Folia Medica. Lodziensia. tom 41 numer 1 2014. Lódzkie Towarzystwo Naukowe

Folia Medica Lodziensia tom 41 numer 1 2014 Lódzkie Towarzystwo Naukowe

Redakcja Naczelna Wydawnictw Łódzkiego Towarzystwa Naukowego Krystyna Czyżewska, Henryk Piekarski, Edward Karasiński, ŁÓDZKIE Wanda M. Krajewska TOWARZYSTWO (Redaktor Naczelny) NAUKOWE, Jan Szymczak 90-505 Łódź, ul. M. Curie-Skłodowskiej 11 tel. 90-505 (42) 665-54-59; Łódź, ul. M. tel./fax Curie-Skłodowskiej (42) 665-54-64 11 tel. 42 665-54-59; tel./fax 42 665-54-64 E-mail: ltn@ltn.lodz.pl www.ltn.lodz.pl Naczelna Redakcja e-mail: Wydawnictw biuro@ltn.lodz.pl Łódzkiego www.ltn.lodz.pl Towarzystwa Naukowego Sprzedaż wydawnictw: (042) 66-55-448, http://sklep.ltn.lodz.pl Wanda M. Krajewska, Sławomir Gala, Jan Szymczak, Edward Karasiński Folia Medica Lodziensia ADRES REDAKTORA NACZELNEGO: Zakład Neuroendokrynologii, Katarzyna 91-425 Winczyk Łódź, ul. Sterlinga 3 tel. 42 664-43-02; Zakład Neuroendokrynologii, tel./fax 42 675-76-13; ul. e-mail: Sterlinga katarzyna.winczyk@umed.lodz.pl 3, 91-425 Łódź tel./fax (42) 675-76-13; e-mail: katarzyna.winczyk@umed.lodz.pl KOMITET NAUKOWY (SCIENTIFIC COMMITEE) REDAKTOR Przewodniczący NACZELNY (Chairman): (EDITOR-IN-CHIEF) Marek Pawlikowski Członkowie (Members): Danuta Chlebna-Sokół Katarzyna (Łódź), Józef Winczyk Drzewoski (Łódź), Alina Gajewska (Warszawa), Kazimierz Jędrzejewski (Łódź), Marcin Kamiński (Katowice), Jarosław Kasprzak (Łódź), Radzisław Kordek (Łódź), Beata Kos-Kudła ZASTĘPCA (Zabrze), Jacek REDAKTORA Kuśmierek (Łódź), NACZELNEGO Andrzej Lewiński (ASSOCIATE (Łódź), Ludwik EDITOR) Malendowicz (Poznań), Dariusz Nowak (Łódź), Włodzimierz Olszewski Jerzy (Warszawa), Krzysztof Wranicz Marek Paradowski (Łódź), Andrzej Radek (Łódź), Lucyna Woźniak (Łódź), Krzysztof Zeman (Łódź) SEKRETARZ REDAKCJI (EDITORIAL SECRETARY) REDAKTOR Karolina NACZELNY Maluga-Beda (EDITOR-IN-CHIEF) SEKRETARZ TECHNICZNY Katarzyna(TECHNICAL Winczyk SECRETARY) ZASTĘPCA REDAKTORA Jacek NACZELNEGO Świętosławski(ASSOCIATE EDITOR) Jerzy Krzysztof Wranicz KOMITET NAUKOWY (SCIENIFIC COMITEE) SEKRETARZ Przewodniczący REDAKCJI (Chairman): (EDITORIAL Marek Pawlikowski SECRETARY) Karolina Beda-Maluga Członkowie (Members): Danuta Chlebna-Sokół (Łódź), Józef Drzewoski (Łódź), Kazimierz Jędrzejewski REDAKTOR (Łódź), JĘZYKOWY Marcin Kamiński (LANGUAGE (Katowice), EDITOR) Jarosław Kasprzak (Łódź), Radzisław Kordek (Łódź), Joanna Dyniak Kazimierz Kochman (Warszawa), Beata Kos-Kudła SEKRETARZ (Zabrze), TECHNICZNY Jacek Kuśmierek (TECHNICAL (Łódź), Andrzej SECRETARY) Lewiński (Łódź), Ludwik Malendowicz (Poznań), Jacek Dariusz Świętosławski Nowak (Łódź), Włodzimierz Olszewski (Warszawa), Daria Orszulak-Michalak (Łódź), Teresa Pajszczyk-Kieszkiewicz (Łódź), Marek Paradowski (Łódź), Andrzej Radek (Łódź), Magdalena Wochna-Sobańska PROJEKT RECENZENCI (Łódź), GRAFICZNY (REVIEWERS) Krzysztof Zeman - Hanna (Łódź) Stańska Magdalena Bryś, Ewa Brzezińska-Błaszczyk, Jan Brzeziński, Jan Chojnacki, Adam Cygankiewicz, Marian Danilewicz, Wojciech Dębek, Andrzej Głąbiński, Anna Głowacka, Dariusz Kajdanowicz, Małgorzata Karbownik-Lewińska, Zofia M. Kiliańska, Józef Kobos, Jolanta Kunert-Radek, Anna Kreślak, Marek Lipiński, Stanisława Lipińska, Zbigniew Maziarz, Beata Olas, Marek Pawlikowski, Bogusława Pietrzak, Hanna Pisarek, Jacek Rysz, Stanisław Sporny, Katarzyna Starska, Jerzy Supady, Ewa Toporowska-Kowalska, Elżbieta Waszczykowska, Anna Zalewska-Janowska, Wojciech Zieleniewski Wydano z pomocą finansową Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego Czasopismo jest indeksowane w bazie Copernicus i znajduje się na liście ministerialnej czasopism punktowanych. Artykuły czasopisma w elektronicznej wersji są dostępne w bazach EBSCOhost i na portalu IBUK. Copyright Wydanie byi, Łódzkie wersja pierwotna Towarzystwo drukowana Naukowe Printed in Poland Copyright by Łódzkie Towarzystwo Naukowe Wyd. Printed I Nakład in Poland 200 egz. DRUK: GRAFIX www.grafix-poligrafia.pl tel./fax (42) 651-96-35 Projekt okładki e-mail: - Hanna grafix@ Sta grafix-poligrafia.pl ńska Nakład 100 egz. ISSN 0071-6731 Druk: 2K Łódź sp. z o.o., ul. Płocka 35/43, e-mail: 2k@2k.com.pl, www.2k.com.pl ISSN 0071-6731

