Optymalizacja procesu biodegradacji zanieczyszczeñ ropopochodnych w zastarza³ych odpadach z do³ów urobkowych

GOSPODARKA SUROWCAMI MINERALNYMI Tom 24 2008 Zeszyt 1/1 TERESA STELIGA* Optymalizacja procesu biodegradacji zanieczyszczeñ ropopochodnych w zastarza³ych odpadach z do³ów urobkowych Wprowadzenie Pracom prowadzonym w górnictwie nafty i gazu towarzyszy nieuchronna koniecznoœæ gromadzenia i zagospodarowania du ych iloœci materia³ów odpadowych, które w latach 1920 1950 by³y sk³adowane w do³ach urobkowych. Rekultywacja terenów zastarza³ych do³ów urobkowych zdegradowanych przez ska enie substancjami ropopochodnymi nale y do kluczowych problemów ekologicznych, jakie staj¹ przed bran ¹ górnictwa nafty i gazu w Polsce. Na do³ach urobkowych z tego okresu prowadzono wstêpne zabiegi zmierzaj¹ce do ich likwidacji poprzez zmieszanie odpadu z ziemi¹ lub torfem. Pod wzglêdem chemicznym odpady te stanowi¹ zró nicowane, wielosk³adnikowe uk³ady, które podczas deponowania i prowadzenia wstêpnych procesów oczyszczania ulega³y zmianom. Istotnym parametrem okreœlaj¹cym zachodz¹ce zmiany w sk³adowanych odpadach jest obecnoœæ zanieczyszczeñ ropopochodnych, które starzej¹ siê wskutek przebiegu wielu procesów, m.in. odparowania, rozpuszczania czy biodegradacji (Qudot i in. 1989; Chaineau i in. 1995). Warunkiem wyboru optymalnej metody oczyszczania do³ów urobkowych z zanieczyszczeñ ropopochodnych jest odpowiednia, interdyscyplinarna analiza wyników uzyskanych z badañ laboratoryjnych i terenowych œrodowiska gruntowo-wodnego. Prawid³owo wykonane badania pozwalaj¹ na okreœlenie najodpowiedniejszych technologii likwidacji zanieczyszczeñ substancjami ropopochodnymi (Lazar i in. 1999; Riser-Roberts 1998; Zieñko 1999; Steliga 2006). * Dr in., Instytyt Nafty i Gazu, Kraków Oddzia³ Krosno; e-mail: Teresa.Steliga@inig.pl

88 Coraz czêœciej prowadzi siê badania nad przyspieszeniem biodegradacji wêglowodorów na drodze procesów biotechnologicznych, przy wykorzystaniu aktywnych kultur bakteryjnych uprzednio wyizolowanych z silnie ska onych œrodowisk naturalnych. Z uwagi na stosunkowo niskie koszty oraz skutecznoœæ metody biologiczne znajduj¹ praktyczne zastosowanie na skalê techniczn¹ (Morgan i in. 1990; Cunnigham i in. 2004). Biodegradacja zanieczyszczeñ ropopochodnych w ska onym œrodowisku uzale niona jest zarówno od czynników abiotycznych, jak i biotycznych. Nale ¹ do nich: w³aœciwoœci fizykochemiczne odpadu wiertniczego/gleby, stê enie i struktura chemiczna zanieczyszczeñ ropopochodnych, stê enie zwi¹zków biogennych (azotu, fosforu), temperatura, zawartoœæ tlenu, wilgotnoœæ, odczyn (ph) odpadu, zawartoœæ zwi¹zków organicznych, obecnoœæ zwi¹zków toksycznych, sk³ad iloœciowy i jakoœciowy mikroorganizmów obecnych w glebie (Li et.al. 2005; Hejazi i in. 2004; Siuta 2003; Xu i in. 2003; Yerushaimi i in. 2003; Hutchinson i in. 2001; Wright i in. 1997; Bragg i in. 1994). Budowa chemiczna zanieczyszczeñ ropopochodnych (TPH) obok uwarunkowañ fizykochemicznych panuj¹cych w zanieczyszczonym odpadzie i jego struktury, ma wp³yw na wielkoœæ sorpcji TPH, a tym samym na ich biodostêpnoœæ (Huesemann i in. 2003; De Jonge i in. 1997). Istniej¹ dwie strategie oczyszczania gruntów: in-situ (on site) iex-situ (off site). Porównuj¹c wymienione metody nale y stwierdziæ, e metoda ex-situ ma nastêpuj¹ce zalety (Canberry i in. 2001; Rubin i in. 2001; Zieñko 1999): zwiêksza ³atwoœæ nadzoru i kontroli parametrów procesu oczyszczania, zapewnia szybkie tempo rozk³adu zanieczyszczeñ, u³atwia dostêp do oczyszczanego materia³u przy obróbce pocz¹tkowej, poœredniej i koñcowej, zapewnia korzystniejsze warunki rozwoju mikroorganizmów. Mimo wymienionych zalet, ze wzglêdu na ograniczone œrodki finansowe oraz mo liwoœæ unikniêcia deformacji struktury gruntu, rzeÿby terenu i nienaruszenia infrastruktury technicznej coraz czêœciej preferuje siê biodegradacjê zanieczyszczeñ ropopochodnych bezpoœrednio w terenie (in-situ). W zakresie doskonalenia technicznych sposobów napowietrzania i zasilania œrodowiska sk³adnikami od ywczymi i preparatami biologicznymi oraz zabezpieczania przyleg³ych terenów przed rozprzestrzenianiem siê ropopochodnych substancji zauwa alne s¹ bardzo du e postêpy. Przek³adanie wyników badañ laboratoryjnych na potrzeby oczyszczania gleby/odpadów wiertniczych w terenie nie jest jednak ³atwe ze wzglêdu na du ¹ z³o onoœæ i wymaga zbadania wielu uwarunkowañ oraz opracowania sposobów skutecznego sterowania przebiegiem biodegradacji zanieczyszczeñ ropopochodnych (Siuta 2003; Steliga 2006). W toku wieloletnich prac badawczych prowadzonych w warunkach laboratoryjnych i przemys³owych w INiG opracowano technologiê oczyszczania odpadów wiertniczych/ /gleby z zanieczyszczeñ ropopochodnych, która obejmuje nastêpuj¹ce etapy (Steliga 2006; Steliga i in. 2006): wstêpn¹ rekultywacjê terenu polegaj¹c¹ na usuniêciu substancji ropopochodnych z g³êbszych warstw poprzez drena melioracyjno-odciekowy; modyfykacjê struktury gleby poprzez zmieszanie jej z czyst¹ ziemi¹ w proporcjach ustalonych na podstawie badañ laboratoryjnych w celu zwiêkszenia bio-

dostêpnoœci mikrooganizmów i substancji od ywczych do wêglowodorów ropopochodnych; bioremediacjê podstawow¹ stymulowan¹ przez biowentylacjê (dostarczanie tlenu poprzez napowietrzanie terenu) oraz wzbogacanie œrodowiska gleby w sk³adniki biogenne wspomagaj¹ce rozwój mikroflory autochtonicznej. W celu doprowadzenia odczynu odpadu do poziomu (ph ~7,4) oraz osi¹gniêcia optymalnego stosunku C:N:P= 100:10:1(Chang i in. 1996; Cookson 1995; Wirght i in. 1997; Saponaro i in. 2002; Wirght i in. 2004; Cunnigham i in. 2004) do gleby (odpadu) dozowano wapno nawozowe i nawozy mineralne, których dawki okreœlano na podstawie badañ laboratoryjnych; bioaugmentacjê polegaj¹c¹ na rozprowadzeniu napowierzchniowym oraz wg³êbnej iniekcji w warstwy oczyszczanego terenu biopreparatu sporz¹dzonego na bazie wyizolowanych oraz wyselekcjonowanych i namno onych mikroorganizmów autochtonicznych. Ca³y cykl oczyszczania odpadów wiertniczych z zanieczyszczeñ ropopochodnych kontrolowano za pomoc¹ opracowanej metodyki analitycznej wykorzystuj¹cej po³¹czenie ekstrakcji rozpuszczalnikowej modyfikowanej ultradÿwiêkami z chromatografi¹ gazow¹, która umo liwia okreœlenie sumarycznej zawartoœci zanieczyszczeñ ropopochodnych (TPH), jak równie identyfikacjê i iloœciowe oznaczenie n-alkanów wchodz¹cych w sk³ad zanieczyszczeñ ropopochodnych. Ponadto umo liwia ona chromatograficzn¹ identyfikacjê jakoœciow¹ i iloœciow¹ wêglowodorów trudno biodegradowalnych z grupy izoprenoidów: pristanu (Pr) i fitanu (F) (Brown i in. 1998; Sharma i in. 2002). Wartoœci stosunków n-c 17 /Pr i n-c 18 /F przyjêto jako wskaÿniki s³u ¹ce do oceny stopnia biodegradacji n-alkanów (Santas i in. 1999; Steliga 2006a), gdy umo liwiaj¹ porównanie przebiegu procesu biodegradacji w warunkach laboratoryjnych i przemys³owych. W celu opracowania uproszczonego matematycznego modelu biodegradacji TPH podczas prowadzenia badañ w warunkach laboratoryjnych do normalizacji stê eñ TPH zastosowano biomarker: C 30 17 (H),21 (H)-hopan, który umo liwia pe³n¹ ocenê stopnia biodegradacji wêglowodorów ropopochodnych (Prince i in. 1999; Xu i in. 2003, 2004). Wyniki analiz chromatograficznych w po³¹czeniu z badaniami mikrobiologicznymi stanowi¹ podstawowe narzêdzie przy opracowywaniu biopreparatu na bazie mikroorganizmów autochtonicznych o profilu œciœle dostosowanym do chemicznego charakteru zanieczyszczeñ wystêpuj¹cych na oczyszczanym terenie. 89 1. Materia³y i metodyka badawcza Na terenie kopalni ropy naftowej Grabownica wystêpuje oko³o 150 zastarza³ych do- ³ów urobkowych, które przed laty czêœciowo poddano wstêpnym procesom maj¹cym na celu ich unieszkodliwienie, tj. zestaleniu czy zmieszaniu z gleb¹, ale nadal ze wzglêdu

