MEDYCYNA DOŚWIADCZALNA I MIKROBIOLOGIA

MEDYCYNA DOŚWIADCZALNA I MIKROBIOLOGIA ORGAN NARODOWEGO INSTYTUTU ZDROWIA PUBLICZNEGO PAŃSTWOWEGO ZAKŁADU HIGIENY 1 ROK LXXI KWARTALNIK 2019 NARODOWY INSTYTUT ZDROWIA PUBLICZNEGO - - PAŃSTWOWY ZAKŁAD HIGIENY

MEDYCYNA DOŚWIADCZALNA I MIKROBIOLOGIA Organ Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego Państwowego Zakładu Higieny i Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów REDAKCJA Redaktor: WALDEMAR RASTAWICKI Zastępca Redaktora: RAFAŁ GIERCZYŃSKI Sekretarz: KATARZYNA ZACHARCZUK Redaktor językowy (język polski): STANISŁAW KAŁUŻEWSKI Redaktor językowy (język angielski): MARIA DOMINGUEZ Redaktor statystyczny: DANIEL RABCZENKO KOMITET REDAKCYJNY D. Dzierżanowska - Warszawa, S. Giedrys-Kalemba - Szczecin, E. Gołąb - Warszawa, E. Gospodarek - Bydgoszcz, P.B. Heczko - Kraków, A. Jaworski - Łódź, B. Litwińska - Warszawa, K. Piekarska - Warszawa, B. Różalska - Łódź, A. Stankiewicz - Warszawa, E.M. Szewczyk - Łódź, A. Szkaradkiewicz - Poznań, J. Szych - Warszawa, E.A. Trafny - Warszawa, S. Tyski - Warszawa, M.L. Zaremba - Białystok, A.A. Zasada - Warszawa, Z. Zwolska - Warszawa Adres Redakcji: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24 E-mail: medmikrobiol@pzh.gov.pl Tel: 22 54 21 325; 22 54 21 240 Fax: 22 54 21 307 www.medmikro.org.pl Indeks 365226 Punktacja za publikację wg MNiSW 7 pkt. Index Copernicus 89,77 pkt. Kwartalnik Medycyna Doświadczalna i Mikrobiologia jest indeksowany w bazie danych pn. Polska Bibliografia Lekarska (PBL). W latach 1949-2017 kwartalnik Medycyna Doświadczalna i Mikrobiologia ukazywał się jako organ Państwowego Zakładu Higieny (obecnie Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego - Państwowy Zakład Higieny) w Warszawie oraz Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów NARODOWY INSTYTUT ZDROWIA PUBLICZNEGO - - PAŃSTWOWY ZAKŁAD HIGIENY Skład i druk: Agencja Reklamowa TOP, ul. Toruńska 148, 87-800 Włocławek, tel.: 54 423 20 40, fax: 54 423 20 80, www.agencjatop.pl

SPIS TREŚCI W. Pollok-Waksmańska, K. Słowiaczek, D. Wijas. Salmonelloza u dzieci hospitalizowanych w Szpitalu Pediatrycznym w Bielsku - Białej w latach 2014 2015...5 W. Rastawicki, N. Rokosz-Chudziak, K. Śmietańska, U. Roguska. Absorpcja nieswoistych przeciwciał zawiesinami Salmonella Enteritidis i Salmonella Typhimurium z badanych próbek surowicy jako przydatna metoda w serodiagnostyce salmonellozy prowadzonej odczynem ELISA na potrzeby nadzoru epidemiologicznego...13 M. Kosecka-Strojek, P. Kaszycki, K. Regdos, K. Guzik, D. Ropek, J. Międzobrodzki. Wpływ nanocząstek na aktywność ludzkich neutrofili: analiza zdolności wytwarzania rodników tlenowych w obecności nanohydrokoloidów Ag i Cu...23 A. Maj, A. Kusiak, K. Garbacz, M. Ziółkowska-Klinkosz. Kliniczna i mikrobiologiczna analiza niechirurgicznego leczenia zapalenia przyzębia ze wspomagającym wykorzystaniem terapii fotodynamicznej badania wstępne...35 W. Rastawicki, K. Śmietańska, N. Rokosz-Chudziak, U. Roguska. Awidność przeciwciał klasy IgG dla antygenów Francisella tularensis w przebiegu tularemii u ludzi... 43 D. Domański, M.A. Sikora, R.T. Kuthan, E. Augustynowicz-Kopeć, E. Swoboda-Kopeć. Nowe gatunki w obrębie kompleksów Candida parapsilosis i Candida glabrata... 51

CONTENTS W. Pollok-Waksmańska, K. Słowiaczek, D. Wijas. Salmonellosis among children hospitalized in Pediatric Hospital in Bielsko-Biała, Poland, in the years 2014-2015...5 W. Rastawicki, N. Rokosz-Chudziak, K. Śmietańska, U. Roguska. Absorption of non-specific antibodies with Salmonella Enteritidis and Salmonella Typhimurium suspensions from tested serum samples as a useful method in serodiagnosis of salmonellosis carried out by ELISA for epidemiological surveillance...13 M. Kosecka-Strojek, P. Kaszycki, K. Regdos, K. Guzik, D. Ropek, J. Międzobrodzki. Effect of colloidal silver and copper nanoparticles on generation of radical oxygen species (ROS) in human neutrophils...23 A. Maj, A. Kusiak, K. Garbacz, M. Ziółkowska-Klinkosz. Analysis of clinical and microbiological results of photodynamic therapy as support in non-surgical treatment of periodontitis preliminary study...35 W. Rastawicki, N. Rokosz-Chudziak, K. Śmietańska, U. Roguska. Avidity of IgG class antibodies to Francisella tularensis in the course of tularemia in humans... 43 D. Domański, M.A. Sikora, R.T. Kuthan, E. Augustynowicz-Kopeć, E. Swoboda-Kopeć. New species within Candida parapsilosis and Candida glabrata... 51

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2019, 71: 5-12 https://doi.org/10.32394/mdm.71.01 Salmonelloza u dzieci hospitalizowanych w Szpitalu Pediatrycznym w Bielsku - Białej w latach 2014-2015 Salmonellosis among children hospitalized in Pediatric Hospital in Bielsko-Biała, Poland, in the years 2014-2015 Wioletta Pollok-Waksmańska, Krystyna Słowiaczek, Danuta Wijas Wydział Nauk o Zdrowiu, Katedra Zdrowia Publicznego, Akademia Techniczno-Humanistyczna w Bielsku-Białej Zakażenia wywoływane pałeczkami z rodzaju Salmonella są poważną przyczyną nieżytu żołądkowo-jelitowego u dzieci. Prewencja poprzez odpowiednią higienę, w celu zminimalizowania ryzyka potencjalnej ekspozycji, jest kluczowa w zmniejszeniu liczby zachorowań. Celem pracy była analiza częstości występowania salmonellozy u dzieci w Szpitalu Pediatrycznym w Bielsku-Białej z uwzględnieniem serotypów pałeczek Salmonella, objawów przy przyjęciu oraz zmiany masy ciała dzieci podczas pobytu w szpitalu. Słowa kluczowe: Salmonelloza, Salmonella Enteritidis, epidemiologia ABSTRACT Introduction: Salmonella is a serious cause of gastroenteritis in children. Prevention through proper hygiene to minimize potential exposure is a key factor decreasing the number of morbidity. The aim of this study was the analysis of Salmonellosis incidence rate among children hospitalized in Pediatric Hospital in Bielsko-Biała, Poland, in the years 2014-2015 having regard to Salmonella s serotype, symptoms at admission to hospital and changes of body weight during hospital stay. Methods: The study was conducted on 79 children with Salmonellosis treated in years 2014-2015 in Pediatric Hospital in Bielsko-Biała, Poland. It was based on retrospective analysis of data from children s medical history. Results: In all age groups the most common serotype was Salmonella Entertidis. Analysis of children s clinical symptoms at admission to hospital showed that all children, both male and female, had abdominal pains before defecation. The major symptoms included also diarrhea with blood and fever. Among half of observed group emesis were observed.

6 W. Pollok-Waksmańska, K. Słowiaczek, D. Wijas The analysis of body weight at the hospital admission and discharge demonstrated that in majority of children the body weight increased during their stay in the hospital the weight gain occurred in 68,8% of male and in 48,4% of female children. Conclusions: The cases of Salmonella appeared comparatively often in children at the age of 0-2 years old and 3-5 years old. The most commonly isolated serotype of Salmonella was Salmonella Entertidis. In all age groups the most common symptoms were abdominal pain before defecation and diarrhea with blood. Due to high diarrhea prevalence it is advisable to introduce the education directed both to children and parents. Keywords: Salmonellosis, Salmonella Enteritidis, epidemiology WSTĘP Choroby biegunkowe są jedną z głównych przyczyn zgonów dzieci (10). Szacuje się, że biegunka jest drugą co do częstości, zaraz po zakażeniach układu oddechowego, przyczyną umieralności wśród dzieci (12). Epizod trwający mniej niż 2 tygodnie klasyfikujemy jako biegunkę ostrą, a gdy trwa ona 2 tygodnie lub dłużej, jako biegunkę przewlekłą (22). Najczęstszym czynnikiem etiologicznym ostrej biegunki u dzieci jest zakażenie wirusowe (ok. 70% zachorowań), z występowaniem rotawirusów i norowirusów, rzadziej przyczyną są zakażenia bakteryjne, m.in. Salmonella, Shigella, Campylobacter, enteropatogenne szczepy Escherichia coli (4). Pałeczki Salmonella są przyczyną około 90 milionów zakażeń i 155.000 zgonów rocznie, a średnia zachorowalność wynosi 1,14 zakażeń/100 osób rocznie. Statystyki są znacznie wyższe w Azji, gdzie zapadalność wynosi 4,72/100 osób rocznie (2). Gram ujemne pałeczki Salmonella należą do rodziny Enterobacteriaceae i obecnie dzieli się je na dwa gatunki: S. enterica i S. bongori (6, 7). Salmonella enterica dzieli się na sześć podgatunków (subspecies): enterica (I), salamae (II), arizonae (III a), diarizonae (III b), houtenae (IV), indica (VI), z czego Salmonella enterica subsp. enterica (I) odpowiada za około 99% infekcji u ludzi (2, 6). Dodatkowo rodzaj Salmonella został podzielony na wiele serotypów (serowarów) (19). Serotypy najczęściej związane z zachorowaniem u ludzi zamieszkałych w krajach należących do w Unii Europejskiej to S. Enteritidis i S. Typhimurium (7). Najczęstszym powodem zakażenia pałeczkami Salmonella jest skażona żywność (drób, jajka, produkty mleczne), u dzieci zdarzają się także przypadki zarażenia drogą fekalno-oralną. Obróbka termiczna produktów żywnościowych oraz odpowiednie mycie rąk są fundamentalne w unikaniu zakażeń (16, 18). Wyróżnia się cztery formy kliniczne zakażenia pałeczkami Salmonella. Najczęściej występującą postacią jest nieżyt żołądkowo-jelitowy. Mogą powodować one również posocznice, dur brzuszny (S. Typhi) i dury rzekome (S. Paratyphi A, B i C) oraz bezobjawową kolonizację (rezerwuarem bakterii jest wtedy woreczek żółciowy) (8, 14, 16). Okres inkubacji wynosi 6-72 godzin (11). Objawami zapalenia jelit są nudności, wymioty, wodnista biegunka, często również gorączka, dreszcze, bóle brzucha, mięśni i głowy. Podczas ostrej fazy zakażenia zajęta jest błona śluzowa jelita cienkiego i okrężnicy. Objawy utrzymują

Salmonelloza u dzieci w Szpitalu Pediatrycznym w Bielsku-Białej 7 się 2-7 dni. Pałeczki Salmonella są wydalane z kałem po infekcji przez około 5 tygodni. Bakteriemia występuje u 5-10% zakażonych osób, a niektóre z nich mogą rozwinąć infekcję ogniskową, taką jak zapalenie opon mózgowych oraz zakażenie kości i stawów. (2, 14). Celem pracy była ocena częstości występowania zakażeń pałeczkami Salmonella, z uwzględnieniem serotypów, u dzieci w grupie wiekowej od 0 16 lat zgłaszających się z ostrą biegunką do Szpitala Pediatrycznego w Bielsku-Białej. MATERIAŁ I METODY Analizą objęto pacjentów hospitalizowanych od 1.01.2014 r. do 31.12.2015 r. w Szpitalu Pediatrycznym w Bielsku Białej. Badane dzieci to mieszkańcy terenu Podbeskidzia, w przedziale wiekowym od 0 16 lat. Na przeprowadzone badania uzyskano zgodę Dyrekcji szpitala. Oceniano częstość występowania u dzieci objawów klinicznych przy przyjęciu do szpitala, rodzaj wyhodowanych drobnoustrojów z posiewu kału oraz stosunek zmian masy ciała przy przyjęciu i przy wypisie dziecka. Metodą badawczą była retrospektywna analiza zebranych danych z historii chorób dzieci z zakażeniem pałeczkami z rodzaju Salmonella. Dane, które pozyskano to: wiek, płeć, liczebność, rodzaj wystąpienia objawów klinicznych przy przyjęciu do szpitala. Wszystkim dzieciom pobierano krew, mocz i kał na badania. U dzieci od 0 2 lat kał wysyłano do laboratorium Stacji Sanitarno-Epidemiologicznej. Pobierano 3 próbki na posiew, a u dzieci powyżej 2 lat posiew kału wykonywano w przyszpitalnym laboratorium i pobierano dwie próbki kału. Każde dziecko miało wykonane przy przyjęciu lub następnego dnia badanie USG jamy brzusznej. Wszystkie dzieci były nawadniane pozajelitowo. Otrzymywały dożylnie odpowiednią ilość płynów z uzupełnieniem 8,4% NaHCO3 lub 15% KCL w zależności od niedoborów elektrolitowych. Analizą objęto 79 dzieci. W badanej grupie było 48 chłopców i 31 dziewcząt z zakażeniem pałeczkami Salmonella. W grupie wiekowej od 0 2 lat było 18 (37,5%) chłopców i 8 (25,8%) dziewcząt, w wieku od 3 5 lat było 16 (33,3%) chłopców i 12 (38,7%) dziewcząt, w wieku od 6 10 lat było 9 (18,8%) chłopców i 8 (25,8%) dziewcząt, natomiast w wieku od 11 16 lat było 5 chłopców (10,4%) i 3 dziewcząt (9,7%): (Tabela I). Tabela I. Liczebność badanej grupy w 2014 i 2015 roku z podziałem według płci i wieku. Przedział wiekowy/ wiek w latach Ogółem Płeć 0-2 lat 3 5 lat 6 10 lat 11 16 lat n % n % n % n % n % Chłopiec 18 37,5% 16 33,3% 9 18,8% 5 10,4% 48 100% Dziewczynka 8 25,8% 12 38,7% 8 25,8% 3 9,7% 31 100% n liczba dzieci, % - odsetek z grupy chłopców lub dziewcząt WYNIKI We wszystkich grupach wiekowych najczęściej występującym serotypem pałeczek Salmonella była S. Enteritidis. W grupie dzieci od 0 2 lat kolejne miejsca pod względem

8 W. Pollok-Waksmańska, K. Słowiaczek, D. Wijas częstości występowania zajęły serotypy: S. Mbandaka, S. Infantis, S. Paratyphi B oraz S. Enterica podgat. 3, w grupie wiekowej 3 5 lat były to Salmonella sp., S. Typhimurium, S. Infantis i S. Mbandaka. W grupie wiekowej 6 10 lat występowały serotypy Salmonella sp., S. Typhimurium oraz S. Mbandaka, a w grupie dzieci 11 16 lat oprócz serotypu S. Enteritidis wystąpił jeden przypadek S. Typhimurium (Tabela II). Tabela II. Wyhodowany serotyp pałeczek Salmonella z posiewu kału w badanej grupie dzieci z podziałem według płci i wieku. 0 2 lat 3 5 lat 6 10 lat 11 16 lat Serotyp Salmonella Chłopcy Dziewczynki Chłopcy Dziewczynki Chłopcy Dziewczynki Chłopcy Dziewczynki Enteritidis Mbandaka Paratyphi B Infantis Enterica podgat. 3 Salmonella sp. Typhimurium Razem n 14 6 13 9 9 4 4 3 % 77,8% 75% 81,25% 75% 100% 50% 80% 100% n 1 1-1 - 1 - - % 5,5% 12,5% - 8,33% - 12,5% - - n - 1 - - - - - - % - 12,5% - - - - - - n 2-1 - - - - - % 11,2% - 6,25% - - - - - n 1 - - - - - - - % 5,5 - - - - - - - n - - 1 1-2 - - % - - 6,25% 8,33-25% - - n - - 1 1-1 1 - % - - 6,25 8,33% - 12,5 20% - n 18 8 16 12 9 8 5 3 % 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% n liczba dzieci, % - odsetek z grupy chłopców lub dziewcząt Przeprowadzona analiza objawów klinicznych występujących u dzieci przy przyjęciu do szpitala wykazała, że u wszystkich dzieci, zarówno chłopców jak i dziewcząt występowały bóle brzucha przed oddaniem stolca, do głównych objawów należała również biegunka z krwią oraz gorączka. U około połowy dzieci zaobserwowano wymioty - wystąpiły one u 51,6% dziewcząt i u 43,8% chłopców (Tabela III). Przeprowadzona analiza masy ciała przy przyjęciu i przy wypisie wykazała, że u jednej z dziewczynek masa ciała była bez zmian, a u połowy grupy nastąpił przyrost masy ciała. W grupie chłopców u większości wystąpił przyrost masy ciała (68%) (Tabela IV).