3 Spis treści Agnieszka Jeleń, Anna Koziróg, Aleksandra Sałagacka, Monika Talarowska, Piotr Gałecki, Ewa Balcerczak... 5 Czy cichy polimorfizm pojedynczego nukleotydu (SNP) C1236T genu ABCB1 jest związany z predyspozycją do rozwoju depresji i skutecznością jej leczenia? badanie wstępne Is the silent single nucleotide polymorphism (SNP) C1236T of ABCB1 gene associated with predisposition to depression development and efficiency of therapy? preliminary study Michał Bednarek, Maria Constantinou, Bogdan Kałużewski... 17 Analysis of polymorphisms / mutations of PTEN, CDKN2A, TP53 genes and of hmsh6 gene in endometrial hyperplasia and carcinoma Analiza polimorfizmów/mutacji genów PTEN, CDKN2A, TP53 oraz genu hmsh6 w rozrostach oraz rakach endometrium Agnieszka Wosiak, Aleksandra Sałagacka, Ewa Balcerczak, Marta Żebrowska... 33 Analiza częstości występowania polimorfizmu C421A genu ABCG2 w przypadkach raków żołądka w regionie łódzkim Analysis of the incidence of ABCG2 gene C421A polymorphism in cases of gastric cancer in the Łódź region Dominika Porembińska, Marek Paradowski, Kamila Olszowiec, Rafał Nikodem Wlazeł... 47 Ocena profilu lipidowego u pacjentów aglomeracji łódzkiej leczonych statynami Lipid profile evaluation in Lodz agglomeration patients treated with statins Piotr Ciesielski, Anna Krześlak... 65 Zaburzenia procesu O-GlcNAcylacji w nowotworach Alterations of O-GlcNAcylation process in cancers Agnieszka Szymczyk, Ewa Forma... 93 Udział zaburzeń szlaku FGF/FGFR w transformacji nowotworowej piersi, jajnika oraz błony śluzowej trzonu macicy The role of FGF/FGFR signaling pathway disorders in breast, ovarian and endometrial cancerogenesis

Folia Medica Lodziensia, 2014, 41/1:5-15 Czy cichy polimorfizm pojedynczego nukleotydu (SNP) C1236T genu ABCB1 jest związany z predyspozycją do rozwoju depresji i skutecznością jej leczenia? badanie wstępne Is the silent single nucleotide polymorphism (SNP) C1236T of ABCB1 gene associated with predisposition to depression development and efficiency of therapy? preliminary study AGNIESZKA JELEŃ 1, ANNA KOZIRÓG 1, ALEKSANDRA SAŁAGACKA 1, MONIKA TALAROWSKA 2, PIOTR GAŁECKI 2, EWA BALCERCZAK 1 1 Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki, Zakład Biochemii Farmaceutycznej i Diagnostyki Molekularnej, Uniwersytet Medyczny w Łodzi. 2 Klinika Psychiatrii Dorosłych, Uniwersytet Medyczny w Łodzi Streszczenie Wstęp: Według danych Światowej Organizacji Zdrowia depresja dotyka około 350 milionów osób na całym świecie. Jednak pomimo powszechnego występowania, zarówno etiologia tej choroby, jak i przyczyny oporności na leczenie w dalszym ciągu nie są w pełni poznane. Gen ABCB1 koduje glikoproteinę P, która jest jednym z elementów bariery krew-mózg. Główną funkcją białka jest usuwanie związków toksycznych, w tym także leków, co może wskazywać na potencjalny związek między prawidłowym działaniem glikoproteiny P a predyspozycją do rozwoju zaburzeń depresyjnych czy niepowodzeniem terapii lekami przeciwdepresyjnymi. Celem pracy była ocena polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (ang. single nucleotide polymorphism - SNP) C1236T genu ABCB1 wśród chorych na zaburzenia depresyjne nawracające (ang. recurrent depressive disorder - rdd) oraz oszacowanie potencjalnego związku tego polimorfizmu z odpowiedzią na terapię lekami przeciwdepresyjnymi. Materiał i metody: Polimorfizm C1236T oceniono w grupie 30 pacjentów, u których zdiagnozowano rdd. Genotyp określono wykorzystując technikę automatycznego sekwencjonowania metodą Sangera. Otrzymane wyniki porównano z wynikami grupy kontrolnej, którą stanowiło 96 dawców krwi z lokalnego banku krwiodawstwa. Wyniki: Nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic w częstości występowania poszczególnych genotypów (p=0,0665) i alleli (p=0,1489) polimorfizmu C1236T genu ABCB1 między grupą pacjentów z rdd a grupą kontrolną. Nie wykazano również zależności pomiędzy C1236T a wiekiem w chwili diagnozy Adres do korespondencji: Agnieszka Jeleń, Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki, Zakład Biochemii Farmaceutycznej i Diagnostyki Molekularnej Uniwersytet Medyczny w Łodzi, ul. Muszyńskiego 1, 90-151 Łódź tel. 42 677 91 30, fax. 42 677 91 30, e-mail: agnieszka.jelen@umed.lodz.pl

6 Ocena genu ABCB1 w depresji badanie wstępne rdd (p=0,0807), nasileniem objawów depresji przed rozpoczęciem terapii (p=0,7956) czy skutecznością leczenia przeciwdepresyjnego (p=0,2051). Wnioski: Na podstawie wyników badania wstępnego, stwierdzono brak wpływu polimorfizmu C1236T genu ABCB1 na predyspozycję do rozwoju rdd, nasilenie objawów depresji w chwili diagnozy czy skuteczność terapii przeciwdepresyjnej. Słowa kluczowe: ABCB1, polimorfizm pojedynczego nukleotydu, C1236T, glikoproteina P, depresja, farmakogenomika, podatność. Abstract Introduction: According to the World Health Organization about 350 million people around the world are affected by depression. Despite the high prevalence of this disease the mechanism of depression origination as well as the causes of the resistance to therapy are still not fully understood. ABCB1 gene encode P-glycoprotein which is one of the components of blood-brain barrier. The main function of this protein is the efflux of many toxic compounds, including drugs, which may indicate potential association between the proper functioning of P-glycoprotein and the susceptibility to the development of depressive disorders or the failure of antidepressant therapy. The objective of this study was to evaluate single nucleotide polymorphism (SNP) C1236T of the ABCB1 gene in the group of patients with recurrent depressive disorder (rdd) and to estimate the possible association of this polymorphism with the response to antidepressant therapy. Material and methods: C1236T was evaluated in 30 patients with rdd. Genotyping was performed using automated sequencing (the Sanger method). The results were compared with those obtained from the control group which consisted of 96 blood donors from the local blood bank. Results: No statistically significant difference in the frequency of genotypes (p=0.0665) and allele (p=0.1489) for the SNP C1236T of ABCB1 gene was found between the patients with rdd and the control group. No correlation between C1236 and the age when the disease was stated (p=0.0807). Neither the association between genotypes and the severity of depressive symptoms before treatment (p=0.7956) nor the association with effectiveness of the therapy (p=0.2051) were found. Conclusions: On the basis of the results of the preliminary study, C1236T of ABCB1 gene have no influence on the predisposition to rdd, the severity of depressive symptoms and the efficiency of antidepressant therapy have not been stated, either.