90 na wysok¹ zawartoœæ zanieczyszczeñ ropopochodnych stanowi¹ du e zagro enie dla œrodowiska. Przedmiotem badañ przedstawionych w niniejszym artykule by³y zastarza³e odpady wiertnicze zmieszane z gleb¹ pochodz¹ce z do³ów urobkowych G-44 (g³êbokoœæ 1,5 m, powierzchnia 350 m 2 ) i G-40 (g³êbokoœæ 1,4 m, powierzchnia 170 m 2 ). Charakteryzowa³y siê one zró nicowan¹ zawartoœci¹ zanieczyszczeñ ropopochodnych. 1.1. Metodyka analityczna Analiza zanieczyszczeñ ropopochodnych nale y do trudnych zadañ. Wynika to z wielu przyczyn, do których mo na zaliczyæ: du ¹ liczbê i ró norodnoœæ produktów naftowych, które mog¹ byæ Ÿród³em ska eñ, skomplikowany sk³ad (wielosk³adnikowe mieszaniny, w których tylko nieliczne indywidua wystêpuj¹ w stê eniach wy szych ni 1% mas.) i zró - nicowane w³aœciwoœci poszczególnych produktów naftowych, powoduj¹ce ich niespecyficznoœæ analityczn¹, z³o onoœæ i niejednorodnoœæ matrycy œrodowiskowej, szczególnie odpadu wiertniczego. W celu uzyskania pe³nej kontroli przebiegu procesu oczyszczania odpadu wiertniczego z zanieczyszczeñ ropopochodnych oraz przygotowania skutecznego biopreparatu z mikroorganizmów autochtonicznych opracowano metodykê chromatograficznego jakoœciowego i iloœciowego oznaczania substancji ropopochodnych w glebie/odpadzie wiertniczym (TPH, n-c 6 n-c 44,pristan,fitan,C 30 17 (H),21 (H)-hopan). Pobrane próbki po uœrednieniu i ujednoliceniu poddano izolacji i wzbogacaniu analitów. Izolacjê analitów ropopochodnych przeprowadzono metod¹ ekstrakcji rozpuszczalnikowej modyfikowan¹ ultradÿwiêkami (Chaîneau i in. 2003). Jako optymalny rozpuszczalnik wytypowano dichlorometan (Hutchinson i in. 2001; Steliga 2003; Steliga i in. 2004), przy odzysku substancji ropopochodnych (TPH) wynosz¹cym 75,8%. Zastosowanie w procesie ekstrakcji rozpuszczalnikowej sonifikacji spowodowa³o zwiêkszenie stopnia odzysku zanieczyszczeñ ropopochodnych do 95,9%. Optymalny czas dzia³ania ultradÿwiêków (30 khz) waha³ siê w zakresie od 30 do 45 minut (Roche i in. 1991; Chang i in. 1992; Wang i in. 1994). Dla uzyskania ¹danego odzysku analitów z matrycy glebowej wskazane jest powtórzenie ekstrakcji (2- lub 3-krotnie) nowymi porcjami rozpuszczalnika. W okresie trwania procesu sonifikacji nie stwierdzono artefaktów. Stê enia analitów w ekstraktach rozpuszczalnikowych s¹ niewystarczaj¹ce i wymagaj¹ wzbogacenia (zatê enia) do poziomu powy ej dolnej granicy oznaczalnoœci. Stopieñ odzysku analitów okreœlano za pomoc¹ standardu zastêpczego, którym by³ o-terfenyl (Sawyer i in. 1996; Wang i in. 1994). Oczyszczanie analitów substancji polarnych przeprowadzono przy zastosowaniu kolumienek sorpcyjnych wype³nionych sorbentem o nazwie florosil (Van Delft i in. 1994; Waksmundzka-Hajnos 1998). Analizê zanieczyszczeñ ropopochodnych w odpadzie obejmuj¹c¹ identyfikacjê oraz iloœciowe oznaczenie n-alkanów (n-c 6 n-c 44 ), wêglowodorów z grupy izoprenoidów (Pr, F) oraz ca³kowitej zawartoœci wêglowodorów naftowych (TPH)

wykonano na chromatografie Clarus 500 GC/FID firmy Perkin Elmer, wyposa onym w kolumnê kapilarn¹ QUADREX 007-1 (30 m 0,53 mm) firmy Panalytica, przy przep³ywie 20 ml/min helu jako gazu noœnego. Temperatura in ektora PPS i detektora wynosi³a odpowiednio: 290 C i 300 C. Program temperaturowy dla wêglowodorów alifatycznych przebiega³ nastêpuj¹co: 28 C przebieg izotermiczny przez 2 min, 28 105 C przyrost temperatury 10 C/min, 105 285 C przyrost temperatury 5 C/min i przez 10 mim przebieg izotermiczny w temperaturze 285 C. Program temperaturowy przy oznaczaniu C 30 17 (H),21 (H)-hopanu przebiega³ nastêpuj¹co: 28 C przebieg izotermiczny przez 2 min, 28 105 C przyrost temperatury 10 C/min, 105 320 C przyrost temperatury 5 C/ min i przez 20 mim przebieg izotermiczny w temperaturze 320 C. Do oznaczenia iloœciowego sumarycznej zawartoœci wêglowodorów naftowych (TPH) zastosowano zestaw standardów kalibracyjnych firmy Tusnovic Insruments, zaœ do iloœciowego oznaczenia poszczególnych n-alkanów wchodz¹cych w sk³ad zanieczyszczeñ ropopochodnych wykorzystano wzorce certyfikowane firmy Supelco oraz Restek (mieszanina wzorcowa n-alkanów o d³ugoœci ³añcucha wêglowego n-c 6 n-c 44 oraz certyfikowana mieszanina wzorcowa zawieraj¹ca: n-c 17,pristan, n-c 18, fitan). Jako biomarker zastosowano wzorzec certyfikowany C 30 17 (H),21 (H)- hopan firmy Supelco. W oznaczeniach TPH z odpadu uwzglêdniano podczas obliczeñ stopieñ odzysku analitów i wspó³czynnik ubytku masy odpadu podczas suszenia. Pozosta³e parametry charakteryzuj¹ce przebieg procesu oczyszczania odpadu wiertniczego zmieszanego z gleb¹ wykonano na spektofotometrze Perkin-Elmer-Lambda 40. Oceny frakcji ilastej w zastarza³ym odpadzie wiertniczym zmieszanym z gleb¹ z do³ów urobkowych dokonano metod¹ rentgenowskiej analizy fazowej, w której wykorzystuje siê zjawisko dyfrakcji (ugiêcia) promieni rentgenowskich na elementach strukturalnych cia³a krystalicznego. Badania wykonuje siê za pomoc¹ dyfraktometru rentgenowskiego X Pert MPD firmy Philips (lampa rentgenowska Cu o maksymalnej mocy 2500 W). Przy analizie jakoœciowej przyjêto nastêpuj¹ce warunki pomiarowe: napiêcie wzbudzania 40 kv, pr¹d anodowy 34 ma, czas naœwietlania 1,0 s, krok pomiarowy 0,05 (2 ), zakres k¹towy pomiaru 3 64 (2 ). W celu wydzielenia frakcji ilastej próbki zosta³y poddane odpowiedniej obróbce chemicznej (usuwania wêglanów, substancji organicznej i elaza, wymiany kationowej). Nastêpnie wydzielono z nich frakcjê ziarnow¹ < 0,2 m i wykonano preparaty sedymentowane i zarejestrowano je po glikolowaniu stosuj¹c nastêpuj¹ce warunki pomiarowe: napiêcie wzbudzania 40 kv, pr¹d anodowy 34 ma, czas naœwietlania 2,5 s, krok pomiarowy 0,02 (2 ), zakres k¹towy pomiaru 2 50 (2 ). Interpretacji dyfraktogramów dokonano porównuj¹c po³o enie i wzglêdne intensywnoœci zarejestrowanych refleksów z po³o eniami wzorcowymi, rozpoczynaj¹c od refleksów o najwiêkszej intensywnoœci. 91

