Skrót sprawozdania z pracy badawczo-rozwojowej wykonanej w Wydziale Biologii Centralnego laboratorium Kryminalistycznego Komendy Głównej Policji w Warszawie, w ramach projektu celowego KBN Locus, pod kierunkiem prof. dr. hab. Andrzeja Płucienniczaka 1, na temat: Badania kryminalistyczne z wykorzystaniem dziesięciu niekodujących układów STR, obejmujących reprezentatywną część populacji polskiej. Stworzenie możliwości identyfikacji genetycznej sprawców przestępstw. Warszawa 2002 r. 1 Instytut Biotechnologii i Antybiotyków w Warszawie, Warszawa, ul. Starościńska 5. BADANIA POPULACYJNE Kryminalistyczna analiza DNA jest analizą porównawczą. W przypadku porównywania śladu biologicznego z materiałem porównawczym, tj. pobranym od konkretnej osoby, brak zgodności profili DNA w którymkolwiek z badanych loci wyklucza pochodzenie DNA wyizolowanego ze śladu od tej osoby. W przypadku zgodności profili DNA w każdym z badanych loci, ekspert musi ocenić, jakie jest prawdopodobieństwo wystąpienia zaistniałej zgodności w określonej populacji ludzkiej. Przedstawiana w opiniach wartość prawdopodobieństwa poddawana jest ocenie sądu i stanowi o sile zebranego w sprawie materiału dowodowego. Wartość ta jest zależna od liczby zdefiniowanych loci i częstości występowania w danej populacji oznaczonych alleli. W standardowych wyliczeniach statystycznych wykorzystuje się dane populacyjne, opracowane dla poszczególnych grup rasowych lub etnicznych danego kraju, którego sprawa karna dotyczy. Celem pracy było zbadanie i ustalenie częstości alleli dziesięciu loci STR (SGM plus) w populacji polskiej oraz wykazanie, że dane te, wyliczone na podstawie przebadanej próby populacyjnej, mogą stanowić bazę służącą do statystycznej oceny profili DNA osób identyfikowanych w sprawach karnych.
Pobieranie materiału Materiał do badań populacyjnych stanowiły komórki nabłonkowe jamy ustnej, pobrane sterylnymi wymazówkami (HAGMED- Zakład Tworzyw Sztucznych i Wyrobów dla Medycyny w Rawie Mazowieckiej), od dobrowolnych dawców. W celu uzyskania próby reprezentatywnej dla polskiej populacji, uwzględniając homogenność rasową populacji polskiej, kompletowanie wymazów odbywało się według wstępnie określonych założeń, a mianowicie: z wyłączeniem osób blisko spokrewnionych i osób o innej niż rasa biała kaukaska przynależności rasowej, z uwzględnieniem całego obszaru Polski, przyjmując miejsce urodzenia za kryterium przynależności terytorialnej. Przygotowanie próbek do badań Zebrane do badań wymazy grupowano w partie po 30 sztuk. Każdy z wymazów dzielono na dwie części, z których jedną przeznaczano do badań populacyjnych a drugą do ewentualnego powtórzenia. Izolowanie DNA Przeznaczone do badań populacyjnych wymazy poddawano ekstrakcji DNA metodą absorpcji-elucji, przy użyciu gotowego zestawu QIAamp DNA Mini Kit firmy QIAGEN (nr katalogowy 51306), według protokołu podanego przez producenta zestawu. Ekstrakcję przeprowadzano w partiach, po 30 próbek w każdej. Dla sprawdzenia prawidłowości procesu ekstrakcji, do każdej partii dołączano dwie próby kontrolne- kontrolę dodatnią, którą stanowił wymaz o znanym profilu DNA, pochodzący od personelu laboratoryjnego i kontrolę negatywną jako kontrolę sterylności procesu. Amplifikacja DNA Proces amplifikacji, czyli powielania fragmentów DNA wykonywano metodą multipleksowej reakcji PCR, przy użyciu gotowego zestawu odczynników- AmpFlSTR SGM Plus firmy Applied Biosystems (nr katalogowy 4307133). Reakcję przeprowadzano w partiach, po 30 próbek w każdej, w aparatach GeneAmp PCR System 9700 tej samej firmy, zaprogramowanych zgodnie z zaleceniami producenta (PE Biosystems, 1999). Dla sprawdzenia prawidłowości procesu PCR, do każdej partii próbek, oprócz dwóch 2