Agnieszka Jeleń i wsp. 7 Key words: ABCB1, single nucleotide polymorphism, C1236T, P-glycoprotein, depression, pharmacogenomics, susceptibility. Wstęp W odpowiedzi na problem XXI wieku, jakim niewątpliwie jest nieskuteczność farmakoterapii w leczeniu zaburzeń psychicznych przy jednocześnie szybko powiększającym się odsetku osób dotkniętych tą chorobą, coraz większe znaczenie wydaje się mieć poznanie endogennych przyczyn rozwoju oraz niepowodzenia w leczeniu tych zaburzeń. Na depresję, która jest najczęściej występującym zaburzeniem psychicznym, choruje w ciągu całego swojego życia nawet do kilkunastu procent osób dorosłych [1]. Glikoproteina P, produkt ekspresji genu oporności wielolekowej ABCB1 (MDR1), jest błonowym białkiem transportującym o szerokim spektrum substratowym. Jej główną funkcją jest ochrona tkanek przed szkodliwym działaniem endo- i egzogennych substancji, w tym także leków [2]. Różnorodność genetyczna w obrębie genu ABCB1 może mieć wpływ na jego ekspresję [3] czy funkcjonowanie białka [4], a w konsekwencji na predyspozycję do rozwoju chorób i/lub efekt terapii lekami, które stanowią substrat dla glikoproteiny P. Związek pomiędzy występowaniem polimorfizmu ABCB1 a rozwojem chorób zaobserwowano w przypadku C3435T [5, 6], najdokładniej zbadanego spośród ponad 50 poznanych dotąd polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (ang. single nucleotide polymorphism - SNP) w regionie kodującym genu. Innym, równie często występującym w populacji, jest SNP C1236T (rs1128503), zlokalizowany w eksonie 12. Występowanie poszczególnych wariantów allelicznych tego polimorfizmu, podobnie jak w przypadku C3435T, nie powodując zmiany w sekwencji aminokwasowej białka, może wpływać na poziom ekspresji genu ABCB1 i/lub aktywność glikoproteiny P [7]. Warianty alleliczne C1236T również mogą mieć wpływ na predyspozycję do rozwoju chorób, np. raka jelita grubego [8]. C1236T jest najczęściej analizowany wspólnie z dwoma innymi polimorfizmami - C3435T i G2677T/A, zlokalizowanymi odpowiednio w eksonie 26 i 21, z którymi współtworzy haplotyp [9]. Lokalizacja glikoproteiny P w barierze krew-mózg wskazuje na potrzebę oceny polimorfizmów tego genu także w zaburzeniach psychicznych.

8 Ocena genu ABCB1 w depresji badanie wstępne Otrzymane wyniki mogą przyczynić się do lepszego poznania etiologii depresji oraz przyczyn nieskuteczności terapii tej jednostki chorobowej. Dlatego też, celem niniejszej pracy była ocena SNP C1236 genu ABCB1 wśród chorych na zaburzenia depresyjne nawracające (ang. recurrent depressive disorder - rdd) oraz oszacowanie potencjalnego związku tego polimorfizmu z odpowiedzią na terapię lekami przeciwdepresyjnymi. Materiał i metody Materiał do badania stanowiło 30 prób DNA wyizolowanego z leukocytów krwi obwodowej pacjentów (20 kobiet i 10 mężczyzn) hospitalizowanych w Szpitalu im. J. Babińskiego w Łodzi. U wszystkich pacjentów zdiagnozowano rdd. Rozpoznanie postawiono w oparciu o kryteria ICD-10 [10]. W przebiegu hospitalizacji pacjenci otrzymywali leki przeciwdepresyjne. Ocena nasilenia objawów depresyjnych w chwili postawienia diagnozy (HDRS I) jak i po zakończeniu leczenia (HDRS II) została przeprowadzona przez tego samego lekarza psychiatrę, przy użyciu 17-punktowej Skali Depresji Hamiltona (ang. Hamilton Depression Rating Scale - HDRS). Informacje o stanie zdrowia pacjentów po terapii przeciwdepresyjnej zebrano od 25 osób. Do oceny skuteczności leczenia posłużyły parametry, takie jak: zmiana HDRS, będąca różnicą pomiędzy wartością na skali przed i po terapii lekami przeciwdepresyjnymi (HDRS I HDRS II) oraz % zmiany HDRS wyliczony ze wzoru [(HDRS I HDRSII) 100%] / HDRS I. Szczegółową charakterystykę grupy badanej zawarto w Tabeli 1. Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi o numerze RNN/566/08/KB. Wszystkie zakwalifikowane osoby wyraziły zgodę na udział w badaniu. Grupę kontrolną stanowiło 96 osób zdrowych, dawców krwi pochodzących z Łodzi i okolic, którzy zostali zgenotypowani w Pracowni Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki. Otrzymane wyniki zostały zawarte w publikacji Jamroziak i wsp. [11]. Izolacja DNA, namnażanie otrzymanego DNA oraz automatyczne sekwencjonowanie zostały wykonane zgodnie z metodyką opisaną przez Żebrowską i wsp. [12].

Agnieszka Jeleń i wsp. 9 Analizę danych statystycznych wykonano przy użyciu programu Statistica wersja 10, StatSoft, Inc. (2011). Tabela 1. Szczegółowa charakterystyka grupy badanej. Table 1. Baseline characteristics of investigated group. Wiek w chwili diagnozy (lata) Czas trwania choroby (lata) N Średnia Mediana Minimum Maksimum Odchylenie standardowe 30 49,8 53,5 21,0 61,0 9,8 30 6,6 3,5 1,0 30,0 7,3 HDRS I (0-52) 30 23,1 22,0 11,5 37,0 7,3 HDRS II (0-52) 25 7,2 5,0 0,0 22,0 5,9 Zmiana HDRS 25 16,4 15,0 4,0 35,0 7,5 % zmiany HDRS 25 70,1 73,9 18,5 100,0 21,8 Wyniki Analizę wyników rozpoczęto od porównania oczekiwanych i obserwowanych częstości genotypów w grupie pacjentów chorych na depresję. Wyniki genotypowania, zarówno w grupie badanej (p=0,7147), jak i w grupie kontrolnej (p=0,5662) [11], były zgodne z prawem Hardy ego-weinberga. Obecność genotypu CC wykazano u 8 (26,7%), CT u 12 (40,0%), a TT u 10 (33,3%) pacjentów z rdd. Częstość występowania wariantu allelicznego T wyniosła w tej grupie 53,3%. Porównując wyniki otrzymane dla grupy badanej z wynikami w grupie kontrolnej zaobserwowano tendencję do częstszego występowania genotypu TT wśród osób z rdd niż u osób zdrowych (p=0,0665) (Tabela 2). Następnie dokonano analogicznego porównania częstości występowania wariantów allelicznych C i T między tymi samymi dwiema grupami. Analiza ta nie wykazała istotnej statystycznie zależności pomiędzy

10 Ocena genu ABCB1 w depresji badanie wstępne obecnością któregokolwiek wariantu allelicznego a występowaniem rdd (p=0,1489). Tabela 2. Porównanie częstość genotypów dla polimorfizmu C1236T genu ABCB1 między pacjentami z rdd a grupą kontrolną. Table 2. Comparison of genotype frequencies of ABCB1 SNP C1236T polymorphism between rdd and control group. Genotyp Grupa badana N (%) Grupa kontrolna N (%) CC 8 (26,7) 28 (29,2) CT 12 (40,0) 54 (56,2) TT 10 (33,3) 14 (14,6) p* p=0,0665 * test Chi 2 Pearsona Analizując rozkład liczby osób z rdd w zależności od wieku, w którym zdiagnozowana została choroba zaobserwowano, że największa zapadalność na depresję występowała pomiędzy 45. a 55. rokiem życia (Ryc. 1). Dokonano także oceny wieku w chwili postawienia rozpoznania pomiędzy grupami osób o tych samych genotypach i nie stwierdzono istotnej statystycznie zależności między wiekiem w chwili diagnozy a genotypem C1236T (p=0,0807). Oceniając potencjalny związek między polimorfizmem C1236T a nasileniem objawów depresji wykazano brak zależności pomiędzy częstością występowania poszczególnych genotypów a wartością na skali HDRS w chwili diagnozy (p=0,7956). Nie zaobserwowano także istotnej statystycznie zależności między genotypem C1236T a skutecznością leczenia wyrażoną zarówno jako różnica między wartością na skali HDRS przed i po zakończeniu terapii (p=0,2051), jak i w postaci % zmiany na tej skali w wyniku leczenia (p=0,4609). Nie mniej jednak, porównanie zmiany na skali HDRS zarówno w obrębie całej grupy badanej (p=0,0000), jak i w grupach pacjentów o tym samym genotypie (CC (p=0,0020), CT (p=0,0000), TT (p=0,0117)) wykazało istotną poprawę stanu zdrowia będącą skutkiem odbytego leczenia.

