Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 48 (1) 2008 WSPÓŁZALEŻNOŚĆ POMIĘDZY ŹRÓDŁEM WODY I PORĄ ROKU A WYSTĘPOWANIEM PHYTOPHTHORA SP W ŚRODOWISKU LESZEK B. ORLIKOWSKI, MAGDALENA PTASZEK, ALEKSANDRA TRZEWIK, TERESA ORLIKOWSKA Instytut Sadownictwa i Kwiaciarstwa Pomologiczna 18, 96-100 Skierniewice leszek.orlikowski@insad.pl I. WSTĘP Gatunki rodzaju Phytophthora należą do najgroźniejszych patogenów roślin powodując zgniliznę korzeni i podstawy pędu, zarazę pędów, zgniliznę owoców i bulw. Występowaniem Phytophthora spp. w wodzie zainteresowano się już w latach 20. XX wieku (Bewley i Buddin 1921). W minionym 80-leciu opublikowano dziesiątki prac dotyczących tego zagadnienia, w tym głównie w USA. Podsumowaniem tych badań może być wniosek Hong i Moorman (2005), iż woda zakażona przez Phytophthora spp. jest głównym, jeśli nie jedynym, źródłem inokulum tej grupy patogenów w szkółkach, sadach i uprawach warzyw. Dwa lata wcześniej Kong i wsp. (2003) stwierdzili, że woda jest nie tylko ważnym źródłem Phytophthora spp., ale rozprzestrzenia tę grupę patogenów z miejsca wystąpienia fytoftorozy po całym terenie, jak również z określonego regionu geograficznego do innych krajów, a nawet kontynentów poprzez naturalny system cieków wodnych. Przy zastosowaniu różnych metod, w tym głównie roślin pułapkowych, w wodzie wykryto co najmniej 21 gatunków rodzaju Phytophthora. W badaniach Themann i wsp. (2002a) zastosowanie liści różanecznika dało możliwość wykrycia w zbiorniku wodnym 10 gatunków tego rodzaju oraz 21 niezidentyfikowanych izolatów. Podczas, gdy przy zastosowaniu sit oraz jabłek i siewek łubinu wykrywano 5 6 gatunków. Ta wysoka przydatność liści różanecznika w wykrywaniu Phytophthora w wodzie wiąże się z faktem, iż jest to roślina żywicielska dla 17 gatunków tego rodzaju. Na wykrywanie gatunków omawianego rodzaju bardzo duży wpływ ma źródło wody, pora roku, a także zmieniające się warunki w poszczególnych latach. Bardzo istotna jest również zawartość resztek nawozów i pozostałości pestycydów (Themann i wsp. 2002b). Celem badań było określenie składu gatunkowego Phytophthora oraz zmiany w liczebności jednostek propagacyjnych w rzece, kanale i zbiorniku wodnym w szkółce pojemnikowej roślin ozdobnych.