Salmonelloza u dzieci w Szpitalu Pediatrycznym w Bielsku-Białej 9 Tabela III. Objawy występujące u dzieci przyjętych do Szpitala Pediatrycznego w Bielsku-Białej w latach 2014 i 2015. 0 2 lat 3 5 lat 6 10 lat 11 16 lat Występowanie objawów przy przyjęciu Chłopcy Dziewczynki Chłopcy Dziewczynki Chłopcy Dziewczynki Chłopcy Dziewczynki Ból brzucha przed oddaniem stolca Biegunka z krwią Gorączka Wymioty n 18 8 16 17 9 8 5 3 % 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% n 17 7 15 17 9 7 5 3 % 94,4% 87,5% 93,8% 100% 100% 87,5% 100% 100% n 16 8 15 16 9 8 5 3 % 88,9% 100% 93,8% 94,1% 100% 100% 100% 100% n 5 5 8 6 6 4 2 1 % 27,8% 62,5% 50% 35,3% 75% 44,4% 40% 33,3% n- liczba dzieci u których wystąpiły objawy, % - odsetek dzieci z objawami Tabela IV. Zmiana masy ciała przy wypisie w stosunku do masy ciała przy przyjęciu w analizowanej grupie z podziałem według płci i wieku dzieci. 0 2 lat 3 5 lat 6 10 lat 11 16 lat Zmiana masy ciała przy przyjęciu i wypisie Chłopcy Dziewczynki Chłopcy Dziewczynki Chłopcy Dziewczynki Chłopcy Dziewczynki Utrata masy ciała Przyrost masy ciała Bez zmian Razem n liczba dzieci, % - odsetek z grupy chłopców n 2 6 6 4 2 4 1 1 % 11,1% 75% 37,5% 33,3% 22,2% 50% 20% 33,3% n 15 2 9 7 5 4 4 2 % 83,3% 25% 56,3% 58,3% 55,6% 50% 80% 66,7% n 1-1 1 2 - - - % 11,1% - 6,2% 8,4% 22,2% - - % n 18 8 16 12 6 8 5 3 % 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100%

10 W. Pollok-Waksmańska, K. Słowiaczek, D. Wijas DYSKUSJA Pałeczki z rodzaju Salmonella są częstym patogenem ludzi, a większość pacjentów których dotyczy zakażenie, to dzieci poniżej 5 roku życia (2). Źródłem zakażeń są głównie produkty pochodzenia zwierzęcego, szczególnie jaja i drób (20). Częściej chorują osoby z niedokwasotą żołądka, po niedawnej antybiotykoterapii, leczeniu immunosupresyjnym, dzieci oraz osoby starsze (3). W latach 2007 2013 przeprowadzono retrospektywne badania zakażenia pałeczkami Salmonella w wybranych powiatach województwa kujawsko pomorskiego. Najczęściej izolowanym serotypem z 1452 próbek kału była Salmonella Enteritidis 1071 przypadków tj. 74,5% wszystkich izolacji. W dalszej kolejności znalazły się S. Typhimurium 101 przypadków (7,0%), S. Infantis 55 przypadków (3,8%), S. Virchow 46 przypadków (3,2%), S. Mbandaka 27 przypadków (1,9%) oraz S. Hadar 24 przypadki (1,7%). Najwięcej izolacji pochodziło od pacjentów z grupy wiekowej od 0 4 lat (32%) (23). W latach 2002 do 2012 przeprowadzono analizę sytuacji epidemiologicznej salmonelloz odzwierzęcych zarejestrowanych w Powiatowej Stacji Sanitarno Epidemiologicznej w Szczecinie. Spośród wszystkich zgłoszonych 1234 zachorowań, 762 (61,8%) dotyczyło dzieci do 14. roku życia. Najczęstszym rejestrowanym serotypem była Salmonella Enteritidis. Udział zachorowań tym typem Salmonelli wyniósł 84,85%. Kolejne miejsca zajęły S. Typhimurium, Infantis, Hadar, Mbandaka i Virchow (13). W 2014 roku została przeprowadzona ocena sytuacji epidemiologicznej salmonellozy w Polsce. Ocenę przeprowadzono na podstawie danych z biuletynu Choroby zakaźne i zatrucia w Polsce w 2014. W 2014 roku w Polsce zarejestrowano 8392 zachorowania na salmonellozy odzwierzęce, w tym 8197 przypadków salmonellozy jelitowej i 195 pozajelitowej. Z 5 serotypów najczęściej powodującym zachorowania we wszystkich województwach była S. Enteritidis. Ten typ serologiczny spowodował 76% ogólnego zachorowania na salmonellozę. S. Typhimurium była na drugiej pozycji na liście wykrytych serotypów. Najczęściej na salmonellozy chorowały dzieci w wieku poniżej 5 roku życia (17). W badaniach własnych najczęściej izolowanym serotypem pałeczek Salmonella u dzieci była S. Entertidis. Grupą wiekową, w której najczęściej rozpoznawano salmonellozy były dzieci do 5. roku życia (dziewczynki poniżej 5 lat stanowiły 64,5% chorych dziewczynek, a chłopcy 70,8%). Badania wskazują, że zakażenia pałeczkami Salmonella występują częściej u dzieci płci męskiej (1, 15). Według badań przeprowadzonych w Stanach Zjednoczonych w latach 1968 2000 częściej rozpoznaje się salmonellozę u chłopców niż u dziewczynek, ale w dorosłym wieku częściej występuje ona u kobiet (15). W badaniach własnych przeprowadzono analizę z podziałem według płci i zaobserwowano większą liczbę dzieci płci męskiej niż żeńskiej przyjmowanych do szpitala z zakażeniem pałeczkami Salmonella. W latach 2014-2015 liczba przyjętych chłopców wynosiła 48, a dziewcząt 31. W 2017 roku przedstawiono przypadek czternastoletniego chłopca, u którego przebieg zakażenia S. Enteritidis początkowo imitował objawy neuroinfekcji. W dniu poprzedzającym przyjęcie chłopiec gorączkował, zgłaszał światłowstręt i ból głowy, który nasilał się przy pionizacji. W dniu przyjęcia do Kliniki pojawiła się wodnista biegunka bez patologicznych domieszek. Potwierdzenie zakażenia nastąpiło na podstawie posiewu kału (21). We włoskich badaniach przeprowadzonych w 2003 roku wśród dzieci, które trafiły do szpitala w Palermo

Salmonelloza u dzieci w Szpitalu Pediatrycznym w Bielsku-Białej 11 z ostrym nieżytem żołądkowo-jelitowym, u prawie wszystkich pacjentów występowała biegunka oraz gorączka, u 55% pojawił się też jeden lub więcej epizod wymiotów (18). W badaniach własnych u wszystkich dzieci przy przyjęciu do szpitala występowały bóle brzucha przed oddaniem stolca, u większości objawami była również biegunka z krwią i gorączka. U około połowy dzieci (51,6% dziewcząt i 43,8% chłopców) wystąpiły wymioty. W badaniach własnych u większości pacjentów zaobserwowano przyrost masy ciała przy wypisie w porównaniu do masy ciała przy przyjęciu (przyrost masy ciała wystąpił u 68,8% dzieci płci męskiej i 48,4% dzieci płci żeńskiej). Inni autorzy w swoich badaniach nie przedstawiają informacji na temat zmian masy ciała podczas zakażeń. Biegunki wywołane pałeczkami z rodzaju Salmonella spowodowane są nieprzestrzeganiem zasad higieny podczas przygotowywania posiłków i zbyt rzadkim myciem rąk. Nieodpowiednia obróbka termiczna oraz przechowywanie potraw w temperaturze pokojowej powoduje namnażanie się i rozprzestrzenianie drobnoustrojów w zbiorowiskach ludzkich (18). Wskazane jest więc prowadzenie edukacji w tym zakresie skierowanej zarówno do dzieci jak i rodziców. PODSUMOWANIE 1. Porównywalnie często zakażenie pałeczkami Salmonella występowało u dzieci w grupach wieku: 0 2 oraz 3 5 lat. 2. Najczęściej izolowanym wśród dzieci serotypem pałeczek Salmonella była Salmonella Enteritidis. 3. We wszystkich grupach wiekowych dominującym objawem były bóle brzucha przed oddaniem stolca oraz biegunka z krwią. 4. Ze względu na częste występowanie biegunek wskazane jest prowadzenie edukacji skierowanej zarówno do dzieci jak i do rodziców. PIŚMIENNICTWO 1. Aiat Melloul A, Hassani L. Salmonella infection in children from the wastewater- spreading zone of Marrakesh city (Morocco). J Appl Microbiol 1999; 87, 4: 536-9. 2. Chen HM, Wang Y, Su LH, Chiu CH. Nontyphoid Salmonella Infection: Microbiology, Clinical Features, and Antimicrobial Therapy. Pediatr Neonatol 2013; 54, 3: 147-52. 3. Crum-Cianflone NF. Salmonellosis and the GI Tract: More than Just Peanut Butter. Curr Gastroenterol Rep 2008; 10, 4: 424 31. 4. Czerwionka-Szaflarska M, Adamska I. Ostra biegunka u dzieci najnowsze wytyczne. Forum Med Rodz 2009; 3, 6: 431-8. 5. Elliott EJ. Acute gastroenteritis in children. BMJ 2007; 6, 334: 35-40. 6. Eng SK, Pusparajah P, Ab Mutalib NS, Ser HL, Chan KG, Lee LH. Salmonella: A review on pathogenesis, epidemiology and antibiotic resistance. Frontiers in Life Science 2015; 8, 3: 284-93. 7. European Union Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks in 2010. EFSA Journal. 2012; 10, 3: 2597. 8. Gal-Mor O, Boyle EC, Grassl GA. Same species, different diseases: how and why typhoidal and non-typhoidal Salmonella enterica serovars differ. Front Microbiol 2014; 4, 5: 391.

12 W. Pollok-Waksmańska, K. Słowiaczek, D. Wijas 9. Guarino A, Ashkenazi S, Gendrel D. Evidence-Based Guidelines for Management of Gastroenteritis in Children in Europe. JPGN 2014; 59, 1: 132 52. 10. Guerrant RL, Huhhes JM, Lima NI, Crane J. Diarrhea in Developed and Developing Countries: Magnitude, Special Settings, and Etiologie. Rev Infect Dis 1990; 12, 1: 41-50. 11. Hohmann EL. Nontyphoidal Salmonellosis. Clin Infect Dis 2001; 15, 32, 2: 263-9. 12. Kelly P. Diarrhoeal disease. Clin Med 2011; 11, 5: 488-91. 13. Król-Pakulska E, Szlempo N, Pakulski C. Sytuacja epidemiologiczna salmoneloz odzwierzęcych w Szczecinie w latach 2002 2012. Pol Prz Nauk Zdr 2013; 1, 31: 32-7. 14. Murray PR, Rosenthal KS. Medical Microbiology. Sixth edition. Elsevier, 2009: 299-301. 15. Reller ME, Tauxe RV, Kalish LA, Molbak K. Excess salmonellosis in women in the United States: 1968 2000. Epidemiol Infect 2008: 138, 8: 1109-17. 16. Rożkiewicz D, Ołdak E. Bakteryjne zakażenie przewodu pokarmowego u dzieci. Gastroneterol Prakt 2014; 27: 11 3. 17. Sadkowska-Todys M, Czarkowski, MP. Salmonellozy w Polsce w 2014 roku. Prz Epidemiol 2016; 70: 358-66. 18. Saporito L, Colomba C, Scarlata F, Vrcchi V, Mammina C, Titone L. Clinical and microbiological features of Salmonella gastroenteritis in children. Infez Med 2007; 15: 24-9. 19. Su LH, Chiu CH. Salmonella: Clinical Importance and Evolution of Nomenclature. Chang Gung Med J 2007; 30: 210-9. 20. Suh DK, Song JC. Analysis of Salmonella enterica serotype Enteritidis isolated from human and chickens by repetitive sequence-pcr fingerprinting, antibiotic resistance and plasmid profiles. J Vet Sci 2006; 7: 37-41. 21. Szewczyk M, Pokorska - Śpiewak M, Szczepaniak K. Zakażenie Salmonella enteritidis imitujące neuroinfekcję u czternastoletniego pacjenta opis przypadku. Pediatr Pol 2017; 92, 2: 210-3. 22. World Health Organisation. The management and prevention of diarrhoea: practical guidelines. 3 rd ed. 1993. https://apps.who.int/iris/handle/10665/37036 23. Zuziakowski M, Kasprzak, J. Klawe J. Analiza retrospektywna zakażeń pałeczkami Salmonella w latach 2007 2013 w wybranych powiatach województwa kujawsko pomorskiego. Probl Hig Epidemiol 2014; 95: 616-23. Otrzymano: 18 XII 2018 r. Adres Autora: 43-300 Bielsko-Biała, ul. Willowa 2, Wydział Nauk o Zdrowiu, Akademia Techniczno-Humanistyczna

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2019, 71: 13-21 https://doi.org/10.32394/mdm.71.02 Absorpcja nieswoistych przeciwciał zawiesinami Salmonella Enteritidis i Salmonella Typhimurium z badanych próbek surowicy jako przydatna metoda w serodiagnostyce salmonellozy prowadzonej odczynem ELISA na potrzeby nadzoru epidemiologicznego Absorption of non-specific antibodies with Salmonella Enteritidis and Salmonella Typhimurium suspensions from tested serum samples as a useful method in serodiagnosis of salmonellosis carried out by ELISA for epidemiological surveillance Waldemar Rastawicki, Natalia Rokosz-Chudziak, Karolina Śmietańska, Urszula Roguska Zakład Bakteriologii i Zwalczania Skażeń Biologicznych, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Państwowy Zakład Higieny w Warszawie Poszukiwanie przeciwciał dla pałeczek Salmonella w próbkach surowicy jest cenną metodą diagnostyczną w przypadku podejrzenia salmonellozy u ludzi. Ze względu na wysokie podobieństwo antygenowe pałeczek Salmonella, jako antygenu w odczynie ELISA wykorzystuje się przeważnie mieszaninę lipopolisacharydów uzyskanych z dwóch najczęściej występujących serotypów pałeczek Salmonella, tj. S. Enteritidis i S. Typhimurium. Taki antygen zapewnia wystarczającą czułość i swoistość w rutynowo prowadzonej na potrzeby lekarzy klinicystów serodiagnostyce salmonellozy, nie umożliwia natomiast rozróżnienia serotypu pałeczek Salmonella odpowiedzialnego za zakażenie. W przypadku konieczności określenia konkretnego serotypu, np. w dochodzeniu epidemiologicznym, pomocne może być zastosowanie absorpcji zawiesinami bakteryjnymi nieswoistych przeciwciał z próbek surowicy osób chorych. W prezentowanej pracy przedstawiono prostą, tanią i skuteczną metodę prowadzenia absorpcji zawiesinami pałeczek S. Enteritidis i S. Typhimurium nieswoistych przeciwciał z próbek surowicy osób z salmonellozą. Słowa kluczowe: S. Typhimurium, S. Enteritidis, serodiagnostyka salmonelozy, krzyżowe reakcje, absorpcja

14 W. Rastawicki, N. Rokosz-Chudziak, K. Śmietańska, U. Roguska ABSTRACT Introduction: Diagnosis of salmonellosis is usually made by stool culture however in many laboratories ELISA for the detection of human serum antibodies against mixture of LPS antigens of the two predominant serovars of Salmonella was developed. We present the method of absorbing non-specific antibodies with S. Enteritidis (serovars D) and S. Typhimurium (serovars B) suspensions from serum samples as a useful method in serodiagnosis of salmonellosis carried out by ELISA. This simple, cost-efficient and effective method of absorption may be used in the epidemiological investigations. Methods: We used in-house ELISA three different antigens: LPS of the S. Enteritidis, LPS of the S. Typhimurium and 1:1 mixture of LPS of both serovars. Serum samples collected from 14 patients with salmonellosis, were absorbed with 20% bacterial suspensions obtained from S. Enteritidis, S. Typhimurium and mixture of both serovars (serovars B+D). The non-absorbed sera and sera after particular absorptions were tested separately in ELI- SA with all three antigens. Results: The all 14 non-absorbed serum samples showed a high positive results in the IgA, IgG and IgM ELISA with all three LPS antigens. Absorption of the 13 from 14 tested samples with the Salmonella B suspension resulted in a significant decrease in the level of antibodies to Salmonella B antigen, but only a very slight decrease in the levels of Salmonella B + D and Salmonella D antigen. On the other hand, the absorption of the same sera with Salmonella D suspension, caused a significant decrease in the level of antibodies for serovars D, B and B + D antigens. Such a test result clearly shows that the 13 serum samples were obtained from patients with an infection caused by S. Enteritidis (serogroup D). A opposite picture of the humoral response was obtained in the case of one serum sample obtained from a subject with an infection caused by S. Typhimurium (serogroup B). Conclusions: The presented work demonstrates the usefulness of absorption of non-specific antibodies with S. Enteritidis and S. Typhimurium suspensions in serodiagnosis of salmonellosis carried out by ELISA. Key words: S. Typhimurium, S. Enteritidis, serodiagnosis of salmonelosis, cross-reactions, absorption WSTĘP Salmonellozy to grupa chorób zakaźnych przewodu pokarmowego wywoływana przez Gram-ujemne pałeczki Salmonella, tzw. pałeczki niedurowe (odzwierzęce), inne niż S. typhi i S. paratyphi (czynniki etiologiczne duru brzusznego i durów rzekomych), zaliczane do dwóch gatunków: S. enterica i S. bongori. Zgodnie z danymi epidemiologicznymi za wywoływanie salmonellozy w naszym kraju odpowiedzialne są przede wszystkim pałeczki należące do grupy serologicznej D, głównie S. Enteritidis (ponad 70,0% przypadków) i grupy B, głównie S. Typhimurium (około 10,0% przypadków) (8). Drobnoustroje te posiadają wspólne komponenty antygenowe (antygen 1,12) odpowiedzialne za występowanie reakcji krzyżowych w badaniach serologicznych. W dostępnej literaturze istnieją liczne doniesienia o wykorzystaniu badań serologicznych w laboratoryjnej diagnostyce salmonellozy (1, 2, 4, 5, 7, 9, 10, 11, 12, 13). Serodiag-

