Część teoretyczna: Mikrobiologia II rok Towaroznawstwo i Dietetyka Ćwiczenie 7 I. GRZYBY STRZĘPKOWE (KRÓLESTWO: Fungi) A. Sprzężniaki (Zygomycota) cechy charakterystyczne: - grzybnia wielojądrowa, - brak przegród poprzecznych (sept), - rozmnażanie wegetatywne przez zarodniki (spory), powstające w zarodniach (sporangium), tworzonych na specjalnych strzępkach trzonkach zarodnionośnych (sporangioforach), - charakterystyczny element strukturalny zarodni kolumella, - rozmnażanie płciowe połączenie gametangiów męskich i żeńskich, tworzy się zygota, przedstawiciele: Rodzaj Mucor grzybnia wysoka przejrzysta, początkowo biała później szarzejąca, nazywane drożdżami mukorowymi fermentują cukry wytwarzając w środowiskach płynnych ok. 7% etanolu, występują jako zanieczyszczenia powietrza w mleczarniach, mogą powodować wady masła (silne właściwości lipolityczne), Rodzaj Rhizopus jasnoszare murawki o luźnej strukturze, brzeżne strzępki w zetknięciu z powierzchnią stałą tworzą rozgałęzione chwytniki (ryzoidy), są bardzo rozpowszechnione, przyczyniają się do psucia owoców, wady niektórych serów, występują jako zanieczyszczenie żywności, są przyczyną psucia się mięsa przechowywanego w chłodni, są zdolne do wytwarzania mykotoksyn, 1
B. Inne grzyby strzępkowe: - septowana, wielokomórkowa grzybnia, często rozgałęziona - mogą tworzyć się artrokonidia, lub oidia, - formą przetrwalną są chlamydospory jedno lub wielokomórkowe, powstające w wyniku przekształcenia strzępek lub konidiów wielokomórkowych, Najważniejsze rodzaje Rodzaj Aspergillus charakteryzuje się główkowatym zakończeniem konidioforu, tworzącym się na strzępkach powietrznych (aparat konidialny), niektóre gatunki mają stadium płciowe tworząc zarodniki workowe, rozpowszechnione w przyrodzie, Najliczniej występują w glebie, rozwijają się na resztkach roślinnych i zwierzęcych, znanych jest ponad 150 gatunków, wśród których są odmiany odpowiedzialne za psucie się żywności, skór, drewna i papieru, liczne gatunki są patogenne dla ludzi i zwierząt. U nielicznych gatunków tego rodzaju wykryto stadia płciowe, które tworzą zarodniki workowe. A. niger wytwarza kwas cytrynowy wykorzystywany w przemyśle. A. flavus wytwarza aflatoksynę, która może powodować nowotwory wątroby, zanieczyszcza produkty żywnościowe, jak np. orzeszki ziemne. Rodzaj Penicillium - pędzelkowate konidiofory, powstające przez rozgałęzienie strzępka konidionośnego, konidia są z łatwością przenoszone przez wiatr, dzięki czemu są wszechobecne w środowisku, jako typowe sąprofity, aktywnie uczestniczą w rozkładzie materii organicznej, są przyczyną psucia się zarówno surowców roślinnych podczas ich magazynowania oraz produktów spożywczych, liczne szczepy wytwarzają mykotoksyny: głównie aflatoksyny, ochratoksynę A i patulinę. Gatunki z rodzaju Penicillium wytwarzają również liczne antybiotyki, np. penicylina jest wytwarzana przez Penicillium chrysogenum. Rodzaj Fusarium tworzy obfitą grzybnię o jasnych barwach od spodu zabarwioną pomarańczowo, czerwono lub fioletowo, znane są dwa rodzaje konidiów makrokonidia, wielokomorowe o rogalikowatym kształcie oraz jednokomórkowe, owalne lub elipsoidalne mikrokonidia, są powszechnie występującymi sąprofitami bytującymi w glebie i na szczątkach roślinnych, liczne są pasożytami roślin. Wytwarzają enzymy hydrolizujące pektyny. Wiele gatunków wytwarza bardzo silne toksyny, które mogą wywoływać śmiertelne zatrucia u ludzi. Niektóre gatunki z tego rodzaju są anamorfami grzybów Giberella. 2