ekstrakcyjnych prób kontrolnych, dołączano dwie kontrole PCR- kontrolę dodatnią o znanym profilu DNA, pochodzącą z zestawu AmpFlSTR SGM Plus i kontrolę negatywną jako kontrolę sterylności procesu. W celu bardziej ekonomicznego wykorzystania odczynników wchodzących w skład zestawu SGM Plus, dziesięć początkowych partii próbek amplifikowano w dwóch wersjach objętościowych. W pierwszej wersji reakcję PCR przygotowywano ściśle według procedury podanej przez producenta zestawu (PE Biosystems, 1999), tj. w zalecanej przez producenta objętości reakcyjnej wynoszącej 50 µl i przy zachowaniu określonych w procedurze proporcji poszczególnych składników reakcji. W drugiej wersji, utrzymując proporcje składników, zredukowano objętość reakcyjną do 25 µl. Po przeprowadzeniu dalszych etapów badawczych powyższego eksperymentu i stwierdzeniu pełnej powtarzalności wyników, kolejne partie próbek amplifikowano w zmodyfikowanej objętości reakcyjnej, tj. wynoszącej 25 µl. Elektroforeza Powielone metodą PCR fragmenty DNA rozdzielano elektroforetycznie w denaturujących, 5% żelach poliakryloamidowych, w aparatach ABI Prism 377 firmy Applied Biosystems. Żele sporządzano z gotowych zestawów odczynników- Long Ranger Singel Packs firmy BMA (nr katalogowy 50691), zgodnie z procedurą dołączoną do zestawu. Próbki do elektroforezy przygotowywano poprzez zmieszanie produktów PCR w stosunku 1:1 z roztworem formamidu zawierającym standard wielkości- GS 500 Rox Size Standard firmy Applied Biosystems (nr katalogowy 401734), a następnie denaturowano w 95 o C przez 2 minuty, w aparacie GeneAmp PCR System 9700 firmy Applied Biosystems. Elektroforezę prowadzono na 36 ścieżkach żelu (30 ścieżek zajmowały próbki badane, 4 próby kontrolne, 2 drabiny alleli, pochodzące z zestawu SGM Plus), w środowisku buforowym 1xTBE (89 mm Tris, 89 mm H 3 BO 3, 2 mm EDTA) przez 2,5 godziny, zachowując wskazane przez producenta parametry prądowe i temperaturowe (PE Biosystems, 1999). Do sterowania procesem elektroforezy i zbierania danych użyto oprogramowania ABI Prism 377 Collection. Analiza danych Analizę danych zebranych w trakcie elektroforez wykonywano przy użyciu programu komputerowego Genescan 3.1.2. Analiza obejmowała: ocenę prawidłowości przebiegu elektroforezy, przygotowanie obrazu elektroforetycznego do pobierania danych, 3
pobieranie danych z poszczególnych ścieżek żelu i zebranie ich w zbiorach próbek, definiowanie standardu, zainstalowanie matrycy matematycznej korygującej występowanie artefaktów wynikających z wzajemnego przenikania barw światła emitowanego przez barwniki fluorescencyjne, użyte do wyznakowania standardu, próbek i drabin, wprowadzenie określonych proceduralnie parametrów analizy, w tym progowych wartości detekcji pików (75 rfu dla pików próbek, 50 rfu dla standardu i drabin, rfu relative fluorescence unit), komputerową analizę danych - program automatycznie obliczał i zapisywał czas zarejestowania fragmentów DNA, ich wielkość wyrażoną w ilości par zasad, wysokość i pole pików oraz numer skanu rejestrującego dany fragment. Dane te były przedstawiane w postaci graficznej i tabelarycznej. sprawdzanie wyników przez operatora. Podstawą do zakwalifikowania próbek do następnego etapu analizy wyników była poprawność drabin alleli, prób kontrolnych i standardu wielkości. Definiowanie alleli i ocena profili SGM plus Zarejestrowane przez program Genescan allele dziesięciu loci STR i locus Amelogeniny definiowano zgodnie z obowiązującą nomenklaturą, przy użyciu programu Genotyper 2.5 i matrycowego