Dr hab. Elżbieta Król Aberdeen, 22 stycznia 2015 Institute of Biological and Environmental Sciences University of Aberdeen Aberdeen AB24 2TZ, Scotland, UK e-mail: e.krol@abdn.ac.uk Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Julity Sadowskiej pt. The parental investment capacity and basal metabolic rate correlation in mammalian endothermy evolution 1. Informacje ogólne o rozprawie Rozprawa doktorska mgr Julity Sadowskiej, realizowana pod kierunkiem dr hab. Andrzeja Gębczyńskiego w Instytucie Biologii na Uniwersytecie w Białymstoku, przygotowana jest według nowego trybu. Jako taka, rozprawa ta składa się ze streszczenia w języku polskim (3 strony) i angielskim (3 strony), trzech rozdziałów empirycznych stanowiących kopie trzech opublikowanych lub przyjętych do druku artykułów naukowych (łącznie 65 stron ), poprzedzonych wspólnym wstępem (General Introduction, 8 stron) oraz wspólnie podsumowanych (General Conclusions, 3 strony). W skład rozprawy wchodzi również spis literatury (wspólny dla General Introduction i General Conclusions, 7 stron) oraz oświadczenia współautorów artykułów (prof. dr hab. Marka Konarzewskiego, dr hab. Andrzeja Gębczyńskiego oraz mgr Katarzyny Paszko), deklarujące ich szczegółowy udział w badaniach naukowych i przygotowywaniu publikacji składających się na rozprawę doktorska mgr Sadowskiej. Na szczególna uwagę zasługuje fakt, że mgr Sadowska jest na wszystkich trzech publikacjach pierwszym oraz korespondencyjnym autorem, co jednoznacznie definiuje jej dojrzałość i odpowiedzialność naukową oraz wskazuje na znaczący udział doktorantki w planowaniu i realizacji przedstawionych badań naukowych, analizie danych, przygotowaniu manuskryptów do druku oraz skutecznym polemizowaniu z recenzentami i edytorami renomowanych czasopism naukowych o ważności merytorycznej swojej pracy badawczej. Artykuły naukowe, które są podstawą recenzowanej rozprawy doktorskiej, to:
2 1) Sadowska J, Gębczyński AK, Konarzewski M (2015) Effect of reproduction on the consistency of the between-line type divergence in laboratory mice selected on BMR. Physiological and Biochemical Zoology [w druku]. 2) Sadowska J, Gębczyński AK, Konarzewski M (2013) Basal metabolic rate is positively correlated with parental investment in laboratory mice. Proceedings of the Royal Society B, 280: 20122576. 3) Sadowska J, Gębczyński AK, Paszko K, Konarzewski M (2014) Milk output and composition in mice divergently selected for BMR. Journal of Experimental Biology, doi: 10.1242/jeb.111245 [Epub ahead of print]. Wszystkie trzy artykuły zostały opublikowane w prestiżowych czasopismach z listy filadelfijskiej, charakteryzujących się wysokimi Impact Factor (Physiological and Biochemical Zoology, IF = 2.5; Proceedings of the Royal Society B, IF = 5.3; Journal of Experimental Biology, IF = 3.0). Nic dziwnego, że publikacje mgr Sadowskiej zostały natychmiast w środowisku naukowym zauważone, czego dowodem jest 10 cytowań artykułu opublikowanego zaledwie kilkanaście miesięcy temu w Proceedings of the Royal Society B. Wysoka cytowalność artykułów z tak krótkim stażem świadczy o ważności podejmowanej w nich tematyki badawczej oraz istotnym znaczeniu tej tematyki dla rozwoju współczesnej biologii. 2. Ocena tematyki badawczej i testowanych hipotez Cykl artykułów mgr Sadowskiej składający się na jej rozprawę doktorską zajmuje się bardzo ważnym zagadnieniem współczesnej biologii, jakim jest ewolucja stałocieplności. Stałocieplność jest złożoną adaptacją fizjologiczną, dzięki której ptaki i ssaki utrzymują względnie stałą, wysoką temperaturę ciała, niezależnie od temperatury otoczenia. Możliwe jest to dzięki posiadaniu wysokiego tempa metabolizmu podstawowego (BMR) oraz zdolności ptaków i ssaków do szybkiego zwiększania tempa metabolizmu ponad poziom podstawowy. Wysoka temperatura ciała oznacza możliwość przyspieszenia wszystkich procesów metabolicznych, a zatem zwiększenia ogólnego tempa przetwarzania energii, co w sensie fizycznym oznacza osiągnięcie większej mocy. Stałe utrzymywanie wysokiej temperatury ciała daje gotowość do rozwinięcia tej mocy w każdej chwili i niezależnie od
