D. SPRAWOZDANIE MERYTORYCZNE Osiągnięcia 1. Ocena aktywności antyoksydacyjnej, zawartości polifenoli ogółem oraz określenie profilu polifenoli ekstraktów i surowców roślinnych (zielona herbata, cytryniec chiński, soja, dereń, borówka brusznica, pigwowiec japoński, malina, czarny bez, żurawina, jagody goji, pokrzywa, czosnek niedźwiedzi, czerwona cebula, spirulina, ekstrakt z miąższu i pestek grejpfruta - Citrosept, sok z noni). 2. Ocena aktywności antyoksydacyjnej roztworów czystych związków polifenolowych (katechiny, kwercetyny, rutyny, hesperetyny, hesperydyny, naringeniny, naringina, rezweratrolu, florydzyny, kempferolu). 3. Zbadanie wpływu różnych stężeń związków polifenolowych i ekstraktów roślinnych na 7 różnych gatunków bakterii jelitowych: Escherichia coli DSM 1116, Bacteroides galacturonicus DSM 3978, Enterococcus caccae DSM 19114, Bifidobacterium catenulatum DSM 16992, Ruminococcus gauvreauii DSM 19829, Eubacterium cylindroides DSM 3983, Lactobacillus sp. DSM 20059. Wyznaczenie MIC dla związków o działaniu hamującym. 4. Ocena wpływu poszczególnych gatunków bakterii na polifenole, w tym określenie potencjału antyoksydacyjnego produktów powstałych na skutek metabolizmu bakteryjnego wybranych polifenoli i/lub ekstraktów oraz zbadanie zmian w profilu polifenoli wybranych ekstraktów po ekspozycji na poszczególne gatunki bakterii. Uzyskane wyniki Głównym celem projektu było poznanie interakcji pomiędzy antyoksydacyjnymi składnikami żywności (polifenole) a bakteriami, będącymi przedstawicielami mikroflory jelita ludzkiego. W badaniach wykorzystano szczepy wyizolowane z jelita ludzkiego: Escherichia coli DSM 1116 (EC), Bacteroides galacturonicus DSM 3978 (BAC), Enterococcus caccae DSM 19114 (EN), Bifidobacterium catenulatum DSM 16992 (BF), Ruminococcus gauvreauii DSM 19829 (RUM), Eubacterium cylindroides DSM 3983 (EUB), Lactobacillus sp. DSM 20059 (LCB). W pierwszym etapie badań oceniono wpływ polifenoli na wzrost bakterii jelitowych. Jako źródło polifenoli zostały wybrane surowce roślinne, zawierające przeciwutleniacze, w tym polifenole, o znanych właściwościach prozdrowotnych i wykorzystywane do leczenia różnych schorzeń. W doświadczeniach wykorzystano: zieloną herbatę (GT); nasiona soi (S); suszone jagody goji (G) i cytryńca chińskiego (CCH); świeże owoce derenia (D), borówki brusznicy (B), pigwowca japońskiego (P), maliny (M), czarnego bzu (BEZ) i żurawiny (Z); pokrzywę (PO); czosnek niedźwiedzi (CN); czerwoną cebulę (CC) oraz gotowe preparaty farmaceutyczne tj. spirulinę (SP), ekstrakt z miąższu i pestek grejpfruta Citrosept (CIT), sok z noni (N). Z surowców przygotowano 10% ekstrakty etanolowe, za wyjątkiem CIT i N, które były stosowane bezpośrednio. W materiale badawczym oznaczono aktywność antyoksydacyjną metodą z rodnikiem ABTS + i zawartość