Absorpcja przeciwciał zawiesinami S. Typhimurium i S. Enteritidis 15 nostyka jest szczególnie przydatna w przewlekłych przypadkach chorobowych, przebiegających chociażby jako reaktywne zapalenie stawów, kiedy nie ma już możliwości wyizolowania czynnika etiologicznego. Ze względu jednak na występowanie licznych, czasami bardzo silnych reakcji krzyżowych, w większości testów jako antygenu wykorzystuje się mieszaninę lipopolisacharydów uzyskanych metodą Westphala z pałeczek należących tylko do dwóch serotypów najczęściej odpowiedzialnych za wywoływanie salmonellozy, tj. S. Typhimurium oraz S. Enteritidis (2, 7, 9, 10). Takie postępowanie jest bardzo wygodne i wystarczające w rutynowej serodiagnostyce salmonellozy prowadzonej na potrzeby lekarzy klinicystów. Trzeba mieć jednak na uwadze fakt, że przy użyciu takiego preparatu antygenowego, nie można jednoznacznie określić odczynem ELISA grupy serologicznej pałeczek Salmonella odpowiedzialnych za zakażenie i wystąpienie objawów klinicznych. Nie mniej jednak taka informacja może być przydatna w niektórych okolicznościach, np. w dochodzeniu epidemiologicznym. W przypadkach bowiem, kiedy wynik badania bakteriologicznego jest ujemny, poszukiwanie swoistych przeciwciał, utrzymujących się w surowicy chorego przez szereg tygodni, może być jedyną możliwością potwierdzenia etiologii choroby oraz grupy serologicznej pałeczek Salmonella odpowiedzialnych za wywołanie objawów klinicznych. W prezentowanej pracy przedstawiono metodę absorpcji nieswoistych przeciwciał zawiesinami Salmonella Typhimurium i Salmonella Enteritidis z próbek surowicy osób z salmonellozą jako skutecznego narzędzia przydatnego w dochodzeniu epidemiologicznym prowadzonym metodami serologicznymi. MATERIAŁ I METODY Próbki surowicy. Przedmiotem badań było 14 próbek surowicy uzyskanych od osób podejrzanych o salmonellozę. Do badań wybrano próbki surowicy, w których w rutynowych badaniach prowadzonych odczynem ELISA wykazano wysoki poziom przeciwciał dla preparatu antygenowego, będącego mieszaniną lipopolisacharydów (w stosunku 1:1) uzyskanych z pałeczek Salmonella Typhimurium oraz Salmonella Enteritidis. Odczyn immunoenzymatyczny ELISA. Odczyn opracowano we własnym zakresie i wykonywano na płytkach polistyrenowych firmy Nunc zgodnie z metodyką opisaną uprzednio (7). W odczynie ELISA zastosowano trzy różne preparaty antygenowe: 1. Mieszaninę wagowo równych ilości lipopolisacharydów (Sigma, nr kat. L-6011 i L-6511) uzyskanych metodą Westphala z pałeczek S. Enteritidis (grupa D) oraz S. Typhimurium (grupa B). Preparat ten jest stosowany w rutynowo prowadzonych badaniach serologicznych w kierunku salmonellozy. 2. Lipopolisacharydy (Sigma, nr kat. L-6011) uzyskane metodą Westphala z pałeczek S. Enteritidis (grupa D) 3. Lipopolisacharydy (Sigma, nr kat. L-6511) uzyskane metodą Westphala z pałeczek S. Typhimurium (grupa B) Końcowe stężenie użytkowe każdego preparatu antygenowego wynosiło 5 µg/ml. W badaniach wykorzystano próbki surowicy nie poddane absorpcji, absorbowane zawiesiną pałeczek Salmonella grupy B, absorbowane zawiesiną pałeczek Salmonella grupy D oraz absorbowane zawiesiną pałeczek Salmonella grup B+D. Rozcieńczenie próbek surowicy wynosiło 1:100.

16 W. Rastawicki, N. Rokosz-Chudziak, K. Śmietańska, U. Roguska Absorbcja przeciwciał. Absorpcję wykonywano w celu pozbycia się krzyżowych, nieswoistych reakcji zachodzących pomiędzy badanymi próbkami surowicy oraz użytymi w odczynie ELISA preparatami antygenowymi. W tym celu uzyskano we własnym zakresie 20% zawiesinę pałeczek S. Enteritidis (grupa D) oraz S. Typhimurium (grupa B). Następnie, do trzech probówek zawierających każda po 75 µl surowicy dodawano odpowiednio: 150 µl 20% zawiesiny pałeczek S. Enteritidis, 150 µl 20% zawiesiny pałeczek S. Typhimurium oraz 150 µl mieszaniny obydwu 20% zawiesin (75 µl S. Enteritidis + 75 µl S. Typhimurium). Surowice wraz zawiesinami wytrząsano przez 1,5 godziny w temperaturze 37 o C, wirowano i wstawiano na noc do chłodni. Po tym czasie osad bakteryjny ponownie zwirowywano a surowicę przeznaczano do badań w odczynie ELISA. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Na Rycinach 1-3 przedstawiono średnie arytmetyczne poziomy przeciwciał klasy IgA, IgG i IgM oznaczone we wszystkich 14 próbkach surowicy osób z salmonellozą. Jako antygen w odczynie ELISA zastosowano kolejno: zawiesinę pałeczek Salmonella serotypów B+D (Ryc. 1), serotypu Salmonella B (Ryc. 2) oraz serotypu Salmonella D (Ryc. 3). Ryc. 1. Średni arytmetyczny poziom przeciwciał klasy IgA, IgG i IgM (OD 450 ) dla antygenu LPS Salmonella grup B+D oznaczony odczynem ELISA w 14 próbkach surowicy osób z salmonelozą bez absorpcji, absorbowanych zawiesiną Salmonella grupy B, Salmonella grupy D oraz Salmonella grup B+D. W przypadku badania próbek surowicy nie poddanych absorpcji, bez względu na zastosowany antygen, uzyskiwano w odczynie ELISA wynik dodatni. Istotne różnice w poziomie przeciwciał można zaobserwować dopiero po zastosowanej absorpcji. I tak, absorpcja badanych próbek zawiesiną Salmonella B spowodowała, co oczywiste, wyraźny spadek poziomu przeciwciał dla antygenu Salmonella B, ale za to niewielki spadek poziomu przeciwciał dla antygenu Salmonella B+D oraz Salmonella D.

Absorpcja przeciwciał zawiesinami S. Typhimurium i S. Enteritidis 17 Ryc. 2. Średni arytmetyczny poziom przeciwciał (OD 450 ) dla antygenu LPS Salmonella grupy B oznaczony odczynem ELISA w 14 próbkach surowicy osób z salmonelozą bez absorpcji, absorbowanych zawiesiną Salmonella grupy B, Salmonella grupy D oraz Salmonella grup B+D. Ryc. 3. Średni arytmetyczny poziom przeciwciał (OD 450 ) dla antygenu LPS Salmonella grupy D oznaczony odczynem ELISA w 14 próbkach surowicy osób z salmonelozą bez absorpcji, absorbowanych zawiesiną Salmonella grupy B, Salmonella grupy D oraz Salmonella grup B+D.

18 W. Rastawicki, N. Rokosz-Chudziak, K. Śmietańska, U. Roguska Z drugiej strony, absorpcja surowic zawiesiną pałeczek Salmonella D, poza bardzo wyraźnym spadkiem poziomu przeciwciał oznaczonego odczynem ELISA z antygenem Salmonella D, spowodowała także znaczący spadek poziomu przeciwciał dla antygenów B oraz B+D. We wszystkich przypadkach największy spadek siły reakcji w odczynie ELISA zaobserwowano po absorpcji surowic mieszaniną zawiesin pałeczek Salmonella z grup B+D. Taki wynik badań świadczy jednoznacznie, że badane próbki surowicy w zdecydowanej przewadze uzyskano od osób z zakażeniem wywołanym przez pałeczki Salmonella Enteritidis (grupa serologiczna D). Faktycznie, szczegółowa analiza poszczególnych wyników wykazała, że tylko w jednym przypadku uzyskano próbkę surowicy od osoby z zakażeniem wywołanym przez pałeczki Salmonella Typhimurium (grupa serologiczna B). Na rycinie 4 przedstawiono szczegółowe poziomy przeciwciał klasy IgG oznaczone odczynem ELISA w próbce surowicy osoby z zakażeniem wywołanym przez pałeczki S. Typhimurium (słupki zaznaczono kolorem ciemniejszym) oraz dla porównania, poziomy przeciwciał osoby z typowym zakażeniem pałeczkami S. Enteritidis. Obydwie surowice nie poddane absorpcji, bardzo wyraźnie, prawie bez znaczących różnic, reagowały ze wszystkimi trzema antygenami. Tak więc, bez względu na użyty w odczynie ELISA antygen, nie było możliwe rozróżnienie grupy serologicznej pałeczek Salmonella odpowiedzialnych za zakażenie. Aby to umożliwić konieczne było przeprowadzenie swoistej absorpcji. I tak, w odczynie ELISA, w którym zastosowano mieszaninę dwóch antygenów (B+D), czyli stosowaną do opłaszczania płytek w rutynowych badaniach diagnostycznych, zaobserwowano spadek siły reakcji po absorpcji zawiesiną pałeczek Salmonella B surowicy uzyskanej tylko od osoby z zakażeniem S. Typhimurium. Dokładnie odwrotna sytuacja miała miejsce po absorpcji surowic zawiesiną Salmonella D, gdzie nastąpił drastyczny spadek reakcji z antygenem B+D tylko w przypadku surowicy osoby z zakażeniem wywołanym pałeczkami S. Enteritidis. Dopiero absorpcja próbek surowicy mieszaniną pałeczek Salmonella B+D spowodowała bardzo wyraźny spadek reakcji w odczynie ELISA zarówno z antygenem Salmonella B+D jak i pozostałymi dwoma antygenami. Wyniki uzyskane w odczynie ELISA z poszczególnymi antygenami Salmonella B oraz Salmonella D potwierdziły obserwacje poczynione w przypadku użycia jako antygenu mieszaniny obydwu serotypów. Co ciekawe, absorpcja przeciwciał osoby z zakażeniem S. Enteritidis swoistą zawiesiną Salmonella D spowodowała silniejszy spadek reakcji w odczynie ELISA z antygenem Salmonella B niż absorpcja przeciwciał osoby z zakażeniem S. Typhimurium swoistą zawiesiną Salmonella B w odczynie ELISA z antygenem Salmonella D (Rycina 4). Prowadzenie serodiagnostyki zakażeń wywoływanych przez pałeczki z rodzaju Salmonella nie jest łatwym zadaniem, ze względu na powszechność występowania zakażeń (wysoki poziom tła immunologicznego) oraz wysokie podobieństwo budowy antygenowej nie tylko w obrębie rodzaju Salmonella ale także rodziny Enterobacteriaceae. Lipopolisacharydy, stosowane jako antygeny w odczynie ELISA, są długimi heteropolimerami złożonymi z trzech strukturalnie odmiennych regionów: lipidu A, oligocukru rdzeniowego i wielocukru o swoistości antygenowej O, będącego antygenem somatycznym. Zarówno lipid A jak i oligocukier rdzeniowy są strukturami wysoce konserwatywnymi, o podobnej budowie antygenowej charakterystycznej dla wszystkich pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae. O przynależności pałeczek Salmonella do określonych grup serologicznych decyduje natomiast budowa antygenu somatycznego a utworzone przez różne cukry proste konfiguracje chemiczne decydują o jego swoistości serologicznej. Jest to najbardziej zewnętrzna część LPS którą można uzyskać z komórki bakteryjnej różnymi metodami, w tym metodą ekstrakcji kwasem trójchlorooctowym (metoda Boivina) lub mieszaniną fenolu z wodą (metoda Westphala) (3, 6, 7, 14).

Absorpcja przeciwciał zawiesinami S. Typhimurium i S. Enteritidis 19 Ryc. 4. Poziom przeciwciał klasy IgG (OD 450 ) dla antygenu LPS Salmonella grupy B+D, Salmonella grupy B oraz Salmonella grupy D oznaczony odczynem ELISA w próbce surowicy osoby z zakażeniem pałeczkami S. Enteritidis (grupa D) oraz z zakażeniem pałeczkami S. Typhimurium (grupa B) bez absorpcji i po absorpcji zawiesinami pałeczek Salmonella.

20 W. Rastawicki, N. Rokosz-Chudziak, K. Śmietańska, U. Roguska Zastosowanie w odczynie ELISA jako antygenu mieszaniny LPS dwóch najczęściej występujących serotypów pałeczek Salmonella, jest podyktowane ich wysokim podobieństwem antygenowym. Taki antygen zapewnia wystarczającą czułość i swoistość wyników serologicznych rutynowych badań prowadzonych u osób z podejrzeniem salmonellozy (2, 7, 9, 10). W przypadku konieczności określenia konkretnego serotypu pałeczek Salmonella odpowiedzialnego za zakażenie, pomocne może być zastosowanie absorpcji swoistymi zawiesinami nieswoistych przeciwciał obecnych w badanych próbkach surowicy. W takim przypadku, równolegle do surowicy nie poddanej absorpcji należy zbadać w odczynie ELI- SA z antygenem B+D surowice absorbowane niezależnie zawiesiną pałeczek S. Typhimurium oraz S. Enteritidis. Opisaną metodę absorpcji nieswoistych przeciwciał można również wykorzystać w przypadku próbek surowicy uzyskanych od osób zakażonych innymi serotypami pałeczek Salmonella. PIŚMIENNICTWO 1. Chart H, Cheasty T, Pinna E i inni. Serodiagnosis of Salmonella enterica serowar Typhi and S. enterica serovars Paratyphi A, B and C human infections. J Med Microbiol 2007; 56: 1161-6. 2. Falkenhorst G, Ceper TH, Strid MA i inni. Serological follow-up after non-typhoid salmonella infection in humans using a mixed lipopolysaccharide ELISA. Int J Med Microbiol 2013; 303: 533-8. 3. Freudenberg M, Merlin T, Gumenscheime M i inni. Role of lipopolysaccharide susceptibility in the innate immune response to Salmonella typhimurium infection: LPS, a primary target for recognition of Gram-negative bacteria. Microbes and Infection 2001; 3: 1213-22. 4. Gall D, Nielsen K, Bermudez RM i inni. Development of an indirect enzyme-linked immunosorbent assay for detecting equine serum antibodies to the lipopolysaccharide of Salmonella abortusequi. Res Vet Sci 2006; 81: 215-7. 5. Isomaki O, Vuento R, Granfors K. Serological diagnosis of salmonella infections by enzyme immunoassay. Lancet 1989; i: 1411-4. 6. Lamas A, Miranda JM, Regal P i inni. A comprehensive review of non-enterica subspecies of Salmonella enterica. Microbiol Res 2018; 206: 60-73. 7. Rastawicki W, Rokosz N, Jagielski M. Przydatność wybranych lipopolisacharydowych preparatów antygenowych uzyskanych z pałeczek Salmonella grupy serologicznej B i D do serodiagnostyki salmonelozy. Med Dośw Mikrobiol 2011, 63: 65 71. 8. Małgorzata Sadkowska-Todys, Mirosław P Czarkowski. Salmonelozy w Polsce w 2014 roku. Przegl Epidemiol 2016; 70: 358-66. 9. Strid MA, Dalby T, Mølbak K, Krogfelt KA. Kinetics of the human antibody response against Salmonella enterica Serovars Enteritidis and Typhimurium determinated by lipopolysaccharide enzyme-linked immunosorbent assay. Clin Vac Immunol 2007; 14:741-7. 10. Strid MA. Sero-response to Salmonella Enteritidis and Typhimurium infections: antibody decay profiles and sero-epidemiology. Rozprawa doktorska 2005, Statens Serum Institut, Kopenhaga, Dania.

Absorpcja przeciwciał zawiesinami S. Typhimurium i S. Enteritidis 21 11. van Zijderveld FG, van Zijderveld-van Bemmel AM, Anakotta J. Comparison of four different enzyme-linked immunosorbent assays for serological diagnosis of Salmonella enteritidis infections in experimentally infected chickens. J Clin Microbiol 1992; 30: 2560-6. 12. Wirz-Dittus S, Belloy L, Doherr MG i inni. Use of an indirect enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibodies in sheep naturally infected with Salmonella Abortusovis. J Vet Diagn Invest 2010; 22: 531-6. 13. Svenungsson B, Jorbeck H, Lindberg AA. Diagnosis of Salmonella infections: specificity of indirect immunofluorescence for rapid identification of Salmonella enteritidis and usefulness of enzyme-linked immunosorbent assay. J Infect Dis 1979; 140: 927-36. 14. Wen SC, Best E, Nourse C. Non-typhoidal Salmonella infections in children: Review of literature and recommendations for management. J Paediatr Child Health 2017; 53: 936-41. Otrzymano: 1 IV 2019 r. Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii i Zwalczania Skażeń Biologicznych, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego - Państwowy Zakład Higieny w Warszawie

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2019, 71: 23-33 https://doi.org/10.32394/mdm.71.03 Wpływ nanocząstek na aktywność ludzkich neutrofili: analiza zdolności wytwarzania rodników tlenowych w obecności nanohydrokoloidów Ag i Cu Effect of colloidal silver and copper nanoparticles on generation of radical oxygen species (ROS) in human neutrophils Maja Kosecka-Strojek 1, Paweł Kaszycki 2, Kinga Regdos 2, Krzysztof Guzik 3, Dariusz Ropek 4, Jacek Międzobrodzki 1 * 1 Zakład Mikrobiologii, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński w Krakowie 2 Zakład Biochemii, Instytut Biologii Roślin i Biotechnologii, Uniwersytet Rolniczy w Krakowie 3 Zakład Immunologii, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński w Krakowie 4 Katedra Ochrony Środowiska Rolniczego, Uniwersytet Rolniczy w Krakowie Rosnąca skala praktycznego użycia nanocząstek srebra i miedzi, a zwłaszcza perspektywa wykorzystania tych nanostruktur do stosowania wewnątrzustrojowego, skłoniły nas do zbadania wpływu nanokoloidów Ag i Cu na potencjał fizjologiczny neutrofili, mierzony chemiluminometrycznie zdolnością do generowania rodników tlenowych, czyli do tzw. wybuchu tlenowego. Neutrofile inkubowane z nanokoloidami nie wykazywały podniesionej aktywności wytwarzania rodników tlenowych. Podczas aktywacji neutrofili stymulatorem wybuchu tlenowego (drobiny lateksu polistyrenowego), obecność nanostruktur Ag i Cu nie wpływała dodatkowo na aktywność fizjologiczną komórek, co dowodzi zarówno braku cytotoksyczności, jak i braku stymulacji metabolizmu neutrofili przez badane nanokoloidy. Słowa kluczowe: nanokoloidy, nanomateriały, nanocząstki srebra, nanocząstki miedzi, neutrofile, chemiluminescencja, wybuch tlenowy ABSTRACT Introduction: Silver and copper nanoparticles (AgNPs, CuNPs) applied as hydronanocolloids are known to produce strong antibacterial and antifungal activities. They are extensively used in a number of applications including pharmacy, medicine and cosmetology (especially for surface-applied treatment of skin lesions) as well as agriculture, industry (paint, construction, etc.) and home or office (mainly disinfection applications). Moreover, there is a promising