Rodzaj Botrytis charakteryzuje się wełnistą grzybnią jasnoszarą lub oliwkowobrunatną z szarą warstwą konidiów. Konidiofory są proste, septowane, rozgałęzione na końcu, kończą się pęcherzykami z blastokonidiami na ich powierzchni. Powszechnie występują w przyrodzie, spełniając ważną rolę w procesie biodegradacji celulozy i pektyn w warunkach naturalnych, są sąprofitami, ale w pewnych warunkach występują jako organizmy patogenne, na owocach identyfikowana jest jako tzw. szara pleśń. Rodzaj Alternaria tworzy grzybnię aksamitną, wełnowatą, ciemnoszarą i oliwkową, z wydzielanym do podłoża czarnym pigmentem, konidia są duże, wielokomorowe (podziały poprzeczne i podłużne) o szerszej podstawie, brunatne, ostatnia komórka wypączkowuje nowe konidium, co w rezultacie daje ich łańcuchy, grzyby te występują pospolicie jako saprofity i pasożyty roślin, są przyczyną psucia owoców powodując mięknięcie tkanki i wyciek soku, są zdolne do wytwarzania mykotoksyn. Powszechne w powietrzu alergie. Rodzaj Cladosporium tworzy grzybnie początkowo białą, później przybierającą czarne lub oliwkowe zabarwienie, konidia są wielokomórkowe (przegroda tylko poprzeczna) lub jednokomórkowe, cylindryczne, lub o kształcie cytryny, zakończone tępo, o zabarwieniu oliwkowym, są sąprofitami materiału roślinnego, żywności, tekstyliów i materiałów gumowych, niektóre gatunki produkują toksyczne metabolity. Częste w powietrzu (alergie u ludzi). 3
Rodzaj Geotrichum tworzy grzybnie niską, gładką o zabarwieniu białym, cylindryczne lub elipsoidalne artrokonidia (oidia) powstają w łańcuchach na szczytach strzępek w wyniku rozpadu, jest uciążliwym mikroorganizmem w przemyśle mleczarskim i przy produkcji kiszonek, powoduje rozkład kwasu mlekowego (odkwaszanie). Rodzaj Trichoderma tworzy kolonie przejrzyste, szybko rozprzestrzeniające się, płaskie i nieregularne. Konidiofory są rozmieszczone nierównomiernie na powierzchni kolonii, ale w określonych jej strefach, są silnie rozgałęzione, z osią centralną - tworzą kształt drzewka. Fialidy są kształtu butelkowatego, na ich końcach umieszczone są w grupach konidia, zwykle zielone, czasami szkliste. Mikroorganizmy te charakteryzują się silnymi właściwościami celulolitycznymi, często występują na roślinach, mogą wywoływać zgniliznę artykułów żywnościowych w magazynach. W rolnictwie wykorzystywane jako naturalny środek biologiczny do ochrony nasion - działa antagonistycznie w stosunku do innych grzybów glebowych. Dla niektórych gatunków znane są stadia teleomorficzne, np. Trichoderma viride stanowi stadium konidialne workowca Hypocrea rufum. II. MYKOTOKSYNY Są toksycznymi metabolitami wtórnymi grzybów (pleśni), należących przede wszystkim do rodzajów Aspergillus, Penicillium i Fusarium. Mogą powstawać w wielu produktach rolnych i w bardzo różnych warunkach. Mykotoksyny mają różnorodne działania toksyczne oraz charakteryzują się wysoką odpornością na temperaturę i dlatego ich obecność w żywności i paszach niesie ze sobą potencjalne zagrożenie dla zdrowia zarówno ludzi jak i zwierząt. 4