polifenoli ogółem metodą Folin-Ciocalteu. Największy potencjał antyoksydacyjny oznaczono dla Citroseptu (21270±3601 mg Troloksu/100 ml) oraz zielonej herbaty (10998±282). Na uwagę, jako stosunkowo bogate źródło przeciwutleniaczy, zasługuje także sok z noni (424,5±39,5), ekstrakty z derenia, pigwowca, czarnego bzu i czosnku niedźwiedziego (260-283 mg Troloksu/100 ml). Z kolei bardzo małą aktywnością przeciwrodnikową charakteryzowały się ekstrakty ze spiruliny (24,1±1,2), czerwonej cebuli (432±2,9), cytryńca chińskiego (54,0±4,1) i soi (66,0±9,0). W większości przypadków silne zmiatanie rodnika ABTS korelowało z ilością polifenoli ogółem (R=0,9904). Najwięcej polifenoli oznaczono dla Citroseptu (25772±15 mg katechiny/100 ml), zielonej herbaty (9549±4,6), noni (1088,4±6,4) i czarnego bzu (883,1±11,9). Natomiast w przypadku jagód goji i pokrzywy wysoka zawartość polifenoli (odpowiednio 810,6 i 618,9 mg katechiny/100 ml) nie korespondowała z aktywnością antyoksydacyjną (197,2 i 107,1 mg Troloksu/100 ml), sugerując dominację związków o niskim potencjale antyoksydacyjnym. W przypadku derenia, pigwowca i czosnku niedźwiedziego wynik wskazuje na obecność innych niż polifenole substancji o zdolności zmiatania rodnika ABTS, np. witaminy C, karotenoidów, tokoferoli. Wpływ związków bioaktywnych obecnych w ekstraktach na bakterie jelitowe określano w hodowlach płynnych. W tym celu, badany ekstrakt etanolowy lub gotowy produkt dodawano do podłoża,
odpowiedniego dla danego gatunku bakterii, w stężeniu końcowym 1,0; 2,5 lub 5,0%. Tak przygotowane podłoże zaszczepiano gęstwą bakteryjną (stężenie końcowe 3 10 6 jtk/ml) i inkubowano w odpowiednich dla danego mikroorganizmu warunkach przez 24 h. Po tym czasie liczebność populacji bakterii w hodowli oznaczano turbidymetrycznie za pomocą densytometru, wyskalowanego w jednostkach McFarlanda. Wyniki, po uwzględnieniu kontroli negatywnej (wpływ samego rozpuszczalnika), przedstawiono jako procent kontroli pozytywnej, czyli liczebności populacji danej bakterii po 24 h hodowli w medium bez dodatku ekstraktu (tab. 1). Wykazano znaczne zróżnicowanie wpływu poszczególnych ekstraktów, od stymulującego, przez obojętny, bakteriostatyczny, aż po bakteriobójczy, w zależności od badanego gatunku bakterii. W przypadku ekstraktów wykazujących działanie hamujące wyznaczono MIC. Tabela 1. Zmiany liczebności w populacji bakterii pod wpływem różnych stężeń ekstraktów i surowców roślinnych (jako % kontroli pozytywnej). Wyniki przedstawione jako średnia arytmetyczna ± SD (n 3) Ekstrakt Stężenie EN RUM LCB EC BAC EUB BF P PO SP M Ż S CCH CN CC D B GT CIT G BEZ N 1,0% 88,4±1,4 104,0±0,6 94,2±2,4 122,7±4,6 100,2±0,8 89,4±5,5 87,7±3,8 2,5% 80,3±0,9 104,5±0,5 91,6±3,5 50,6±1,0 50,4±1,0 10,5±3,6 155,8±3,3 5,0% 56,8±1,3 103,0±1,6 118,5±1,8 50,7±7,4 7,2±1,8 3,0±0,9 