Źródło wody, okres badań i występowanie Phytophthora spp. 247 II. MATERIAŁ I METODY Źródło wody. Obiektem badań była rzeka w centralnej części Polski, przepływająca przez tereny ogrodnicze, w tym usytuowane w jej pobliżu szkółki roślin ozdobnych. Wcześniej, stwierdzono w nich występowanie cinnamomi i. W szkółce usytuowanej we wschodniej Polsce, obiektem badań był staw zasilany wodą spływającą z terenów wyżej położonych oraz kanał zbierający nadmiar wody ze szkółki i odprowadzający ją do innego zbiornika. Termin prowadzenia badań. Liście pułapkowe umieszczano w wodzie od marca do sierpnia 2007 roku w odstępach miesięcznych. Wykrywanie Phytophthora spp. w wodzie. W badaniach użyto jako pułapki liście różanecznika odmiany Nova Zembla, bardzo wrażliwej na Phytophthora spp. Liście pobierano z intensywnie rosnących wierzchołków pędów w przeddzień ich umieszczania w wodzie. Pędy zawierające co najmniej 6 liści, umieszczone na sznurku o 3 4 m długości, wrzucano do wody. Po 5 6 dniach pędy wyjmowano z wody, wkładano do worków foliowych i przewożono do laboratorium. Tego samego lub następnego dnia na opłukanych pod bieżącą wodą liściach określano liczbę nekrotycznych plam, następnie płukano je w wodzie destylowanej, osuszano pomiędzy warstwami bibuły filtracyjnej, odkażano nad płomieniem palnika i ok. 5 mm fragmenty wykładano na agar ziemniaczano-glukozowy (PDA) w szalkach Petriego o średnicy 90 mm. Po 1 2 dniach inkubacji w ciemności, w temp. 24ºC wyrastające wokół skrawków kolonie przeszczepiano na skosy. Po segregacji, wybrane izolaty oznaczano do gatunku na podstawie wzrostu i cech morfologicznych, a identyfikację potwierdzano stosując techniki molekularne (Trzewik i wsp. 2006). Kolonizacja tkanek roślin przez izolaty Phytophthora spp. z wody. Celem tych doświadczeń było stwierdzenie patogeniczności izolatów Phytophthora spp. w stosunku do liści i części jednorocznych łodyg brzozy (Betula pendula) i olszy czarnej (Alnus glutinosa). Do inokulacji użyto izolaty cinnamomi z rzeki, ze stawu i citrophthora z kanału. Doświadczenia założono w kuwetach wyłożonych wilgotną, sterylną bibułą filtracyjną, przykrytą cienką, nylonową siatką. Na środek liści i u nasady łodygi nanoszono krążki inokulum 3 gatunków Phytophthora pobranych z brzegów kolonii 7-dniowych kultur, rosnących na PDA w ciemności, w temp. 24ºC. Tace przykrywano folią i inkubowano w ciemności, w temp. 22 24ºC. Po 6 dniach mierzono średnicę i długość nekrozy. Doświadczenia założono w układzie bloków losowych w 4 powtórzeniach po 10 liści i części łodyg, powtórzono 2-krotnie, a w tabeli 3. podano średnie z 2 serii badań. III. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Zastawianie pułapek z liści różanecznika od marca do sierpnia włącznie powodowało, że w każdym terminie po 5 6 dniach inkubacji w wodzie, na blaszkach liściowych stwierdzano pojawianie się nekrotycznych plam (tab. 1). Nie obserwowano ich, gdy liście wrzucano do wody ze studni głębinowej i wody wodociągowej. W badanej szkółce, na uprawianych roślinach, stwierdzono występowanie cambivora, cinnamomi,, citrophthora i cryptogea.
248 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 48 (1) 2008 Badania współzależności pomiędzy źródłem wody, terminem zastawiania pułapek liściowych a liczbą plam na blaszkach jako miernika występowania i liczebności Phytophthora wskazały na następujące uwarunkowania: nie stwierdzono istotnych różnic pomiędzy źródłem wody (rzeka, staw i kanał w szkółce) a liczbą nekrotycznych plam na liściach. Średnia liczba plam wahała się od 11,6 do 13,4. stwierdzono istotne różnice pomiędzy terminem zastawiania liści pułapkowych w wodzie, a liczbą plam na liściach. Najwięcej nekrotycznych plam stwierdzano na blaszkach w kwietniu i w maju, a najmniej w czerwcu (tab. 1). Również w lipcu liczba plam na liściach była znacznie niższa aniżeli w okresie marzec maj (tab. 1). W badaniach Themann i wsp. (2002b) najwięcej izolatów Phytophthora stwierdzono w lutym, marcu i lipcu, a najmniej w sierpniu i październiku. Autorzy wykrywali rzadko lub bardzo rzadko cinnamomi