze. Ansari i wsp. (1) podają, że pałeczki S. maltophilia w 46% izolowano w hodowli mieszanej. Inni autorzy również wykazali (7, 9), że pałeczki S. maltophilia w 50,0% wyodrębniane są z hodowli mieszanej, podobnie jak w badaniu własnym. Poważnym problemem staje się coraz częstsza izolacja z materiału klinicznego szczepów S. maltophilia oraz narastająca wśród nich oporność na antybiotyki i chemioterapeutyki, w tym na lek pierwszego wyboru w leczeniu zakażeń wywoływanych przez ten patogen, jakim jest trimetoprim/sulfametoksazol. Wzrost odsetka izolacji szczepów S. maltophilia odnotowano już na początku lat 70. ubiegłego wieku (4). Podobne wyniki uzyskano w Szpitalu Uniwersyteckim nr 1 im. dr. A. Jurasza w Bydgoszczy, chociaż w przyszłości należałoby objąć analizą szczepy S. maltophilia pochodzące z dłuższego okresu w powiązaniu z oceną zużycia karbapenemów w tym okresie. W przypadku izolacji szczepów S. maltophilia z materiału klinicznego trudnym zagadnieniem jest odróżnienie kolonizacji od zakażenia oraz zakażenia szpitalnego od pozaszpitalnego. Holmes i wsp. (wg 3) podają, że spośród 128 chorych tylko 6 wykazywało kliniczne objawy zakażenia. W innym badaniu (wg 3) spośród 68 tylko u 9 chorych występowały kliniczne objawy zakażenia. Jak dotychczas nie ustalono jasnych kryteriów pozwalających na odróżnienie kolonizacji szczepami S. maltophilia od zakażenia o tej etiologii. Ponadto, do niedawna uznawano S. maltophilia za patogen szpitalny, jednak coraz częściej izolowany jest także z przypadków zakażeń pozaszpitalnych (3). W badaniach własnych przypuszcza się, że pacjenci leczeni w Poradniach Przyklinicznych Szpitala Uniwersyteckiego nr 1 im. dr. A. Jurasza w Bydgoszczy, od których izolowano S. maltophilia skolonizowani byli szczepami szpitalnymi, jako efekt wcześniejszej hospitalizacji. Zwrócenie uwagi na izolację szczepów S. maltophilia, racjonalne stosowanie antybiotyków w leczeniu szpitalnym, w razie konieczności modyfikację schematów leczenia empirycznego, a także przestrzeganie zasad aseptyki i antyseptyki może przyczynić się do zmniejszenia liczby izolatów szczepów opornych, a także zmniejszenia częstości występowania zakażeń o etiologii S. maltophilia.

Nr 2 Lekowrażliwość S. maltophilia 133 PODSUMOWANIE 1. Szczepy S. maltophilia izolowano zarówno w monokulturze, jak i w hodowli mieszanej, głównie od chorych hospitalizowanych w Klinice Anestezjologii i Intensywnej Terapii z Pododdziałem Kardioanestezjologii i klinikach chirurgicznych. 2. Szczepy S. maltophilia najczęściej wyosobniano z popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelikowych, materiału ropnego oraz wymazów ze stomii. 3. W leczeniu zakażeń z udziałem szczepów S. maltophilia zastosować można lewofloksacynę, trimetoprim/sulfametoksazol, gentamicynę oraz tigecyklinę, gdyż najwięcej szczepów S. maltophilia wykazywało wrażliwość na te leki. Izolowane szczepy S. maltophilia w większości były wielolekooporne. K. Hankiewicz-Ziołkowska, A. Mikucka, E. Gospodarek CLINICAL STRAINS ISOLATION AND ANTIBIOTIC SUSCEPTIBILITY OF STENOTROPHOMONAS MALTOPHILIA SUMMARY Stenotrophomonas maltophilia is an opportunistic Gram-negative bacillus which is becoming increasingly recognized as an important nosocomial pathogen especially in debilitated or immune suppressed patients. S. maltophilia is found in a wide variety of environments. It has been isolated from a number of water sources, soil, variety of plants and food sources. S. maltophilia can form biofilm on synthetic materials for temporary or permanent implantation, i.e. central venous catheters, urinary catheters and prosthetic heart valves. In hospital the organism has been isolated from wet environments such as antiseptic fluids containing chlorhexidine, respiratory therapy