1799,4±141,3 1,0% 90,5±1,8 97,2±1,6 94,1±1,8 129,7±3,0 89,4±0,4 86,2±7,8 142,88±3,6 2,5% 84,3±1,5 97,1±1,2 94,6±8,9 169,6±3,1 116,4±0,9 81,1±10,8 325,4±11,8 5,0% 83,2±1,3 107,4±1,0 129,0±4,3 289,2±12,5 201,6±2,4 181,2±6,8 3566,4±61,8 1,0% 122,5±24,8 102,4±1,5 96,3±7,8 107,8±5,4 87,1±5,0 74,5±1,0 75,6±3,5 2,5% 121,2±32,3 102,3±2,0 90,4±7,2 40,3±4,7 95,3 ±6,2 45,3±0,7 119,0±21,5 5,0% 60,3±5,2 115,2±3,7 110,7±5,2 30,7±11,4 45,3±5,0 5,1±2,3 1129,9±88,8 1,0% 95,4±5,3 105,3±4,8 81,1±8,9 95,3±7,2 93,7±7,8 91,7±2,1 101,7±17,0 2,5% 87,3±6,9 103,3±1,0 85,7±7,3 82,1±11,5 118,9±9,6 61,9±6,1 222,6±9,2 5,0% 73,4±18,8 112,1±7,6 76,9±3,6 45,2±4,8 167,6±20,2 3,1±1,8 3185,0±87,2 1,0% 100,9±0,5 98,9±1,2 87,0±1,8 97,8±13,0 86,0±9,3 58,7±11,8 118,8±20,3 2,5% 93,8±1,7 99,5±2,0 77,4±11,6 65,0±10,3 110,0±13,2 11,1±2,4 247,8±11,6 5,0% 90,2±0,6 108,0±3,3 3,4±0,3 25,7±9,8 167,6±11,3 0,0±2,1 3430,6±111,5 1,0% 100,1±9,6 103,2±2,7 11,5±4,2 108,8±11,5 83,7±7,4 73,8±5,7 89,4±29,2 2,5% 94,0±11,1 105,8±6,4 11,7±3,3 56,4±5,0 107,9±1,8 16,8±3,3 120,8±2,3 5,0% 55,8±2,0 104,9±5,3 129,8±2,1 27,9±13,7 142,8±25,0 1,5±1,4 1321,4±53,3 1,0% 83,8±1,7 93,7±3,3 95,7±0,7 93,2±12,2 77,9±1,0 108,4±4,0 94,3±5,3 2,5% 55,2±3,0 66,8±10,7 49,9±7,9 69,1±2,8 45,6±7,6 75,9±2,0 6,1±1,1 5,0% 3,2±2,4 44,7±16,9 1,0±0,6 11,2±8,0 37,1±3,7 5,1±3,8 0,0±29,9 1,0% 92,6±0,8 105,3±3,7 106,4±8,2 111,5±3,9 83,3±6,3 110,1±4,6 101,1±5,2 2,5% 83,7±0,9 104,2±5,4 105,1±4,9 39,7±8,1 99,6±3,7 74,6±1,2 151,4±12,4 5,0% 74,4±4,4 101,7±0,4 128,2±2,0 51,9±2,2 132,7±20,6 10,0±2,6 2114,1±324,2 1,0% 94,6±6,6 98,4±0,8 89,3±3,6 79,4±4,8 97,8±1,4 98,7±2,9 88,1±4,6 2,5% 86,8±1,5 99,8±1,0 87,6±3,6 80,3±7,0 121,1±6,2 91,0±10,3 224,2±19,4 5,0% 66,0±7,8 112,5±1,5 5,8±2,4 52,2±5,7 192,5±11,9 44,1±84 1892,7±42,8 1,0% 93,1±1,1 99,7±1,7 97,2±2,0 105,4±11,6 89,0±5,1 105,7±4,3 123,9±11,0 2,5% 80,0±1,0 97,9±3,2 93,7±3,6 105,3±4,9 106,3±6,9 97,0±7,1 218,5±24,2 5,0% 57,1±8,3 94,0±5,4 54,5±5,1 98,8±8,9 155,4±11,6 133,8±33,1 2866,6±333,9 1,0% 98,7±1,0 99,8±1,4 99,5±7,6 96,4±17,1 73,4±11,6 70,4±3,0 100,1±6,76 2,5% 83,5±0,8 102,6±1,2 100,7±12,6 70,7±8,1 111,1±8,7 42,8±1,4 193,2±39,77 5,0% 64,1±4,8 103,8±1,8 139,0±18,7 43,7±6,0 114,5±16,6 1,8±2,4 2038,9±262,1 1,0% 99,9±8,7 105,4±0,7 116,4±5,0 89,3±17,5 85,6±3,7 93,9±2,8 70,6±7,3 2,5% 94,6±7,7 105,7±1,0 115,9±8,7 52,7±7,1 69,6±4,7 40,9±2,0 104,2±10,3 5,0% 78,5±2,5 96,3±6,4 138,3±5,1 40,4±17,1 72,0±5,6 1,2±0,8 1869,5±72,1 1,0% 101,4±6,7 108,5±1,5 116,5±4,3 108,9±1,8 44,5±2,9 52,5±1,3 111,6±16,0 2,5% 92,2±9,0 104,6±7,9 122,1±6,2 37,6±2,8 37,5±1,2 29,1±3,9 110,2±18,1 5,0% 77,3±17,4 84,7±1,0 124,2±6,6 19,2±4,6 19,4±3,5 3,1±1,1 90,7±5,4 1,0% 88,9±4,5 108,4±3,2 105,1±5,6 123,7±16,4 96,0±5,3 77,7±3,0 92,5±7,8 2,5% 90,6±1,1 110,0±2,3 105,6±6,7 108,3±6,0 117,3±10,7 29,5±2,4 184,2±57,8 5,0% 58,6±1,9 113,5±8,7 135,7±7,3 105,9±5,0 