Agnieszka Jeleń i wsp. 11 Ryc. 1. Rozkład liczby osób z rdd w zależności od wieku w chwili diagnozy. Fig. 1. Distribution of the number of patients depending on the age at the onset of rdd. Dyskusja Depresja jest chorobą szeroko rozpowszechnioną na całym świecie o wciąż niejasnej etiologii. Identyfikacja molekularnych mechanizmów predysponujących do rozwoju depresji oraz wpływających na skuteczność terapii i nasilenie efektów ubocznych jej leczenia staje się jednym z głównych celów badań w dziedzinie psychiatrii, biologii molekularnej i farmacji. Dlatego też, celem pracy była ocena polimorfizmu C1236T genu ABCB1, kodującego transporter błonowy zlokalizowany m.in. w barierze krew-mózg, w grupie osób chorych na rdd. Częstość występowania genotypów i alleli w grupie badanej była zbliżona do wyników uzyskanych przez Singh i wsp. wśród osób z epizodem depresji dużej (ang. Major Depressive Disorder - MDD) w populacji kaukaskoazjatyckiej [13], a różna od wyników Kato i wsp. oraz Fujii i wsp. otrzymanych w grupie pacjentów z MDD będących przedstawicielami populacji azjatyckiej

12 Ocena genu ABCB1 w depresji badanie wstępne [14, 15]. Powodem rozbieżności mogą być, podobnie jak dla innych polimorfizmów tego genu (np. C3435T), różnice w dystrybucji alleli SNP C1236T między populacjami [16]. Występowanie zróżnicowania międzypopulacyjnego w przypadku tego polimorfizmu potwierdza również fakt, że częstości występowania genotypów i alleli u osób zdrowych stanowiących grupę kontrolną były zbliżone do wyników uzyskanych w badaniach innych populacji tj. czeskiej [17], niemieckiej [18], rosyjskiej [19] czy serbskiej [20], a zdecydowanie różniły się od wyników otrzymanych wśród zdrowych przedstawicieli populacji azjatyckiej [21, 15]. Zgodnie z wynikami badań wstępnych, polimorfizm C1236T nie ma związku z predyspozycją do rozwoju rdd, mimo tego, że genotyp TT wykazywał tendencję do częstszego występowania wśród chorych niż wśród zdrowych osób. W badaniach Fujii i wsp. wykazano związek występowania depresji nie z genotypem C1236T, ale z haplotypem TT1236-TT3435 [15]. Mimo tego, że porównanie wyników dla populacji kaukaskiej z wynikami populacji azjatyckiej jest niemożliwe z uwagi na różnicę w dystrybucji alleli C1236T, to wskazuje na wymagany dalszy kierunek badań obejmujący nie tylko analizę pojedynczych polimorfizmów, ale całych haplotypów. Zmiana w funkcjonowaniu białka spowodowana zamianą jednego nukleotydu może być statystycznie nieistotna, jednakże w biologicznym połączeniu z innymi modyfikacjami tego typu może prowadzić do powstania odmiennego fenotypu. Według raportu World Federation of Mental Health (WFMH) z 2012 roku, kobiety chorują na depresję dwa razy częściej niż mężczyźni [22]. Dysproporcja ta jest dostrzegalna również w grupie badanej, w której kobiety stanowią 2/3 wszystkich pacjentów. Z analizy wynika również, że rdd było najczęściej diagnozowane pomiędzy 45. a 55. rokiem życia (średnia=49,8), podczas gdy w badaniu Kato i wsp. oraz w 2 grupach pacjentów w badaniu Singh i wsp. średnia wieku osób z depresją wynosiła odpowiednio 45 oraz 41 i 38 lat [13, 14]. Wzrost odsetka osób młodych zapadających na depresję może być z jednej strony spowodowany niekorzystnymi warunkami socjo-ekonomicznymi, szczególnie w krajach wysoko rozwiniętych, z drugiej strony coraz lepszą diagnostyką i większą świadomością społeczną. W badaniu nie wykazano wpływu genotypu C1236T na wiek, w jakim pojawiają się objawy depresji. Zarówno dla całej grupy badanej, jak i w grupie osób o tym samym genotypie występowały znaczące różnice w nasileniu objawów depresji przed

Agnieszka Jeleń i wsp. 13 i po terapii lekami przeciwdepresyjnymi. U wszystkich pacjentów wystąpiła znaczna redukcja objawów choroby wskutek zastosowania leków przeciwdepresyjnych, ale ani nasilenie objawów przed wdrożeniem leczenia ani efektywność terapii nie była związana z polimorfizmem C1236T. Podobne wnioski wyciągnięto w innych badaniach [13, 14]. Jednakże Kato i wsp. wykazali, że posiadanie haplotypu 3435C-2677G-1236T wiąże się z osłabieniem redukcji objawów depresji w wyniku leczenia [14]. Natomiast Noordam i wsp. dowiedli, że genotyp TT 1236 jest związany ze zwiększeniem ryzyka konieczności zmiany leku przeciwdepresyjnego w trakcie leczenia w porównaniu z osobami o genotypie CC. Ponadto, według tych samych autorów, osoby posiadające haplotyp 3435T-2677T-1236T (zarówno heterozygoty, jak i homozygoty) prezentują zwiększone ryzyko konieczności zmiany leku w trakcie terapii lub jej zaniechania [23]. Można zatem spekulować, że allel T dla polimorfizmu C1236T wiąże się z osłabieniem aktywności glikoproteiny P, czego konsekwencją jest osiąganie wyższego niż terapeutyczne stężenia leku w organizmie, co nasila objawy niepożądane i często jest przyczyną przerwania przyjmowania leków. Jednakże, wyciągnięcie jednoznacznych wniosków wymaga badań wśród dużej grupy osób, obejmujących wiele polimorfizmów, w przypadku których istnieją doniesienia o ich wpływie na aktywność lub ekspresję glikoproteiny P. Niezbędne jest również przeprowadzenie analogicznych badań wśród innych przedstawicieli populacji kaukaskiej. Podziękowania Praca finansowana ze środków statutowych Zakładu Biochemii Farmaceutycznej i Diagnostyki Molekularnej, Uniwersytetu Medycznego w Łodzi nr 503/3-015-02/503-01 oraz ze środków na nowe zadanie badawcze Wydziału Farmaceutycznego, Uniwersytetu Medycznego w Łodzi nr 502-03/3-015-02/502-34-037 i nr 503/3-015-02/503-06-300.