pliku AmpFlSTR SGM Plus (PE Biosystems, 1999), zawierającego gotowe zbiory poleceń (makra). Wygenerowane graficznie wyniki poddawane były szczegółowej weryfikacji przez operatora. W pierwszej kolejności sprawdzane były oznaczenia pików standardu, a następnie oznaczenia pików w ścieżkach drabin alleli i w ścieżkach próbek kontrolnych. Po zatwierdzeniu poprawności tych oznaczeń, analizowano i weryfikowano oznaczenia dla pozostałych ścieżek elektroforetycznych, zawierających profile DNA badanych próbek. Warunkiem zatwierdzenia i wprowadzenia do populacyjnej bazy danych profilu DNA danej próbki było uzyskanie profilu pełnego, tj. we wszystkich loci SGM Plus oraz stwierdzenie poprawności oznaczenia alleli w każdym z tych locus. Próbki, dla których profilu pełnego nie uzyskano z powodu zbyt małej ilości DNA, lub profil otrzymano, ale stwierdzono, że wymaga on potwierdzenia, kierowano do przeprowadzenia ponownego procesu badawczego. 4
W przebadanej próbie populacyjnej, zdecydowaną większość stanowiły próbki DNA o allelach typowych, tzn. mających odpowiedniki w drabinie alleli SGM Plus. Stwierdzono także allele nie występujące w drabinie alleli, ale odnotowane już wcześniej, w populacji białej kaukaskiej. Były to allele: w locus D3S1358: 11 (PE Biosystems. 1999, Turowska B. 1999, Czarny J. 2002), 20 (Pawłowski R. 2000, Czarny J. 2002), w locus D19S433: 12.1 (Binda S. 2000), 18 (Pepiński W. 2001, Czarny J. 2002), 18.2 (PE Biosystems. 1999, Foreman L. 2001, Steinlechner M. 2001, Czarny J. 2002), 19.2 (Foreman L. 2001), w locus D18S51: 17.2 (Gill P., 1996), w locus TH01: 8.3 (Evett I.W. 1997, Steinlechner M. 2001), w locus FGA: 16 (Pawłowski R., 2000) oraz allele zaliczane do częściej obserwowanych wariantów: 20.2, 21.2, 22.2, 23.2, 24.2, 25.2. Zaobserwowano ponadto allele, których nie odnaleziono jako występujących, w dostępnych danych źródłowych. Należą do nich allele: w locus D3S1358: 21, w locus D16S539: 7, w locus D19S433: 11.1, 11.2. Niektóre wymienione allele nie zostały zdefiniowane automatycznie przez program. Były to allele znajdujące się poza obszarem odczytu dla danego locus, takie jak allel 21 locus D3S1358 i allel 19.2 locus D19S433 oraz allele występujące w obszarze odczytu locus, będące wariantami zawierającymi niepełne powtórzenia typu X.1 i X.3, takie jak allel 8.3 locus TH01 i allele 11.1 oraz 12.1 locus D19S433. Allele te oznaczono manualnie, po wykazaniu korelacji przesunięcia prążków (Gill P., 1996). Takie same oznaczenia otrzymano po ponownym przeprowadzeniu analizy próbek. Analizę wyników poszczególnych partii próbek DNA kończono zestawieniem poprawnie oznaczonych profili SGM plus w tabelach Genotyper a. Utworzenie populacyjnego zbioru danych Oznaczone i zestawione w tabelach Genotyper a profile SGM Plus przekopiowano do arkusza excel a, a następnie za pomocą programu Microsoft Acces, utworzono zbiór danych o liczebności i częstości alleli tych loci. 5
Statystyczna analiza danych Otrzymane dane populacyjne poddano analizie statystycznej pod kątem zastosowania ich w rutynowych badaniach identyfikacyjnych. Za pomocą programu GDA (Lewis P.O., Zaykin D., 2002), dla poszczególnych loci SGM plus określono heterozygotyczność obserwowaną (Ho) i oczekiwaną (He) oraz zbadano zgodność z prawem równowagi Hardy ego-weinberga (HW P), stosując testy exact Fishera i χ 2. Siłę dyskryminacji PD dla poszczególnych loci SGM plus, oznaczającą prawdopodobieństwo, że dwie osoby przypadkowo wybrane z populacji polskiej będą miały różne genotypy w locus k (k = 1,...,10), wyliczono stosując wzór Fishera: n PD k = 1 - Pi 2 = 1 - S k i=1 gdzie n oznacza liczbę alleli w locus k, Pi - oczekiwaną częstość genotypów w locus k, n a S k = Pi 2 i=1 PD dla całego systemu SGM plus wyliczono za pomocą wzoru: 10 PD SGM plus = 1 - S k k=1 Prawdopodobieństwo przypadkowej zgodności MP dla systemu SGM plus, oznaczającą prawdopodobieństwo, że dwie osoby przypadkowo wybrane z populacji polskiej będą miały takie same profile SGM plus, otrzymano ze wzoru: 10 P SGM plus = S k k=1 6