3 zmieniających się warunków środowiskowych, co istotne jest zarówno przy wysiłku krótkotrwałym (ucieczka przed drapieżnikiem, pogoń za ofiarą) jak i długotrwałej opiece nad potomstwem czy migracji. Powszechnie uważa się, że duża moc, osiągnięta dzięki wysokiej temperaturze ciała, stała się prerekwizytem zdolności do lotu u ptaków oraz umożliwiła znaczne udoskonalenie sytemu nerwowego (szczególnie mózgu) u ssaków, co przyczyniło się do opanowania przez te zwierzęta większości środowisk na Ziemi. Pomimo łatwości, z jaką wylicza się potencjalne korzyści wynikające ze stałocieplności ptaków i ssaków, dużo trudniej odpowiedzieć na pytanie jak doszło do ewolucji stałocieplności, biorąc pod uwagę jej wysokie koszty energetyczne oraz fakt, że metabolizm ptaków i ssaków utrzymywany jest na poziomie około 20 razy wyższym niż metabolizm gadów. Szczególnie burzliwa dyskusja dotyczy pytania do czego konkretnie w ewolucji stałocieplności potrzebny był wysoki BMR, czyli która z domniemanych cech osobniczych faworyzowanych przez dobór naturalnych w procesie wykształcania się stałocieplności była na tyle funkcjonalnie związana z tempem metabolizmu podstawowego, że kierunkowe zmiany tej cechy prowadziły do skorelowanego wzrostu BMR. Wśród cech osobniczych uważanych za potencjalnie istotne w procesie ewolucji stałocieplności oraz mogących funkcjonalnie zależeć od BMR, do najczęściej dyskutowanych i testowanych empirycznie zalicza się: 1) maksymalne wysiłkowe tempo metabolizmu tlenowego (model wydolności tlenowej, według którego wzrost dostosowania osobnika osiągany jest na przykład poprzez szybszą ucieczkę przed drapieżnikiem lub/i skuteczniejszą pogoń za ofiarą), 2) maksymalne tempo produkcji ciepła (model według którego lepsza wydolność termogeniczna umożliwiała lepszą opiekę rodzicielską realizowaną przez wydajniejszą inkubację jaj i ogrzewanie młodych), 3) maksymalne tempo asymilacji pokarmu (model wydolności asymilacyjnej, według którego długotrwała zwiększona asymilacja pokarmu umożliwia intensywniejsze karmienie młodych i skuteczniejszą obronę gniazda). Ponieważ przemiany metaboliczne oraz asymilacja pokarmu dotyczą procesów zachodzących przede wszystkim w tkankach miękkich organizmu, wnioskowanie o ewolucji stałocieplności w kontekście ewolucji zmian tempa metabolizmu jest znacznie utrudnione ze względu na brak stosownych dowodów paleontologicznych. Empiryczne testowanie poszczególnych
4 scenariuszy dotyczących ewolucji stałocieplności polega więc na badaniu związków między BMR a maksymalnym wysiłkowym tempem metabolizmu tlenowego (model wydolności tlenowej), maksymalną termogenezą bezdreszczową (model wydolności termogenicznej) i maksymalną asymilacją pokarmu (model wydolności asymilacyjnej). Zarówno model wydolności termogenicznej jak i model wydolności asymilacyjnej zostały sformułowane w kontekście domniemanego popierania przez dobór naturalny zwiększonej opieki nad potomstwem, prowadzącej do zwiększonej wydolności reprodukcyjnej, mierzonej liczebnością miotu/lęgu oraz wielkością/jakością młodych. Oba te modele charakteryzują się więc tym samym efektem końcowym (zwiększoną wydolnością reprodukcyjną), osiąganym poprzez różne mechanizmy (termoregulacja versus odżywianie i obrona młodych). Sytuacje komplikuje ponadto fakt, że zwiększona termoregulacja wymaga na dłuższa metę zwiększonej asymilacji pokarmu, więc mierzenie samej asymilacji pokarmu w czasie opieki nad potomstwem nie informuje nas jak asymilowana energia jest wykorzystywana. Podobnie, mierzenie tylko i wyłącznie wydolności reprodukcyjnej nie informuje nas w jaki sposób doszło do zwiększenia liczby/wielkości/jakości młodych - czy poprzez skuteczniejszą termoregulację, czy poprzez lepsze odżywianie młodych i ich skuteczniejszą obronę, czy też poprzez wszystkie te