i, a bardzo często gonapodyides, cryptogea i drechsleri. Niższą latem aniżeli zimą i wiosną izolację Phytophthora spp. autorzy tłumaczą częstym pobieraniem wody ze zbiorników i ich uzupełnianie wodą ze studni głębinowych. Prowadzi to do rozcieńczania skażonej wody i drastycznego spadku liczebności tej grupy patogenów. Znaczny wpływ na zmniejszenie liczebności Phytophthora spp. w zbiornikach wodnych mogą mieć pozostałości fungicydów, stosowanych do ochrony upraw przed fytoftorozą i spływające z nadmiarem wody do stawów czy basenów (Themann i wsp. 2002b). Tabela 1. Współzależność pomiędzy źródłem wody, terminem wykorzystywania pułapek a liczbą nekrotycznych plam na liściach różanecznika Table 1. Relantionship between source of water, surveying time and number of spots on rhododendron leaf baits Źródła wody Sources of water Rzeka River Staw w szkółce Water pond Kanał w szkółce Nursery canal Miesiące badań Months of surveying III IV V VI VII VIII 15,5 b-e 22,5 e 16 c-e 5,3 a 12,8 a-e 8,3 a-d 14,5 a-e 13,0 a-e 15,3 c-e 6,5 a-c 8,5 cd 11,0 a-d 11,0 a-d 15,5 b-e 17,3 de 11,3 a-d 5,8 ab 17,5 de Średnie w kolumnach oznaczone tą samą literą nie różnią się istotnie (5%) wg testu Duncana Means in columns, followed by the same letter, do not differ according to Duncan s test at p = 0.05 Analiza składu gatunkowego Phytophthora spp. w wodzie wymaga jeszcze czasu na identyfikację wszystkich, uzyskanych izolatów. To problem nie tylko tych badań, gdyż wielu badaczy, w tym Hansen i Delatour (1999) oraz Themann i wsp. (2002a, b) nie oznaczyli wszystkich izolatów uzyskanych z wody do gatunku. W rzece, stawie i kanale w szkółce stwierdzono występowanie począwszy od maja do sierpnia. cinnamomi wykrywano również w 3 źrodłach wody, przy czym w rzece i stawie w marcu, a w kanale w czerwcu. Gatunek citrophthora zidentyfikowano tylko w kanale na liściach pułapkowych zastawionych w czerwcu (tab. 2). Wykrywanie Phytophthora spp. w wodzie koresponduje z obecnością gatunków tego rodzaju w szkółkach. Obecność
Źródło wody, okres badań i występowanie Phytophthora spp. 249 cinnamomi i w rzece jest zapewne powiązana z występowaniem tych gatunków na porażonych roślinach wrzosowatych (Orlikowski i Szkuta 2002a, b, 2005; Sroczyński i Skrzypczak 2008), których zarodniki pływkowe mogły być przenoszone z nadmiarem spływającej wody do cieku wodnego. Z kolei w drugiej szkółce notowano na porażonych roślinach iglastych (Orlikowski i Szkuta 2002c), a citrophthora na lilakach i pierisie (Orlikowski i Szkuta 2002a, 2005). Razem z resztkami podłoża, częściami porażonych roślin, niesionymi przez nadmiar wody wypływającej z podlewanych pojemników, gatunek ten oraz dostają się do kanału, a następnie do stawu. Gromadzona woda, użyta wielokrotnie do spryskiwania roślin w okresie wegetacji jest źródłem zoospor, które w sprzyjających warunkach infekują młode, niezdrewniałe części pędów, powodując ich zamieranie (Orlikowski i wsp. 2007). Tabela 2. Izolacja Phytophthora spp. z wody w zależności od źródła i terminu wykorzystywania pułapek Table 2. Isolation of Phytophthora spp. from water in relation to source of water and surveying time Źródła wody Miesiące badań Months of surveying Sources of water III IV V VI VII VIII Rzeka River Staw w szkólce Nursery pond Kanał w szkółce Nursery canal cinnamomi cinnamomi cinnamomi citrophthora Doświadczenia nad kolonizacją brzozy i olszy przez 3 gatunki Phytophthora wykazały, że zasiedlają one zwłaszcza liście powodując powstawanie na nich nekrotycznych plam. Na brzozie plamy, powodowane przez cinnamomi i, rozwijały się średnio 5,7 mm na dobę (tab. 3). Na liściach olszy nekroza rozwijała się podobnie, jak na brzozie, gdy blaszki zainokulowano gatunkiem, a około 2-krotnie wolniej, gdy do zakażenia użyto cinnamomi i citrophthora (tab. 3). Na częściach jednorocznych łodyg brzozy zainokulowanych gatunkiem, nekroza rozwijała się 2-krotnie szybciej (ok. 2 mm na dobę) aniżeli w przypadku 2 innych gatunków. Na łodygach olszy badane gatunki powodowały kolonizację tkanek z szybkością ok. 2,7 mm na dobę (tab. 3).