14 Ocena genu ABCB1 w depresji badanie wstępne Piśmiennictwo 1. Andrade L, Caraveo-Anduaga JJ, Berglund P, Bijl RV, De Graaf R, Vollebergh W i wsp. The epidemiology of major depressive episodes: results from the International Consortium of Psychiatric Epidemiology (ICPE) Surveys. Int J Methods Psychiatr Res. 2003; 12: 3-21. 2. Bamburowicz-Klimkowska M, Bogucka U, Szutowski MM. Funkcje transporterów typu ABC. Biul Wydz Farm WUM. 2011; 3: 34-40. 3. Hoffmeyer S, Burk O, von Richter O, Arnold HP, Brockmöller J, Johne A i wsp. Functional polymorphisms of the human multidrug-resistance gene: multiple sequence variations and correlation of one allele with P-glycoprotein expression and activity in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97: 3473-3478. 4. Kimchi-Sarfaty C, Oh JM, Kim IW, Sauna ZE, Calcagno AM, Ambudkar SV i wsp. A "silent" polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity. Science. 2007; 315: 525-528. 5. Siegsmund M, Brinkmann U, Scháffeler E, Weirich G, Schwab M, Eichelbaum M i wsp. Association of the P-glycoprotein transporter MDR1(C3435T) polymorphism with the susceptibility to renal epithelial tumors. J Am Soc Nephrol. 2002; 13: 1847-1854. 6. Jamroziak K, Balcerczak E, Smolewski P, Robey RW, Cebula B, Panczyk M i wsp. MDR1 (ABCB1) gene polymorphism C3435T is associated with P-glycoprotein activity in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Pharmacol Rep. 2006; 58: 720-728. 7. Hemauer SJ, Nanovskaya TN, Abdel-Rahman SZ, Patrikeeva SL, Hankins GD, Ahmed MS. Modulation of human placental P-glycoprotein expression and activity by MDR1 gene polymorphisms. Biochem Pharmacol. 2010; 79: 921-925. 8. Panczyk M, Balcerczak E, Piaskowski S, Jamroziak K, Pasz-Walczak G, Mirowski M. ABCB1 gene polymorphisms and haplotype analysis in colorectal cancer. Int J Colorectal Dis. 2009; 24: 895-905. 9. Kroetz DL, Pauli-Magnus C, Hodges LM, Huang CC, Kawamoto M, Johns SJ i wsp. Sequence diversity and haplotype structure in the human ABCB1 (MDR1, multidrug resistance transporter) gene. Pharmacogenetics. 2003; 13: 481-494. 10. World Health Organization. The ICD-10 Classification of Mental & Behavioural Disorders. Diagnostic criteria for research. Geneva. 1993 http://www.who.int/ classifications/icd/en/grnbook.pdf. (dostęp z dnia 30.06.2014r.). 11. Jamroziak K, Balcerczak E, Calka K, Piaskowski S, Urbanska-Rys H, Salagacka A i wsp. Polymorphisms and haplotypes in the multidrug resistance 1 gene (MDR1/ABCB1) and risk of multiple myeloma. Leuk Res. 2009; 33: 332-335. 12. Żebrowska M, Jażdżyk M, Sałagacka A, Balcerczak M, Janiuk R, Mirowski M. Investigation of ABCB1 1236 and 2677 SNPs in patients with peptic ulcer. Scand J Gastroenterol. 2012; 47: 22-27.

Agnieszka Jeleń i wsp. 15 13. Singh AB, Bousman CA, Ng CH, Byron K, Berk M. ABCB1 polymorphism predicts escitalopram dose needed for remission in major depression. Transl Psychiatry. 2012; 2:e198. doi: 10.1038/tp.2012.115. 14. Kato M, Fukuda T, Serretti A, Wakeno M, Okugawa G, Ikenaga Y i wsp. ABCB1 (MDR1) gene polymorphisms are associated with the clinical response to paroxetine in patients with major depressive disorder. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 2008; 32: 398-404. 15. Fujii T, Ota M, Hori H, Sasayama D, Hattori K, Teraishi T i wsp. Association between the functional polymorphism (C3435T) of the gene encoding P-glycoprotein (ABCB1) and major depressive disorder in the Japanese population. J Psychiatr Res. 2012; 46: 555-559. 16. Ameyaw MM, Regateiro F, Li T, Liu X, Tariq M, Mobarek A i wsp. MDR1 pharmacogenetics: frequency of the C3435T mutation in exon 26 is significantly influenced by ethnicity. Pharmacogenetics. 2001; 11: 217-221. 17. Pechandová K, Buzková H, Slanar O, Perlík F. Polymorphisms of the MDR1 gene in the Czech population. Folia Biol (Praha). 2006; 52: 184-189. 18. Cascorbi I, Gerloff T, Johne A, Meisel C, Hoffmeyer S, Schwab M i wsp. Frequency of single nucleotide polymorphisms in the P-glycoprotein drug transporter MDR1 gene in white subjects. Clin Pharmacol Ther. 2001; 69: 169-174. 19. Goreva OB, Grishanova AY, Domnikova NP, Mukhin OV, Lyakhovich VV. MDR1 Gene C1236T and C6+139T polymorphisms in the Russian population: associations with predisposition to lymphoproliferative diseases and drug resistance. Bull Exp Biol Med. 2004; 138: 404-406. 20. Milojkovic M, Stojnev S, Jovanovic I, Ljubisavljevic S, Stefanovic V, Sunder- Plassman R. Frequency of the C1236T, G2677T/A and C3435T MDR1 gene polymorphisms in the Serbian population. Pharmacol Rep. 2011; 63: 808-814. 21. Tanabe M, Ieiri I, Nagata N, Inoue K, Ito S, Kanamori Y i wsp. Expression of P-glycoprotein in human placenta: relation to genetic polymorphism of the multidrug resistance (MDR)-1 gene. J Pharmacol Exp Ther. 2001; 297: 1137-1143. 22. World Federation for Mental Health. Depression: A global crisis. 2012 http://www.wfmh.org/2012docs/wmhday%202012%20small%20file%2 0FINAL.pdf (dostęp z dnia 07.05.2013). 23. Noordam R, Aarts N, Hofman A, van Schaik RH, Stricker BH, Visser LE. Association between genetic variation in the ABCB1 gene and switching, discontinuation, and dosage of antidepressant therapy: results from the Rotterdam Study. J Clin Psychopharmacol. 2013; 33: 546-550.