procesy łącznie. W oparciu o najnowsza literaturę światową oraz wcześniejsze badania przeprowadzone przez swoich kolegów w Białymstoku, mgr Sadowska skoncentrowała się w swojej pracy doktorskiej na bardzo rzetelnym i konsekwentnym testowaniu modelu wydolności asymilacyjnej laktujacych samic myszy laboratoryjnej, odrzucając niejako a priori model wydolności termoregulacyjnej. Stało się tak ze względu na zademonstrowany wcześniej przez dr Gębczyńskiego (2008) brak korelacji między BMR a maksymalną termogenezą bezdreszczową u samców myszy laboratoryjnej. Uważam, że sytuacja metaboliczna laktujących samic rożni się zasadniczo od sytuacji samców, i używanie parametrów fizjologicznych zmierzonych u jednej płci do podejmowania strategicznych decyzji o przyjmowaniu/odrzucaniu hipotez dotyczących wydolności reprodukcyjnej drugiej płci, może być ryzykowne. Być może, w przyszłości, należałoby przeprowadzić eksperyment laktacyjny, w którym mierzona jest nie tylko asymilacja pokarmu i produkcja mleka, lecz również wydolność termoregulacyjna laktujących samic. Nie ukrywam, że byłabym wynikami takiego eksperymentu bardzo zainteresowana, ze względu na sugerowaną przez grupę w Aberdeen negatywną korelację między produkcją mleka w szczycie laktacji a aktywnością termogeniczna brunatnej tkanki tłuszczowej, w kontekście proponowanych ograniczeń laktacji związanych z tempem dysypacji ciepła (Król et al. 2011).
5 U ssaków, udział samców w opiece nad potomstwem jest na ogół dużo mniejszy niż udział samic, biorąc pod uwagę ich wydatki energetyczne na reprodukcje oraz budżet czasowy. Od dawna zastanawiałam się czy jeżeli dobór działał na parametry fizjologiczne (takie jak termoregulacja lub asymilacja) zwiększające wydolność reprodukcyjną samic, czego skorelowanym efektem jest ich zwiększone tempo metabolizmu podstawowego, to jak należy interpretować wysoki BMR samców? Innymi słowy, czy dobór naturalny działał na wydolność termoregulacyjna/asymilacyjna obu płci, dlatego obie płcie maja wysoki BMR, czy też tylko na wydolność samic, czego efektem sprzężonym jest wysoki metabolizm samców? Czy możliwy jest dymorfizm płciowy, jeśli chodzi o BMR? Czy są jakieś dane pokazujące związek między wydolnością termoregulacyjną/asymilacyjną samców a ich sukcesem rozrodczym? Panią mgr Sadowską uważam za eksperta, jeśli chodzi o zagadnienia związane z ewolucją stałocieplności, dlatego chętnie bym z nią na te tematy porozmawiała. 3. Ocena metodyki badawczej Wiele prób testowania hipotez dotyczących ewolucji cech przystosowawczych zakończyło się fiaskiem, ze względu na stosunkową niską zmienność fenotypowa tych cech w kohortach zwierząt laboratoryjnych lub populacjach naturalnych, jak również niemożność odróżnienia czynników genetycznych od środowiskowych składających się na obserwowaną zmienność. Prace mgr Sadowskiej nie mają tego rodzaju problemów, ponieważ opierają się na unikatowym układzie eksperymentalnym, polegającym na wykorzystaniu doboru sztucznego do selekcji myszy laboratoryjnych (Swiss-Webster) na wysoki i niski BMR (dwie linie selekcyjne bez powtórzeń). Eksperymenty laktacyjne będące podstawą doktoratu mgr Sadowskiej zostały przeprowadzone na generacjach 32-43, czemu towarzyszyły prawie 50% różnice w poziomie BMR między selekcjonowanymi liniami, jak również różnice w wielkości organów wewnętrznych, ilości konsumowanego pokarmu i poziomie aktywności. Nie ulega zatem wątpliwości, że wykryta przez doktorantkę dodatnia korelacja między wydolnością reprodukcyjna laktujących samic a ich selekcjonowanym poziomem metabolizmu bazalnego ma charakter genetyczny. Wynik ten jest bardzo ważny, ponieważ wskazuje na możliwość skorelowanej ewolucji wydolności reprodukcyjnej i BMR, czego podłożem (po wykluczeniu efektu dryfu genetycznego) jest najprawdopodobniej ścisła zależność funkcjonalna, związana z wielkością organów wewnętrznych, koniecznych do asymilacji energii ale jednocześnie kosztownych do utrzymania (stąd wysoki BMR).