Główne grupy mykotoksyn MYKOTOKSYNY Aflatoksyny B 1, B 2, G 1, G 2 i M 1 Ochratoksyna A Patulina PRODUCENT Aspergillus flavus, A. parasiticus, A. nomius Penicillium verrucosum, Aspergillus alutaceus Penicillium expansum, Aspergillus clavatus, Byssochlamys nivea Fumonizyny Fusarium moniliforme, F. proliferatum Deoksywalenon Fusarium graminearum, F. culmorum, F. crookwellense, F. sporotrichoides, F. poae, F. acuminatum Zearalenon Fusarium graminearum, F. culmorum, F. crookwellense Liczne gatunki pleśni klasy Ascomycetes wytwarzają mykotoksyny, np. ochratoksyny, aflatoksyny, patulinę, kwas penicylinowy, cytryninę. Ochratoksyny są wytwarzane przez kilka szczepów grzybów rodzaju Aspergillus i Penicillium. Grzyby te są wszechobecne i stanowią duże zagrożenie zakażenia żywności i pasz. Ochratoksyna A należy do najbardziej rozpowszechnionych związków i stwierdzono jej występowanie w ponad 10 krajach Europy i USA. Wytwarzanie ochratoksyny przez grzyby rodzaju Aspergillus (Aspergillus ochraceus) jest ograniczone i następuje w warunkach wysokiej wilgotności i podwyższonej temperatury, podczas gdy co najmniej kilka szczepów Penicillium (Penicillium viridictum) może wytwarzać ochratoksynę w niskiej temperaturze, w granicach 5 C. Aflatoksyny są produkowane przez niektóre rodzaje A. flavus i większość, lecz nie wszystkie, rodzaje A. parasiticus. Istnieją cztery główne aflatoksyny: B 1, B 2, G 1, G 2. Mają zdolność fluorescencji w świetle UV. Aflatoksyny mogą znajdować się w mleku, serze, ziarnach zbóż, orzeszkach ziemnych, nasionach bawełny, orzechach, migdałach, figach, przyprawach oraz różnych innych produktach żywnościowych i paszach. Obecność toksyn w mleku, jajach i mięsie wynika z faktu, że zwierzęta spożywały zanieczyszczoną paszę. Jednak największe ryzyko skażenia toksynami występuje w takich produktach jak ziarno kukurydzy, orzeszki ziemne oraz nasiona bawełny. Patulina jest toksycznym metabolitem wtórnym niektórych gatunków grzybów, zarówno z rodzaju Aspergillus, Penicillium, jak i Byssochlamys nivea. Wśród wyżej wymienionych grzybów pleśniowych najważniejszym gatunkiem, który powszechnie skaża jabłka i inne owoce jest Penicillium expansum. P. expansum jest często izolowany z ziemi, która zanieczyszcza powierzchnie zdrowych tkanek owoców. Tym niemniej, porost pleśni i towarzysząca mu produkcja patuliny, normalnie zachodzą tylko w następstwie uszkodzenia powierzchni owocu, które może być spowodowane przez owady i/lub burze oraz w toku obróbki. W warunkach laboratoryjnych patulina może być produkowana przez wiele różnych grzybów pleśniowych na jabłkach, winogronach, zbożach i nawet produktach przetrzymywanych w lodówce, takich jak żółty ser i konserwowane mięsa, ale w warunkach naturalnych znana jest przede wszystkim jako substancja skażająca jabłka i sok jabłkowy. III. INFORMACJE DODATKOWE Ważne pojecia: Teleomorf: stadium rozmnażania płciowego, zwykle o kształcie owocnika Anamorf: stadium rozmnażania bezpłciowego, często pleśnio-podobne Synanamorfy: liczne morfologicznie różne stadia bezpłciowe wytwarzane przez jednego grzyba Holomorf: cały grzyb obejmujący zarówno stadium teleomorficzne, jak i anamorficzne. Grzyby klasyfikuje się głównie na podstawie budowy struktur związanych z rozmnażaniem płciowym. Jednakże, liczne grzyby rozmnażają się tylko bezpłciowo i nie da się ich umiejscowić w takiej klasyfikacji. Inne gatunki wytwarzają zarówno stadia płciowe, jak i bezpłciowe. Do takich 5