24 M. Kosecka-Strojek, P. Kaszycki, K. Regdos i inni perspective of an intra-systemic NP use, especially to optimize targeted drug delivery. For the above reasons NPs cause risk of penetrating human body and exerting toxic effects and/ or stress reactions. This issue has inspired the authors to launch studies on the influence of colloidal AgNPs and CuNPs on physiological potential of neutrophils, blood-cells acting as the first line of immunological defense. Methods: Physiological activity of neutrophils was evaluated by measuring their ability to generate oxygen radicals (radical oxygen species, ROS) due to the respiratory (oxidative) burst mechanism. Human, peripheral blood-isolated neutrophils were stimulated with a standard activating agent (polystyrene latex particles) to develop high physiological potential revealed by enhanced ability to produce oxygen radicals. The cells were treated with silver and copper hydronanocolloids (each applied at concentrations ranging from 0.4 to 50 mg/kg) alternatively: in the absence and presence of the mentioned activator. The level of generated ROS upon oxidative burst was monitored chemiluminometrically. Results: The tested Ag and Cu-nanocolloids were not toxic against neutrophils although they hampered mitochondrial dehydrogenase activities when applied at higher levels. At lower concentrations they tended to stimulate ROS generation; however the treatment did not launch the oxidative burst. In the case of the latex-stimulated neutrophils, both types of nanoparticles in all experimental variants did not influence the levels of produced ROS. Conclusions: The obtained results indicate that the exposure of human neutrophils to colloidal AgNPs and CuNPs does not lead to an enhanced ROS generation, which may enable direct intra-blood application of the tested nanostructures, provided further necessary toxicological studies are carried out. Keywords: nanocolloids, nanomaterials, silver nanoparticles, copper nanoparticles, neutrophils, chemiluminescence, respiratory burst WSTĘP Ważnym kierunkiem i wyzwaniem nanotechnologii jest wykorzystywanie właściwości przeciwdrobnoustrojowych nanomateriałów. Bakteriobójcza i grzybobójcza aktywność nanocząstek srebra, miedzi, innych metali oraz ich tlenków została wykazana w licznych pracach badawczych (10, 17, 20, 23). Mechanizmy oddziaływania różnorodnych nanostruktur zawierających metale na komórki pro- i eukariotyczne (w tym ludzkie i zwierzęce) są w ostatnich latach intensywnie badane i poznawane (1, 2, 3, 8, 10, 20). Uzyskane dotąd wyniki badań otwierają optymistyczną perspektywę wykorzystania nanostruktur w celu pozyskania nowych leków przeciwdrobnoustrojowych, opracowania nośników związków o charakterze biobójczym, adiuwantów w innowacyjnych szczepionkach lub nośników farmaceutyków (16, 17, 24). Sprzyja temu zjawisko narastającej lekooporności patogenów na antybiotyki. Nanomateriały są już od lat obecne w praktyce farmakologicznej, przyczyniając się do opracowania modyfikowanych strukturalnie leków tak, aby wytworzyć funkcjonalne obiekty o skali submikroskopowej. Ostatnio szczególnie obiecującą drogą jest produkcja nanostruktur jako specyficznych nośników leków (22). Przy konstruowaniu nanoukładów, w tym nośnikowych, zabiegi prowadzące do modyfikacji strukturalnych stanowią często uzupełnienie technologii ich syntezy, zwłaszcza dominującej metody chemicznej syntezy organicznej (21).

Wpływ nanokoloidów Ag i Cu na aktywność neutrofili 25 Ważną rolę odgrywają przy tym nanocząstki zbudowane z kilkudziesięciu do kilku tysięcy atomów takich metali, jak srebro, złoto, miedź, iryd czy chrom (19). Liczne korzyści wynikające ze stosowania produktów nanotechnologicznych nie mogą przesłaniać możliwych zagrożeń wynikających z szerokiego zakresu ich użycia. Powracającą kwestią jest toksyczność nanomateriałów w stosunku do człowieka. Nanostruktury przedostają się do płynów ustrojowych, tkanek i narządów człowieka, stwarzając liczne zagrożenia. Jest to obszar tylko częściowo rozpoznany (11, 13, 18), a wiele opisanych bądź postulowanych skutków zdrowotnych wymaga potwierdzenia i dalszych analiz. Z pewnością badania te należy rozszerzyć o określenie wpływu nanomateriałów na tkanki pacjenta i poszczególne komórki narządów, będących celem leków wprowadzanych na nanonośnikach. Obecna wiedza na temat ewentualnych skutków interakcji komórek pacjentów z nanocząstkami jest wciąż niewystarczająca i trudno przewidzieć, jakie to może mieć znaczenie lub jakie mogą być tego odległe konsekwencje (17). Pytania budzą mechanizmy i następstwa kontaktu nanodrobin z neutrofilami, pełniącymi kluczową rolę we wrodzonej obronie immunologicznej organizmu, jako pierwsza linia obrony przed obcymi cząstkami (4). W niniejszej pracy przedstawiono interakcje zachodzące między nanokoloidami miedzi i srebra a neutrofilami. Celem pracy było zbadanie wpływu tych nanoukładów na aktywność fizjologiczną neutrofili, którą oceniano poprzez analizę intensywności oddychania mitochondrialnego oraz określenie zdolności do generowania reaktywnych form tlenu w procesie wybuchu tlenowego. MATERIAŁ I METODY Nanokoloidy miedzi i srebra. Badania prowadzono z wykorzystaniem komercyjnych preparatów nanocząstek miedzi i srebra w postaciach hydrokoloidalnych (oznaczanych, odpowiednio, CuNPs i AgNPs, z ang. NanoParticles), uzyskanych opatentowaną (Patent RP nr 3883399) metodą fizyczną firmy Nano-Tech Polska. Koloid nanocząstek miedzi (axonnite Copper) o stężeniu 0,005%, (50 mg/l, 50 ppm) składał się z nanocząstek miedzi metalicznej 4N i wody demineralizowanej, podobnie jak i koloid nanocząstek srebra (axonnite Silver) o stężeniu 0,005% (50 mg/l, 50 ppm), który składał się z nanocząstek srebra metalicznego 4N i wody demineralizowanej (3, 7, 12). Średnica stosowanych nanocząstek mieściła się w zakresie 2 do 35 nm. Ich zbliżony do sferycznego kształt oraz wielkość oceniono na podstawie analiz z wykorzystaniem transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) pracującego pod napięciem 200 kev, gwarantującym brak uszkodzeń badanych nanostruktur (3). Neutrofile. Neutrofile izolowano z krwi obwodowej łącznie od 14 zdrowych dawców. Do próbek krwi dodawano jako antykoagulant izocytrynian sodu (końcowe stężenie 0,01 M). Krew pozyskiwano z Regionalnego Centrum Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa w Krakowie. Izolację prowadzono z dolnej frakcji uzyskanej po izolacji komórek jednojądrzastych (PBMC), będącą mieszaniną neutrofili i erytrocytów. Neutrofile oddzielano od czerwonych krwinek wykorzystując różnice w szybkości ich sedymentacji. Osad zawieszano w roztworze 1% alkoholu poliwinylowego (PVA, Merck-Schuchardt ohg) w soli fizjologicznej, po czym zawiesinę pozostawiano do sedymentacji w ciemności. Frakcję wzbogaconą w neutrofile płukano przez wirowanie w buforze PBS (10 minut, 280 g, 20 C). Domieszkę erytrocytów poddawano lizie w buforze litycznym RBC (Du Pont, Wilmington, USA) zgodnie z zaleceniami producenta. Następnie neutrofile płukano, jak wyżej. Jeżeli w osadzie komórek po wirowaniu ponownie obserwowano erytrocyty, lizę powtarzano. Uzyskaną czystą frakcję neutrofili zawieszano w pożywce hodowlanej RPMI 1640 (Gibco, Life Technologies).

26 M. Kosecka-Strojek, P. Kaszycki, K. Regdos i inni Analizy cytotoksyczności nanokoloidów i oddziaływania na metabolizm neutrofili. Aktywność metaboliczną neutrofili wyznaczano metodą pomiaru intensywności respiracji mitochondrialnej (aktywność dehydrogenazowa) z wykorzystaniem barwnika MTT (ang. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). W teście tym, aktywnie oddychające komórki zdolne są do redukowania rozpuszczalnej, żółtej soli tetrazolowej MTT do nierozpuszczalnego formazanu o barwie purpurowej, którego stężenie, po solubilizacji, mierzy się spektrofotometrycznie. W każdej z serii pomiarowych testowano następujące stężenia nanokoloidów, przygotowane przez rozcieńczenie roztworu wyjściowego 50 mg/l buforem RPMI Medium 1640 (Gibco): 0,4, 2,0, 10 oraz 50 mg/l. Komórki (ok. 5,0 10 5 ) umieszczano w probówkach typu Eppendorf, wirowano (temp. 4 C, 370 g, 1200 obr./min przez 6 min) w wirówce Eppendorf Centrifuge 5415 R, po czym do peletu komórkowego dodawano po 200 μl wcześniej przygotowanego rozcieńczenia odpowiedniego nanokoloidu. Neutrofile inkubowano z badanym roztworem wariantowo, 5, 10 oraz 15 min. Po upływie tego czasu zawiesiny komórek ponownie wirowano, usuwano nadsącz, a w jego miejsce dodawano 100 μl roztworu MTT. Następnie, komórki inkubowano 2,5 godz. w temp. 37 C, po czym zawiesinę ponownie wirowano, usuwano rozpuszczony MTT, a osad komórek zadawano izopropanolem zakwaszonym HCl w celu ekstrakcji kryształków formazanu. Próbki wirowano, a następnie frakcję izopropanolową przenoszono do studzienki na płytce 96-dołkowej, gdzie mierzono absorbancję przy λ=560 nm (Molecular Devices Microplate Reader z oprogramowaniem SoftMax Pro 4.7 Software, Molecular Devices, LLC, USA) wobec izopropanolu jako próby ślepej. Potencjał fizjologiczny neutrofili związany ze skłonnością do wybuchu tlenowego, oceniano poprzez pomiar zdolności komórek do wytwarzania rodników tlenowych. Analizy prowadzono metodą chemiluminometryczną (14) w aparacie MicroLumat LB 96 P (EG&G Berthold, Niemcy). Do odczytu intensywności chemiluminescencji stosowano plastikowe mleczne płytki z 96 mikrostudzienkami, do których wprowadzano kolejno 150 μl buforu do chemiluminescencji, 2 μl CaCl 2, 30 μl badanego nanokoloidu w odpowiednim stężeniu i 2,5 10 5 neutrofili w 10 μl zawiesiny. Dla każdej z próbek przeprowadzano 6 serii pomiarowych, trwających po 20 minut. Wyniki rejestrowano za pomocą programu WinGlow. Przygotowano rozcieńczenia badanych nanokoloidów w wodzie destylowanej w zakresie stężeń, analogicznym do opisanego wyżej (0,4, 2,0, 10 i 50 mg/l). Ponadto, zawiesiny neutrofili traktowanych nanokoloidami stymulowano standardowym aktywatorem chemiluminescencji drobinami lateksu polistyrenowegoo średnicy ziaren Ø=80 μm (wyprodukowane w Instytucie Katalizy i Fizykochemii Powierzchni PAN w Krakowie; dodawano po 10 μl zawiesiny aktywatora do każdej ze studzienek). Opracowanie statystyczne wyników. Testy oddziaływania preparatów nanokoloidów Cu i Ag na neutrofile prowadzono w sześciu niezależnych seriach pomiarowych, każda z wykorzystaniem neutrofili pochodzących z krwi obwodowej innego dawcy. Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej za pomocą modułu Anova programu Statistica 13, dla poziomu istotności p= 0,05. Istotność różnicy między średnimi zawartościami badanych związków dla poszczególnych wariantów określono przy użyciu testu Tukeya. WYNIKI Analizy aktywności respiracyjnej neutrofili traktowanych zawiesinami nanokoloidalnych cząstek miedzi i srebra (CuNPs i AgNPs) wykazały tendencję do hamowania intensywności oddychania mitochondrialnego podczas inkubacji z wysokimi stężeniami nanocząstek.

Wpływ nanokoloidów Ag i Cu na aktywność neutrofili 27 Na Ryc. 1 i 2 przedstawiono przykładowe wyniki pomiaru aktywności dehydrogenazowej po 10 minutach inkubacji z CuNPs (Ryc. 1) i AgNPs (Ryc. 2). W przypadku CuNPs, nanokoloidy w stężeniach do 10 mg/l nie wykazywały hamującego wpływu, a jedynie podane w stężeniu 50 mg/l, po 10 min hamowały aktywność oddechową. Silniejszy efekt hamujący obserwowano w przypadku AgNPs; nanostruktury te nie wpływały negatywnie na metabolizm oddechowy w stężeniach 0,4 i 2,0 mg/l, natomiast stosowane w stężeniach 10 i 50 mg/l znacząco hamowały aktywność respiracyjną. Ryc. 1. Aktywność dehydrogenazowa neutrofili traktowanych przez 10 min nanokoloidami miedzi (preparat axonnite Copper). Kontrolę stanowiły zawiesiny neutrofili nieinkubowane z preparatami nanocząstek. Ryc. 2. Aktywność dehydrogenazowa neutrofili traktowanych przez 10 min nanokoloidami srebra (preparat axonnite Silver). Kontrolę stanowiły zawiesiny neutrofili nieinkubowane z preparatami nanocząstek.

28 M. Kosecka-Strojek, P. Kaszycki, K. Regdos i inni Badania chemiluminometryczne pokazały, że chemiluminescencja naturalna neutrofili nietraktowanych nanokoloidami (próba kontrolna), wyrażona w jednostkach względnych RLU (RLU, ang. relative luminescence unit względna jednostka luminescencji), wynosiła średnio 3,07 10 6 ± 1,66 10 6 RLU. Wartość ta wzrastała podczas traktowania nanocząstkami w wariantach niższych stężeń. W przypadku CuNPs (Ryc. 3, słupki ciemne) zastosowanych w stężeniach 0,4, 2,0 i 10 mg/l, intensywności chemiluminescencji wynosiły odpowiednio 1,04 10 7 ± 1,55 10 6, 7,37 10 7 ± 3,97 10 6 i 7,81 10 7 ± 4,6 10 6 RLU. Inkubacja z nanocząstkami Cu w stężeniu 50 mg/l nie skutkowała znaczącą zmianą sygnału luminescencyjnego (4,88 10 6 ± 1,66 10 6 RLU). Z kolei, nanokoloid srebra (Ryc. 4, słupki ciemne) wywoływał wzrost liczby rodników tlenowych w stężeniach 0,4 i 2,0 mg/l, odpowiednio do wartości 1,14 10 7 ± 2,09 10 6 i 1,25 10 7 ± 2,25 10 6 RLU. Traktowanie większymi dawkami, tj. 10 i 50 mg/l nie powodowało istotnych statystycznie zmian w stosunku do próby kontrolnej (odpowiednio 1,39 10 6 ± 1,05 10 5 i 2,23 10 6 ± 1,09 10 6 RLU). Ryc. 3. Wyniki chemiluminometrycznej analizy aktywności wytwarzania rodników tlenowych przez neutrofile traktowane koloidalnymi nanocząstkami miedzi (preparat axonnite Copper, słupki ciemne) oraz w warunkach dodatkowej aktywacji lateksem polistyrenowym (słupki jasne). Kontrolę stanowiły zawiesiny neutrofili nieinkubowane z preparatem nanocząstek, odpowiednio bez dodatku lateksu oraz aktywowane zawiesiną lateksu. Neutrofile aktywowane lateksem polistyrenowym emitowały chemiluminescencję o intensywności blisko dwa rzędy wielkości większej (wzrost średniej wartości sygnału z 3,07 10 6 ± 1,66 10 6 RLU do średnio 1,72 10 8 ± 5,59 10 7 RLU, Ryc. 3 i 4, słupki jasne, kontrola), co potwierdza, że drobiny tego aktywatora pobudzały komórki do reakcji w postaci wybuchu tlenowego. W warunkach zastosowania lateksu, dodanie do studzienek nanokoloidu miedzi lub srebra w różnych stężeniach nie wpływało znacząco na sygnał mierzonej chemiluminescencji (Ryc. 3 i 4, słupki jasne); średnie wartości, odpowiednio dla CuNPs i AgNPs wynosiły: 1,44 10 8 ± 4,23 10 7 RLU i 2,17 10 8 ± 6,0 10 6 RLU).

