Przegląd testów komercyjnych

W całej Polsce odnotowuje się znaczny wzrost zachorowań na boreliozę. Diagnostyka laboratoryjna oparta jest na wykrywaniu przeciwciał klasy IgM i IgG. Stosowanie w laboratoriach testów w oparciu wyłącznie o charakterystykę podaną przez producenta może być źródłem wyników fałszywie ujemnych. Zofia Czubasiewicz STAMAR, Dąbrowa Górnicza Przegląd testów komercyjnych fot. istock stosowanych w pierwszym etapie w celu wykrycia zakażenia Borrelia burgdorferi Review of commercial tests used at the first stage to detect Borrelia burgdorferi infection STRESZCZENIE: Czynnikiem etiologicznym boreliozy z Lyme są krętki Borrelia burgdorferi sensu lato. W 2016 r. średnia zapadalność na 100 tys. mieszkańców dla Polski wyniosła 55,2. Jest to wzrost o ponad połowę w porównaniu do roku poprzedniego. W 2016 r. w całej Polsce odnotowano 21 200 zachorowań na boreliozę. Diagnostyka laboratoryjna oparta jest na wykrywaniu przeciwciał klasy IgM i IgG. Antygeny do wykrywania przeciwciał pozyskiwane są z ekstraktów z hodowli trzech genogatunków Borrelii tj.: B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii i B. garinii lub też metodą rekombinacji. Stosowanie w laboratoriach testów w oparciu wyłącznie o charakterystykę podaną przez producenta może być źródłem wyników fałszywie ujemnych. SŁOWA KLUCZOWE: antygeny, borelioza, diagnostyka, ELISA SUMMARY: The aetiological factor of Lyme disease are spirochetes Borrelia burgdorferi sensu lato. In 2016, the average morbidity (per 100 000 citizens) in Poland was 55,2. This is an increase by more than a half as compared to the previous year. 21 200 cases of Lyme disease were observed Poland-wide in 2016. The laboratory diagnostics is based on the detection of IgM and IgG antibodies. Antigens for the detection of antibodies are obtained from extracts from the cultures of three genospicies of Borrelia, i.e. B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii and B. garinii, or also by recombination. The use of tests in laboratories based solely on the characteristics provided by the manufacturer may be a source of false negative results. KEYWORDS: antigens, Lyme disease, diagnosis, ELISA Czynnikiem etiologicznym boreliozy z Lyme są krętki Borrelia burgdorferi sensu lato. Siedem genogatunków Borrelia uznawanych jest za odpowiedzialne za rozwój boreliozy z Lyme. Należą do nich: B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii, B. garinii, B. bissettii oraz B. spielmanii [1], a także B. lusianiae i B. valaisiana [2]. Wszystkie wymienione mogą wywoływać boreliozę w Europie, najczęściej jednak dotyczy to trzech gatunków: B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii oraz B. garinii [3]. Poszczególne szczepy wiąże się z rozwojem różnych obrazów choroby: Borrelia afzelii powoduje zazwyczaj rozwój przewlekłego zanikowego zapalenia skóry, Borrelia burgdorferi sensu stricto jest najczęściej odpowiedzialna za rozwój zapalenia stawów, natomiast neuroboreliozę może powodować zarówno B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii, jak i B. garinii [3]. DROGI ZAKAŻENIA Zakovska i wsp. (2008) wymieniają kleszcze z rodziny Ixodidae jako najczęstszy wektor zakażenia krętkami 8 LABORATORIUM MEDYCZNE

GENOGATUNEK KLESZCZA REJON GŁÓWNEGO ROZPOWSZECHNIENIA DOMINUJĄCY REZERWUAR Borrelia afzelii Europa Centralna, Wschodnia, Północna, Skandynawia Gryzonie Borrelia burgdorferi sensu stricto USA, Europa Wschodnia, Rosja Ptaki, gryzonie Borrelia garinii Europa Zachodnia Ptaki, gryzonie Borrelia valaisiana Głównie Irlandia, także Wielka Brytania, Holandia, Skandynawia, Szwajcaria, Włochy Ptaki Tab. 1. Rozpowszechnienie i dominujący rezerwuar krętków Borrelia burgdorferi wg Lindgren i Jaenson, 2006 [8] REGION STOPIEŃ ZAKAŻENIA POPULACJI KLESZCZY KRĘTKAMI B. BURGDORFERI S.L. ŹRÓDŁO Olsztyn i okolice 11-35% Wegner i wsp., 1995 Trójmiasto 10,5% Wegner i wsp., 1997 