92 1.2. Analizy mikrobiologiczne Ca³kowit¹ liczbê komórek bakteryjnych ustalano poprzez zliczanie metod¹ wielokrotnych rozcieñczeñ, wysiewaj¹c 1 ml z ka dego rozcieñczenia (po wczeœniejszej ekstrakcji mikroroganizmów) na p³ytkê agarow¹ o œrednicy 70 mm (pod³o e sta³e) i liczono wyroœniête kolonie. W przypadku mikroorganizmów wykorzystuj¹cych wêglowodory albo ropê naftow¹ jako jedyne Ÿród³o wêgla wyroœniête kolonie poddawano dalszym testom biochemicznym w celu potwierdzenia. Ka dy przedstawiony wynik jest œredni¹ z przynajmniej 3 lub 4 oznaczeñ. Drugi metoda polega³a na zastosowaniu metody (MPN) najbadziej prawdopodobnej liczby (Chaîneau i in. 1995; Wrenn i in. 1996). W tym wypadku równie dokonywano wielokrotnych rozcieñczeñ i wysiewano mikroorganizmy na pod³o e p³ynne, gdzie zmêtnienie pod³o a oznacza³o wynik pozytywny. Liczbê mikroroganizmów obliczano na podstawie wyników uzyskanych z 3 5 powtórzeñ. 2. Analiza statystyczna i pierwszorzêdowy model biodegradacji TPH Zastosowanie biomarkera C 30 17 (H),21 (H)-hopanu w badaniach laboratoryjnych procesu biodegradacji TPH w odpadzie wiertniczym pozwala na wyeliminowanie b³êdów analitycznych w oznaczeniach iloœciowych wêglowodorów ropopochodnych. Znormalizowane hopanem wyniki oznaczeñ chromatograficznych TPH wykonane w trakcie prowadzenia procesu ich biodegradacji pos³u y³y do opracowania matematycznego pierwszorzêdowego modelu opisuj¹cego przebieg biodegradacji TPH (Venosa i in. 1997; Xu and Obbard 2004; Xu i in. 2004). Zosta³ on opisany równaniem: C/C H =(C/C H ) 0 exp( kt) [1] gdzie: C koncentracja analitu, C H koncentracja hopanu, k sta³a biodegradacji pierwszego rzêdu [dni 1 ], C/C H znormalizowane stê enie analitu w czasie, (C/C H ) 0 znormalizowane stê enie analitu w punkcie wyjœciowym procesu biodegradacji, t czas trwania procesu [dni]. Analiza regresji nieliniowej z zastosowaniem przedstawionego powy ej równania umo - liwi³a wyznaczenie sta³ej biodegradacji pierwszego rzêdu (k) oraz wspó³czynnika korelacji (r 2 ) okreœlaj¹cego dopasowanie punktów pomiarowych do krzywej teoretycznej procesu biodegradacji TPH.

Przeprowadzenie nieliniowej analizy wariacji (ANOWA) metod¹ Tukeya na poziomie ufnoœci p < 0,05 umo liwia eliminacjê danych analitycznych (chemicznych i biologicznych) statystycznie nieistotnych. Do statystycznego przetworzenia otrzymanych danych analitycznych zastosowano program Statistica wersja 7.1. 93 3. Wyniki badañ Analiza chromatograficzna w uœrednionej i w ujednoliconej próbce odpadu z do³u urobkowego G-44 wykaza³a, e TPH wynosi 82 564 mg/kg s.m. odpadu, przy czym w najwy szych stê eniach wystêpuj¹ wêglowodory szeregu alifatycznego n-c 16 n-c 22 wgranicach: 3,47 19,11%. Stwierdzono obecnoœæ wêglowodorów trudno biodegradowalnych z grupy izoprenoidów, tj. pristanu (Pr) w iloœci; 1881 mg/kg s.m. odpadu i fitanu (F) 1631 mg/kg s.m. odpadu. Zawartoœæ BTEX waha siê w zakresie od 44 do 13 mg/kg s.m. odpadu, zaœ WWA wystêpuj¹ w œladowych iloœciach (2,5 3,9 mg/kg s.m. odpadu), czyli ich zawartoœæ nie przekracza dopuszczalnych standardów glebowych. Pobrane i odpowiednio przygotowane próbki odpadu z do³u urobkowego G-40 charakteryzuj¹ siê bardzo wysok¹ zawartoœci¹ TPH na poziomie 101 842 mg/kg s.m. odpadu. Porównanie zawartoœci poszczególnych zidentyfikowanych wêglowodorów stanowi¹cych zanieczyszczenia ropopochodne w próbkach z do³u urobkowego G-40 wskazuje, e najwiêkszy udzia³ w ogólnej iloœci zanieczyszczeñ ropopochodnych maj¹ wêglowodory z zakresu n-c 13 n-c 18 (11,605 3,936%). Zawartoœæ wêglowodorów z zakresu n-c 7 n-c 12 utrzymywa³a siê na nieznacznie ni szym poziomie od 0,827 do 3,299%, natomiast wêglowodorów ciê kich n-c 21 n-c 36 kszta³towa³a siê w granicach 0,372 1,419%. Analiza chromatograficzna wykaza³a obecnoœæ wêglowodorów trudno biodegradowalnych, tj. pristanu w iloœci 1867 mg/kg s.m. odpadu i fitanu 964 mg/kg s.m. odpadu. Wêglowodory aromatyczne w badanych próbkach wystêpuj¹ w œladowych iloœciach. Zawartoœæ TPH w analizowanych próbkach z do³ów urobkowych zawiera³a siê w granicach; 8,3 10,2%. Ograniczeniem metod biologicznych jest krytyczne stê enie wêglowodorów wynosz¹ce 10%. Przy wy szym stê eniu wêglowodory ropopochodne staj¹ siê toksyczne dla mikroogranizmów (Colleran 1996; Amakiri and Onofeghara 1983; Steliga 2006a). W celu uzyskania efektywnych wyników biodegradacji wêglowodorów ropopochodnych opracowano etapow¹ technologiê oczyszczania zastarza³ych odpadów z do³ów urobkowych zmieszanych z gleb¹. Polega ona na stopniowym obni aniu TPH i wprowadzaniu kolejnych etapów przy mo liwie niskim pu³apie zawartoœci zanieczyszczeñ ropopochodnych (Steliga i in. 2006). Ze wzglêdu na przewa aj¹c¹ zawartoœæ w zanieczyszczeniach ropopochodnych n-alkanów, charakteryzuj¹cych siê podatnoœci¹ na biodegradacjê (Heddlestone i in. 1986; Qudot i in. 1989; Chaîneau i in. 1999), zmianê zawartoœci poszczególnych n-alkanów podczas przebiegu procesu biodegradacji przyjêto jako jeden ze wskaÿników jej efektywnoœci (Steliga 2006a).