156,9±23,5 0,0±2,5 1805,9±40,4 1,0% 93,8±1,5 103,8±0,8 98,4±4,4 115,2±2,8 114,5±0,2 109,3±7,1 79,7±2,3 2,5% 84,3±2,1 105,9±0,6 98,4±4,6 97,7±1,8 103,3±3,8 80,9±8,2 190,9±10,3 5,0% 70,5±1,4 113,3±0,5 124,9±3,1 76,4±5,5 19,5±7,4 79,3±1,79 1700,2±114,8 1,0% 95,3±1,2 104,4±4,4 107,6±3,4 141,2±5,0 63,0±1,8 102,1±5,0 135,1±11,7 2,5% 94,9±1,4 111,8±1,6 113,5±6,6 94,8±8,0 41,7±3,1 99,6±2,4 140,6±4,8 5,0% 82,8±1,7 118,2±1,2 118,5±4,8 41,0±2,9 34,0±2,8 36,6±1,2 151,7±2,7 Wykazano, że najmniej wrażliwy na działanie badanych ekstraktów jest RUM. Zahamowanie wzrostu tej bakterii uzyskano jedynie po zastosowaniu Citroseptu i ekstraktu z cytryńca chińskiego. Natomiast zwiększenie liczebności RUM można uzyskać poprzez dodatek bioaktywnych składników zawartych w spirulinie, czerwonej cebuli, jagodach goji, czarnym bzie oraz soku z noni. Z kolei wobec EN wszystkie badane ekstrakty wykazywały działanie bakteriostatyczne. Dość wrażliwy był także EUB, którego wzrost był hamowany przez większość badanych ekstraktów, za wyjątkiem 5% ekstrakt z derenia (stymulacja wzrostu). Wykazano, że jedynie ekstrakty z CCH znacząco hamowały wzrost wszystkich badanych bakterii jelitowych (MIC 2,5%), co daje możliwość ich zastosowania do eliminacji niepożądanych gatunków mikroflory jelitowej, przed suplementacją gatunkami pożądanymi. Podobne
zastosowanie może znaleźć także ekstrakt z miąższu i pestek grejpfruta (Citrosept), który hamował wzrost badanych bakterii, oprócz LCB (MIC 5%). Owoce pigwowca działały silnie hamująco na BAC (MIC 5%) i EUB (MIC 2,5%). W celu wzbogacenia populacji mikroflory jelitowej w BAC można wykorzystać bioaktywne składniki pokrzywy, malin, żurawiny, derenia, czerwonej cebuli oraz jagód goji. Zaś do stymulacji wzrostu LCB pigwowca, czosnku niedźwiedziego, pokrzywy, brusznicy, soi, zielonej herbaty, Citroseptu, jagód goji, czarnego bzu lub noni. Surowce te można zatem z powodzeniem stosować do jogurtów jako składniki smakowe i wzbogacające je równocześnie w naturalne związki przeciwutleniające. Nie zaleca się natomiast dodawania do produktów zawierających żywe kultury bakterii z rodzaju Lactobacillus ekstraktów, ani liofilizowanych czy suszonych owoców żurawiny, derenia i malin. EC była stymulowana jedynie przez składniki pokrzywy oraz małe stężenia czarnego bzu i noni, natomiast hamowana przez żurawinę, która jeszcze silniej hamująco działała na LCB i EUB. Uzyskane wyniki wskazują, że tradycyjne zastosowanie preparatów na bazie tylko i wyłącznie pokrzywy w leczeniu chorób układu moczowego nie jest korzystne, mimo ich właściwości moczopędnych. O ile preparaty żurawinowe hamują rozwój EC, która najczęściej odpowiada za te dolegliwości, o tyle pokrzywa stymuluje namnażanie się tych bakterii. Optymalne zatem będzie stosowanie preparatów wieloskładnikowych. Silny efekt