6 Przy okazji chciałam dodać, że Instytut Biologii na Uniwersytecie w Białymstoku jest jednym z niewielu ośrodków na świecie, który może się poszczycić prowadzeniem wieloletniego doboru sztucznego na populacjach myszy laboratoryjnych. Takie eksperymenty selekcyjne są niezmiernie kosztowne i pracochłonne (z tysiącami osobników, które trzeba przebadać pod kątem selekcjonowanej cechy), co dodatkowo przyczynia się do niezwykłej wartości naukowej badań przeprowadzonych przez mgr Sadowską. W celu porównania wydolności laktacyjnej samic selekcjonowach na wysoki i niski BMR, mgr Sadowska zrezygnowała z tak zwanych laktacji naturalnych (z naturalną wielkością miotów i podczas których samice wychowują swoje własne potomstwo), ze względu na to że naturalna zmienność miotu wprowadziłaby dodatkowa zmienność mierzonych parametrów laktacyjnych, takich jak wielkość młodych oraz tempo ich wzrostu, jak również tempo asymilacji energii i produkcji mleka. Dodatkowym argumentem przeciwko laktacjom naturalnym, jeśli chodzi o porównywanie dwóch linii selekcyjnych, jest niemożność odseparowania efektów samicy od efektów młodych. Bardzo dobrym pomysłem mgr Sadowskiej było przeprowadzenie eksperymentu laktacyjnego w ten sposób, że wszystkie matki karmiły taką samą liczbę młodych, żadne z młodych nie było karmione przez matkę biologiczna, oraz że połowa młodych w miocie pochodziła z linii selekcjonowanej na wysoki metabolizm, a druga połowa z linii selekcjonowanej na niski BMR. Z niejakim zdziwieniem natomiast przyjęłam fakt, że eksperymenty laktacyjne przeprowadzone były na miotach składających się tylko z ośmiu młodych. Za optymalną wielkość miotu u myszy laboratoryjnej przyjmuje się 10 młodych, gdyż przy takiej wielkości miotu, młode nie musza konkurować o dostęp do sutków, których samica ma 10. Przy ośmiu młodych też oczywiście nie dochodzi do takiej konkurencji, ale za to samica nie pracuje na maksymalnych obrotach, a zatem nie osiągą swojej maksymalnej wydolności laktacyjnej. Dlatego, częstym zabiegiem eksperymentalnym jest dawanie samicom myszy laboratoryjnej 12 lub 14 młodych, szczególnie jak badania dotyczą czynników ograniczających maksymalną asymilację pokarmu oraz maksymalną produkcję mleka. Nie ukrywam, że chciałabym się dowiedzieć, dlaczego mgr Sadowska zdecydowała się na użycie 8 młodych w miocie, oraz jak według niej zmuszenie samic do cięższej pracy (poprzez zwiększenie liczy młodych w miocie) mogłoby wpłynąć na wyniki badań. 4. Ocena wyników badań Wyniki badań mgr Sadowskiej są imponujące i stanowią bardzo poważny wkład w burzliwą dyskusję dotycząca ewolucji adaptacji fizjologicznych organizmów stałocieplnych, a w
7 szczególności ewolucji budżetów energetycznych ssaków. O jakości i znaczeniu tych badań świadczy fakt, że zostały one ocenione pozytywnie przez co najmniej 12 niezależnych recenzentów oraz trzech edytorów naukowych, zanim zostały opublikowane w prestiżowych czasopismach o wysokim Impact Factor i międzynarodowym zasięgu. Fakt ten czyni moje zadanie bardzo łatwe i przyjemne. Pierwsza publikacja poświęcona jest kluczowemu zagadnieniu, czy różnice w poziomie BMR miedzy selekcjonowanymi liniami myszy utrzymują się przez całe życie osobników (a nie tylko w młodym wieku, kiedy osobniki są selekcjonowane) oraz jak na utrzymywanie tych różnic wpływa reprodukcja. Pomiary metabolizmu u 47 samic z genetycznie wysokim BMR oraz 52 samic z genetycznie niskim BMR, przeprowadzone w wieku 12, 22 i 27 tygodni, z połową samic dopuszczoną do reprodukcji w wieku 14 tygodni, jednoznacznie wykazały że różnice metaboliczne miedzy liniami utrzymują się przez całe życie osobników, jak również w okresie reprodukcji. Druga publikacja dotyczy eksperymentu laktacyjnego przeprowadzonego na 15 samicach z linii