94 Proces rozk³adu pristanu wystêpuj¹cego w odpadzie w obecnoœci bakterii rodzaju Acinetobacter i Brevibacterium (wyizolowanych z odpadu G-44 i G-40) przebiega z dynamik¹ zbli on¹ do rozk³adu alifatycznych wêglowodorów o prostych ³añcuchach. Jednak e w z³o- onych mieszaninach wêglowodorów (zanieczyszczenia ropopochodne w odpadach; G-44 i G-40) rozk³ad jego jest znacznie wolniejszy ni pozosta³ych wêglowodorów alifatycznych, a tak e niektórych wêglowodorów aromatycznych (Rittmann 1994; Ko³wzan 2005; Steliga 2006a) i z tego wzglêdu obliczone wartoœci stosunków n-c 17 /Pr i n-c 18 /F przyjêto jako wskaÿniki stopnia biodegradacji n-alkanów. Analiza mineralogiczna odpadów z do³ów urobkowych: G-44 i G-40 wykaza³a obecnoœæ zró nicowanych iloœci kwarcu, skaleni i minera³ów z grupy illitu oraz minera³ów ilastych. Dyfraktogram rentgenowski frakcji ilastej dokumentuje stan wysokiej delaminacji minera³ów o strukturze pêczniej¹cej (smektytu i minera³u mieszanopakietowego smektyt/illit) na podstawie bardzo silnie rozmytego pasma dyfrakcyjnego w zakresie niskok¹tnym 4 10 (2 ) (rys. 1). Minera³ mieszanopakietowy illit/smektyt w postaci pakietów smektytowych wystêpuje w odpadzie z do³u urobkowego G-44 w iloœci 40%, zaœ w odpadzie G-40 85%. Minera³y ilaste zwykle o du ej lepkoœci, niskiej przewodnoœci hydraulicznej, wysokiej wodoch³onnoœci zwiêkszaj¹ sorpcjê zanieczyszczeñ ropopochodnych, która wzrasta wraz z czasem zalegania i utrudnia proces ich biodegradacji (Pettersen i in. 1993; Czekaj i in. 2005). W badanych próbkach odpadów z do³ów urobkowych stwierdzono, e nie ma sprzyjaj¹cych warunków rozwoju flory mikrobiologicznej, gdy proporcje N:P odbiegaj¹ od optymalnych (10:1) i kszta³tuj¹ siê œrednio na poziomie 5:1 dla odpadu z do³u urobkowego G-44 oraz 1:8 dla odpadu z do³u urobkowego G-40, co dowodzi, e procesy mikrobiologiczne s¹ zahamowane i bez korekty iloœci tych sk³adników autochtoniczna flora bakteryjna nie zostanie uaktywniona. Ponadto odczyn (ph) odpadów kszta³tuje siê na poziomie 5,98 6,02 i odbiega od optymalnego, który powinien wynosiæ 7,5 7,8 (Atlas 1981). Wilgotnoœæ odpadu kszta³tuje siê na zadowalaj¹cym poziomie od 22,7 do 30,6%, który jest zbli ony do optymalnej wilgotnoœci gleby wynosz¹cej dla procesu biodegradacji aerobowej 7 24% (Sims i in. 1993). Rys. 1. Dyfraktogram rentgenowski frakcji ilastej < 2 m linia czarna próbka w stanie powietrznie suchym, linia szara preparat glikolowany I/S minera³ mieszanopakietowy illit/smektyt, I illit, Kl kaolinit, Q kwarc Fig. 1. X Ray diffractogramme of clay fraction < 2 micrometers

Analizy chemiczne wykaza³y, e zawartoœæ metali ciê kich oraz fenoli w opadach wiertniczych:g-44 i G-40 nie przekracza dopuszczalnych wartoœci, co dowodzi, e w niniejszych zastarza³ych do³ach urobkowych prowadzono wiercenia metod¹ udarow¹, nie stosuj¹c p³uczek zawieraj¹cych materia³y toksyczne. Badany zastarza³y odpad zmieszany z gleb¹ z do³ów urobkowych; G-44 i G-40 jest silnie zdegradowany, o czym œwiadczy stosunek wêgla do azotu wynosz¹cy odpowiednio dla: G-44 C:N = 690:1 i G-40 C:N = 824:1. Analizy mikrobiologiczne wykonane metod¹ MPN (p < 0,05, n = 5) dla odpadu z do³u G-44 wykaza³y obecnoœæ mikroorganizmów na poziomie 2 10 7 jtk/g odpadu, w tym 9 10 5 jtk/g odpadu mikroorganizmów utleniaj¹cych wêglowodory ropopochodne. Natomiast z odpadzie pochodz¹cym z do³u urobkowego G-40 obliczona ca³kowita liczba mikroorganizmów wynosi³a 1 10 6 jtk/g odpadu, w tym utleniaj¹cych wêglowodory 2 10 5 jtk/g odpadu. Wysoki poziom ska enia substancjami ropopochodnymi dowodzi, e obecnie procesy biodegradacji zosta³y zahamowane pomimo obecnoœci mikroorganizmów rozk³adaj¹cych wêglowodory ropopochodne. 95 4. Wyniki i dyskusja 4.1. Omówienie wyników badañ procesu biodegradacji zanieczyszczeñ ropopochodnych w odpadzie z do³u urobkowego G-44 Wstêpna faza rekultywacji wykonywana zgodnie z opracowanym projektem rekultywacyjnym GN. 6018-1-15/04 z dnia 20.12.2004 zatwierdzonym przez Starostê Brzozowskiego, polega³a na przeprowadzeniu drena u melioracyjno-odciekowego na oczyszczanym terenie do³u urobkowego G-44 oraz modyfikacji struktury odpadu. Drena melioracyjno-odciekowy polega³ na odzysku zanieczyszczeñ ropopochodnych poprzez wykonanie rowów odciekowych na g³êbokoœci 1,2 1,4 m i drena u terenu do³u urobkowego G-44 za pomoc¹ rur melioracyjnych, które zosta³y zamontowane na ró nych g³êbokoœciach (40, 80, 100, 130 cm ppt). Zanieczyszczenia ropopochodne wraz z wod¹ z rowów odciekowych zbierano w ³apaczkach zamontowanych w dolnej czêœci rekultywowanego terenu. Badana mineralogiczne odpadu z do³u urobkowego G-44 wykaza³y wysok¹ zawartoœæ minera³ów ilastych i z tego wzglêdu po osuszeniu terenu do³u G-44 przyst¹piono do modyfikacji struktury odpadu poprzez zmieszanie go z czyst¹ ziemi¹ (nie zawieraj¹c¹ zanieczyszczeñ ropopochodnych) w odpowiednich proporcjach (10:1) ustalonych w badaniach laboratoryjnych na podstawie analiz rentgenowskich frakcji ilastej. Zabieg ten mia³ na celu rozluÿnienie struktury odpadu i zwiêkszenie biodostêpnoœci dla mikroorganizmów i substancji od ywczych do zanieczyszczeñ ropopochodnych.

96 W wyniku zabiegu wstêpnej rekultywacji, prowadzonego w ca³ej objêtoœci oczyszczanego odpadu z do³u urobkowego G-44, zawartoœæ TPH uleg³a obni eniu o 46,9% do 44 394 mg/kg s.m. odpadu, co umo liwi³o przeprowadzenie dalszych etapów oczyszczania. Odpad z do³u urobkowego G-44 po procesie wstêpnej rekultywacji pos³u y³ jako materia³ w badaniach laboratoryjnych (metoda ex-situ) przebiegu procesu biodegradacji zanieczyszczeñ ropopochodnych. Odpad G-44 na stanowisku badawczym poddano procesowi bioremediacji podstawowej stymulowanej poprzez napowietrzanie oraz stworzenie optymalnych warunków pokarmowych, wodnych, ustalenie odpowiedniego odczynu, a tak e warunków termicznych. Zapotrzebowanie na tlen odpadu zanieczyszczonego substancjami ropopochodnymi jest wielokrotnie wiêksze ni analogicznej gleby wolnej od zanieczyszczeñ i jego niedostatek jest istotnym czynnikiem ograniczaj¹cym intensywnoœæ bioremediacji (Colleran 1996). W celu osi¹gniêcia odpowiedniego odczynu na poziomie ph ~7,4 oraz stosunku azotu do fosforu (1:10) w odpadzie dozowano wapno nawozowe i nawóz mineralny (Azofoska o sk³adzie: NO 2 -N 7,5%, NH 3 -N 10,5%, P 2 O 5 -P 11%, K 2 O 19,1%, K 2 SO 4 4,4% oraz mikroelementy: 0,17% Fe, 0,27% Mn, 0,18% Cu, 0,045% Zn, 0,045% B), których dawki okreœlono na podstawie badañ laboratoryjnych. Wapno nawozowe dozowano w iloœci oko³o 3,0 3,5 g/kg odpadu, zaœ dawka nawozu mineralnego Azofoski wynosi³a 1,0 1,5 g/kg odpadu. Wapñ pochodz¹cy z wêglanu wapnia sprzyja tworzeniu siê struktury gruze³kowej powoduj¹c koagulacjê koloidów glebowych, dziêki czemu poprawiaj¹ siê warunki powietrzno- -wodne w odpadzie. Wp³ywa on tak e na odczyn odpadu i zwiêksza prze ywalnoœæ mikroorganizmów poprzez ochronê ich b³on komórkowych przed dezintegruj¹cym wp³ywem wêglowodorów alifatycznych (Kurek i in. 1998). Temperaturê wewn¹trz pryzmy utrzymywano na poziomie 17 20 C, gdy tak¹ wartoœæ temperatury przyjêto jako mo liw¹ do osi¹gniêcia w warunkach terenowych w sezonie letnim w umiarkowanej strefie klimatycznej. Temperatura jest czynnikiem, od którego zale y aktywnoœæ drobnoustrojów, a tym samym intensywnoœæ rozk³adu wêglowodorów. Podczas przebiegu procesów bioremediacyjnych optymalny zakres temperatur dla wiêkszoœci bakterii wynosi 20 38 C (Bossert i in. 1984; Zhou i in. 1995; Colleran 1996). Wilgotnoœæ utrzymywano na poziomie zbli onym do optymalnego 20 25% stosuj¹c zraszanie wod¹. W wyniku prowadzonego w warunkach laboratoryjnych (metoda ex-situ) procesu bioremediacji podstawowej, stymulowanej poprzez dobór optymalnych parametrów jej przebiegu, na podstawie wykonanych analiz chromatograficznych mo na stwierdziæ, e w pocz¹tkowym etapie prowadzenia procesu osi¹gniêto najwy szy stopieñ obni enia zawartoœci TPH, który kszta³tuje siê nastêpuj¹co: po 30 dniach 19,1%, po 40 dniach 31,7%, po 70 dniach 52,0%, po 90 dniach 61,8%. Nastêpnie tempo procesu biodegradacji spada i obni enie TPH utrzymuje siê na sta³ym poziomie. W wyniku prowadzonego procesu nast¹pi³a znaczna redukcja zanieczyszczeñ zawartych w mocno zdegradowanym odpadzie wiertniczym zmieszanym z gleb¹ z 44 394 do 15 499 mg/kg s.m. odpadu (rys. 2). Najwy szy