stymulujący większości badanych ekstraktów, w odniesieniu do BF, prawdopodobnie odzwierciedla szczególnie dużą wrażliwość tego gatunku na alkohol, który został wykorzystany jako ekstrahent. Nawet 0,1% dodatek EtOH do medium hodowlanego powodował spadek liczebności tej bakterii. Etanol, dodany do medium już w stężeniu końcowym 2% powodował spadek liczebności populacji BF o 72%. Etanol w stężeniu wyższym niż 3% zmniejszał po 24 h godzinach inkubacji liczebność populacji BF o ponad 95%, podczas gdy populacje RUM i EN były przez najwyższe badane stężenie (5%) EtOH hamowane zaledwie o 18%. Dodatek 5% EtOH powodował także praktycznie całkowite zahamowanie wzrostu EUB (do 0,2% kontroli) oraz silną inhibicję EC (do 12,5% kontroli). Należy natomiast zaznaczyć, że małe stężenia etanolu (0,1-1,0%) w przypadku BAC, LCB i RUM wykazywały działanie stymulujące wzrost tych gatunków (maksymalnie do 113%). W kolejnej części badań oceniano wpływ różnych stężeń czystych związków polifenolowych (w zakresie 4-250 µg/ml) na badane bakterie. Wybrane związki to: katechina (CAT), kwercetyna (Q) i jej glikozyd rutyna (RUT), naringenina (N) i jej glikozyd naringina (NR), hesperetyna (H) i jej glikozyd hesperydyna (HR), rezweratrol (RS), kempferol (KMP) oraz florydzyna (PHL), dla których przygotowano roztwory w DMSO o stężeniu wyjściowym 25 mg/ml (wyj. Q i KMP - 5 mg/ml). Związki te zostały wybrane jako najważniejsze polifenole jakie można znaleźć w wybranych surowcach (na podstawie analizy ich profilu polifenolowego w badanych ekstraktach określonego metodą HPLC) oraz w oparciu o dostępną literaturę tematu. Wykazano, że hamująco na wszystkie badane gatunki bakterii działają kwercetyna i kempferol (już w stężeniu 20 µg/ml), przy czym w przypadku BF i EN siła hamowania jest porównywalna do kontrolnego antybiotyku chloramfenikolu (ChlA) (Tab. 2). Hamująco działały także naringenina (100 µg/ml), hesperetyna (250 µg/ml, za wyjątkiem LCB), oraz rezweratrol (od 100 µg/ml, oprócz EUB). Wyznaczone wartości MIC dla poszczególnych polifenoli w odniesieniu do konkretnych gatunków (w µg/ml) wahały się od 20 µg/ml do ponad 250 µg/ml. Należy podkreślić, że glikozydy tych związków, czyli rutyna, naringenina oraz hesperydyna, nie wykazały takiego inhibitorowego działania lub było ono znikome (głównie dla wyższych stężeń, co można tłumaczyć metaboliczną przemianą lub samoistnym rozpadem nieaktywnego glikozydu do działającego inhibitorowo aglikonu). Hesperydyna, jako jedyny badany związek, nie hamowała żadnej z analizowanych bakterii, a nawet stymulowała nieznacznie wzrost EC. Katechina działała lekko stymulująco w stosunku do BAC i EC zaś florydzyna zwłaszcza w niższych stężeniach wobec EC, BF i LCB. Natomiast wobec EN florydzyna i katechina działały słabo bakteriostatycznie. Spośród stosowanych związków