250 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 48 (1) 2008 Tabela 3. Kolonizacja liści (a) i części łodyg (b) brzozy i olszy przez izolaty Phytophthora spp. uzyskane z wody w 2007 roku Table 3. Colonisation of leaves (a) and stem fragments (b) of birch and alder by Phytophthora isolates Gatunki Phytophthora Phytophthora species Średnica/długość nekrozy w mm po 6 dniach inkubacji Diam/length of necrosis [mm] after 6-day-incubation brzoza birch olsza alder cinnamomi 32,3 b 6,0 a 17,0 ab 19,5 a 34,8 b 12,5 b 32,8 c 13,8 a citrophthora 20,0 a 5,5 a 11,8 a 16,0 a Średnie w kolumnach oznaczone tą samą literą nie różnią się istotnie (5%) wg testu Duncana Means in columns, followed by the same letter, do not differ according to Duncan s test at p = 0.05 Brzoza i olsza należą do drzew często lub bardzo często rosnących nad brzegami cieków wodnych i wód stojących. Opadające do wody liście lub części pędów stanowią źródło energii dla Phytophthora spp. Z zamierających siewek brzozy izolowano głównie cactorum i (Oszako i Orlikowski, niepublik.), podczas gdy z olszy również alni i cambivora (Orlikowski i Oszako 2005). Na porażonych tkankach w wodzie tworzą się bardzo licznie zarodnie pływkowe, z których nawet przy niewielkich wahaniach temperatury uwalniają się zarodniki pływkowe, główne źródło Phytophthora spp. w ciekach wodnych (Hansen i Delatour 1999). Porażone tkanki, opadające na dno cieków i zbiorników wodnych, są miejscem przetrwalnikowania Phytophthora spp. Badania (Orlikowski i wsp., niepublik.) wykazały występowanie niektórych gatunków tego rodzaju w osadach dennych. IV. PODSUMOWANIE WYNIKÓW 1. Uzyskane dane wskazały na występowanie Phytophthora spp. w rzece oraz w stawie i kanale w szkółce począwszy od marca do sierpnia. 2. Nie stwierdzono różnic w liczebności Phytophthora spp. w zależności od źródła wody, ale większą liczbę plam na liściach pułapkowych notowano w kwietniu i maju, a najmniej w czerwcu. 3. Spośród zidentyfikowanych już gatunków Phytophthora najczęściej wykrywano, a rzadko cinnamomi i citrophthora. 4. Wyszczególnione gatunki kolonizowały liście i części łodyg brzozy i olszy, przy czym nekroza rozwijała się znacznie szybciej na blaszkach brzozy. Na liściach olszy zainokulowanych przez, nekroza rozwijała się około 2-krotnie szybciej aniżeli w przypadku 2 pozostałych gatunków użytych do zakażenia. 5. Jest bardzo prawdopodobne, że liście i najmłodsze części pędów, opadające do wody, są źródłem energii dla Phytophthora spp., a także miejscem ich przetrwalnikowania. V. LITERATURA Bewley W.F., Buddin W. 1921. On the fungus flora of greenhouse water supplies in relation to plant disease. Ann. Appl. Biol. 8: 10 19.