Folia Medica Lodziensia, 2014, 41/1:17-32 Analysis of polymorphisms / mutations of PTEN, CDKN2A, TP53 genes and of hmsh6 gene in endometrial hyperplasia and carcinoma Analiza polimorfizmów/mutacji genów PTEN, CDKN2A, TP53 oraz genu hmsh6 w rozrostach oraz rakach endometrium MICHAŁ BEDNAREK, MARIA CONSTANTINOU, BOGDAN KAŁUŻEWSKI Chair of Clinical and Laboratory Genetics, Department of Clinical Genetics, Medical University of Lodz Abstract Endometrial cancer belongs to the most frequent malignancies in the female genital organs with a growing incidence trend. The molecular changes, which are specific for particular stages of neoplastic transformation or the histopathological type of neoplasm, have not yet been described in any more uniform way. The goal of the undertaken studies was the evaluation of the polymorphisms / mutations of PTEN, CDKN2A, TP53 suppressor genes and of hmsh6 gene of incorrectly paired base-pairs in a group of female patients with endometrial hyperplasia and endometrial cancer. The studies involved forty-four (44) female patients: five (5) cases, despite the fact that clinical inclusion criteria had been met, no hyperplastic features were confirmed in a histopathological analysis. Twenty-six (26) patients with histopathologically confirmed endometrial hyperplasia and thirteen (13) patients with diagnosed carcinoma of uterine body mucosa were added into the study. The sequencing method was used for the identification of mutations / polymorphisms in MSH6, CDKN2A, PTEN and TP53 genes. Two changes were identified in TP53 gene: R175H G>A (CGC>CAC) polymorphism in exon 5 and R213R (CGA>CGG) synonimic change in exon 6 in 15% of the examined patients (2/13 cases of endometrial cancer). Regarding DNA sequence of exon 3 in MSH6 gene, the following polymorphism was found in 29% of the patients: D180D (GAT>GAC). None of the patients demonstrated any changes, either in DNA sequence of CDKN2A gene or in exons 2, 5, 7 and 8 of the PTEN gene. Key words: endometrial hyperplasia, endometrial cancer, PTEN, CDKN2A, TP53, hmsh6. Adres do korespondencji: Dr Michał Bednarek, Chair of Clinical and Laboratory Genetics, Department of Clinical Genetics, Medical University of Lodz, Pomorska Str. 251, 90-236 Łódź, e-mail: robin4307@wp.pl; genetyka@kardio-sterling.lodz.pl

18 Analysis of polymorphisms / mutations of genes Streszczenie Rak endometrium należy do najczęstszych nowotworów złośliwych żeńskich narządów płciowych. Rejestruje się stały wzrost liczby zachorowań. Dotychczas nie zostały jednoznacznie opisane zmiany molekularne, specyficzne dla poszczególnych etapów transformacji nowotworowej lub typu histopatologicznego nowotworu. Celem podjętych badań była analiza polimorfizmów/mutacji genów supresorowych PTEN, CDKN2A, TP53 oraz genu naprawy błędnie sparowanych zasad hmsh6 w grupie pacjentek z rozrostem endometrium oraz rakiem endometrium. Badaniami objęto 44 pacjentki: w 5 przypadkach, pomimo spełnienia klinicznych kryteriów włączenia, histopatologicznie nie potwierdzono cech rozrostu, do dalszych badań włączono 26 pacjentek z histopatologicznie potwierdzonym rozrostem endometrium oraz 13 pacjentek ze zdiagnozowanym rakiem błony śluzowej trzonu macicy. Do identyfikacji mutacji/polimorfizmów w genach MSH6, CDKN2A, PTEN i TP53 wykorzystano metodę sekwencjonowania. W genie TP53 wykryliśmy dwie zmiany: polimorfizm R175H G>A (CGC>CAC) w egzonie 5 oraz zmianę synonimiczną R213R (CGA>CGG) w egzonie 6 u 15% badanych (2/13 przypadków raka endometrium). W sekwencji DNA egzonu 3 genu MSH6 u 29% pacjentek został wykryty polimorfizm: D180D (GAT>GAC). U żadnej z pacjentek nie została wykryta zmiana w sekwencji DNA genu CDKN2A oraz w egzonach 2; 5; 7 i 8 genu PTEN. Słowa kluczowe: rozrost endometrium, rak endometrium, PTEN, CDKN2A, TP53, hmsh6 Introduction Endometrial carcinoma is one of the most frequent malignancies in female genital organs observed in the Western countries with high living standards. Its annual incidence is estimated at 15-20 new cases per 100 thousand of women [1, 2]. The identification of the genetic origins and basis of neoplastic disease becomes a significant element of the diagnostic and classification apparatus. Histopathology results are more and more often supplemented with molecular diagnostics, just as it is in the cases of breast cancer or hyperplastic blood diseases.

Michał Bednarek et al. 19 Molecular studies on the pathogenesis of endometrial cancer have unveiled a number of genetic changes, both hereditary and somatic, the accumulation of which is observed in the course of neoplastic transformation. This type of cancer develops via two mechanisms of carcinogenesis. These two ways are reflected in the endometrial cancer division into the following two types: endometrioid (type I) and non-endometrioid (type II) [3-6]. Type I cancers are associated with mutations of KRAS2 oncogene, mutations of the PTEN suppressor gene and β-catenin, defects in the repair system of incorrectly paired base-pairs in DNA (MMR, DNA mismatch repair) and with diploidal karyotype; whereas type II cancers are associated with mutations of TP53 and CDKN2A gene and with the overexpression of ERBB-2 (HER-2/neu) gene [7]. The criteria of the above mentioned division are not unequivocal as there are tumours demonstrating molecular features of both type I and type II cancers. Material and methods The study involved forty-four (44) female patients with perimenopausal bleeding episodes, resistant to pharmacological therapy. In five (5) cases, histopathology did not indicate any hyperplastic features, while in twenty-six (26) cases endometrial hyperplasia was confirmed in the histopathological evaluation of collected material. No atypy features were identified, either in six (6) patients with simple hyperplasia or in eleven (11) patients with microscopically complex hyperplasia. Cellular atypy was observed in two (2) patients with simple hyperplasia and in seven (7) patients with complex hyperplasia. Endometrial cancer was diagnosed in thirteen (13) patients, including seven (7) cases with G1 degree of histological malignancy, while G2 degree was diagnosed in six (6) cases. All the cases of cancers were histologically diagnosed as endometrioid adenocarcinoma. At the time of surgical intervention the age of the patients varied from 39 to 87 years. The patients excluded from the study were those with concomitant malignancy, either diagnosed or in history. The population of the control group included fifty-four (54) female patients at the age from 20 to 80, while the reference group consisted of female subjects with no cancer in history. The research project obtained a positive opinion

20 Analysis of polymorphisms / mutations of genes of the Committee of Bioethics at the Medical University of Lodz, Approval No. RNN/80/10/KE. Each time, the doctor informed a given patient about the study goals and received a voluntary consent to participate in the research project. In hyperplasia cases, the material for the analysis was collected via negative pressure transcervical aspiration and immediately placed either in Bouin s fluid (for histopathological studies) or in liquid nitrogen (-196 C) (for molecular studies). Peripheral venous blood was another material for molecular evaluations. In each case of malignant changes the collected material consisted of the samples of peripheral blood, tumour fragments and specimens of the healthy myometrial tissue. The collected material was secured as specified above. Evaluations were carried out by two experienced pathologists from two independent diagnostic centres. Molecular studies were performed in all the types of clinical specimens for each patient. DNA was isolated by the column method, using a Sherlock AX kit of the A&A Biotechnology Company. The quality of obtained DNA was assessed by a NanoDrop ND-1000 spectrophotometer. The Real-time HRM technique was used for genomic DNA replication, which enabled the identification of different variants of the amplified genes and the sequencing method was applied to identify the found polymorphisms/mutations. For the amplification of genomic DNA Precision Melt Supermix of the BioRad Company (www.bio-rad.com) was used. The set included: itaq hot-strt DNA polymerase, dntps, MgCl 2 buffer ions, EvaGreen dye and a mixture of amplifiers and stabilizers optimized for the reaction of HRM. We used 1-50 ng of genomic DNA in PCR reaction. The reaction mixture was prepared according to the manufacturer's instructions. All primers used in the PCR reactions are shown in the table number I below.