najwyższy potencjał antyoksydacyjny wykazano dla roztworów naringeniny i rezweratrolu (powyżej 25000 mg Troloksu/100 ml), katechiny (20920), florydzyny (13000) i rutyny (14000). Najmniejszy potencjał zmiatania rodnika ABTS + wykazano dla roztworu hesperydyny (3617) oraz KMP (5464) i Q (4836), przy czym należy przypomnieć, że te ostatnie dwa związki stosowano w roztworach o 5-krotnie mniejszym stężeniu. Wynika z tego, że wpływ polifenoli na badane bakterie nie jest zależny od ich potencjału antyoksydacyjnego, a raczej jest efektem budowy cząsteczki. Aglikony są silniejszymi inhibitorami niż glikozydy. Ma to szczególne znaczenie w przypadku przyjmowania związków polifenolowych w postaci preparatów farmaceutycznych, gdzie wysterują one głównie w postaci aglikonów, podczas gdy w surowcach roślinnych dominują formy glikozydowe. W kolejnych doświadczeniach badano wpływ mieszanin polifenoli na wybrane bakterie i stwierdzono, że RUT i CAT mogą znosić hamujące działanie aglikonów H i N na Bifidobacterium, ale już w przypadku Ruminococcus nie chronią przed hamującym działaniem N. Nie chronią też przed toksycznym
wpływem Q i RS na Bacteroides. W większości badanych przypadków łączne działanie 2 polifenoli było równoważne sumie działania tych związków pojedynczo, jednakże zanotowano wyjątki. Na przykład łączne działanie H+N wobec BF, było słabsze niż hamowanie silniejszego inhibitora (N), ale mocniejsze niż słabszego (H). Tak samo H, działająca samodzielnie w sposób stymulujący na BAC, w połączeniu z kempferolem (20H +50KMP) potęgowała hamujące działanie KMP. Tabela 2. Zmiany liczebności w populacji bakterii pod wpływem różnych stężeń polifenoli (% kontroli pozytywnej). Wyniki przedstawione jako średnia arytmetyczna ± SD (n 3) Związek Stężenie EN RUM LCB EC BAC EUB BF [µg/ml] 20 80,4±4,0 100,1±0,5 100,5±1,6 110,8 ±1,3 98,4±1,2 96,9±1,8 101,7±1,9 CAT 100 78,9±1,3 99,5±1,2 99,9±1,8 104,8±6,4 101,7±1,0 97,5±1,3 98,6±2,0 250 81,0±1,5 98,9±0,5 98,2±2,3 102,3±2,3 101,2±1,8 95,7±2,4 99,2±0,9 20 95,7±0,9 98,2±2,0 101,7 ±1,7 107,8±2,3 95,6±2,9 91,5±6,1 94,8±6,5 HR 100 96,5±1,5 99,9±0,7 91,4±2,2 108,0±3,3 96,3±0,8 101,2±0,8 95,8±4,1 250 92,5±1,5 97,6±0,6 103,2±0,9 102,8±3,2 96,0±0,6 94,2±5,8 84,0±14,8 20 99,4±1,7 84,8±2,8 103,8±1,0 106,3±1,2 104,4±0,8 94,7±0,9 102,2±7,2 H 100 101,0±2,1 27,2±12,0 98,3±3,8 95,8±3,3 81,3±8,8 89,2±4,8 74,9±7,5 250 37,8±2,5 27,2±0,7 101,5±0,7 92,4±1,2 93,6±2,8 42,9±0,8 83,5±1,0 20 88,6±1,3 96,6±2,1 100,6±2,5 108,2±2,5 92,6±0,7 106,6±3,9 102,6±1,0 NR 100 900,2±2,1 95,7±2,5 101,8±0,8 107,9±2,0 81,9±2,3 96,8±4,6 99,9±2,2 250 89,6±1,6 98,1±0,4 101,7±1,2 107,8±1,8 95,4±1,1 99,7±1,2 87,8±7,7 20 81,5±0,8 46,9±2,2 102,8±1,3 96,3±2,0 104,8±1,2 114,8±5,1 96,4±4,3 N 100 55,6±1,3 1,2±1,3 64,3±13,9 83,3±3,7 55,9±5,8 93,5±1,4 47,5±12,5 250 3,9±0,5 0±0,3 1,8±0,4 