97 Rys. 2. Obni enie zawartoœci TPH (C/C H ) po normalizacji hopanem w kolejnych etapach biodegradacji odpadu z do³u urobkowego G-44 (liczba powtórzeñ pomiarów n =4 6,p < 0,05) Fig. 2. Reduction in TPH (C/C H ) quantity after hopane normalization in biodegradation phases of G-44 waste (number of repetitions n = 4 6, p <0.05) stopieñ obni enia zawartoœci wêglowodorów zanotowano dla szeregu alifatycznego n-c 13 n-c 22 w zakresie 65,5 76,5%, a w przypadku ciê szych wêglowodorów o d³ugoœci ³añcucha od n-c 21 do n-c 36 biodegradacja zachodzi³a w granicach 26,7 55,9% (rys. 3). Bioremediacja podstawowa polegaj¹ca na uaktywnieniu jedynie naturalnej mikroflory ska onego terenu, co wykorzystano do obni enia koncentracji zanieczyszczeñ ropopochodnych, spowodowa³a wzrost liczebnoœci mikroorganizmów utleniaj¹cych wêglowodory ropopochodne z 9 10 5 do 8 10 6 jtk/g odpadu. Na podstawie przeprowadzonych badañ mikrobiologicznych odpadu z do³u urobkowego G-44 w po³¹czeniu z wynikami analiz chromatograficznych zanieczyszczeñ ropopochodnych zawartych w odpadzie, opracowano biopreparat G-44 z wyizolowanych, wyselekcjonowanych i namno onych mikroorganizmów autochtonicznych ukierunkowanych na biodegradacjê zidentyfikowanych wczeœniej zanieczyszczeñ ropopochodnych. Przy opracowaniu biopreparatu badania mikrobiologiczne by³y ukierunkowane pod k¹tem: ruchliwoœci mikroorganizmów, zdolnoœci wzrostu w warunkach tlenowych i beztlenowych, zdolnoœci wzrostu w szerokim zakresie temperatur, zdolnoœci wykorzystywania wêglowodorów ropopochodnych jako jedynego Ÿród³a wêgla w procesach yciowych (Steliga 2006a). Opracowany biopreparat zawiera³ 27 kultur bakteryjnych pochodz¹cych z odpadu z do³u urobkowego G-44 nale ¹cych do najaktywniejszych bakterii (Atlas 1984, Liu; i in. 1993; Korda i in. 1997; Rahman i in. 2002) rodzajów: Acinetobacter sp., Alcaligenes sp., Bacillus sp., Flavobacterium sp., Mycobacterium sp., Nocardia sp., Peudomonas sp., Rhodococcus sp. i Sphingomonas sp. Biopreparat G-44 sporz¹dzono w postaci aktywnej zawiesiny o stê eniu 1 10 9 j kt/cm 3. Biopreparat zosta³ przebadany na obecnoœæ mikroorganizmów patogennych i potencjalnie chorobotwórczych. Etap bioaugmentacji w ramach procesu oczyszczania odpadu z do³u urobkowego G-44, realizowany przez inokulacjê biopreparatem G-44 sporz¹dzonym na bazie mikroorganiz-

98 mów autochtonicznych, w warunkach laboratoryjnych przeprowadzono przez okres 130 dni (rys. 3). Umo liwi³ on obni enie zawartoœci TPH do poziomu 1 279 mg/kg s.m. odpadu zbli onego do poziomu t³a na otaczaj¹cym terenie. Analiza chromatograficzna wykaza³a, e najszybciej zachodzi biodegradacja wêglowodorów alifatycznych (n-alkanów) o d³ugoœci ³añcucha wêglowego n-c 13 n-c 22,któres¹ substancjami najchêtniej wykorzystywanymi przez mikroorganizmy. Stopieñ obni enia ich zawartoœci mieœci siê w przedziale; 93,1 97,3%. Wêglowodory z zakresu n-c 23 n-c 30 ulegaj¹ biodegradacji w nieco mniejszym, lecz tak e w wysokim stopniu (73,7 87,2%), natomiast n-alkany zawieraj¹ce powy ej 30 atomów wêgla w cz¹steczce, które s¹ odporne na biodegradacjê (Pollard i in. 1999; Wilson i in. 1986; Heddlestone i in. 1986; Rehm i in. 1981), równie ulegaj¹ biodegradacji w granicach 53,9 62,4%. Przedstawione wyniki badañ dowodz¹, e opracowany biopreparat G-44 posiada wysok¹ efektywnoœæ oraz szerokie spektrum dzia³ania, gdy obni enie zawartoœci jest widoczne prawie dla wszystkich n-alkanów wchodz¹cych w sk³ad zanieczyszczeñ ropopochodnych w oczyszczanym odpadzie G-44 (rys. 3). Obliczone wskaÿniki oceny stopnia biodegradacji n-alkanów wchodz¹cych w sk³ad zanieczyszczeñ ropopochodnych (n-c 17 /Pr i n-c 18 /F) w kolejnych etapach oczyszczania Rys. 3. Porównanie zmian zawartoœci n-alkanów po przeprowadzeniu kolejnych etapów oczyszczania odpadu z do³u urobkowego G-44 w warunkach laboratoryjnych (metoda ex-situ). (liczba powtórzeñ pomiarów n = 6 8, p < 0,05) Fig. 3. Petroleum hydrocarbon (n-alkanes) content in subsequent waste purification stages. Waste from G-44 purifiend in laboratory conditions (ex-situ method) (number of repetitions n = 6 8, p <0.05)