Źródło wody, okres badań i występowanie Phytophthora spp. 251 Hansen E., Delatour C. 1999. Phytophthora species in oak forests of north-east France. Ann. For. Sci. 56: 539 547. Hong C.X., Moorman G.W. 2005. Plant pathogens in irrigation water: challenges and opportunities. Rev. Plant Sci. 24: 189 208. Kong, Hong C.X., Jeffers S.N., Richardson A. 2003. A species specific polymerase chain reaction assay for rapid detection of Phytophthora nicotianae in irrigation water. Phytopathology 93: 822 831. Orlikowski L.B., Oszako T. 2005. Phytophthora cambivora on Alnus glutinosa; isolation and colonization of plants. J. Plant Protection Res. 45: 235 240. Orlikowski L.B., Szkuta G. 2002a. Dieback of pieris caused by Phytophthora citrophthora. Acta Mycol. 36: 251 256. Orlikowski L.B., Szkuta G. 2002b. Fytoftorozy w szkółkach roślin ozdobnych. Prace IBL, s. A, 2: 134 137. Orlikowski L.B., Szkuta G. 2002c. First notice of Phytophthora tip blight of Picea omorika and Thuja occidentalis in Poland. Phytopathol. Pol. 28: 63 67. Orlikowski L.B., Szkuta G. 2005. Occurrence of Phytophthora citrophthora on Syringa vulgaris in Poland. Acta Mycol. 40: 175 180. Orlikowski L.B., Trzewik A., Orlikowska T. 2007. Water as potential source of Phytophthora. J. Plant Protection Res. 47: 125 132. Sroczyński M., Skrzypczak Cz. 2008. Zwalczanie Phytophthora spp. w nasadzeniach roślin wrzosowatych. Prog. Plant Protection/Post. Ochr. Roślin 48, w druku. Themann K., Werres S., Diener H.A., Luttmann R. 2002a. Comparison of different methods to detect Phytophthora spp. in recycling water from nurseries. J. Plant Pathol. 84: 41 50. Themann K., Werres S., Luttmann R., Diener H.A. 2002b. Observations of Phytophthora spp. in water recirculation systems in commercial hardy ornamental nursery stock. Europ. J. Plant Pathol. 108: 337 343. Trzewik A., Wiejacha K., Orlikowski L.B., Szkuta G., Orlikowska T. 2006. The identification of five Phytophthora species on the basis of DNA markers obtained via the PCR technique with nonspecific primers. Phytopathol. Pol. 41: 27 37. LESZEK B. ORLIKOWSKI, MAGDALENA PTASZEK, ALEKSANDRA TRZEWIK, TERESA ORLIKOWSKA RELATIONSHIP BETWEEN SOURCE OF WATER, SURVEYING TIME AND OCCURRENCE OF PHYTOPHTHORA SP SUMMARY Using of rhododendron leaves as baits Phytophthora spp. were isolated from river, nursery water pond and canal. There were no significant differences between source of water and number of necrotic spots of rhododendron leaves as the measure of Phytophthora density. Among already identified species was detected the most often from 3 sources of water whereas cinnamomi in nursery pond and canal in March and May and citrophthora only in nursery canal in June. The lowest number of spots/leaf was observed in June and about twice more in March and April. Three Phytophthora species colonized leaves and 1-year-old stem parts of birch and alder with the quickest development of necrosis on leaf blades of birch. It is possible that parts of birch and alder are the source of Phytophthora in water and place of pathogen surviving. Key words: river, pond, canal, bait, Phytophthora, detection, density, colonization