73,8±1,3 0±0,9 81,2+ 3,2 7,5±3,14 20 86,3±1,1 99,5±0,7 104,5±1,1 109,5±1,1 95,9±1,3 95,1±0,8 110,3±1,1 PHL 100 82,2±1,2 97,7±0,7 104,6±2,4 105,7±2,1 98,3±2,1 93,3±4,8 108,1±1,4 250 37,8±2,5 27,2±0,7 101,5±0,7 92,4±1,2 93,6±2,8 95,2 + 2,7 83,5±1,0 20 86,6±2,1 82,6±4,0 75,0±7,0 99,7±2,2 93,3±1,2 102,1±6,2 102,5±1,7 RS 100 57,4±2,5 1,7±0,5 0,7±0,5 78,8±6,4 22,6±9,3 105,1±0,9 58,0±13,4 250 0±1,8 2,4±1,4 0±0,9 48,2±6,7 1,1±0,8 107,1±7,5 23,0±4,0 20 93,8±1,2 96,2±0,7 102,5±1,9 105,4±3,2 97,4±1,7 99,8±2,5 100,5±2,0 RUT 100 94,0±1,2 96,7±0,4 102,9±1,4 102,0±1,6 96,7±1,6 97,5±3,2 100,0±6,2 250 95,2±1,2 98,9±0,6 99,9±2,6 100,8±1,6 96,2±0,8 94,0±4,3 93,7±5,9 4 72,2±1,8 91,0±3,4 97,6±5,1 91,9±3,0 107,8±1,8 101,6±12,1 96,7±2,9 KMP 20 71,2±1,4 5,2±0,8 89,4±3,2 89,7±2,3 82,9±12,5 48,8±10,5 90,4±3,1 50 69,2±1,7 8,2±1,7 85,6±7,4 86,2±2,5 68,7±1,3 2,6±1,0 16,4±9,0 4 89,1±0,8 94,1±1,0 97,1±2,1 106,0±1,3 98,8±3,0 108,1±10,1 103,7±0,6 Q 20 76,5±20,7 4,6±1,0 71,2±7,6 52,2±1,3 66,8±1,1 100,4±2,4 89,8±4,5 50 48,8±1,7 2,9±0,2 58,4±8,5 42,8±4,9 2,4±4,0 87,1±3,6 10,3±5,7 Drugi etap badań miał na celu ocenę potencjału antyoksydacyjnego (AOX) produktów powstałych na skutek metabolizmu bakteryjnego wybranych polifenoli i/lub ekstraktów. Wykazano, że kierunek zmian zależy zarówno od gatunku bakterii, jak i użytego ekstraktu/związku i jego stężenia. Im bardziej złożone medium hodowlane tym mniejszy był wpływ dodatku na aktywność antyoksydacyjną. Wynika to z faktu, że już same podłoża wykazywały znaczący potencjał antyoksydacyjny (w zakresie od 18-894 mg Troloksu/100 ml) odzwierciedlający zawartość składników przeciwutleniających, takich jak aminokwasy (w szczególności tryptofan, tyrozyna, L-cysteina, metionina), resazuryna, ekstrakt sojowy czy drożdżowy. W niektórych przypadkach AOX malał nawet mimo dodania polifenolu/ekstraktu, w szczególności właśnie w przypadku pożywek bardzo złożonych (dla BF, EUB, BAC, RUM), najprawdopodobniej na skutek reakcji związków przeciwutleniających ze składnikami podłoża. Także zmiany ph medium pod wpływem namnażających się bakterii i wytwarzanych przez nie związków mogły prowadzić do samoistnej hydrolizy glikozydów polifenoli (skutkując zwiększeniem AOX), bądź powstawania związków o charakterze soli, estrów itd. (spadek AOX). Nie każda zatem zmiana AOX zaobserwowana w podłożu po dodaniu bakterii wynikała z metabolizmu polifenoli przez te bakterie. W celu potwierdzenia, czy dane związki polifenolowe ulegały reakcjom biotransformacji pod wpływem badanych gatunków bakterii jelitowych (do metabolitów o większym lub mniejszym AOX) wykonano dodatkowe oznaczenia. Media hodowlane z/bez dodatku polifenoli/ekstraktów po inkubacji z bakteriami poddano analizie HPLC pod kątem zmian w obecności i ilości związków polifenolowych. Wykazano, że wykorzystane w doświadczeniach gatunki bakterii nie przejawiały zdolności metabolizowania większości badanych związków polifenolowych. Jedynie RUT częściowo ulegała reakcjom biotransformacji, pod wpływem EN do kwercetyny i innego niezidentyfikowanego związku (nowy pik na chromatogramie), pod wpływem EC do glukozydu kwercetyny, zaś pod wpływem BAC i EUB do pochodnych, nie będących ani kwercetyną ani jej glukozydem. Potencjał