odpadu wiertniczego G-44 ulegaj¹ odpowiednio zmniejszeniu (tab. 1), co dowodzi, e biodegradacja przebiega na zadowalaj¹cym poziomie. Analiza mikrobiologiczna wykaza³a, e w wyniku przeprowadzonej inokulacji biopreparatem na bazie mikroorganizmów autochtonicznych wzros³a liczba mikroorganizmów utleniaj¹cych wêglowodory do poziomu 7 10 7 jtk/g odpadu. W celu opracowania matematycznego modelu przebiegu procesu biodegradacji TPH w kolejnych etapach oczyszczania w badaniach laboratoryjnych zastosowano biomarker C 30 17 (H),21 (H)-hopan, wzglêdem którego przeprowadzono normalizacjê koncentracji TPH oznaczanej w trakcie przebiegu poszczególnych etapów procesu biodegradacji. Przebieg procesu biodegradacji TPH w odpadzie z do³u urobkowego G-44 (obejmuj¹cego bioremediacjê podstawow¹ i inokulacjê biopreparatem G-44) opisano równaniem [1]. Poszczególne wspó³czynniki niniejszego równania (k, (C/C H ) 0 ) oraz wspó³czynniki korelacji (r 2 ) dla kolejnych etapów oczyszczania zestawiono w tabeli 2. Sta³a biodegradacji pierwszego rzêdu (k) podczas etapu bioremediacji podstawowej wynosi 0,0087 [d 1 ], zaœ przy bioaugmentacji biopreparatem G-44 bazie mikroorganizmów autochtonicznych 0,0162 [d 1 ]. Sta³a biodegradacji pierwszego rzêdu (k) jest wy sza podczas etapu bioaugmentacji 99 TABELA 1 Zestawienie wskaÿników okreœlaj¹cych stopieñ biodegradacji n-alkanów po przeprowadzeniu kolejnych etapów oczyszczania odpadu z do³u urobkowego G-44 w warunkach laboratoryjnych (metoda ex-situ) TABLE 1 Indicators of pertoleum hydrocarbon biodegradation for subsequent purification stages. G-44 pit waste material purification. Laboratory conditions (ex-situ metod) WskaŸnik Po wstêpnej rekultywacji Po bioremediacji podstawowej Po inokulacji mikroorganizmami autochtonicznymi n-c 17 /Pr 3,938 ± 0,389 0,659 ± 0,035 0,054 ±.0,005 n-c 18 /F 7,637 ± 0,645 1,666 ± 0,133 0,179 ± 0,014 TABELA 2 Zestawienie wspó³czynników równania modelu matematycznego biodegradacji TPH w kolejnych etapach procesu oczyszczania odpadu G-44 TABLE 2 Comparison of first order reaction rates of biodegradation model in subsequent purification stages G-44 pit waste material purification Etap oczyszczania k [d 1 ] (C/C H ) 0 Wspó³czynnik korelacji r 2 Bioremediacja podstawowa (G-44) 0,0087 ± 0,002 6814 ± 405 0,9579 Bioaugmentacja biopreparatem (G-44) 0,0162 ± 0,011 2539 ± 189 0,9783

100 biopreparatem G-44 na bazie mikroorganizmów autochtonicznych, co œwiadczy o wy szej dynamice przebiegu tego procesu. Wspó³czynniki korelacji wynosz¹ odpowiednio; 0,9579 i 0,9783, co œwiadczy o zadowalaj¹cym dopasowaniu punktów pomiarowych z poszczególnych etapów biodegradacji TPH do krzywych opisanych równaniem [1] (rys. 2). Prawid³owoœæ postêpowania podczas próby opracowania modelu matematycznego biodegradacji TPH potwierdzaj¹ doniesienia literaturowe (Venosa i in. 1996, 1997; Xu i in. 2004). Przeprowadzone badania w warunkach laboratoryjnych stanowi¹ podstawê opracowania wytycznych prowadzenia procesu biodegradacji substancji ropopochodnych z odpadu pochodz¹cego z do³u urobkowego G-44 w warunkach przemys³owych metod¹ in-situ (Steliga 2006a; Siuta 2003). Proces bioremediacji podstawowej przeprowadzono poprzez dawkowanie wapna nawozowego, a nastêpnie nawozów mineralnych w dawkach ustalonych w badaniach laboratoryjnych. Prowadzono ci¹g³y monitoring w³aœciwoœci fizykochemicznych oczyszczanego odpadu, staraj¹c siê zachowaæ optymalne wartoœci parametrów ph ~7,5 oraz N:P = 10:1 poprzez stosowanie korekty wyznaczonych dawek substancji biogennych. W okresie letnim, przy zbyt ma³ej iloœci opadów, stosowano zraszanie oczyszczanego terenu wod¹ w celu utrzymania optymalnej wilgotnoœci odpadu. Proces biodegradacji podstawowej w warunkach terenowych prowadzono przez okres 10 miesiêcy dozuj¹c substancje biogenne w okresie wiosennym i jesiennym. Zawartoœæ zanieczyszczeñ ropopochodnych monitorowano przez ca³y okres trwania procesu wykonuj¹c analizy chromatograficzne. W wyniku prowadzonego procesu uzyskano obni enie zawartoœci TPH do poziomu 21 458 mg/kg s.m. odpadu, co stanowi 51,6% redukcji. Po procesie biodegradacji podstawowej najwy szy stopieñ obni enia zawartoœci zanieczyszczeñ ropopochodnych zanotowano dla wêglowodorów alifatycznych (n-alkanów) n-c 13 n-c 22 w zakresie 48,5 69,9%. Wêglowodory ciê kie o d³ugoœci ³añcucha od n-c 23 do n-c 38 ulegaj¹ trudniej biodegradacji i stopieñ ich rozk³adu wynosi: 21,5 38,7% (rys. 4). W nastêpnym roku prowadzenia procesu oczyszczania, w okresie wiosennym, rozpoczêto proces inokulacji biopreparatem G-44 na bazie mikroorganizmów autochtonicznych, realizuj¹c go w dwóch seriach w odstêpach 3-miesiêcznych. Biopreparat G-44 rozprowadzano w warstwie napowierzchniowej oraz stosowano jego dozowania w wg³êbne warstwy do³u urobkowego G-44. W wyniku prowadzenia procesu oczyszczania odpadu z do³u urobkowego G-44 uzyskano obni enie zawartoœci TPH do poziomu 1259 mg/kg s.m. odpadu zbli onego na otaczaj¹cym terenie ( t³a ). Najszybciej zachodzi³a biodegradacja n-alkanów o d³ugoœci ³añcucha wêglowego n-c 13 n-c 22, dla których stopieñ obni enia zawiera siê w przedziale 79,1 91,2%. Wêglowodory ciê kie n-c 23 do n-c 38 ulegaj¹ równie biodegradacji w wysokim stopniu w granicach 59,8 72,3%, co dowodzi szerokiego spektrum dzia³ania w warunkach przemys³owych opracowanego biopreparatu G-44 (rys. 4). Odnotowane w warunkach przemys³owych (metoda in-situ) zmniejszenie wartoœci stosunków n-c 17 /Pr i n-c 18 /F w stopniu tylko nieznacznie ni szym w porównaniu z warunkami

101 Rys. 4. Porównanie zmian zawartoœci n-alkanów po prowadzeniu kolejnych etapów oczyszczania odpadu zdo³uurobkowegog-44wwarunkachprzemys³owych (metoda in-situ) (liczba powtórzeñ pomiarów n = 8 10, p <0,05) Fig. 4. Petroleum hydrocarbon (n-alkanes) content in subsequent waste purification stages. Waste from G-44 purifiend in the field conditions (in-situ method) (number of repetitions n = 8 10, p <0.05) laboratoryjnymi (metoda ex-situ) œwiadczy, e biodegradacja n-alkanów zachodzi na podobnym poziomie (tab. 1 i 3). Pe³na kontrola procesu oczyszczania odpadu z do³u urobkowego G-44 i wyd³u enie czasu jego trwania umo liwia osi¹gniêcie w warunkach przemys³owych (metoda in-situ) prognozowanego stopnia biodegradacji zanieczyszczeñ ropopochodnych. TABELA 3 Zestawienie wskaÿników okreœlaj¹cych stopieñ biodegradacji n-alkanów po przeprowadzeniu kolejnych etapów procesu oczyszczania odpadu z do³u urobkowego G-44 w warunkach przemys³owych (metoda in-situ) TABLE 3 Indicators of pertoleum hydrocarbon (n-alkanes) biodegradation for subsequent purification stages. G-44 pit waste material purification. The field process (in-situ method) WskaŸnik Po wstêpnej rekultywacji Po bioremediacji podstawowej Po inokulacji mikroorganizmami autochtonicznymi n-c 17 /Pr 4,028 ± 0,308 0,863 ± 0,048 0,109 ± 0,019 n-c 18 /F 7,466± 0,635 1,980 ± 0,125 0,192 ± 0,024