Wpływ nanokoloidów Ag i Cu na aktywność neutrofili 29 Ryc. 4. Wyniki chemiluminometrycznej analizy aktywności wytwarzania rodników tlenowych przez neutrofile traktowane koloidalnymi nanocząstkami srebra (preparat axonnite Silver, słupki ciemne) oraz w warunkach dodatkowej aktywacji lateksem polistyrenowym (słupki jasne). Pozostałe informacje jak w opisie pod Ryc. 3 DYSKUSJA Wykorzystywanie nanopreparatów zawierających małe cząstki w zakresie wielkości od 1 do 100 nm jest coraz popularniejsze w różnych dziedzinach, takich jak elektronika, kataliza, rolnictwo, przemysł budowlany, farbiarski, kosmetyka, farmacja, medycyna, jak również praktyka życia codziennego (biuro, dom, tekstylia, środki higieny osobistej i inne) (6, 7, 13, 17, 19, 20). Dynamiczny rozwój technologii nanomateriałowych pozwala na opracowanie innowacyjnych produktów i zastosowanie wielu nieznanych wcześniej, nowatorskich rozwiązań. Nanocząstki miedzi i srebra, w tym zwłaszcza preparaty aplikowane w postaci hydronanokoloidów, już znajdują zastosowanie jako środki bakteriobójcze i przeciwgrzybicze (7). Nanocząstki, obecne w wielu produktach i materiałach, dodawane do pasz, żywności, kosmetyków, leków czy opatrunków, jak również te przedostające się do środowiska w postaci odpadów, nie pozostają bez wpływu na organizmy żywe. Mogą kumulować się w tkankach tworząc złogi w organellach komórkowych, wpływać na strukturę i właściwości błon biologicznych, uszkadzać DNA, zaburzać procesy metaboliczne oraz wywoływać reakcje stresu komórkowego, m.in. indukując wytwarzanie wolnych rodników tlenowych (1, 2, 3, 8, 11, 17, 20). W przypadku nanocząstek srebra, stwierdzono ich negatywne działanie na komórki układu immunologicznego, m.in. cytotoksyczność wobec makrofagów (25) i ludzkich limfocytów T (5). Szczególna perspektywa zastosowania nanopreparatów podawanych drogą infuzji w postaciach iniekcji i wlewów stała się inspiracją do podjęcia badań nad wpływem nanokoloidów miedzi i srebra na neutrofile krwi obwodowej. Ważne jest uzyskanie jednoznacznej informacji, czy te preparaty, używane obecnie przede wszystkim do dezynfekcji (7), nadawałyby się do stosowania wewnętrznego. Jest to pytanie bardzo istotne w kontekście prowadzonych prac nad wykorzystaniem nanocząstek jako leków, bądź jako nośników le-

30 M. Kosecka-Strojek, P. Kaszycki, K. Regdos i inni ków podawanych wewnątrzustrojowo (16, 17, 22, 24). Neutrofile są najliczniejszymi komórkami odpornościowymi we krwi, a ich uszkodzenie mogłoby mieć poważne konsekwencje dla zdrowia pacjenta (4). Z drugiej strony, koloidalne nanocząstki metali mogą działać prozapalnie i/lub negatywnie oddziaływać na poszczególne elementy układu immunologicznego. Rolą neutrofili, uczestniczących w pierwszych etapach odpowiedzi na obecność obcych dla organizmu cząstek jest, między innymi, podwyższona produkcja reaktywnych form tlenu, opisana jako wybuch tlenowy (4). Mając na uwadze powyższe, dużą wagę ma ocena zachowania się neutrofili podczas ekspozycji na nanocząstki pojawiające się we krwi. Atrakcyjnym podejściem badawczym kondycji fizjologicznej i stanu czynnościowego neutrofili jest metoda chemiluminometryczna, opracowana i stosowana przez autorów (14, 15). Wykorzystuje ona zjawisko chemiluminescencji w zawiesinie badanych neutrofili. Zjawisko to powstaje, gdy naturalna emisja kwantów światła w wyniku zachodzących w komórce reakcji chemicznych (bioluminescencja) jest wzmacniana przez obecność dodatkowego związku w środowisku reakcji (luminol, lucygenina, lucyferaza). Komórki neutrofili, pobudzone (powierzchniowo lub fagocytujące) przez czynniki, takie jak np. napotkane we krwi patogeny lub aktywator lateksowy podawany w czasie eksperymentu, wytwarzają liczne rodniki tlenowe. Pomiar poziomu chemiluminescencji wywołanej obecnością reaktywnych form tlenu pozwala na określenie, w jakim stanie fizjologicznym znajdują się komórki. W niniejszej pracy zastosowano dwa modele eksperymentalne oddziaływania nanocząstek z neutrofilami: inkubację z komórkami wyizolowanymi bezpośrednio z krwi obwodowej oraz traktowanie neutrofili aktywowanych drobinami lateksu polistyrenowego. Oba modele dowiodły braku wpływu badanych nanokoloidów miedzi i srebra na potencjał fizjologiczny neutrofili człowieka, mierzony poziomem wydzielanych reaktywnych form tlenu. Nanocząstki prawdopodobnie nie były fagocytowane przez neutrofile i dlatego nie pobudzały komórek do wybuchu tlenowego, mając jednocześnie ograniczony potencjał aktywowania neutrofili powierzchniowo. Obserwowano ponad dwukrotny wzrost sygnału chemiluminescencji przy niższych stężeniach nanocząstek (0,4, 2,0 i 10 mg/l dla CuNPs, 0,4 i 2,0 mg/l dla AgNPs, Ryc. 3 i 4). Jakkolwiek wyniki te oznaczają podwyższoną produkcję rodników tlenowych, odnotowane zmiany nie mogą zostać uznane za przejaw wybuchu tlenowego. W tym ostatnim przypadku bowiem mobilizacja neutrofili skutkowałaby wzrostem intensywności luminescencji przynajmniej o rząd wielkości. W drugim modelu doświadczalnym, komórki aktywowano cząstkami lateksu polistyrenowego. Wiadomo, że drobiny polistyrenu pobudzają receptory powierzchniowe lub są fagocytowane, czemu towarzyszy podwyższony poziom chemiluminescencji (15). Należy przy tym uwzględnić fakt, że pomiary prowadzono na neutrofilach izolowanych, a sam proces izolacji komórek mógł osłabić ich zdolność do reagowania na działanie relatywnie słabszych czynników pobudzających. Niemniej jednak, wyraźny efekt aktywujący za pomocą drobin lateksu dowodzi utrzymania zdolności izolowanych neutrofili do aktywnej produkcji rodników tlenowych w procesie wybuchu tlenowego. W konsekwencji zastosowania nanokoloidów Cu i Ag, podanych we wszystkich wariantach stężeń, wartości sygnału chemiluminescencji nie wykazywały statystycznie znaczących zmian w stosunku do kontroli, tj. komórek stymulowanych wyłącznie lateksem. Otrzymany wynik świadczy o braku dodatkowego aktywującego działania nanostruktur na neutrofile i jest zgodny z obserwacjami wcześniejszymi (tzn. analizami w warunkach braku aktywowania lateksem). Z drugiej strony, rezultat ten oznacza brak nega-

Wpływ nanokoloidów Ag i Cu na aktywność neutrofili 31 tywnego (cytotoksycznego) wpływu na stymulowane lateksem komórki, nawet w stężeniach nanocząstek hamujących oddychanie mitochondrialne (patrz niżej). Widoczne jest wprawdzie duże zróżnicowanie danych pomiarowych uzyskanych w poszczególnych powtórzeniach, skutkujące stosunkowo dużymi odchyleniami standardowymi przy niektórych wartościach sygnału chemiluminescencji; jest to jednak uzasadnione zastosowanym podejściem badawczym, w którym komórki za każdym razem były pobierane od innego dawcy i w związku z tym mogły różnić się stanem czynnościowym, a w konsekwencji reagowaniem na pobudzanie. W testach aktywności respiracyjnej, nanokoloidy Cu i Ag firmy Nano-Tech Polska nie były toksyczne wobec neutrofili człowieka, aczkolwiek zastosowane wyższe stężenia obniżały intensywność procesów oddechowych. Całkowite zahamowanie aktywności dehydrogenazowej nastąpiło jedynie przy największych stężeniach użytych CuNPs i AgNps (50 mg/l, Ryc. 1 i 2). W przypadku AgNPs, znaczny efekt hamujący odnotowano również podczas traktowania roztworem 10 mg/l. Z kolei, testowane stężenia CuNPs w zakresie 0,4 10 mg/l nie były hamujące. Należy podkreślić, że zaobserwowane przypadki obniżenia tempa metabolizmu mitochondrialnego neutrofili nie implikują spadku przeżywalności komórek; nie muszą też oznaczać obniżenia ich zdolności do reagowania wybuchem tlenowym na czynniki stymulujące. Brak toksycznego działania nanokoloidów znalazł potwierdzenie w wynikach stabilnego poziomu wybuchu tlenowego podczas aktywowania lateksem, obserwowanego przy wszystkich stężeniach obu rodzajów nanocząstek. Podsumowując, uzyskane wyniki sugerują kontynuację prac badawczych nad możliwością wewnątrzustrojowego zastosowania nanomateriałów o charakterze hydrokoloidów nanocząstek metali. Można przypuszczać, że w warunkach in vivo, po zetknięciu się nanocząstek z granulocytami krwi, również nie wystąpiłby efekt stymulacji neutrofili do wybuchu tlenowego, co obniżyłoby ryzyko wystąpienia negatywnych reakcji w obrębie układu immunologicznego, wywołanych potencjalnym stosowaniem nanokoloidów. Mając jednak na uwadze zakres przeprowadzonych dotąd badań, ograniczony wyłącznie do analizy wpływu badanych nanostruktur na fizjologiczny stan neutrofili, podczas prób korzystania z tych preparatów należy zachować ostrożność, ponieważ mechanizmy oddziaływania nanocząstek na wewnętrzne organy organizmu człowieka, a także inne komórki i tkanki, nie zostały jeszcze wystarczająco dobrze poznane. Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego jest członkiem Konsorcjum, które uzyskało status Krajowego Naukowego Ośrodka Wiodącego (KNOW). Badania zostały częściowo sfinansowane z dotacji przyznanej przez MNiSW na działalność statutową Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie. PIŚMIENNICTWO 1. Asharani PV, Low KahMun G, Hande MP, Valiyaveettil S. Cytotoxicity and genotoxicity of silver nanoparticles in human cells. ACS Nano 2009; 3: 279-90. 2. Bankier C, Cheong Y, Mahalingam S i inni. A comparison of methods to assess the antimicrobial activity of nanoparticle combinations on bacterial cells. PLoS One 2018; 13: e0192093. 3. Chwalibog A, Sawosz E, Hotowy A i inni. Visualization of interaction between inorganic nanoparticles and bacteria or fungi. Int J Nanomedicine 2010; 5: 1085-94.

32 M. Kosecka-Strojek, P. Kaszycki, K. Regdos i inni 4. Dąbrowski Z. Fizjologia krwi. Wybrane zagadnienia. Część 2. Wyd. 1. Wydawnictwo Naukowe PWN Warszawa 2000. 5. Eom HJ, Choi J. p38 MAPK activation, DNA damage, cell cycle arrest and apoptosis as mechanisms of toxicity of silver nanoparticles in Jurkat T cells. Environ Sci Technol 2010; 44: 8337-42. 6. Heiligtag FJ, Niederberger M. The fascinating world of nanoparticle research. Mater Today 2013; 16: 262-71. 7. https://nano-tech.pl/(dostęp 22.12.2018) 8. Ivask A, Juganson K, Bondarenko O i inni. Mechanisms of toxic action of Ag, ZnO and CuO nanoparticles to selected ecotoxicological test organisms and mammalian cells in vitro: a comparative review. Nanotoxicology 2014; 1: 57-71. 9. Karlsson HL. The comet assay in nanotoxicology research. Anal Bioanal Chem 2010; 398: 651-66. 10. Kim KJ, Sung WS, Moon SK i inni. Antifungal effect of silver nanoparticles on dermatophytes. J Microbiol Biotechnol 2008; 18: 1482-4. 11. Łebkowska M, Załęska-Radziwiłł M. Występowanie i ekotoksyczność nanocząstek. Ochrona Środowiska 2011; 33: 23-6. 12. Markowska K, Grudniak AM, Krawczyk K i inni. Modulation of antibiotic resistance and induction of stress response in Pseudomonas aeruginosa by silver nanoparticles. J Med Microbiol 2014; 63: 849-54. 13. Medina C, Santos-Martinez MJ, Radomski A i inni. Nanoparticles: pharmacological and toxicological significance. Br J Pharmacol 2009; 150: 552-8. 14. Międzobrodzki J, Panz T, Płonka PM i inni. Platelets augment respiratory burst in neutrophils activated by selective species of gram-positive or gram-negative bacteria. Folia Histochem Cytobiol 2008; 46: 383-8. 15. Międzobrodzki J, Zemanek G, Baran J. Chemiluminescencja opis zjawiska, możliwości jego detekcji i wykorzystania. Mikrobiol Med 1999; 18: 41-5. 16. Mohan T, Verma P, Rao DNS. Novel adjuvants and delivery vehicles for vaccines development: a road ahead. Indian J Med Res 2013; 138: 779 95. 17. Nawrotek P, Augustyniak A. Nanotechnologia w mikrobiologii wybrane aspekty. Post Mikrobiol 2015; 54: 275-82. 18. Oberdorster G. Safety assessment for nanotechnology and nanomedicine: concepts of nanotoxicology. J Intern Med 2010; 267: 89-105. 19. Pike-Bieguński MJ. Nanotechnologia w medycynie i farmacji. Lek w Polsce 2005; 15: 30-7. 20. Prabhu S, Poulose EK. Silver nanoparticles: mechanism of antimicrobial action, synthesis, medical applications, and toxicity effects. Int Nano Lett 2012;2; doi. org/10.1186/2228-5326-2-32. 21. Pulit J, Banach M, Kowalski Z. Właściwości nanocząsteczek miedzi, platyny, srebra, złota i palladu. Czasopismo Techniczne. Chemia 2011; 108: 197-209. 22. Velavan P, Karuppusamy C, Venkatesan P. Nanoparticles as drug delivery systems. J Pharm Sci Res 2015; 7: 1118-22. 23. Wang L, Hu C, Shao L. The antimicrobial activity of nanoparticles: present situation and prospects for the future. Int J Nanomedicine 2017; 12: 1227-49. 24. Wanigasekara J, Witharana C. Applications of nanotechnology in drug delivery and design - an insight. Curr Trends Biotechnol Pharm 2016; 10: 78-91.

Wpływ nanokoloidów Ag i Cu na aktywność neutrofili 33 25. Yen HJ, Hsu SH, Tsai CL. Cytotoxicity and immunological response of gold and silver nanoparticles of different sizes. Small 2009; 5: 1553-61. Otrzymano: 11 I 2019 r. Adres Autora: 30-387 Kraków, ul. Gronostajowa 7, Zakład Mikrobiologii, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński w Krakowie. *Autor do korespondencji: jacek.miedzobrodzki@uj.edu.pl

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2019, 71: 35-41 https://doi.org/10.32394/mdm.71.04 Kliniczna i mikrobiologiczna analiza niechirurgicznego leczenia zapalenia przyzębia ze wspomagającym wykorzystaniem terapii fotodynamicznej badania wstępne Analysis of clinical and microbiological results of photodynamic therapy as support in non-surgical treatment of periodontitis preliminary study Adrian Maj 1, Aida Kusiak 1, Katarzyna Garbacz 2, Marta Ziółkowska-Klinkosz 2 1 Katedra i Zakład Periodontologii i Chorób Błony Śluzowej Jamy Ustnej GUMed 2 Zakład Mikrobiologii Jamy Ustnej GUMed Terapia fotodynamiczna stanowi wspomagającą metodę niechirurgicznego leczenia zapaleń przyzębia. Celem pracy była ocena wpływu zastosowania terapii fotodynamicznej na parametry kliniczne przyzębia ze szczególnym uwzględnieniem aspektu mikrobiologicznego w trakcie leczenia periodontologicznego. Przeprowadzone badania wykazały poprawę kliniczną stanu przyzębia u 6 na 7 pacjentów biorących udział w badaniu. Eliminację stanu zapalnego uzyskano u 85,7% badanych. Niechirurgiczne leczenie zapalenia przyzębia w połączeniu ze wspomagającym działaniem terapii fotodynamicznej przynosi obiecujące efekty terapeutyczne poprzez ograniczenie stanu zapalnego i spłycenie głębokości kieszonek przyzębnych. Słowa kluczowe: terapia fotodynamiczna, leczenie niechirurgiczne, zapalenie przyzębia. ABSTRACT Introduction. Photodynamic therapy is supportive method of non-surgical treatment of periodontitis. The aim of the study was the assessment of photodynamic therapy impact on periodontal disease clinical parameters with a particular emphasis on microbiological aspects during periodontal treatment. Material and methods. The research was conducted on seven healthy patients aged 26-55 years. All the patients were treated with a non-surgical (SRP) periodontal treatment. Then, the assisted photodynamic therapy was applied in selected pockets. Samples of the material obtained from periodontal pockets before and after the treatment were cultured in a microbiological laboratory. Results. After the introduced therapy the clinical improvement of periodontal disease was observed in the majority (6/7) of patients taking part in the study. There obtained the elimination of inflammation to 85.7% of the patients. Periodontal pocket depths have deteriorated from 0.5

36 A. Maj, A. Kusiak, K. Garbacz, M. Ziółkowska-Klinkosz to 3.0 mm in comparison to the pre-treatment values. The overall number of bacteria compared to the pre-treatment value was reduced. In addition, there was noticed a decrease in the number of periopathogens. Control samples showed a vivid dominance of the physiological flora. Conclusions. The non-surgical treatment of periodontitis in combination with the supportive action of photodynamic therapy has promising therapeutic effects by reducing the inflammation and decreasing the depth of periodontal pockets. The change in the ratio of periopathogens to physiological flora may indicate the restoration and maintenance of the state balance in periodontal pockets for patients with periodontitis. Keywords: photodynamic therapy, non-surgical treatment, periodontitis. WSTĘP Jedną z najczęstszych przyczyn utraty uzębienia są choroby przyzębia. Ich etiopatogeneza jest złożona. Głównym rolę odgrywa zachwianie równowagi pomiędzy drobnoustrojami płytki nazębnej a mechanizmami obronnymi gospodarza, które są modyfikowane przez czynniki ryzyka. Obecnie w niechirurgicznej terapii zapalenia przyzębia, poza mechaniczną i chemiczną eliminacją periopatogenów (bakterie kompleksu czerwonego Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola i Tanarella forsythia oraz zielonego Aggregatibacter actinomycetemcomitans), wciąż poszukuje się wspomagających metod leczenia tej jednostki chorobowej (20,23). Jedną z nich jest miejscowa terapia fotodynamiczna, stosowana od niedawna w odniesieniu do przyzębia, stanowiąca element wspomagający klasyczne leczenie. W metodzie tej wykorzystuje się zjawisko wzbudzania fotouczulacza (najczęściej błękit toluidyny) przez falę świetlną dostosowaną do jego widma absorpcyjnego, w wyniku czego dochodzi do powstawania reaktywnych form tlenu (tlenu singletowego wraz z rodnikami: ponadtlenkowymi; hydroksylowymi i wodoronadtlenkowymi), które niszczą błony komórkowe bakterii (16,4,8). Źródłami światła w terapii fotodynamicznej mogą być niskoenergetyczne lasery i lampy LED, które powodują mniejszą generację ciepła i lepszą penetrację światła (co ma szczególnie istotne znaczenie przy bakteriach takich jak Porphyromonas gingivalis i Aggregatibacter actinomycetemcomitans). Mającym częste zastosowanie fotosensibilizatorem o strukturze kationowej jest chlorek toluidyny (tzw. błękit toluidyny) należący do barwników tiazynowych. Maksimum absorpcji błękitu toluidynowego mieści się w zakresie długości fali światła widzialnego o barwie czerwonej wynoszącej 630 nm (6,17,14,21,22,9). Celem pracy była ocena wpływu zastosowania terapii fotodynamicznej na parametry kliniczne przyzębia ze szczególnym uwzględnieniem aspektu mikrobiologicznego w trakcie leczenia periodontologicznego. MATERIAŁ I METODY W badaniu klinicznym brało udział 7 ogólnie zdrowych, niepalących osób (3 mężczyzn, 4 kobiety) w wieku 26-55 lat (śr= 36,9; SD= 10,8) z dobrą higieną jamy ustnej z zapaleniem przyzębia z obecnością kieszonek przyzębnych PD 5 mm. Badane osoby w ciągu ostatnich