Michał Bednarek et al. 21 Table I. The sequences of primers, melting temperatures, and the size of PCR products. Gen Starter F 5 3 Starter R 5 3 CDKN2A-exon 1 CDKN2A-exon 2 CDKN2A-exon 3 MSH6 exon 1p1 MSH6 exon 1p2 MSH6 exon 2 MSH6 exon 3 MSH6 exon 4p3 MSH6 exon 4p5 MSH6 exon 4p7 MSH6 exon 4p8 MSH6 exon 4p10 MSH6 exon 6 MSH6 exon 9 TP53 exon 5 TP53 exon 6 TP53 exon 7 TP53 exon 8 PTEN exon 2 PTEN exon 5p1 GAA GAA AGA GGA GGG GCT G GAA AAT TGG AAA CTG GAA GC CCG GTA GGG ACG GCA AGA GA TCC GTC CGA CAG AAC GGT TG CGC TGA GTG ATG CCA ACA AG AAC TAA GTT ATG TAT TTC CT CTG GTC TTG AAC TGC T CGT TAG TGG AGG TGG TGA TG CCT CTG AGA ACT ACA GTA AG CCT CAA AAA ATG CCT TAT TG ACT TGC CAT ACT CCT TTT GG GAA AAG GCT CGA AAG ACT GG GTT TAT GAA ACT GTT ACT ACC TTT TGA GAG GGC ACT TCT GT TGT GCC CTG ACT TTC AAC TC TGA TTC CTC ACT GAT TGC TC AAG GCG GAC TGG CCT CAT CT GGA CCT GAT TTC CTT ACT GC TTT CAG ATA TTT CTT TCC TTA ACC TGT TAA GTT TGT ATG CAA C GCG CTA CCT GAT TCC AAT TC TCT GAG CTT TGG AAG CTC T CTG TAG GAC CCT CGG TGA CTG TTC GCG TGA GGC CCT GGC CGA CAA CCC CCT GTG CGA GCC TC CCT GTC TGT CTG TTT CTC TC CCC CTT TCT TCC CCC ATC ATG AAT ACC AGC CCC AGT TC CCA AAA CTG GGA GCC GGG TA AGC CAT TGC TTT AGG AGC CG TCC AGA GCA GAA AGA AAA TC TCG TTT ACA GCC CTT CTT GG GCA AAT ATC TTT TAT CAC AT CCC CTT TTA CTG TTT CTT TG AAC CAG CCC TGT CGT CTC TC ACC CCA GTT GCA AAC CAG AC CAG TGT GCA GGG TGG CAA GT GAG GCA TAA CTG CAC CCT TG AAC AAG AAT ATA AAA CAT CAA CTT TCC AGC TTT ACA GTG AA Temp. C bp 50.3 340 51.8 508 57.9 169 58 208 58 355 50 334 58 289 55 353 52 333 52 304 50 339 52 301 52 282 52 365 58 263 55 157 64 181 58 241 40.7 170 47.7 234

22 Analysis of polymorphisms / mutations of genes Table I. The sequences of primers, melting temperatures, and the size of PCR products (contiunued). Gen Starter F 5 3 Starter R 5 3 PTEN exon 5p2 PTEN exon 7 PTEN exon 8p1 PTEN exon 8p2 GCT AAG TGA AGA TGA CAA TCA TGA CAG TTT GAC AGT TAA AGG TTA AAT ATG TCA TTT CAT TTC TTT T GTG CAG ATA ATG ACA AGG AAT A TCC AGG AAG AGG AAA GGA AA GGA TAT TTC TCC CAA TGA AAG TTG CTT TGT CAA GAT CAT T TCA TGT TAC TGC TAC GTA AAC Temp. C bp 48.5 201 48.5 264 55 233 54 263 PCR was performed in 40 cycles, initial denaturation in 95 C for 120 seconds, annealing 45-58 C for 30 seconds, depending on the primer pairs used, extension 72 C for 30 seconds, and a final extension at 72 C for 10 minutes. The HRM analysis was preceded by the formation of heteroduplexes: 95 C for 30 seconds, then 60 C for 10 seconds. The range of the melting temperature was 65-95 o C, the temperature increased by 0.1 C every 10 seconds. The reaction was stopped at 4 C. The sequencing was carried out with a 3730 DNA Analyzer of the Applied Biosystems Company at the Source Bioscience Sequencing. Results Each of the PCR product was subjected to the melting process. After HRM reaction the samples were divided into different groups - genotypes. A representative number of samples from each group was sent for sequencing to detect changes in the DNA sequence. The normalized melting curves of HRM reaction for the exon 3 in MSH6 gene and the exon 5 in TP53 gene respectively show figure 1 and 2.

Michał Bednarek et al. 23 Fig. 1. Normalized melting curve for exon 3 in MSH6 gene Fig. 2. Normalized melting curve for exon 5 in TP53 gene In none of the patients changes in DNA sequence of the CDKN2A gene or in exons 2, 5, 7 and 8 of the PTEN gene were detected.

24 Analysis of polymorphisms / mutations of genes In DNA sequence of exon 3 in MSH6 gene of thirteen (13) (29.5%) patients, D180D (GAT>GAC) polymorphism was found. It is a synonymic change, not exerting any changes in the encoded amino acid, while both GAT and GAC encode tyrosine. The polymorphism of heterozygotic character was identified in ten (10) patients, while the polymorphism of homozygotic character was found in three (3) patients. That change was detected in three types of clinical material: blood, a tumour fragment and in the fragment of the macroscopically unchanged myometrial tissue. See Figures No. 3 and 4 below for the histograms of sequencing reaction, depicting the discussed change. Fig. 3. Histogram of exon 3 sequencing in MSH6 gene: D180D (GAT>GAC) homozygotic polymorphism.

Michał Bednarek et al. 25 Fig. 4. Histogram of exon 3 sequencing in MSH6 gene: D180D (GAT>GAC) heterozygotic polymorphism. In none of the patients changes in DNA sequence in exons 1, 6 and 9 or in the studied parts of exon 4 of MSH6 gene were detected. In order to evaluate the usefulness of D180D polymorphism in exon 3 of MSH6 gene as a diagnostic marker, DNA samples from fifty-four (54) patients of the control group were submitted to HRM (high-resolution melting) analysis. D180D polymorphism was not identified in any patient from the control group. In one (1) patient (2.3%) the following mutation was found in DNA sequence of exon 5 in TP53 gene: R175H G>A (CGC>CAC). There was a change in the encoded amino acid, where arginine was replaced by histidine. That change was detected in three material types: blood, a tumour fragment and in the fragment of macroscopically unchanged myometrial tissue. See Fig. 5 below for the histogram of sequencing reaction, depicting the described change.

26 Analysis of polymorphisms / mutations of genes Fig. 5. Histogram of exon 5 sequencing in TP53 gene: R175H G>A (CGC>CAC) mutation. The following change was identified in DNA sequence of exon 6 in TP53 gene of one (1) patient (2.3%): R213R (CGA>CGG). It was a synonimic change, not exerting any changes in the encoded amino acid, where both CGA and CGG encodes arginine. That change was found in three material types. See Fig. 6 for the histogram of sequencing reaction depicting the described change. No DNA sequence changes were found in exons 7 and 8 of TP53 gene in any of the patients.