102 Rekultywacjê gruntu na dole urobkowym G-44 uznano za zakoñczon¹ na podstawie decyzji GN.6018-1-3/06 z dnia 25.05.2006 wydanej przez Starostê Brzozowskiego. 4.2. Omówienie wyników badañ procesu biodegradacji zanieczyszczeñ ropopochodnych w odpadzie z do³u urobkowego G-40 W wyniku przeprowadzonego na dole urobkowym G-40 zabiegu rekultywacyjnego, zgodnie z projektem rekultywacyjnym GN.6018-1-1/06 z dnia 27.02. 2006 r. zatwierdzonym przez Starostê Brzozowskiego, obejmuj¹cego wykonanie drena u odciekowo-melioracyjnego w ca³ej objêtoœci oczyszczanego odpadu z do³u urobkowego G-40, uzyskano obni enie zawartoœci zanieczyszczeñ ropopochodnych (TPH) do poziomu 37 245 mg/kg s.m. odpadu, co stanowi 63,4% redukcji. Ze wzglêdu na wysok¹ zawartoœæ w odpadzie z do³u urobkowego G-40 zanieczyszczeñ ropopochodnych oraz minera³ów ilastych o pêczniej¹cej strukturze (rys. 1), po osuszeniu terenu do³u G-40 podjêto dzia³ania maj¹ce na celu modyfikacjê struktury odpadu. Polega³y one na zmieszaniu odpadu z do³u urobkowego G-40 z czyst¹ ziemi¹ (nie zawieraj¹c¹ zanieczyszczeñ ropopochodnych) w optymalnym stosunku okreœlonym na podstawie badañ laboratoryjnych wynosz¹cym 7:1. Po przeprowadzonych zabiegach odpad G-40 pos³u y³ jako materia³ badawczy w badaniach laboratoryjnych (metoda ex-situ). W wyniku prowadzonego w warunkach laboratoryjnych procesu oczyszczania odpadu z do³u urobkowego G-40, podczas etapu bioremediacji podstawowej stymulowanej poprzez biowentelacjê (dostarczanie tlenu przez napowietrzanie) oraz wzbogacanie œrodowiska glebowego w sk³adniki biogenne wspomagaj¹ce rozwój Rys. 5. Obni enie zawartoœci TPH (C/C H ) po normalizacji hopanem w kolejnych etapach biodegradacji odpadu G-40 (liczba powtórzeñ pomiarów n = 4 6, p < 0,05) Fig. 5. Reduction in TPH (C/C H ) quantity after hopane normalization in biodegradation phases of G-40 waste (number of repetitions n = 4 6, p < 0.05)

mikroflory autochtonicznej, na podstawie wykonanych analiz chromatograficznych mo - na stwierdziæ, e po okresie 80 dni nast¹pi³a znaczna redukcja (63,8%) TPH z 37 245 do 13 458 mg/kg s.m. odpadu. Podczas dalszego przebiegu procesu oczyszczania dynamika biodegradacji zmniejszy³a siê i utrzymywa³a siê na zbli onym poziomie (rys. 5). Najwy szy stopieñ obni enia zawartoœci n-alkanów zanotowano dla n-c 10 n-c 20 w zakresie 59,5 74,5%, a w przypadku ciê szych wêglowodorów o d³ugoœci ³añcucha wêglowego od n-c 21 n-c 36 biodegradacja zachodzi³a w granicach 23,2 38,7% (rys. 6). Dziêki po³¹czeniu uzyskanych wyników z badañ mikrobiologicznych odpadu z do³u urobkowego G-40 i analiz chromatograficznych zanieczyszczeñ ropopochodnych zawartych w odpadzie, opracowano biopreparat G-40 z wyizolowanych, wyselekcjonowanych i namno onych mikroorganizmów autochtonicznych zawieraj¹cy 17 aktywnych kultur bakteryjnych. Etap oczyszczania odpadu z do³u urobkowego G-40 poprzez inokulacjê biopreparatem G-40 prowadzono przez okres 120 dni. Analiza chromatograficzna wykaza³a, e po tym okresie dynamika procesu biodegradacji uleg³a zmniejszeniu i zawartoœæ TPH wynosi³a 1 267 mg/kg s.m. odpadu. Najszybciej zachodzi³a biodegradacja wêglowodorów alifatycznych (n-alkanów) o d³ugoœci ³añcucha wêglowego n-c 13 n-c 22, gdy stopieñ obni enia ich zawartoœci zawiera³ siê w przedziale 82,3 97,1%. Wêglowodory z zakresu n-c 24 n-c 36 ulega³y biodegradacji w nieco mniej- 103 Rys. 6. Porównanie zawartoœci n-alkanów po przeprowadzeniu kolejnych etapów oczyszczania odpadu z do³u urobkowego G-40 w warunkach laboratoryjnych (metoda ex-situ) (liczba powtórzeñ pomiarów n = 6 8, p < 0,05) Fig. 6. Petroleum hydrocarbon (n-alkanes) content in subsequent waste purification stages. Waste from G-40 purifiend in laboratory conditions (ex-situ method) (number of repetitions n = 6 8, p < 0.05)

104 szym, lecz tak e wysokim stopniu (57,6 71,2%), co dowodzi, e opracowany biopreparat G-40 posiada wysok¹ efektywnoœæ oraz szerokie spektrum dzia³ania i nadaje siê do stosowania w warunkach przemys³owych (rys. 6). Obliczone na podstawie analiz chromatograficznych wskaÿniki oceny stopnia biodegradacji n-alkanów (n-c 17 /Pr i n-c 18 /F) w kolejnych etapach oczyszczania odpadu G-40 ulegaj¹ odpowiednio zmniejszeniu, co upowa nia do stwierdzenia, e ich biodegradacja przebiega na zadowalaj¹cym poziomie (tab. 4). W celu okreœlenia szybkoœci biodegradacji TPH w badaniach laboratoryjnych zastosowano biomarker C 30 17 (H),21 (H)-hopan, wzglêdem którego przeprowadzono normalizacjê koncentracji analitu TPH zmieniaj¹cej siê w trakcie prowadzenia kolejnych etapów procesu oczyszczania. Kinetykê biodegradacji TPH w kolejnych etapach oczyszczania odpadu G-40 (bioremediacji podstawowej i inokulacji biopreparatem G-40) opisano za pomoc¹ równania [1], którego wspó³czynniki przedstawiono w tabeli 5. Sta³a biodegradacji pierwszego rzêdu (k) podczas etapu bioremediacji podstawowej wynosi 0,0096 [d 1 ], zaœ przy bioaugmentacji biopreparatem G-40 kszta³tuje siê na poziomie 0,0131 [d 1 ]. Wspó³czynniki korelacji (r 2 ) TABELA 4 Zestawienie wskaÿników okreœlaj¹cych stopieñ biodegradacji n-alkanów po przeprowadzeniu kolejnych etapów procesu oczyszczania odpadu z do³u urobkowego G-40 w warunkach laboratoryjnych (metoda ex-situ) TABLE 4 Indicators of pertoleum hydrocarbon biodegradation for subsequent purification stages. G-40 pit waste material purification. Laboratory conditions (ex-situ metod) WskaŸnik Po wstêpnej rekultywacji Po bioremediacji podstawowej Po inokulacji mikroorganizmami autochtonicznymi n-c 17 /Pr 4,154 ± 0,294 1,047 ± 0,063 0,077 ± 0,008 n-c 18 /F 5,401 ± 0,485 1,906 ±0,156 0,162 ± 0,014 TABELA 5 Zestawienie wspó³czynników równania modelu matematycznego biodegradacji TPH w kolejnych etapach procesu oczyszczania odpadu G-40 TABLE 5 Comparison of first order reaction rates of biodegradation model in subsequent purification stages G-40 pit waste material purification Etap oczyszczania k [d 1 ] (C/C H ) 0 Wspó³czynnik korelacji r 2 Bioremediacja podstawowa (G-40) 0,0096 ± 0,003 5604 ± 399 0,9497 Bioaugmentacja biopreparatem (G-40) 0,0131 ± 0,009 1961 ± 187 0,9945