Niechirurgiczne leczenie zapalenia przyzębia 37 3 miesięcy nie przyjmowały antybiotyków i nie były poddawane zabiegowi usunięcia złogów nazębnych. Z badania zostali wyłączeni pacjenci z zaawansowanym zapaleniem przyzębia (duże ubytki poziome kości, bez obecności kieszonek przyzębnych). Wszystkich pacjentów przed i po leczeniu poddano badaniu periodontologicznemu i mikrobiologicznemu (pomiar stanu higieny wskaźnikiem API, stanu przyzębia wskaźnikami msbi i BOP, głębokości kieszonek przyzębnych PD oraz pobranie materiału z kieszonek za pomocą jałowych sączków). Następnie przeprowadzono standardowe leczenie niechirurgiczne (skaling i root planning- SRP) z użyciem narzędzi ultradźwiękowych EMS dental i ręcznych kiret Gracey Hu-Friedy. W ciągu tygodnia wybrane kieszonki przyzębne zostały poddane terapii fotodynamicznej za pomocą lampy FotoSan 630 CMS Dental z końcówką perio oraz fotouczulacza FotoSan agent CMS Dental o średniej gęstości. Zastosowana w badaniach procedura terapii fotodynamicznej: przed aplikacją preparatu o działaniu fotouczulającym, kieszonkę przyzębną dokładnie przepłukano 0,9% roztworem NaCl. Za pomocą strzykawki i igły z bocznym otworem zaaplikowano do jej wnętrza 0,2 ml fotouczulacza i pozostawiono na okres 3 minut. Następnie kieszonkę ponownie obficie przepłukano roztworem soli fizjologicznej celem wypłukania niezwiązanego preparatu. Przy pomocy lampy FotoSan 630 aktywowano fotouczulacz poprzez wprowadzenie do kieszonki jednorazowej końcówki perio oraz naświetlaniu przez 20 sekund na jedną powierzchnię korzenia. Po zakończonym zabiegu kieszonkę przepłukano roztworem soli fizjologicznej. Powyższą procedurę powtarzano 3 razy w ciągu 7 dni. Zastosowana w badaniach procedura oceny mikrobiologicznej: materiał do badań pobierano za pomocą jałowych sączków,każdy z nich umieszczano na 2 minuty w kieszonce przyzębnej, a następnie niezwłocznie w aseptyczny sposób przenoszono do bulionu tioglikolanowego. Materiał dostarczano do laboratorium w temperaturze pokojowej maksymalnie po 2 godzinach od pobrania. Wykonywano seryjne rozcieńczenia próbek w bulionie Schaedlera, które niezwłocznie posiewano na podłoża stałe wzbogacone i wybiórcze do hodowli bakterii beztlenowych: Schaedler agar z 5% krwią i witaminą K3, Schaedler CNA agar z 5% krwią, Schaedlerz kanamycyną i vancomycyną - agar z 5% krwią, Schaedler z neomycyną i vancomycyną - agar z 5% krwią. Płytki inkubowano przez 10 dni w temperaturze 37 C w anaerostatach wypełnionych mieszaniną gazów: 10% C02, 10% H2 i 80% N2 w obecności katalizatora palladowego i wskaźnika warunków beztlenowych. Wyhodowane szczepy bakterii beztlenowych identyfikowano przy użyciu spektrometrii masowej MALDI Biotyper firmy Bruker Daltonik GmbH. Niewielką ilość wyhodowanego materiału nanoszono na metalową płytkę, którą pozostawiano do wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Następnie, na płytkę, nakładano 70% kwas mrówkowy, a po wyschnięciu 1 μl roztworu matrycy i ponownie pozostawiano do wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Płytkę umieszczano w komorze pomiarowej aparatu MALDI Biotyper. Usuwano powietrze w celu uzyskania próżni i poddawano działaniu promienia laserowego. Następowała desorpcja i jonizacja białek bakteryjnych. Zjonizowane peptydy przyspieszano w silnym polu elektrycznym i mierzono czas ich przelotu (time of flight). System MALDI-TOF MS automatycznie generował spektrometryczne widma pików odpowiadających jonom o różnym stosunku masy do ładunku na podstawie rozkładu peptydów według masy cząsteczkowej, ładunku, oraz zróżnicowanego czasu przelotu. Ponadto analizował ilość, intensywność i korelację plików. Badane widmo było porównywane z widmami referencyjnymi drobnoustrojów. Badania zostały zatwierdzone przez Niezależną Komisję Bioetyczną ds. Badań Naukowych Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego (NKBBN/508/2016). Wszelkie etyczne aspekty projektu były zgodne z Deklaracją Helsińską.

38 A. Maj, A. Kusiak, K. Garbacz, M. Ziółkowska-Klinkosz WYNIKI Po zastosowanej terapii zaobserwowano poprawę kliniczną stanu przyzębia u zdecydowanej większości (6/7) pacjentów biorących udział w badaniu. Eliminację stanu zapalnego wyrażoną poprzez zmniejszenie wskaźnika krwawienia po zgłębnikowaniu (BOP) uzyskano u 85,7% badanych. U tych osób znaczącej poprawie uległa również głębokość sondowania (PD). Uzyskano spłycenie głębokości kieszonek przyzębnych od 0,5 do 3,0 mm (śr=1,36 mm; SD= 1,14) w stosunku do wartości przed leczeniem (Tabela I). Tabela I. Ocena parametrów klinicznych stanu przyzębia. Nr PACJENTA PŁEĆ WIEK ZĄB PRZED LECZENIEM PO LECZENIU PD BOP PD BOP 1 M 26 16 5,0 + 4,5-2 M 55 16 13,0 + 10,0-3 K 28 46 5,0 + 4,5-4 K 34 46 5,0 + 3,5-5 K 47 17 5,5-3,5-6 M 39 26 7,0 + 7,0 + 7 K 29 26 6,0 + 5,0 - Poprawę stanu klinicznego przyzębia potwierdziły wyniki badania mikrobiologicznego. Ogólna liczba wszystkich bakterii w stosunku do wartości przed leczeniem uległa zmniejszeniu o 1-2 rzędy wielkości ( do wartości 10 6-10 7 /ml). Ponadto, w próbkach pobranych po leczeniu odnotowano zmniejszenie liczby periopatogenów oraz dominację paciorkowców zieleniejących należących do flory fizjologicznej (Tabela II). Tabela II. Ocena stanu mikrobiomu kieszonek przyzębnych. Nr PACJENTA PRZED LECZENIEM PO LECZENIU LICZBA BAKTERII/ML LICZBA BAKTERII/ML BAKTERIE DOMINUJĄCE 1 1,2*10 7 3,8*10 6 S. oralis S. sanguis 2 8,8*10 8 3,1*10 7 S. mitis S. anginosus S. intermedius S. constellatus 3 1,5*10 7 1,0*10 6 S. cristatus S. oralis 4 3,4*10 8 5,0*10 6 S. gordonii S. intermedius 5 1,8*10 7 4,6*10 6 S. constellatus S. oralis 6 4,6*10 7 1,2*10 6 S. mitis S. oralis S. intermedius 7 2,2*10 8 7,5*10 6 S. gordoni S. oralis S. mitis

Niechirurgiczne leczenie zapalenia przyzębia 39 DYSKUSJA Liczba doniesień naukowych dotyczących terapii fotodynamicznej w skojarzonej terapii zapaleń przyzębia jest stosunkowo mała. Przedstawiają one często odmienną metodykę badań i uzyskane rezultaty. Poprawę stanu klinicznego przyzębia poprzez zmniejszenie głębokości kieszonek przyzębnych oraz uzysk poziomu przyczepu łącznotkankowego po zastosowanej terapii będącą potwierdzeniem wyników badań własnych otrzymali w swoich pracach Goh i wsp oraz Moreira i wsp. (7, 13). Wyższą skuteczność leczenia niechirurgicznego z zastosowaniem terapii fotodynamicznej wyrażoną poprzez ograniczenie stanu zapalnego i spłycenie głębokości kieszonek przyzębnych uzyskali również Andersen i wsp., Betsy i wsp, Braun i wsp oraz Krajewski i wsp (1, 2, 3, 10). Christodoulides i wsp. (5) oraz Polansky i wsp. (15) uzyskali ograniczenie stanu zapalnego wyrażone wskaźnikami FMBS i BOP na korzyść zastosowanej wspomagającej terapii fotodynamicznej bez różnic w pozostałych parametrach klinicznych (5,15). Ponadto poprawę warunków mikrobiologicznych wyrażoną m.in. zmniejszeniem liczby bakterii należących do kompleksu czerwonego zanotowali Sgolastra i wsp. (18) oraz Mongardini i wsp. (12) zaś spadek poziomu Fusobacterium nucleatum odnotowali Sigusch i wsp. (19). W badanym materiale własnym pobranym z kieszonek przyzębnych przed leczeniem nie można jednoznacznie wskazać gatunku dominującego. Zanotowano tu występowanie zarówno gatunków oportunistycznych, patogennych (beztlenowe pałeczki gram-ujemne), jak i takich, które należą do fizjologicznej flory szczeliny dziąsłowej. W materiale własnym pobranym po leczeniu pomimo obecności gatunków bakterii uznanych za patogenne stwierdzono wyraźną dominację paciorkowców zieleniejących. Potwierdzają to badania Marsha i wsp. (11) gdzie paciorkowce stanowią 29% mikroflory zasiedlającej szczelinę dziąsłową. Często notowano również obecność pałeczek Gram-dodatnich z rodzajów Lactobacillus i Bifidobacterium. Taki wynik badania świadczy prawdopodobnie o powrocie mikrobiomu kieszonki przyzębnej do stanu równowagi. Biorąc pod uwagę analizę własnego materiału mikrobiologicznego wyhodowanego przed zastosowaniem leczenia i po jego zakończeniu należy stwierdzić, że ocena zmian spektrum mikrobiologicznego kieszonki przyzębnej nie powinna opierać się jedynie na stwierdzeniu obecności lub braku gatunków patogennych, ale na ich wzajemnych proporcjach w badanym materiale klinicznym. WNIOSKI 1. Niechirurgiczne leczenie zapalenia przyzębia w połączeniu ze wspomagającym działaniem terapii fotodynamicznej przynosi obiecujące efekty terapeutyczne poprzez ograniczenie stanu zapalnego i spłycenie głębokości kieszonek przyzębnych. 2. Zmiana stosunku periopatogenów do flory fizjologicznej może świadczyć o przywróceniu stanu równowagi mikrobiomu kieszonek przyzębnych u osób z zapaleniem przyzębia. PIŚMIENNICTWO 1. Andersen R, Loebel N, Hammond D, Wilson M. Treatment of Periodontal Disease by Photodisinfection Compared to Scaling and Root Planing. J Clin Dent 2007; 18, 2: 1-5.

40 A. Maj, A. Kusiak, K. Garbacz, M. Ziółkowska-Klinkosz 2. Betsy J, Prasanth CS, Baiju KV i inni. Efficacy of antimicrobial photodynamic therapy in the management of chronic periodontitis: a randomized controlled clinical trial. J Clin Periodontol 2014; 41: 573-81. 3. Braun A, Dehn C, Krause F, Jepsen S. Short-term clinical effects of adjunctive antimicrobial photodynamic therapy in periodontal treatment: a randomized clinical trial. J Clin Periodontol 2008; 35: 877 84. 4. Choromańska A, Kulbacka J, Saczko J. Terapia fotodynamiczna założenia, mechanizm, aplikacje kliniczne. Nowa Medycyna 2013; 1: 26-30. 5. Christodoulides N, Nikolidakis D, Chondros P i inni. Photodynamic therapy as an adjunct to non-surgical periodontal treatment: a randomized, controlled clinical trial. J Periodontol 2008; 79: 1638-44. 6. Dembowska E, Samulak-Zielińska R. Lasery w stomatologii. Laserowa fototerapia w stomatologii. Czelej, Lublin 2015; s. 343-63. 7. Goh EX, Tan KS, Chan YH, Lim LP. Effects of root debridement and adjunctive photodynamic therapy in residual pockets of patients on supportive periodontal therapy: A randomized split-mouth trial. Photodiagnosis Photodyn Ther 2017; 18: 342-8. 8. Gośliński T, Konopka K, Piskorz J i inni. Perspektywy zastosowania fotodynamicznej terapii skierowanej przeciw mikroorganizmom PACT. Post. Mikrobiol 2008; 47: 447-56. 9. Kikuchi T, Mogi M, Okabe I i inni. Adjunctive Application of Antimicrobial Photodynamic Therapy in Nonsurgical Periodontal Treatment: A Review of Literature. Int J Mol Sci 2015; 16: 24111-26. 10. Krajewski J, Siemiątkowski M. Ocena wpływu stosowania terapii fotodynamicznej za pomocą urządzenia FotoSan na parametry kliniczne stanu tkanek przyzębia. Twój Przegląd Stomatologiczny 2010; 9: 59-62. 11. Marsh P.D, Martin M.V. Mikrobiologia Jamy Ustnej. Stała mikroflora zasiedlająca jamę ustną. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1994; s. 40-65. 12. Mongardini C, Di Tanna GL, Pilloni A. Light-activated disinfection using a light-emitting diode lamp in the red spectrum: clinical and microbiological short-term findings on periodontitis patients in maintenance. A randomized controlled split-mouth clinical trial. Lasers Med Sci 2014; 29: 1 8. 13. Moreira AL, Novaes AB Jr, Grisi MF i inni. Antimicrobial photodynamic therapy as an adjunct to non-surgical treatment of aggressive periodontitis: a split-mouth randomized controlled trial. J Periodontol 2015; 86: 376-86. 14. Oruba Z, Chomyszyn-Gajewska M. Zastosowanie terapii fotodynamicznej w stomatologii - przegląd piśmiennictwa. Przegląd Lekarski 2016, 73, 11: 57-861. 15. Polansky R, Haas M, Heschl A, Wimmer G. Clinical effectiveness of photodynamic therapy in the treatment of periodontitis. J Clin Periodontol 2009; 36: 575-80. 16. Rutkowski R, Pancewicz S, Rutkowski K, Rutkowska J. Znaczenie reaktywnych form tlenu i azotu w patomechanizmie procesu zapalnego. Pol Merk Lek 2007; 23: 131-4. 17. Samulak Zielińska R, Dembowska E. Zastosowanie terapii fotodynamicznej w leczeniu zapaleń przyzębia przegląd piśmiennictwa. Dent Med Probl 2010; 47, 2: 221 9. 18. Sgolastra F, Petrucci A, Gatto R i inni. Photodynamic therapy in the treatment of chronic periodontitis: a systematic review and meta-analysis. Lasers Med Sci 2013; 28: 669-82.

Niechirurgiczne leczenie zapalenia przyzębia 41 19. Sigusch BW, Engelbrecht M, Volpel A i inni. Full-mouth antimicrobial photodynamic therapy in Fusobacterium nucleatum-infected periodontitis patients. J Periodontol 2010; 81: 975-81. 20. Socransky SS, Haffajee AD, Cugini MA i inni. Microbial complexes in subgingival plaque. J Clin Periodontol 1998; 25: 134-44. 21. Szulc M, Ziętek M. Zastosowanie terapii fotodynamicznej w chorobach przyzębia na podstawie piśmiennictwa. Czas Stomatol 2007; LX, 8: 527-35. 22. Takasaki AA, Aoki A, Mizutani K i inni. Application of antimicrobial photodynamic therapy in periodontal and peri - implant diseases. Periodontology 2000 2009; 51: 109 40. 23. Ximenez-Fyvie LA, Haffajee AD, Socransky SS. Comparison of the microbiota of supra- and subgingival plaque in health and periodontitis. J Clin Periodontol 2000; 27: 648 57. Otrzymano: 20 XII 2018 r. Adres Autora: 80-204 Gdańsk, ul. Orzeszkowej 18, Katedra i Zakład Periodontologii i Chorób Błony Śluzowej Jamy Ustnej Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego. e-mail: akusiak@gumed.edu.pl; tel.+48 (58) 349-16-67

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2019, 71: 43-50 https://doi.org/10.32394/mdm.71.05 Awidność przeciwciał klasy IgG dla antygenów Francisella tularensis w przebiegu tularemii u ludzi Avidity of IgG class antibodies to Francisella tularensis in the course of tularemia in humans Waldemar Rastawicki, Karolina Śmietańska, Natalia Rokosz-Chudziak, Urszula Roguska Zakład Bakteriologii i Zwalczania Skażeń Biologicznych, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Państwowy Zakład Higieny w Warszawie W pracy przeanalizowano awidność przeciwciał klasy IgG dla antygenów Francisella tularensis w 52 próbkach surowicy uzyskanych od 40 osób z tularemią. Wykazano, że indeks awidności przeciwciał dla F. tularensis o osób dorosłych był niższy niż u dzieci i młodzieży. Badanie próbek surowicy uzyskanych 2-3 krotnie w przebiegu tularemii nie wykazało istotnych różnic w poziomie indeksu awidności w zależności od okresu choroby. Jednakże, w próbkach surowicy uzyskanych pięciokrotnie od 9-letniej dziewczynki z węzłowo-oczną postacią tularemii, stwierdzono narastające wartości indeksu awidności, w zakresie od 0,51 do 0,94. Słowa kluczowe: Francisella tularensis, tularemia, przeciwciała klasy IgG, awidność ABSTRACT Introduction: Tularemia is a highly infectious zoonotic disease caused by Gram-negative bacterium Francisella tularensis. The microbiological diagnosis of tularemia is based mainly on serological investigations. The present study was undertaken to determine the avidity of IgG class antibodies to Francisella tularensis in the course of tularemia in humans and to evaluate its value for estimation of the phase of diseases. Methods: Fifty two serum samples obtained from 40 patients with tularemia were tested by in-house ELISA in duplicate in the same plate, without and after the 0.5 h incubation with 8M urea. The age of the subjects was between 6 and 77 years. From one patient, a 9-years-old girl with oculoglandular form of tularemia, five serum samples were taken, respectively after 0.5, 1.5, 3, 6 and 12 months from the beginning of the first clinical symptoms. Results: The results of the study showed higher values of the avidity index (AI) of IgG antibodies for F. tularensis, often exceeding the value of 0.9, in children and adolescents than in adults. The examination of serum samples obtained 2-3 times in the course of