Michał Bednarek et al. 27 Fig. 6. Histogram of exon 6 sequencing in TP53 gene: R213R (CGA>CGG) change Discussion Changes which have been discovered in CDKN2, PTEN, TP53 and MSH6 genes may potentially have some relationship with the neoplastic transformation in the endometrium. These genes are mainly associated with DNA repair processes and with the process of apoptosis, thus the processes of key importance in carcinogenesis also in the cases of endometrial cancer. Regarding the endometrial cancer, the most frequently observed change in suppressor genes is the mutation in PTEN gene, being diagnosed in up to 55% of the neoplasms, more often in endometrial cancers with an accompanying microsatellite instability [6, 8]. Mutations in PTEN gene are also observed in hyperplasia of the uterine mucous membrane [9], thus a changed protein expression could be used as a diagnostic marker of precursor changes [10]. The evaluation of PTENE gene mutations may also be useful in the differential diagnostics of primary and metastatic changes of endometrial neoplasms [11]. In the studies by Bussaglia et al., changes in PTEN gene were identified in 44% of endometrial tumours. [12]. In turn, Risinger et al. observed mutations

28 Analysis of polymorphisms / mutations of genes in that gene in 32% of cases [13]. Analysing changes in PTEN gene in hyperplasia, Maxwell et al. found changes in 19% of atypical hyperplasia and in 21% of endometrial hyperplasia without atypy features [13]. Our results of DNA sequence analysis from PTEN gene were different from the data, obtained by other authors as no mutations/polymorphisms were found in that gene. The lack of mutations/polymorphisms in the selected sequences of PTEN gene does not, however, exclude their possible occurrence in other regions of the gene, which were not studied. Still the lack of changes in those exons in which molecular events have most frequently been described by other authors may speak in favour of the possible existence of other mechanisms of endometrial hyperplasias and carcinomas which may simply bypass PTEN gene. The results of sequence analysis of CDKN2A gene in the presented study did not reveal any mutations or polymorphisms. Such a result may be explained by the examined patients being qualified to type one (endometrioid) cancers, in which changes in CDKN2A gene are rarely observed. In endometrial cancers of type II changes in TP53 gene are observed in approximately 90% of cases, while it is only 17% in endometrioid cancers [14, 15]. These data reflect the fact that in type II cancers mutations in TP53 gene are early episodes and later events in carcinomas of type I [16-18]. The results of the analysis in our study, targeting DNA sequences in TP53 gene, demonstrated changes in 15% (2/13) of the patients with diagnosed endometrial cancer. However, we did not find any changes in the studied sequences of TP53 gene in the patients with identified endometrial hyperplasia. The diagnosed R175H G>A (CGC>CAC) mutation was identified in exon 5 of a patient with diagnosed endometrial cancer with GII malignancy level, whereas R213R (CGA>CGG) change was found in exon 6 of a patient with endometrial cancer with GI malignancy degree. The presented data confirm the fact that changes in TP53 gene are a rare molecular event in type I endometrial cancers, neither being met in the early stage of carcinogenesis of endometrial cancers, that is at the stage of hyperplasia. R213R change of TP53 gene is a synonimic change, thus it may be assumed that it either has no relationship with the development process of endometrial cancer or has no influence on the course of the disease. R175H mutation in exon

Michał Bednarek et al. 29 5 of TP53 gene may be associated with the increased resistance of endometrial tumours to the therapy and the neoplasms which manifest this change, may be characteristic of a more aggressive course. The interpretation of the results from the experiment by Tsang et al. explains the probable mechanism underlying the decreased response to chemo- and radiotherapy in subjects with R175H mutation in exon 5 of TP53 gene. The cells of the osteosarcoma with R175H mutation in exon 5 of TP53 gene were not susceptible to cytostatic-induced apoptosis. [19]. A separate group of genes whose damage may predispose to cancer formation constitute DNA repair (mutator) genes. The goal of the undertaken study was, among others, to check whether selected sites in hmsh6 gene may be useful in prognosing the risk of endometrial cancer progression. The observed accumulation of errors in microsatellite sequences results from the damages of the repair systems, in particular, the system of postreplication repairs, such as, for example, the system of repair of incorrectly paired base-pairs. The microsatellite instability in neoplasms of type I occurs in 20-45% of the cases and is most often identified in type II cancers (9-11%) [20]. In our study, D180D (GAT>GAC) synonimic polymorphism in exon 3 of MSH6 gene was found in 23% (3/13) of the patients with histopathologically confirmed endometrial cancer. Referring to the patients with diagnosed hyperplasia the change occurred in 34% (9/26) of the examined patients. Analysing the presence of the polymorphism in the context of atypical hyperplasia, that is a change, assumed to be a direct stage, preceding the endometrial cancer formation, it occurred in 33% (3/9) of the patients with hyperplasia with the features of cellular atypy. Our results confirm the thesis that changes in mutator genes are frequent molecular episodes in type I endometrial cancers and occur already in the early stages of carcinogenesis of this neoplasm. Hannemann et al., Samarnthai et al. and Lax et al. described an identical relationship, concerning the occurrence of defects in DNA repair genes in precursor changes of endometrial carcinoma [20-22]. The incidence rate of the identified changes, estimated at 15% for TP53 gene and at 29.5% for hmsh6 gene, allows for a careful speculation on the role of changes in those genes as potential risk factors enabling the differentiation of cases with the threat of endometrial cancer formation. A key fact which speaks

30 Analysis of polymorphisms / mutations of genes in favour of the diagnostic role of changes in hmsh6 gene is their occurrence at the early stage of carcinogenesis at the stage of endometrial hyperplasia. Moreover, taking into consideration the obtained results, one may assume that changes in mutator genes occur earlier, already at the stage of hyperplasia, when compared to the changes in suppressor gene TP53 which manifest their presence only at the stage of endometrial cancer. The data presented over here have also confirmed the retrospective relevance and suitability of histopathological diagnoses in the examined cases qualifying them to type 1 neoplasms. One should, however, remember that the definition of an unequivocal algorithm for the molecular events which lead to the transformation of a normal cell into a neoplastic cell is now rather premature to speak about. The cause(s) should be sought for in the multi-factor differentiation of the pathways which lead to endometrial cancer development on one hand, and in the concomitance of other mechanisms such as chronic infection with oncogenic viruses or the role of hormonal factors on the other. Acknowledgements The study was supported by Promoter Grant of the Ministry of Science and Higher Education No. N N407 687440 and by funds of the Genos Company member of the Polish Technological Platform of Innovative Medicine, the National Centre of Research and Development. Literature 1. Didkowska J, Wojciechowska U, Tarkowski W, Zatoński W. Nowotwory złośliwe w Polsce w 2006 r. Centrum Onkologii Instytut im. M. Skłodowskiej- Curie, Warszawa 2008. 2. Silverberg SG, Kurman RJ, Nogales F, Mutter G, Kubik-Huch RA, Tavassoli FA. Epithelial tumors and related lesions. In: Devilee P, Tavassoli FA, editors. Pathology and Genetics of Tumors of the Breast and Female Organs. Lyon, France: IARC Press; 2003. 3. Bokhman JV. Two pathogenetic types of endometrial carcinoma. Gynecol Oncol. 1983; 15(1): 10-17. 4. Koul A, Willen R, Bendahl PO, Nilbert M, Borg A. Distinct sets of gene alterations in endometrial carcinoma implicate alternate modes of tumorigenesis. Cancer. 2002; 94: 2369-2379.