Częstości alleli poszczególnych loci SGM plus w próbie populacyjnej 2233 osób Allel D3S135 vwa D16S539 D2S1338 D8S1179 D21S11 D18S51 D19S433 TH01 FGA 3 4 5 0,0007 6 0,2373 7 0,0002 0,1288 8 0,0085 0,0096 0,0965 8,3 0,0002 9 0,0898 0,0114 0,0002 0,0002 0,2096 9,3 0,3166 10 0,0403 0,0616 0,0067 0,0002 0,0101 10,2 0,0000 11 0,0007 0,0007 0,2833 0,0694 0,0096 0,0025 0,0002 11,1 0,0002 11,2 0,0002 12 0,3453 0,1751 0,0976 0,0887 12,1 0,0002 12,2 0,0004 13 0,0034 0,0040 0,2022 0,3316 0,0931 0,2094 13,2 0,0000 0,0168 13,3 14 0,1352 0,1021 0,0291 0,2246 0,1536 0,3486 14,2 0,0002 0,0242 15 0,2515 0,1055 0,0013 0,0943 0,1545 0,1814 15,2 0,0403 16 0,2376 0,1845 0,0499 0,0172 0,1755 0,0493 0,0007 16,2 0,0226 17 0,2136 0,2788 0,2060 0,0049 0,1335 0,0016 0,0004 17,2 0,0002 0,0056 18 0,1458 0,2351 0,0835 0,0002 0,0900 0,0004 0,0181 18,2 0,0065 19 0,0116 0,0775 0,1162 0,0408 0,0871 19,2 0,0007 20 0,0004 0,0103 0,1348 0,0275 0,1534 20,2 0,0004 21 0,0002 0,0016 0,0378 0,0067 0,1827 21,2 0,0027 22 0,0242 0,0065 0,1923 22,2 0,0148 23 0,0958 0,0025 0,1171 23,2 0,0096 24 0,1064 0,0007 0,1182 24,2 0,0002 0,0025 25 0,1202 0,0002 0,0002 0,0681 25,2 0,0004 26 0,0222 0,0016 0,0002 0,0271 26,2 27 0,0027 0,0289 0,0038 27,2 28 0,0002 0,1861 0,0004 28,2 0,0002 29 0,2033 29,2 0,0004 30 0,2300 30,2 0,0517 31 0,0663 31,2 0,0858 32 0,0130 32,2 0,0920 33 0,0018 33,1 0,0002 33,2 0,0358 34 34,2 0,0025 35 Ho 0,7902 0,8058 0,7320 0,8792 0,7942 0,8335 0,8766 0,7960 0,7681 0,8689 He 0,7949 0,8060 0,7502 0,8783 0,7894 0,8449 0,8745 0,7892 0,7730 0,8654 PD 0,9250 0,9332 0,8985 0,9729 0,9279 0,9584 0,9708 0,9280 0,9131 0,9661 PD SGM plus MP SGM plus 0,999999999999766 2,3442x10-13 HW P (Fisher) 0,1603 0,2709 0,2700 0,7903 0,8828 0,6934 0,7278 0,6347 0,4806 0,3069 HW P (Chi 2 ) 0,2819 0,4347 0.2706 0,8394 0,6331 0.7869 0,8703 0,4606 0,2734 0,5609 7
Wnioski z analizy statystycznej Wyniki analizy statystycznej prowadzą do wniosku, że populacja polska w poszczególnych loci SGM plus nie wykazuje istotnych odchyleń od prawa równowagi Hardy ego-weinberga (HW P<0,05) co oznacza, że opracowane na podstawie badanej próby dane populacyjne mogą być stosowane do oceny profili SGM plus oznaczanych w sprawach karnych, przy zastosowaniu odpowiednich wzorów rachunku prawdopodobieństwa. Określone na podstawie tych danych wartości PD i MP świadczą o wysokim polimorfiźmie loci STR-SGM plus w populacji polskiej, co obrazuje i potwierdza wysoki poziom użyteczności tego systemu do identyfikacji osób. PODSUMOWANIE W ramach prac badawczo-rozwojowych wdrożono do badań kryminalistycznych nowy system identyfikacji genetycznej, obejmujący dziesięć niekodujących loci STR- D3S1358, VWA, D16S539, D2S1338, D8S1179, D21S11, D18S51, D19S433, TH01, FGA i locus Amelogeniny (XY), wchodzących w skład zestawu SGM plus. Stwierdzono, że system ten z uwagi na wysoką czułość, informatywność i dobór loci STR może służyć standardowo do identyfikacji śladów biologicznych, a także do identyfikacji osób podejrzanych przy użyciu krajowej bazy danych DNA. Ponadto, ze względu na kompatybilność loci STR ze standardowym zestawem ISSOL, stworzona została możliwość międzynarodowej współpracy w wykrywaniu sprawców przestępstw. Na podstawie