selekcjonowanej na wysoki BMR oraz 15 samicach z genetycznie niskim BMR. Wszystkie samice wychowywały po osiem młodych, po cztery młode z linii na wysoki i niski BMR. Pierwszy tydzień laktacji odbywał się w temperaturze 23 C, po czym w ósmym dniu laktacji, matki z młodymi zostały przeniesione do temperatury 17 C. Mgr Sadowska oraz jej współautorzy argumentują, że ekspozycja na niższą temperaturę otoczenia została przeprowadzone po to żeby zabezpieczyć matki przed ograniczeniami laktacji wynikającymi z tempa dysypacji ciepła, które według mnie dotknęłyby przede wszystkim matki z genetycznie wysokim BMR. Uważam, że wynik ten byłby sam w sobie bardzo interesujący i biorąc pod uwagę globalna zmianę klimatu, nie pozbawiony ekologicznego realizmu. Wyniki eksperymentu laktacyjnego połączonego z ekspozycją na niższą temperaturę otoczenia są klarowne i pokazują, że samice selekcjonowane na wysoki BMR charakteryzowały się w takich warunkach środowiskowych wyższą wydolnością reprodukcyjna, ponieważ wyprodukowały większe młode niż samice selekcjonowane na niski BMR. Innym interesującym wynikiem jest wyższe tempo wzrostu młodych z linii o wysokim BMR, niezależne od metabolizmu matek, ale obserwowane tylko w czasie pierwszego tygodnia laktacji, w temperaturze 23 C. Nie jest jasne czy różnica ta utrzymywałaby się w dalszej części laktacji, gdyby nie doszło do zmiany temperatury otoczenia (z 23 na 17 C). Trzecia publikacja bazuje na bardzo podobnym układzie eksperymentalnym jak poprzednia, z ośmioma młodymi w miocie (po cztery młode z obu linii selekcyjnych), z pierwszą częścią laktacji przeprowadzoną w temperaturze 23 C oraz szczytem laktacji
8 odbywającym się w temperaturze 17 C. Tym razem u każdej z samic badane były dwie kolejne laktacje, oddzielone okresem pięciu tygodni. Celem badań było porównanie ilości i jakości mleka produkowanego przez samice selekcjonowane na wysoki i niski BMR. Matki o genetycznie wysokim BMR produkowały więcej mleka niż matki z linii selekcjonowanej na niski BMR, przy niewielkich różnicach dotyczących składu mleka. Różnice między liniami w ilości produkowanego mleka obserwowane były zarówno w czasie pierwszej jak i drugiej laktacji. Imponujący materiał empiryczny wygenerowany przez mgr Sadowską jest spójny z modelem wydolności asymilacyjnej, według którego długotrwała zwiększona asymilacja pokarmu umożliwia intensywniejsze karmienie młodych i skuteczniejszą obronę gniazda, i jako taka, mogła być cechą faworyzowaną przez dobór naturalny. Wyniki badań doktorantki jednoznacznie wskazują na istnienie korelacji genetycznej między wydolnością reprodukcyjną lakujących samic i ich BMR oraz wielkością organów wewnętrznych, co przyczynia się do lepszego zrozumienia procesów ewolucyjnych zachodzących w przeszłości, prowadzących do powstania stałocieplności u ptaków i ssaków. Publikacje dr Sadowskiej dotyczące ewolucji stałocieplności mają zatem dużą szansę na wejście do kanonu literatury naukowej w dziedzinie fizjologii ewolucyjnej ptaków i ssaków. 5. Podsumowanie i wnioski Rozprawa doktorska mgr Julity Sadowskiej oceniam w całości jako bardzo oryginalna i wartościową, oraz dotyczącą zagadnień o dużym znaczeniu i stopniu ogólności, a zatem wnoszącą istotny wkład w rozwój dziedziny. Z całym przekonaniem stwierdzam, że rozprawa doktorska mgr Julity Sadowskiej spełnia wymagania określone w art. 16 i 17 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. Nr 65, poz. 595 ze zm. w Dz. U. z 2005 r.). Wnioskuję więc o dopuszczenie mgr Julity Sadowskiej do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Ponadto, ze względu na wysoką wartość merytoryczną artykułów naukowych składających się na rozprawę, wnoszę o wyróżnienie mgr Julity Sadowskiej stosowną nagrodą. Dr hab. Elżbieta Król