44 W. Rastawicki, K. Śmietańska, N. Rokosz-Chudziak, U. Roguska tularemia from few patients did not show significant differences in the level of avidity index depending on the period of the disease. However, in five serum samples obtained from a 9-years-old girl in the different phases of tularemia the avidity index showed increasing values (0.51, 0.80, 0.92, 0.90 and 0.94, respectively). Conclusions: The avidity index of IgG may be helpful in excluding recent infection, but its usefulness in detecting an active phase of invasion requires further research. Key words: Francisella tularensis, tularemia, antibodies of class IgG, avidity WSTĘP Tularemia jest wysoce zakaźną chorobą odzwierzęcą wywoływaną przez pałeczki Francisella tularensis. W zależności od zjadliwości szczepu oraz drogi wniknięcia patogenu do organizmu ludzkiego, rozpoznaje się następujące postacie kliniczne tularemii: wrzodziejąco-węzłową, węzłową, oczno-węzłową, anginową, trzewną, duropodobną oraz płucną. Zakażenie może przebiegać w postaci ostrej, z wysoką gorączką, dreszczami, bólami mięśni oraz ogólnym osłabieniem lub w postaci łagodnej. Laboratoryjna diagnostyka tularemii opiera się na potwierdzeniu obecności drobnoustrojów bądź ich DNA w próbkach materiału klinicznego czy też na wykryciu na diagnostycznie znamiennym poziomie swoistych przeciwciał w próbkach surowicy (4, 5). Ze względu na fakt, że tularemia nie występuje powszechnie w populacji, a w czasie jej przebiegu stymulowany jest intensywnie układ odpornościowy do produkcji przeciwciał, badania serologiczne charakteryzują się bardzo wysoką czułością i swoistością. Przeciwciała dla antygenów F. tularensis pojawiają się we krwi zazwyczaj już po 10-14 dniach od początku objawów klinicznych, osiągając najwyższy poziom w 4-7 tygodniu choroby (10). Z obserwacji własnych wynika, że przeciwciała we wszystkich trzech klasach immunoglobulin dla antygenów F. tularensis utrzymują się długo na bardzo wysokim poziomie, uniemożliwiając prześledzenie dynamiki przeciwciał w kolejnych, kontrolnych próbkach surowicy uzyskanych po ustąpieniu objawów klinicznych. W rutynowo prowadzonej diagnostyce tularemii właściwość ta może powodować problemy z prawidłową interpretacją wyników badań serologicznych. Nie wiadomo bowiem, czy wykryty diagnostycznie znamienny poziom przeciwciał związany jest z aktualnym zakażeniem pałeczkami F. tularensis czy też świadczy jedynie o przechorowaniu tularemii w przeszłości. Rozróżnienie aktualnego zakażenia od przebytego jest istotnym problemem w serodiagnostyce wielu chorób zakaźnych. Pomocnym narzędziem ułatwiającym to zadanie, oprócz określania indeksu IgM/IgG jest oznaczanie awidności przeciwciał klasy IgG, stosowane powszechnie w serologicznej diagnostyce toksoplazmozy. Termin awidność oznacza wypadkową sił oddziałujących pomiędzy całymi cząsteczkami przeciwciał i antygenem. We wczesnej fazie zakażenia produkowane swoiste przeciwciała charakteryzują się słabą siłą wiązania antygenów a powstające kompleksy antygen przeciwciało są utrzymywane głównie dzięki wiązaniom wodorowym, które łatwo ulegają rozerwaniu pod wpływem mocznika. Produkowane w późniejszej fazie choroby przeciwciała klasy IgG cechują się coraz większą siłą wiązania z antygenem (tzw. wysoką awidnością). Powstałe kompleksy stają się stabilne

Awidność przeciwciał klasy IgG dla Francisella tularensis 45 w obecności mocznika dzięki siłom elektrostatycznym, oddziaływaniom hydrofobowym, siłom Van der Waalsa i wiązaniom wodorowym. Przykładowo, w przypadku toksoplazmozy czas potrzebny na przejście z niskiej do wysokiej awidności wynosi około 12 16 tygodni, zatem przeciwciała o wysokiej awidności występują w fazie przewlekłej zarażenia (3, 7, 15). Celem prezentowanej pracy była ocena poziomu awidności przeciwciał klasy IgG dla antygenów Francisella tularensis w przebiegu tularemii u ludzi. Próbki surowicy. Przedmiotem badań były 52 próbki surowicy uzyskane od 40 osób z tularemią. Dwadzieścia dwie próbki uzyskano w różnych okresach choroby od 8 osób (od czterech osób uzyskano po dwie próbki surowicy, od dwóch osób po trzy próbki i od jednej osoby pięć próbek surowicy). Najbardziej interesujący był materiał zebrany od 9-letniej dziewczynki z oczno-węzłową postacią tularemii. Próbki surowicy uzyskano od tej pacjentki pięciokrotnie, odpowiednio: 2 tygodnie (próbka nr 1), 6 tygodni (próbka nr 2), 3 miesiące (próbka nr 3), 6 miesięcy (próbka nr 4) oraz 12 miesięcy (próbka nr 5) od początku objawów klinicznych. Pozostałe próbki surowicy uzyskano jednokrotnie od osób z różnymi postaciami tularemii. Niestety, w przypadku tych osób nie dysponowano dokładną datą wystąpienia pierwszych objawów klinicznych, należy przypuszczać jednak, że były to próbki uzyskane w ostrej fazie choroby. Wiek badanych osób wynosił od 6 do 77 lat. We wszystkich próbkach surowicy, we wcześniej prowadzonych rutynowych badaniach serologicznych prowadzonych przy rozcieńczeniu badanej próbki 1/100, wykryto bardzo wysoki, diagnostycznie znamienny poziom przeciwciał klasy IgA, IgG i IgM dla antygenów F. tularensis Zestaw ELISA opracowany we własnym zakresie (ELISA NIZP-PZH). Odczyn wykonywano na polistyrenowych płytkach Maxi Sorp firmy Nunc, wg metody opisanej uprzednio, poszukując przeciwciał wyłącznie klasy IgG (12). Jako antygenu użyto inaktywowanej zawiesiny pałeczek F. tularensis rozbitych ultradźwiękami. W odróżnieniu jednak od rutynowo wykonywanego odczynu ELISA, w którym badano próbki surowicy wyłącznie w rozcieńczeniu 1/100, ze względu na bardzo wysoki poziom przeciwciał, wykonywano kolejne, dwukrotne rozcieńczenia próbek surowicy (od rozcieńczenia 1/100 do 1/1600). Pozwoliło to na wybranie najbardziej odpowiedniego rozcieńczenia do badania awidności przeciwciał klasy IgG. W celu określenia awidności przeciwciał badaniom poddawano równolegle na jednej płytce surowice inkubowane bez użycia roztworu mocznika (PBST) oraz te same próbki surowicy inkubowane z użyciem 8 M roztworu mocznika. Ten dodatkowy etap, w porównaniu do rutynowo wykonywanego odczynu ELISA, przeprowadzono przed dodaniem roztworu koniugatów (30 minut inkubacji w temperaturze 37 o C plus czterokrotne płukanie PBST). Określanie indeksu awidności przeciwciał klasy IgG. Indeks awidności próbki (AI) wyznaczano jako stosunek wartości gęstości optycznej (OD 450 ) uzyskanej w reakcji z użyciem roztworu dysocjującego (mocznik) do wartości uzyskanej dla roztworu kontrolnego (bez mocznika). Indeks awidności AI interpretowano arbitralnie zgodnie z podaną niżej tabelą: Indeks awidności AI Interpretacja AI < 0,40 Niska awidność 0,40 AI < 0,60 Średnia awidność AI > 0,60 Wysoka awidność

46 W. Rastawicki, K. Śmietańska, N. Rokosz-Chudziak, U. Roguska WYNIKI Przeprowadzone wstępne miareczkowanie odczynu ELISA wykazało, że do badania poziomu awidności przeciwciał klasy IgG dla F. tularenisis najlepsze będzie rozcieńczenie próbki surowicy 1/400. W tabeli I przedstawiono wyniki oznaczania awidności przeciwciał klasy IgG w próbkach surowicy uzyskanych od osób z tularemią w zależności od wieku. W tabeli uwzględniono jedynie próbki surowicy uzyskane po raz pierwszy od danego pacjenta (w ostrej fazie choroby). U dzieci i młodzieży zdecydowanie dominowały wysokie wartości indeksu awidności, często przekraczające wartość 0,9. U osób dorosłych, po 20-tym roku życia, widoczny jest spadek średniej wartości indeksu AI (0,58), który utrzymuje się na podobnym poziomie u osób dorosłych z pozostałych grup wiekowych. Tabela I. Awidność przeciwciał klasy IgG w próbkach surowicy uzyskanych od osób z tularemią w zależności od wieku. W tabeli uwzględniono jedynie próbki surowicy uzyskane po raz pierwszy od danego pacjenta (w ostrej fazie choroby). Oznacze -nie wykonano przy rozcieńczeniu próbki 1/400. Grupa wieku badanych osób z tularemią (lata) Liczba próbek surowicy Średnia wieku (lata) Liczba próbek z indeksem awidności: Niskim (<0,40) Średnim (0,4-0,6) Wysokim (>0,6) Średnia wartość współczynnika awidności (AI) <10 5 5,8 0 0 5 0,79 10-20 8 12,0 1 0 7 0,77 20-40 10 34,4 4 1 5 0,58 40-60 8 51,1 3 2 3 0,52 >60 10 65,9 2 5 3 0,53 Łącznie 41 37,1 10 8 23 0,62 W tabeli II zaprezentowano dokładne wartości poziomu przeciwciał przed i po zastosowaniu mocznika wraz z uzyskanymi wartościami współczynnika awidności w próbkach surowicy uzyskanych 2-3 krotnie w różnych odstępach czasowych w przebiegu choroby od sześciu osób z tularemią. Przeprowadzone badania nie wykazały istotnych różnic w wartości indeksu awidności w zależności od czasu uzyskania próbki surowicy w przebiegu choroby. Mamy tu do czynienia zarówno z bardzo niewielkim spadkiem jak i wzrostem tej wartości w kontrolnych próbkach surowicy. Kinetykę awidności przeciwciał w przebiegu tularemii najlepiej można zaobserwować na przykładzie próbek surowicy uzyskanych w różnych okresach od początku objawów klinicznych od 9-letniej dziewczynki z węzłowo-oczną postacią tularemii. I tak, w pierwszej próbce uzyskanej na samym początku choroby (około dwa tygodnie od początku objawów klinicznych) awidność przeciwciał klasy IgG dla antygenów F. tularensis wynosiła 0,51. W próbce drugiej, uzyskanej po kolejnych czterech tygodniach, awidność była już zdecydowanie wyższa i wynosiła 0,80. W kolejnej, trzeciej próbce surowicy, uzyskanej po 3 miesiącach od początku objawów klinicznych, wartość współczynnika awidności wynosi już 0,92. Wartość ta utrzymuje się na prawie nie zmienionym poziomie w próbce czwartej i piątej (Tabela III).

Awidność przeciwciał klasy IgG dla Francisella tularensis 47 Tabela II. Awidność przeciwciał klasy IgG w próbkach surowicy uzyskanych 2-3 krotnie w różnych odstępach czasowych w przebiegu choroby od osób z tularemią. Oznaczenie wykonano przy rozcieńczeniu próbki 1/400. Pacjent (wiek, płeć) (66 lat, M) Nr 2 (73 lata, M) Nr 3 (77 lat, K) Nr 4 (34 lata, M) Nr 5 (5 lat, K) Nr 6 (7 lat, M) Odstęp czasu OD 450 próbki bez inkubacji z mocznikiem OD 450 próbki po inkubacji z mocznikiem Współczynnik awidności (AI) - 1,453 0,727 0,50 62 dni 1,394 0,585 0,42-1,374 0,689 0,50 38 dni 1,256 0,559 0,45-1,255 0,198 0,16 40 dni 1,295 0,219 0,17-1,501 0,507 0,34 23 dni 1,548 0,688 0,44-1,384 0,918 0,66 36 dni 1,447 0,828 0,57 70 dni 1,439 0,842 0,58-1,643 1,496 0,91 36 dni 1,603 1,418 0,88 70 dni 1,477 1,164 0,79 Tabela III. Awidność przeciwciał klasy IgG w próbkach surowicy uzyskanych od 10-letniej dziewczynki z węzłowo-oczną postacią tularemii w różnych okresach od początku objawów klinicznych. Oznaczenie wykonano przy rozcieńczeniu próbki 1/400. Kolejny numer próbki Okres choroby OD 450 próbki bez inkubacji z mocznikiem OD 450 próbki po inkubacji z mocznikiem Współczynnik awidności (AI) 1 2 tyg. 1,162 0,596 0,51 2 6 tyg. 1,504 1,203 0,80 3 3 mc 1,608 1,487 0,92 4 6 mc 1,585 1,426 0,90 5 12 mc 1,619 1,524 0,94 DYSKUSJA Podczas odpowiedzi immunologicznej organizm produkuje przeciwciała przeciwko różnym epitopom znajdującym się na obcych cząsteczkach, białkach i czynnikach zakaźnych. Przeciwciała te wiążą się z antygenem z różną siłą określaną jako powinowactwo. Antygen z reguły posiada kilka determinant, które są rozpoznawane przez przeciwciała. Siła wiązania pomiędzy przeciwciałem a kompleksem determinant antygenowych, stanowi tym samym odzwierciedlenie całościowej interakcji antygenu z przeciwciałem i określana jest jako awidność (12). We wczesnej fazie infekcji swoiste przeciwciała charakteryzują się zazwyczaj słabą siłą wiązania antygenów. Powstające kompleksy antygen przeciwciało są utrzymywane głównie

48 W. Rastawicki, K. Śmietańska, N. Rokosz-Chudziak, U. Roguska dzięki wiązaniom wodorowym, które łatwo ulegają rozerwaniu pod wpływem mocznika występującego w buforze stosowanym w teście do odpłukiwania nadmiaru reagentów. Trwająca infekcja stymuluje układ immunologiczny gospodarza a wytwarzane w dużych ilościach przeciwciała IgG cechują się coraz większą siłą wiązania z antygenem (tzw. wysoką awidnością). Powstałe kompleksy stają się stabilne w obecności mocznika dzięki siłom elektrostatycznym, oddziaływaniom hydrofobowym, siłom Van der Waalsa i wiązaniom wodorowym (8). Badanie awidności przeciwciał klasy IgG stosowane jest powszechnie w serodiagnostyce toksoplazmozy (4, 8, 17). Awidność przeciwciał IgG przeciwko T. gondii zwiększa się wraz z czasem trwania zarażenia. U osób z pierwotną inwazją jest niższa od 15% i na tym poziomie utrzymuje się przez 5 7 miesięcy po pojawieniu się pierwszych objawów. Jeśli wynosi powyżej 30%, wskazuje na dłużej trwające zarażenie. U osób, u których stwierdzamy obecność przeciwciał przeciwko T. gondii w klasie IgM, wysoka awidność przeciwciał klasy IgG wskazuje na dłuższy czas trwania zarażenia i pozwala na wykluczenie świeżego zachorowania (1). Wysoka awidność IgG oraz brak wczesnych markerów aktywnego zarażenia (przeciwciałaklasy M i/lub A) przemawiają za przewleką toksoplazmozą, a więc pozwalają na zrezygnowanie z badania kolejnych prób surowicy. Niska awidność dużych stężeń IgG oraz równoczesna obecność przeciwciał klasy M i A pozwalają podejrzewać aktywną toksoplazmozę. Natomiast przypadki średnich stężeń IgG o niskiej awidności, wątpliwa obecność IgM i obecność lub brak IgA wymagają badania serologicznego dalszych próbek surowicy i obserwacji dynamiki przeciwciał. Powodem tego jest fakt, że przeciwciała w niektórych przypadkach mogą dojrzewać długo, dlatego niska awidność nie zawsze świadczy o wczesnej fazie choroby, a jedynie o jej podejrzeniu, natomiast wysoka awidność jest potwierdzeniem przewlekłej toksoplazmozy (8). W dostępnym piśmiennictwie istnieją liczne doniesienia, o bardziej lub mniej udanych próbach zastosowania indeksu awidności przeciwciał klasy IgG do rozróżnienia ostrej fazy choroby od fazy przewlekłej również w przebiegu takich chorób jak: leszmianioza trzewna, strongyloidoza, toksokaroza, salmoneloza bydła, gruźlica, zakażenie wirusami opryszczki, HCV, Epstein-Barr, HIV, różyczki, West Nile i CMV (3, 9, 10, 15, 16, 18, 19, 20). Trzeba mieć jednak na uwadze fakt, że w przypadku serodiagnostyki toksoplazmozy opisano kilka metod oceny awidności przeciwciał (2, 13). Tak więc, istotny jest prawidłowy sposób wyliczenia wartości cut-off oraz indeksu awidności. W badaniach własnych wykazano, że indeks awidności przeciwciał dla F. tularensis o osób dorosłych był niższy niż u dzieci. Badanie próbek surowicy uzyskanych od kilku osób 2-3 krotnie w przebiegu tularemii nie wykazało z kolei istotnych różnic w poziomie indeksu awidności. Na podstawie jego wartości, przynajmniej w przypadku tych kilku osób, nie można było rozróżnić czy próbka została pobrana w ostrej fazie choroby czy też była to próbka kontrolna, uzyskana po kolejnych 1-2 miesiącach. Być może, indeks awidności w próbkach surowicy uzyskanych od tych osób po kolejnych kilku miesiącach od początku objawów klinicznych uległ by istotnej zmianie lecz niestety nie dysponowano takim materiałem klinicznym. Nieco odmienny obraz indeksu awidności uzyskano w przypadku bardzo dobrze udokumentowanej historii choroby 9-letniej dziewczynki z węzłowo-oczną tularemią. W przypadku tej pacjentki, już w drugiej próbce surowicy uzyskanej po sześciu tygodniach od początku objawów klinicznych uzyskano wyraźny wzrost indeksu awidności. Co więcej w kolejnych próbkach indeks ten był jeszcze wyższy. Tak więc, w tym przypadku można było rozróżnić, na podstawie wartości indeksu AI, próbkę surowicy uzyskaną w ostrej fazie choroby (AI = 0,51) od próbek kontrolnych (AI 0,8).