105 dowodz¹ o zadowalaj¹cym dopasowaniu punktów pomiarowych z poszczególnych etapów biodegradacji TPH do krzywych opisanych równaniem [1] (rys. 5). Z porównania matematycznych modeli pierwszorzêdowej biodegradacji TPH, wynika, e biodegradacja zanieczyszczeñ ropopochodnych w odpadach z do³u urobkowego G-44 i G-40 w poszczególnych etapach przebiega w podobnym tempie (tab. 2 i 5). Przeprowadzone badania w warunkach laboratoryjnych (metoda ex-situ), podobnie jak w przypadku oczyszczania do³u urobkowego G-44, pozwoli³y na opracowanie wytycznych prowadzenia procesu oczyszczania z zanieczyszczeñ ropopochodnych odpadu z do³u urobkowego G-40 w warunkach przemys³owych realizowanych metod¹ in-situ. Proces bioremediacji podstawowej przeprowadzono poprzez dawkowanie wapna nawozowego, a nastêpnie nawozu mineralnego (Azofoska) w dawkach ustalonych w badaniach laboratoryjnych. W trakcie procesu prowadzono ci¹g³y monitoring w³aœciwoœci fizykochemicznych oczyszczanego odpadu, staraj¹c siê zachowaæ optymalne wartoœci odczynu odpadu oraz stosunku N:P poprzez korektê wyznaczonych dawek. W okresie letnim, przy zbyt ma³ej iloœci opadów, stosowano zraszanie oczyszczanego terenu wod¹ w celu utrzymania optymalnej wilgotnoœci odpadu. Proces bioremediacji podstawowej w warunkach przemys³owych prowadzono przez okres 10 miesiêcy w okresie wiosennym i jesiennym. Zawartoœæ TPH monitorowano przez ca³y okres trwania procesu wykonuj¹c analizy chromatograficzne. W wyniku prowadzonego procesu uzyskano obni enie zawartoœci TPH do poziomu 19 106 mg/kg s.m. odpadu, co stanowi 51,3% redukcji. Po procesie bioremediacji podstawowej najwy szy stopieñ obni enia zawartoœci zanieczyszczeñ ropopochodnych zanotowano dla n-alkanów o d³ugoœci ³añcucha wêglowego n-c 10 n-c 20 w zakresie 46,5 67,9%. Wêglowodory ciê kie o d³ugoœci ³añcucha wêglowego od n-c 21 do n-c 36 ulegaj¹ trudniej biodegradacji i stopieñ ich rozk³adu kszta³tuje siê na poziomie 15,7 37,6% (rys. 7). W okresie letnim rozpoczêto proces inokulacji biopreparatem G-40 na bazie mikroorganizmów autochtonicznych i prowadzono go w dwóch seriach w odstêpach 3-miesiêcznych, stosuj¹c napowierzchniowe i wg³êbne jego dozowanie. W trakcie prowadzenia procesu oczyszczania (inokulacji biopreparatem G-40) uzyskano obni enie zawartoœci TPH z 19 106 do 8658 mg/kg s.m. odpadu. W nastêpnym roku zabiegi rekultywacyjne na dole urobkowym G-40 prowadzono na podstawie uzyskanego zezwolenia na prowadzenie dzia³alnoœci w zakresie unieszkodliwiania odpadów na dole urobkowym G-40 metod¹ in-situ (Nr SR. 7644-1-8/07 z dnia 13 marca 2007) zgodnie z rozporz¹dzeniem Ministra Œrodowiska z dnia 21 marca 2006 w sprawie odzysku i unieszkodliwiania odpadów poza instalacjami i urz¹dzeniami). W wyniku prowadzonego procesu oczyszczania (inokulacji biopreparatem G-40) uzyskano obni enie zawartoœci TPH z 8 658 do 1 215 mg/kg s.m. odpadu, czyli do poziomu zbli onego na otaczaj¹cym go terenie. Najszybciej zachodzi³a biodegradacja n-alkanów o d³ugoœci ³añcucha wêglowego n-c 12 n-c 22, dla których stopieñ ich obni enia zawiera³ siê w przedziale 71,8 87,4%. Wêglowodory ciê kie ulegaj¹ równie biodegradacji w wysokim stopniu w granicach 43,6 69,8%, co dowodzi szerokiego spektrum dzia³ania opracowanego biopreparatu G-40 (rys. 7).

106 Rys. 7. Porównanie zawartoœci n-alkanów po przeprowadzeniu kolejnych etapów oczyszczania odpadu z do³u urobkowego G-40 w warunkach przemys³owych (metoda in-situ) (liczba powtórzeñ pomiarów n = 8 10, p <0,05) Fig. 7. Petroleum hydrocarbon (n-alkanes) content in subsequent waste purification stages. Waste from G-40 purifiend in the field conditions (in-situ method) (number of repetitions n = 8 10, p <0.05 Na podstawie badañ mikrobiologicznych przeprowadzonych w trakcie procesu biodegradacji TPH w odpadzie pochodz¹cym z do³u urobkowego G-40 zanotowano wzrost liczby mikroorganizmów utleniaj¹cych wêglowodory z 2 10 5 do 1 10 7 jtk/g odpadu. Rekultywacjê gruntu na dole urobkowym G-40 uznano za zakoñczon¹ na podstawie decyzji GN.6018-1-11/07 z dnia 13.11.2007 wydanej przez Starostê Brzozowskiego. TABELA 6 Zestawienie wskaÿników okreœlaj¹cych stopieñ biodegradacji n-alkanów po przeprowadzeniu kolejnych etapów procesu oczyszczania odpadu z do³u urobkowego G-40 w warunkach przemys³owych (metoda in-situ) TABLE 6 Indicators of pertoleum hydrocarbon (n-alkanes) biodegradation for subsequent purification stages. G-40 pit waste material purification. The field process (in-situ method) WskaŸnik Po wstêpnej rekultywacji Po bioremediacji podstawowej Po inokulacji mikroorganizmami autochtonicznymi n-c 17 /Pr 4,030 ± 0,295 1,370 ± 0,091 0,110 ± 0,009 n-c 18 /F 5,436 ± 0,498 2,046 ± 0,164 0,239 ± 0,026

107 Odnotowane zmniejszenie wartoœci stosunków n-c 17 /Pr i n-c 18 /F wyznaczonych na podstawie analiz chromatograficznych œwiadczy o zadawalaj¹cym stopniu biodegradacji n-alkanów wchodz¹cych w sk³ad zanieczyszczeñ ropopochodnych (tab. 6). Porównywanie wartoœci stosunków n-c 17 /Pr i n-c 18 /F (tab. 4 i 6) po kolejnych procesach oczyszczania realizowanych metod¹ ex-situ (w skali laboratoryjnej) i metod¹ in-situ (w warunkach terenowych) dowodz¹ o mo liwoœci optymalizacji metody in-situ w skali przemys³owej na podstawie wyników uzyskanych w warunkach laboratoryjnych. Opracowane modele pierwszorzêdowej biodegradacji TPH w warunkach laboratoryjnych (metoda ex-situ) mog¹ byæ pomocne w prognozowaniu efektów biodegradacji TPH w warunkach terenowych (metoda in-situ), co mo na stwierdziæ na podstawie przeprowadzonych badañ obejmuj¹cych zró nicowane pod k¹tem stopnia ska enia substancjami ropopochodnymi odpady z do³ów urobkowych G-44 i G-40 Podsumowanie Przedstawione wyniki dowodz¹ prawid³owoœci podjêtych decyzji o zastosowaniu do oczyszczania odpadów z do³ów urobkowych G-44 i G-40 etapowej technologii oczyszczania odpadów wiertniczych/gleby z zanieczyszczeñ ropopochodnych metod¹ in-situ, którazosta³a objêta zg³oszeniem patentowym z dnia 28 stycznia 2005 Nr P 372501. Obni enie zawartoœci TPH w odpadach z do³ów urobkowych G-44 i G-40 do poziomu zbli onego do t³a okreœlonego dla s¹siaduj¹cych terenów uzyskano dziêki optymalizacji czynników maj¹cych wp³yw na przebieg procesu biodegradacji substancji ropopochodnych. Chocia przetransponowanie wyników badañ laboratoryjnych (metoda ex-situ) na potrzeby oczyszczania odpadów wiertniczych w terenie (metod¹ in-situ) nie jest ³atwe ze wzglêdu na du ¹ z³o onoœæ i koniecznoœæ brania pod uwagê wielu uwarunkowañ oraz opracowanie sposobów skutecznego sterowania przebiegiem biodegradacji zanieczyszczeñ ropopochodnych, to jednak pozwalaj¹ one na: kontrolê przebiegu procesów oczyszczania odpadu wiertniczego z do³u urobkowego, dobór optymalnych dawek wapna nawozowego i nawozów mineralnych, wstêpne okreœlenie ram czasowych prowadzenia poszczególnych etapów oczyszczania, zapoznanie siê z efektywnoœci¹ opracowanego biopreparatu na bazie mikroorganizmów autochtonicznych. Zastowanie biomarkera (C 30 17 (H),21 (H)-hopan) do normalizacji stê eñ TPH w trakcie przebiegu poszczególnych etapów oczyszczania odpadu pozwoli³o na przedstawienie pierwszorzêdowego modelu biodegradacji TPH i porównanie kinetyki biodegradacji TPH w odpadach pochodz¹cych z do³ów urobkowych G-44 i G-40. Opracowana metoda chromatograficznego oznaczania zanieczyszczeñ ropopochodnych w odpadzie wiertniczym/glebie stwarza mo liwoœæ pe³nej kontroli przebiegu oczyszczania. Pozwala ona równie na uchwycenie zmian zawartoœci n-alkanów wchodz¹cych w sk³ad