antyoksydacyjny w medium z RUT istotnie wzrastał pod wpływem EN, EC i EUB, co potwierdza powstanie metabolitów o wyższym AOX, natomiast metabolity powstałe w reakcjach prowadzonych przez BAC miały niższy potencjał antyoksydacyjny niż wyjściowy. Można zatem wnioskować, że bakterie jelitowe mają zatem zdolność do metabolizowania tego samego związku na drodze odmiennych szlaków metabolicznych i z wytworzeniem odmiennych pochodnych. W przypadku ekstraktów, końcowe stężenia wykrywanych i identyfikowanych polifenoli były znacznie niższe i często poniżej progu detekcji aparatu HPLC. Dla tych, które udało się zidentyfikować nie wykazano istotnych statystycznie zmian w stężeniu pod wpływem badanych gatunków bakterii. Realizowane cele Zrealizowano wszystkie zaplanowane etapy oraz założone we wniosku cele. Podczas badań uzyskano także dodatkowe interesujące wyniki, dotyczące wpływu różnych stężeń etanolu na wzrost badanych bakterii. Wpływ na dyscyplinę Uzyskane wyniki mogą znaleźć zastosowanie w medycynie oraz technologii żywności, głównie w prężnie rozwijających się gałęziach żywności prozdrowotnej, funkcjonalnej i projektowanej, w szczególności w wytwarzaniu produktów wzbogacanych związkami polifenolowymi. Dobór odpowiednich składników diety pozwoli na bardziej świadome modulowanie składu mikroflory jelitowej konsumentów, co może znaleźć zastosowanie we wspomaganiu leczenia niektórych schorzeń. Uzyskane rezultaty stanowią także doskonały punkt wyjścia do dalszych, bardziej szczegółowych badań mających na celu opracowanie preparatów farmaceutycznych zawierających odpowiednie gatunki bakterii, które podane doustnie zmodyfikują skład mikroflory bakteryjnej o pożądane gatunki. Istotne są także uzyskane wyniki wskazujące na hamowanie lub możliwość stymulacji wzrostu bakterii z rodzaju Lactobacillus, które są wykorzystywane na szeroką skalę do produkcji żywności fermentowanej (np. jogurty, kiszonki, żywność probiotyczna i funkcjonalna). Wyniki te umożliwią producentom takiej żywności lepsze wykorzystanie dostępnych surowców roślinnych, uniknięcie przypadkowego i niewłaściwego doboru składników, który mógłby spowodować zahamowanie wzrostu szczepów technologicznych. Dzięki temu ograniczone zostaną ubytki w wartości odżywczej i smakowej produktu oraz straty finansowe. Rezultaty doświadczeń wykonanych w ramach projektu posłużą także do opracowania monografii habilitacyjnej kierownika grantu.