przeprowadzonych badań populacyjnych utworzono dla populacji polskiej populacyjną bazę danych w systemie SGM plus. Analiza statystyczna wykazała, że dla populacji polskiej system SGM plus jest wystarczająco precyzyjny do bardzo dokładnej identyfikacji osobniczej, w procesie wykrywania sprawców przestępstw. Ponadto stwierdzono, że utworzona baza danych populacyjnych spełnia wymagania prawa równowagi Hardy ego-weinberga, jest reprezentatywna dla populacji całego obszaru Polski i przy uwzględnieniu takich założeń może być wykorzystywana do statystycznej oceny zgodności profili DNA, oznaczanych w sprawach karnych. 8
PIŚMIENNICTWO Binda S., Borer U.W., Gehrig C., Hochmeister M., Budowle B.: Swiss Caucasian population data for the STR loci D2S1338 and D19S433 using the AmpFlSTR SGM Plus PCR amplification kit. Forensic Sci Int (2000) 108: 117-120. Czarny J.: Population Genetics of the STRs D3S1358, FGA, D2S1338, D8S1179, D21S11, D18S51 and D19S433 in the Pomerania-Kujawy region of Poland. Forensic Sci Int (2002) 125: 90-92. Evett I.W., Gill P.D., Lambert J. A., Oldroyd N., Frazier R., Watson S., Panchal S., Connolly A., Kimpton C.: Statistical analysis of data for three Brtish ethnic groups from a new STR multiplex. Int J Legal Med (1997) 110: 5-9. Evett I.W., Weir B.: Interpreting DNA Evidence. Copright Sinauer, Inc. (1998). Foreman L.A., Evet I.W.: Statistical analyses to support forensic interpretation for a new tenlocus STR profiling system. Int J Legal Med (2001) 114: 147-155. Gill P., Urquhart A., Millican E., Oldroyd N., Watson S., Sparkes R., Kimpton C.P.: A new method of STR interpretation using inferential logic development of criminal intelligence database. Int Legal Med (1996) 109: 14-22. Gill P., d Aloja E., Andersen J., Dupuy B., Jangblad M., Johnsson V., Kloosterman A.D., Kratzer A., Lareu M.V., Meldegaard M., Phillips C., Pfizinger H., Rand S., Sabatier M., Scheithauer R., Schmitter H., Schneider P., Vide M.C.: Report of the European DNA profiling group (EDNAP): an investigation of the complex STR loci D21S11 and HUMFIBRA (FGA). Forensic Sci Int (1997) 86: 25-33. Nei M.: Genetic distance between populations. Amer. Nat. (1972) 106: 283-291. Olaisen B., Bar W., Brinkmann B., Carracedo A., Gill P., Lincoln P., Mayr W.R., Rand S. DNA recommendations 1997 of the International Society for Forensic Genetics. Vox Sang 74: 61-63. Pawłowski R., Dettlaff-Kąkol A., Jezierski G., Maciejewska A., Paszkowska R., Reichert M.: Genetyka populacyjna dziewięciu loci typu STR z zestawu Profiler Plus w próbce populacyjnej z obszaru Polski. Archiwum Medycyny Sądowej i Kryminologii (2000) 3: PE Biosystems : AmpFlSTR SGM Plus PCR Amplification Kit User s Manual, 1999. Pepiński W., Janica J., Skawrońska M., Niemcunowicz-Janica A., Sołtyszewski I.: Population genetics of 15 STR loci in the population of Podlasie (NE Poland). Forensic Sci Int (2001) 124: 226-227. 9
Steinlechner M., Berger B., Scheithauer R., Parson W.: Population genetics of ten STR loci (AmpFlSTR SGM plus) in Austria. Int J Legal Med. (2001) 114: 288-290. Turowska B., Sanak M., Opolska-Bogusz B.: Wstępne badanie populacji Polski Południowej w zakresie 10 STR loci z zestawu AmpFlSTR SGM Plus. Archiwum Medycyny Sądowej i Kryminologii (1999) Vanek D., Hradil R., Budowle B.: Czech population data on short tandem repeat loci of SGM system kit using in FTA cards. Forensic Sci Int (2001) 119: 107-108. Wolańska-Nowak P., Branicki W., Kupiec T.: STR data for AmpFlSTR Profiler Plus loci in south Poland. Forensic Sci Int (2001) 122: 173-174. Weir B.S.: Genetic Data Analysis II. Copright Sinauer, Inc. (1996). 10