problematycznych gatunków należą przede wszystkim członkowie Ascomycota (workowce), ale także niektóre z Basidiomycota (podstawczaki). Ponadto wśród grzybów, które rozmnażają się i płciowo i bezpłciowo, często jeden ze sposobów rozmnażania może być obserwowany jedynie w ściśle określonych warunkach bądź punkcie czasowym. To sprawia, że często trudno jest skojarzyć ze sobą różne stadia tego samego gatunku grzyba. Jedynie analiza molekularna genomu pozwala na prawidłowe klasyfikowanie grzybów w jednostki ze sobą spokrewnione. W chwili obecnej artykuł 59 Międzynarodowego Kodeksu Nomenklatury Botanicznej pozwala mikologom na stosowanie podwójnego nazewnictwa ( dual nomenclature ), tzn. grzybom rozmnażającym się bezpłciowo (anamorfy) nadaje się inną nazwę niż ich płciowym odpowiednikom (teleomorfy). Jeśli znane jest zarówno stadium anamorficzne, jak i teleomorficzne tego samego grzyba mówimy, że jest on holomorfem, i nazwa stadium płciowego jest ważniejsza niż nazwa stadium bezpłciowego. Np. u powszechnej i ważnej w przemyśle pleśni Aspergillus niger nie wykryto cyklu płciowego. Dlatego Aspergillus niger jest uznawany za jednostkę taksonomiczną. Natomiast, blisko z nim spokrewniony Aspergillus nidulans, ma stadium płciowe nazwane Emericella nidulans. I ta druga nazwa jest uznawana za prawidłową. Grzyby, o których wiadomo, że wytwarzają tylko stadia anamorficzne, były dotąd umiejscawiane w sztucznie wydzielonym typie Deuteromycota (Fungi Imperfecti). Obecnie termin ten jest używany nieformalnie do określania gatunków grzybów, które są rozmnażającymi się bezpłciowo członkami typów Ascomycota i Basidiomycota. Deuteromycota liczy ok. 25 000 gatunków. Część praktyczna: 1. Odczyt wyników z testów fermentacyjnych Wszystkie doświadczenia wykonujemy w warunkach sterylnych! a) obserwować zmiany w hodowlach płynnych (zmętnienie pożywki lub jej brak, osad, pierścień, obecność lub brak pęcherzyka gazu w rurce Durhama i jego wielkość) b) zmiany dla obu cukrów i różnych drożdży wpisać do tabeli (na ćwiczeniach). c) tabelę z wynikami i ich interpretację umieścić w sprawozdaniu 2. 2. Odczyt wyników z testów asymilacyjnych a) obserwować zmiany w hodowlach płynnych (zmętnienie pożywki lub jej brak, osad, pierścień) b) zmiany dla różnych źródeł węgla i azotu oraz różnych drożdży wpisać do tabeli (na ćwiczeniach). c) tabelę z wynikami i ich interpretację umieścić w sprawozdaniu 2. 3. Analiza pleśni a) obserwować morfologię przygotowanych na szalkach Petriego hodowli grzybów pleśniowych (Rhizopus, Aspergillus, Penicillium, Alternaria, Geotrichum, Fusarium) b) z każdej hodowli przygotować preparat przyżyciowy na odtłuszczone szkiełko podstawowe nanieść kroplę płynu Lugola, za pomocą igieł mikrobiologicznych lub pęsety pobrać pleśń wyrywając ją delikatnie z pożywki, umieścić w kropli płynu Lugola, przykryć szkiełkiem nakrywkowym i oglądać pod powiększeniem obiektywu 10 i 40x c) schematyczne rysunki wszystkich pleśni opisać i umieścić wraz z omówieniem w sprawozdaniu 2. 6