equipment and air nebulizers. Little is known of the virulence factors of S. maltophilia. S. maltophilia is naturally resistant to many currently available broad-spectrum antimicrobial agents, including carbapenems. This study was carried out with the objective of evaluating clinical strains isolation and antibiotic susceptibility of S. maltophilia. A total of 80 clinical isolates of S. maltophilia were collected from individual patients, hospitalized at A. Jurasz University Hospital in Bydgoszcz, Poland. To identify S. maltophilia strains and receive biochemical profiles API 20 NE tests (bio Mérieux) ATB Expression computer system (bio Mérieux) with database V 2.4.7. were used. Antimicrobial agents susceptibility was evaluated for 19 different agents. For 18 out of 19 antimicrobial agent Etests (AB Biodisc) were used. For levofloxacine disc diffusion method was used. Most of analyzed strains were isolated from broncho-alveolar lavage (37,5%) from patients hospitalized in Intensive Care Unit (48,8%). 95,7% of isolated strains were susceptible to levofloxacine and 71,3% to trimethoprim/sulfametholxazole. 48 (60,0%) of S. maltophilia strains were identified as multi-drug resistant. PIŚMIENNICTWO 1. Ansari SR, Hachem R, Rolston K, Raad I i inni. Risk factors for infections with multidrug-resistant Stenotrophomonas maltophilia in patients with cancer. Cancer 2007; 109: 2615 22 2. BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 6). J Antimicrob Chemother 2007; 60: 20 41

134 K. Hankiewicz-Ziołkowska, A. Mikucka, E. Gospodarek Nr 2 3. Denton M, Kerr KG. Microbiological and clinical aspects of infection associated with Stenotrophomonas maltophilia. Clin Microbiol Rev 1998; 11: 57 80 4. Gales AC, Jones RN, Forward KR i inni. Emerging importance of multidrug-resistant Acinetobacter species and Stenotrophomonas maltophilia as pathogens in seriously ill patients: geographic patterns, epidemiological features and trends in the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program (1997 1999). Clin Infect Dis 2001; 32: 104 13 5. Khardori N, Elting L, Wong E, Schable B, Bodey GP. Nosocomial infections due to Xanthomonas maltophilia (Pseudomonas maltophilia) in patients with cancer. Rev Infect Dis 1990; 12: 997 1003 6. Micozzi A, Venditti M, Monaco M i inni. Bacteremia due to Stenotrophomonas maltophilia in patients with hematologic malignancies. Clin Infect Dis 2000; 31: 705 11 7. Morrison AJ, Hoffmann KK, Wenzel RP. Associated mortality and clinical characteristics of nosocomial Pseudomonas maltophilia in a university hospital. J Clin Microbiol 1986; 24: 52 5 8. Muder RR, Harris AP, Muller S i inni. Bacteremia due to Stenotrophomonas (Xanthomonas) maltophilia: a prospective, multicenter study of 91 episodes. Clin Infect Dis 1996; 22: 508 12 9. Penzak SR, Abate BJ. Stenotrophomonas (Xanthomonas) maltophilia: a multidrug-resistant nosocomial pathogen. Pharmacotherapy 1997; 17: 293 301 10. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; Sixteenth Informational Supplement. 2006; CLSI M100-S16 11. Rekomendacje doboru testów do oznaczania wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki 2009. Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów 12. Saino Y, Inoue M, Mitsuhashi S. Purification and properties of an inducible cephalosporinase from Pseudomonas maltophilia GN12873. Antimicrob Agents Chemother 1984; 25: 362 5 13. Sanyal SC, Mokaddas EM. The increase in carbapenem use and emergence of Stenotrophomonas maltophilia as an important nosocomial pathogen. J Chemother 1999; 11: 28 33 Otrzymano: 26 IV 2010 r. Adres Autora: 85-094 Bydgoszcz, ul. M. Curie-Skłodowskiej 9, Katedra i Zakład Mikrobiologii, Collegium Medicum im. Rydygiera w Bydgoszczy, Uniwersytet M. Kopernika w Toruniu