Awidność przeciwciał klasy IgG dla Francisella tularensis 49 Podsumowując wyniki przeprowadzonych badań należy stwierdzić, że u większości osób z tularemią stwierdza się wysokie wartości współczynnika awidności (>0,60). Problematyczne wydaje się natomiast bezpośrednie wykorzystanie wartości AI do rozróżnienia aktualnej choroby od fazy przewlekłej. Należy przeprowadzić dalsze badania na dobrze zdefiniowanych próbkach surowicy uzyskanych w różnych okresach choroby. PIŚMIENNICTWO 1. Adamek B, Olszok I, Bluszcz-Rożnowska A i inni. Awidność przeciwciał przeciwko Toxoplasma gondii parametr przydatny w diagnostyce różnicowej. Probl Med Rodz 2009; 1: 46 50. 2. Bitkowska I, Waloch M, Dzbeński T.H. Oznaczanie awidności swoistych przeciwciał klasy G w serologicznej diagnostyce toksoplazmozy. Med Doś Mikrobiol 200, 52, 295-300. 3. Bosqui LR, Gonzaga HT, Gonçalves-Pires MDRF. Avidity as a criterion for diagnosis of human strongyloidiasis increases specificity of IgG ELISA. Diagn Microbiol Infect Dis 2017; 89: 262-4. 4. Cozon GJ, Ferrandiz J, Nebhi H i inni. Estimation of the avidity of immunoglobulin G for routine diagnosis of chronic Toxoplasma gondii infection in pregnant women. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1998; 17: 32 6. 5. Ellis J, Oyston PCF, Green M, Titball RW. Tularemia. Clin Microbiol Rev 2002; 15: 631-46. 6. Foley JE, Nieto NC. Tularemia. Vet Microbiol 2010; 140: 332-8. 7. Gaudy-Graffin C, Lesage G, Kousignian I. Use of an anti-hepatitis C virus (HCV) IgG avidity assay to identify recent HCV infection. J Clin Microbiol 2010; 48: 3281-7. 8. Holec-Gąsior L, Drapała D. Awidność przeciwciał IgG jako ważny test diagnostyczny w rozpoznawaniu aktywnej toksoplazmozy - stan obecny i nowe możliwości. Forum Medycyny Rodzinnej 2012; 6: 74 81. 9. Kimuda SG, Biraro IA, Bagaya BS. Characterising antibody avidity in individuals of varied Mycobacterium tuberculosis infection status using surface plasmon resonance. PLoS One 2018;13: e0205102. 10. Kobayashi N, Nagata T, Shinagawa S i inni. Increase in the IgG avidity index due to herpes simplex virus type 1 reactivation and its relationship with cognitive function in amnestic mild cognitive impairment and Alzheimer s disease. Biochem Biophys Res Commun. 2013; 430: 907-11. 11. Koskela P, Salminen A. Humoral immunity against Francisella tularensis after natural infection. J Clin Microbiol 1985; 22: 973 9. 12. Murray PR., Rosenthal KS, Pfaller MA. Mikrobiologia. Elsevier, 2009, USA 13. Perciani C, Peixoto P, Dias W, Kubrusly F, Tanizaki M. Improved method to calculate the antibody avidity index. J Clin Lab Anal 2007; 21: 201-6. 14. Rastawicki W, Jagielski M, Gierczyński R. Wykorzystanie odczynu ELISA w serologicznej diagnostyce tularemii. Med Dośw Mikrobiol 2005; 57: 425-9. 15. Sirin MC, Agus N, Yilmaz N. Seroprevalence of Toxoplasma gondii, Rubellavirus and Cytomegalovirus among pregnant women and the importance of avidity assays. Saudi Med J 2017; 38: 727-32.

50 W. Rastawicki, K. Śmietańska, N. Rokosz-Chudziak, U. Roguska 16. Shepherd SJ, McAllister G, Keana J i inni. Development of an avidity assay for detection of recent HIV infections. J Virol Methods 2015; 217: 42-9. 17. Suzuki L.A., Rocha R.J., Rossi C.L. Evaluation of serological markers for the immunodiagnosis of acute acquired toxoplasmosis. J Med Microbiol 2001; 50: 62 70. 18. Vilibic-Cavlek T, Ljubin-Sternak S, Kos L i inni. The role of IgG avidity determination in diagnosis of Epstein-Barr virus infection in immunocompetent and immunocompromised patients. Acta Microbiol Immunol Hung 2011; 58: 351-7. 19. Vilibic-Cavlek T, Kristofic B, Savic V. Diagnostic significance of immunoglobulin G avidity in symptomatic and asymptomatic West Nile virus infection. Rev Soc Bras Med Trop 2018; 51: 591-5. 20. Rudzińska M, Kowalewska B, Sikorska K. Clinical usefulness of Western blotting and ELISA avidity for the diagnosis of human toxocariasis. Parasite Immunol 2017; 39 (1) doi: 10.1111/pim.12400. Otrzymano: 1 III 2019 r. Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii i Zwalczania Skażeń Biologicznych, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Państwowy Zakład Higieny w Warszawie

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2019, 71: 51-57 https://doi.org/10.32394/mdm.71.06 Nowe gatunki w obrębie kompleksów Candida parapsilosis i Candida glabrata New species within Candida parapsilosis and Candida glabrata Dariusz Domański 1, Magdalena Anna Sikora 2,3, Robert Tomasz Kuthan 2,4, Ewa Augustynowicz-Kopeć 5, Ewa Swoboda-Kopeć 4 1 Salus Medycyna Medical Center, Siedlce 2 Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Szpital Kliniczny Dzieciątka Jezus, Warszawa 3 Zakład Mikrobiologii Stomatologicznej, Warszawski Uniwersytet Medyczny, Warszawa 4 Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny, Warszawa 5 Zakład Mikrobiologii, Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc, Krajowe Referencyjne Laboratorium Prątka, Warszawa Candida parapsilosis i Candida glabrata to kolejne, po Candida albicans, drożdżaki tworzące kompleksy kryptogatunków. Pomimo, że gatunki te zostały opisane ponad dekadę temu, nadal wiedza na ich temat jest ograniczona. Celem pracy była identyfikacja gatunkowa szczepów klinicznych w obrębie kompleksów C. glabrata i C. parapsilosis. W wyniku przeprowadzonej analizy molekularnej wykryto 24 izolaty Candida nivariensis oraz 4 szczepy C. metapsilosis i 9 szczepów C. orthopsilosis. Słowa kluczowe: Candida nivariensis, Candida metapsilosis, Candida orthopsilosis ABSTRACT Introduction: Candida parapsilosis and Candida glabrata are another yeasts that form complexes of crypospecies. Although these species have been described more than a decade ago, knowledge about them is still limited. The reason for this is the large phenotypic similarity that unables them from being differentiated by classical diagnostic methods. The aim of the study was to identify species of clinical strains within C. glabrata and C. parapsilosis complexes. Material and methods: Standard PCR-RFLP of the secondary alcohol dehydrogenase gene (SADH) with BanI restriction enzyme served to determine species affiliation within the C. parapsilosis complex. The internal transcribed spacer was used to confirm the identification of C. glabrata sensu stricto. The D1/D2 domain of the 26S rdna gene was sequenced in order to identify C. nivariensis and C. bracarensis strains. Results: As a result of the molecular analysis, 24 Candida nivariensis isolates and 4 C. metapsilosis strains and 9 C. orthopsilosis strains were detected. Conclusions: Prevalence of new cryptic species was relatively low. Key words: Candida nivariensis, Candida metapsilosis, Candida orthopsilosis

52 D. Domański, M. A. Sikora, R.T. Kuthan i inni WSTĘP Częstość występowania inwazyjnych zakażeń grzybiczych, w szczególności tych spowodowanych drożdżakami z rodzaju Candida, w ostatnich latach znacząco wzrosła, stając się istotnym powikłaniem infekcyjnym u pacjentów hospitalizowanych. W ostatnich latach zauważalna jest zmiana profilu gatunkowego z C. albicans, na non- albicans Candida species (NAC) (10). Najczęstszym czynnikiem etiologicznym tego typu zakażeń wciąż pozostaje C. albicans, mimo wzrostu udziału grupy drożdżaków innych niż C. albicans (21). Stwierdzono, że NAC coraz częściej stanowią czynnik etiologiczny zakażeń szpitalnych, a wśród nich największe znaczenie mają Candida glabrata oraz Candida parapsilosis (1). Dokładna przyczyna zmiany profilu gatunków w obrębie rodzaju Candida nie jest znana, jednakże wzrost liczby zakażeń drożdżakami z rodzaju NAC, w szczególności C. glabrata przypisuje się nieracjonalnej profilaktyce przeciwgrzybiczej (11). Obecnie obserwowany jest stały wzrost liczby kandydemii o etiologii C. glabrata (20). Drożdżak ten w zaledwie 10 lat (od 1989 roku) z czwartego czynnika etiologicznego zakażeń krwi na oddziałach intensywnej terapii, stał się drugim. Badacze zaobserwowali również występowanie niebezpiecznego zjawiska koinfekcji w przypadku zakażeń krwi spowodowanych przez C. glabrata oraz C. albicans (15). Od 2006 roku Candida glabrata sensu lato (kompleks Candida glabrata) jest kompleksem gatunków, w którego skład wchodzą: Candida glabrata sensu stricto oraz Candida nivariensis i Candida bracarensis (17). Częstość występowania gatunków C. nivariensis oraz C. bracarensis wynosi mniej niż 5% wśród izolatów kompleksu C. glabrata (16). Należy podkreślić, że częstość izolacji C. nivariensis jest wyższa, niż C. bracarensis (2). Badania polimorfizmu fragmentów restrykcyjnych genomowego DNA C. parapsilosis wykazały większą heterogenność genetyczną niż w obrębie innych gatunków Candida spp. (27). Spowodowało to wprowadzenie podziału C. parapsilosis pierwotnie na trzy grupy genetyczne (I-III). Późniejsze badania molekularne ujawniły różnice genetyczne pomiędzy grupami, pozwalające na wyodrębnienie, 3 blisko spokrewnionych, ale odrębnych gatunków: C. parapsilosis (wcześniej grupa I), C. orthopsilosis (wcześniej grupa II) i C. metapsilosis (wcześniej grupa III) (25). Ze względu na bliskie pokrewieństwo genetyczne, gatunki w obrębie kompleksów C. parapsilosis i C. glabrata są fenotypowo nie do odróżnienia. Celem pracy była identyfikacja gatunkowa szczepów klinicznych w obrębie kompleksów C. glabrata i C. parapsilosis. MATERIAŁ I METODY Materiał do badań obejmował 445 klinicznych szczepów C. glabrata sensu lato oraz 171 szczepów Candida parapsilosis sensu lato izolowanych z różnych materiałów klinicznych od pacjentów Szpitala Dzieciątka Jezus. Materiały kliniczne posiewano zgodnie z zasadami rutynowej diagnostyki mikrobiologicznej na standardowe podłoże Sabouraud, do hodowli i izolacji grzybów i inkubowano w temperaturze 30 C przez 24-72h do uzyskania reprezentatywnych, pojedynczych kolonii. Identyfikację gatunkową do kompleksów wykonano przy użyciu komercyjnych testów ID 32 C (biomérieux, France).

Identyfikacja szczepów w obrębie kompleksów C. glabrata i C. parapsilosis 53 Identyfikacja gatunków w obrębie kompleksów C. parapsilosis i C. glabrata. Izolacja DNA genomowego. Izolacja DNA genomowego szczepów z kompleksów C. parapsilosis i C. glabrata przeprowadzona została przy użyciu zestawu do izolacji DNA genomowego firmy EurX zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta (EurX, Polska). Identyfikacja gatunków C. metapsilosis i C. orthopsilosis w obrębie kompleksu C. parapsilosis. Przynależność gatunkowa w obrębie kompleksu C. parapsilosis została wykonana z zastosowaniem standardowej metody PCR RFLP genu dehydrogenazy alkoholowej (SADH), enzymem restrykcyjnym BanI wg metody opisanej przez Tavanti i wsp. (26). Gen SADH C. parapsilosis był amplifikowany za pomocą reakcji PCR przy użyciu starterów specyficznych SADHF (5 -GTTGATGCTGTTGGATTGT-3 ) i SADHR (5 - CAATGCCAAATCTCCCAA-3 ). Identyfikacja gatunkowa wykonana była na podstawie analizy wzorów restrykcyjnych, otrzymanych po trawieniu produktu amplifikacji fragmentu (o długości 716 pz) genu SADH, enzymem BanI. Identyfikacja gatunków C. nivariensis i C. bracarensis w obrębie kompleksu C. glabrata. Różnicowanie gatunkowe w obrębie kompleksu Candida glabrata przeprowadzono w dwóch etapach. W pierwszym za pomocą metody PCR poszukiwano fragmentu genu wewnętrznego regionu kodującego ITS (internal transcripted spacer) charakterystycznego dla gatunku C. glabrata sensu stricto. Drugi etap obejmował sekwencjonowanie fragmentów DNA. Szczepy charakteryzujące się brakiem fragmentu ITS charakterystycznego dla C. glabrata sensu stricto poddano sekwencjonowaniu w rejonie D1/D2 genu 26S rrna według metody opisanej przez Kurtzman (13). Do amplifikacji użyto starterów: NL-1 (5 -GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG ), NL-4 (5 -GGTCCGTGTTTCA- AGACGG ). Do sekwencjonowania użyto wewnętrznych starterów: NL-2A (5 -CTT- GTTCGCTATCGGTCTC ) oraz NL-3A (5 -GAGACCGATAGC GAACAAG ). Wyniki sekwencjonowania analizowane były w programie BLAST. WYNIKI Identyfikacja szczepów nowych gatunków w kompleksach C. glabrata oraz C. parapsilosis. Czterysta czterdzieści pięć szczepów pierwotnie zidentyfikowanych jako Candida glabrata, poddano analizie genetycznej z wykorzystaniem metody PCR. Przeprowadzona analiza wykazała obecność 24 izolatów (5,4% wszystkich analizowanych szczepów), nie posiadających zamplifikowanego fragmentu ITS charakterystycznego dla C. glabrata sensu stricto. Wszystkie 24 szczepy zostały poddane sekwencjonowaniu w rejonie D1/D2 genu 26S rrna. Na podstawie analizy otrzymanych sekwencji, u wszystkich 24 izolatów wykazano 99% homologii z fragmentem 26S rrna dla gatunku Candida nivariensis. W wyniku przeprowadzonej analizy nie wykryto szczepów wykazujących homologii do fragmentu 26S rrna gatunku C. bracarensis. Sto siedemdziesiąt jeden szczepów wyizolowanych z materiałów klinicznych jako Candida parapsilosis sensu lato poddano badaniu opartemu na reakcji PCR-RFLP genu SADH (dehydrogenazy alkoholowej) enzymem BanI. Wykazano różnice we wzorach restrykcyjnych pozwalające na rozróżnienie poszczególnych gatunków w obrębie kompleksu C. parapsilosis. W przypadku braku miejsca cięcia enzymem restrykcyjnym stwierdzono przynależność do gatunku Candida orthopsilosis. Obecność jednego miejsca cięcia świad-

54 D. Domański, M. A. Sikora, R.T. Kuthan i inni czyło o przynależności do gatunku C. parapsilosis sensu stricto. Przy trzech miejscach cięcia, wskazywano na przynależność do gatunku C. metapsilosis. W zależności od otrzymanego wzoru restrykcyjnego określano przynależność do gatunku w obrębie kompleksu. W obrębie tej grupy izolatów zidentyfikowano gatunki: C. parapsilosis sensu stricto, C. metapsilosis i C. orthopsilosis. Udział wyizolowanych gatunków w obrębie kompleksów Candida glabrata oraz Candida parapsilosis przedstawiono w Tabeli 1. Tabela 1. Udział wyizolowanych gatunków w obrębie kompleksów C. glabrata oraz C. parapsilosis Gatunek Liczba szczepów Kompleks Candida glabrata 455 Candida glabrata sensu stricto 431 Candida nivariensis 24 Candida bracarensis 0 Kompleks Candida parapsilosis 171 Candida parapsilosis sensu stricto 158 Candida metapsilosis 9 Candida orthopsilosis 4 Rycina 1. Nowe gatunki w obrębie kompleksów Candida parapsilosis i DYSKUSJA Drobnoustroje z grupy non-albicans Candida są coraz powszechniej izolowane z różnego rodzaju zakażeń. Według danych literaturowych odsetek zakażeń powodowanych przez C. parapsilosis na przestrzeni lat wzrósł w USA z 7 nawet do 37%, a w Europie z 0 do 21%. Obserwuje się również wzrost liczby kandydemii powodowanej przez C. glabrata (20). Czynnikiem sprzyjającym kandydemii o tej etiologii wśród pacjentów z Oddziałów Intensywnej Terapii, była wcześniejsza terapia flukonazolem (24). W Polsce C. parapsilosis stanowiła trzeci co do częstości (13,14%) po C. albicans i C. glabrata drożdżak izolowany z przypadków kandydemii (19). Dużo niższą częstość izolacji (4%) C. parapsilosis z potwierdzonych inwazyjnych zakażeń grzybiczych otrzymano w badaniu Gołaś i wsp. (11). Należy podkreślić, że istnieje bardzo niewiele doniesień dotyczących izolacji nowo odkrytych gatunków z kompleksów C. parapsilosis: C. metapsilosis i C. orthopsilosis