Pojezierze Mazurskie 11,7% wiosną; 2,6% jesienią Pawełczyk i wsp., 2004 Zachodniopomorskie Szczecin 5% 16,5% Wodecka, 2007 Kosik-Bogacka i wsp., 2007 Poznań i okolice 22% Michalik i Rejmenciak, 1998 Śląsk Polska południowa 4-15% 37,5% 15% Petko i wsp., 1997 Stańczak i wsp., 1999 Strzelczyk i wsp., 2015 Lublin i okolice 18,5-30,8% Stefancikova i wsp., 2008 Tab. 2. Stopień zakażenia kleszczy krętkami B. burgdorferi s.l. w poszczególnych regionach Polski [5, 9-17] Borrelia. Najbardziej popularnym w Europie jest Ixodes ricinus natomiast w Ameryce Północnej Ixodes scapularis oraz w Azji Ixodes persulcatus [4]. Wykazano również obecność tych bakterii w organizmach komarów Culex i Aedes i innych owadów krwiopijnych, co wpływa na utrzymywanie się krętków w zoonotycznym rezerwuarze zwierząt, a przypadkowo może prowadzić do infekcji człowieka [5-7]. Cykl rozwojowy kleszczy Ixodes ricinus trwa 2-3 lata i przebiega od jaja, poprzez stadia larwy i nimfy, do stadium dojrzałego. Aby osiągać kolejne stadia, aż do postaci dorosłej, kleszcze muszą wyssać krew kręgowca na każdym etapie rozwoju [2]. Do zakażenia krętkami Borrelia burgdorferi dochodzi, gdy żywicielem kleszczy stanie się kręgowiec już zarażony tymi bakteriami. Takie zakażenie jest przekazywane transstadialnie i transowarialnie. Następnie kleszcze przekazują zakażenie kolejnemu żywicielowi za sprawą przemieszczania się krętków z hemolimfą z przewodu pokarmowego do ślinianek. Żywicielami kleszczy są gady, ptaki i ssaki. Krętki Borrelia burgdorferi mogą bytować cyklicznie na takich gatunkach zwierząt, jak: gryzonie, jaszczurki, ptaki, ssaki (np. jeleniowate). Każdy żywiciel kleszczy może być rezerwuarem krętków Borrelia burgdorferi. EPIDEMIOLOGIA Lindgren i Jaenson (2006) zwracają uwagę na fakt, że kleszcze w trakcie żerowania na żywicielu pozostają na jego ciele przez kilka dni, co sprawia, że przemieszczają się wraz z nim do nowych lokalizacji. Małe ssaki i gryzonie żyją raczej na ograniczonym terytorium, duże ssaki, takie jak jelenie, przemieszczają się w obrębie od 50 do 100 hektarów [8]. Natomiast ptaki wędrowne, które przemieszczają się na bardzo duże odległości po swoich ścieżkach migracyjnych, odgrywają niezwykle ważną rolę w tworzeniu nowych lokalizacji dla kleszczy, a co za tym idzie, dla patogenów przez nich przenoszonych [8]. Tab. 1 przedstawia rozpowszechnienie i dominujący rezerwuar krętków Borrelia burgdorferi. Hubalek i Halouzka (1997) podają, że najbardziej rozpowszechnionymi genogatunkami w całej Europie są Borrelia afzelii i garinii. Rzadziej występuje Borrelia burgdorferi sensu stricto, najczęściej we wschodniej 2/2018 9

Rys. 1. Liczba zachorowań na boreliozę w Polsce i woj. śląskim w latach 1998-2016 (na podstawie danych z PZH) [18] Rys. 2. Zapadalność na boreliozę na 100 tys. mieszkańców w Polsce i w woj. śląskim w latach 1998-2016 (na podstawie danych z PZH) [18] Rys. 3. Zachorowalność na boreliozę w poszczególnych województwach w Polsce w 2016 r. (na podstawie danych PZH) [18] Europie (Polska, Słowacja). Bardzo rzadko występują genogatunki B. valaisiana i B. lusitaniae [3]. W Polsce stopień zakażenia kleszczy I. ricinus przez B. burgdorferi s.l. jest zróżnicowany. W tab. 2. przedstawiono dane dotyczące poszczególnych regionów Polski. Na podstawie danych udostępnionych na stronie internetowej PZH [18] możliwe jest zobrazowanie zachorowalności w Polsce na przestrzeni kilkunastu ostatnich lat. Na rys. 1. zobrazowano liczbę zachorowań na boreliozę w Polsce i w województwie śląskim w latach 1998-2016. Widoczny na wykresie jest bardzo wysoki wzrost liczby zachorowań, który może być związany zarówno z częstszą zapadalnością na tę chorobę, jak również z pojawianiem się coraz bardziej dokładnych testów diagnostycznych umożliwiających rozpoznanie tej infekcji. Rys. 2. przedstawia zapadalność na boreliozę na 100 tys. mieszkańców Polski oraz województwa śląskiego [18]. W 2016 r. najwyższą zapadalność odnotowano dla województwa podlaskiego i wynosiła ona 134,9. Drugie pod tym względem było województwo warmińsko-mazurskie 97,2, trzecie natomiast województwo lubelskie 89,2. Najniższą zapadalność na 100 tys. mieszkańców odnotowano w województwie wielkopolskim (wynosi 16,6). W 2016 r. średnia zapadalność na 100 tys. mieszkańców dla Polski wyniosła 55,2. Jest to wzrost o ponad połowę w porównaniu do roku poprzedniego. Na wykresie widoczne jest, że zapadalność na 100 tys. mieszkańców dla województwa śląskiego od 2005 r. jest wyższa od średniej zapadalności dla Polski, a różnica ta w ostatnich latach jest coraz większa. W 2016 r. zapadalność na 100 tys. mieszkańców dla śląska wyniosła 71,5. Rys. 3. przedstawia zachorowalność na boreliozę w poszczególnych województwach Polski w 2016 r. W województwie śląskim liczba zachorowań w porównaniu do innych województw była najwyższa i wynosiła 3264 osoby. Drugie pod tym względem było województwo małopolskie 2946 osób, trzecie mazowieckie (2184 osoby). Najmniejszą liczbę zachorowań odnotowano w województwie świętokrzyskim 398 osób. W 2016 r. w całej Polsce odnotowano 21 200 zachorowań na boreliozę [18]. DIAGNOSTYKA BORELIOZY Diagnostyka boreliozy staje się problematyczna, w sytuacji gdy objawy kliniczne nie są typowe (np. brak rumienia wędrującego, brak ugryzienia przez kleszcza w wywiadzie), wtedy bardzo istotną częścią rozpoznania są wyniki badań laboratoryjnych. Z tego powodu wskazane jest używanie takich metod diagnostycznych, które w jak najmniejszym stopniu będą obarczone wynikami fałszywie dodatnimi oraz ujemnymi. Najbardziej swoistym badaniem jest bezpośrednie wykrycie patogenu w materiale badanym, czyli badanie mikrobiologiczne [19]. Niestety w przypadku zaka- 10 LABORATORIUM MEDYCZNE

NAZWA TESTU ZASTOSOWANE ANTYGENY CZUŁOŚĆ PODANA PRZEZ PRODUCENTA WZGL. INNEGO TESTU (TEST ODNIESIENIA) SWOISTOŚĆ PODANA PRZEZ PRODUCENTA WZGL. INNEGO TESTU (TEST ODNIESIENIA) WIELKOŚĆ PRÓBY BADANEJ fot. istock Anti-Borrelia ELISA (IgM) Euroimmun [21] Pełny ekstrakt ze szczepów B.b. sensu stricto, B. garinii, B. afzelii 100% (Anti-Borrelia WB (IgM) Euroimmun) 96% (Anti-Borrelia WB (IgM) Euroimmun) 150 Anti-Borrelia plus VlsE ELISA (IgG) Euroimmun [22] Pełny ekstrakt ze szczepów B.b.sensu stricto, B. garinii, B. afzelii; rekombinowany antygen VlsE brak danych Borrelia 14kDa+ OspC IgM ELISA IBL [23] 14 kda rekombinowany fragment flageliny Borrelii i oczyszczone natywne białko OspC ze szczepu B. afzelii 100% (ELISA i WB) > 95% (ELISA i WB) brak danych Borrelia IgG + VlsE ELISA IBL [24] Mieszanina lizatów antygenów ze szczepów B.b. sensu stricto, B. afzelii, B. garinii; rekombinowany antygen VlsE 94.1% (Borrelia recombinant IgG Blot+Borrelia afzelii IgG Blot) 98,3% (Borrelia afzelii IgG Blot) 58/298** IgM MIKROGEN [25] IgG MIKROGEN [26] Rekombinowane antygeny: OspC (B. garini, B. afzelii), p41 (B. bavariensis), VlsE (różne szczepy) Rekombinowane antygeny: OspC (B. garini, B.b. sensu stricto),p100 (B. afzelii), p18 (B. afzelii)), VlsE (różne szczepy) 97% (WB) 15 99% (WB) 20 IDEIA Borrelia burgdorferi IgM Oxoid [27] Oczyszczona, natywna flagelina pochodząca ze szczepu B. afzelii DK1 97,5% (nie podano testu 200 IDEIA Borrelia burgdorferi IgG Oxoid [28] Oczyszczona, natywna flagelina pochodząca ze szczepu B. afzelii DK1 98,5% (nie podano testu 200 Anti-Borrelia rec. IgM ELISA Biotest [29] Rekombinowane OspC i flagelina jako proteina fuzyjna p41pko-p41pbi 91% (nie podano testu 1007 Anti-Borrelia rec. IgG ELISA Biotest [30] Rekombinowane OspC, p18 (Osp17), p83/100 i flagelina jako proteina fuzyjna p41pko-p41pbi 91% (nie podano testu 1007 Borrelia burgdorferi IgM ELISA Demeditec [31] Pełny ekstrakt ze szczepu B.b. sensu stricto z dodatkiem czystego antygenu OspC 100% (nie podano testu 100% (nie podano testu brak danych Borrelia burgdorferi IgG ELISA Demeditec [32] Pełny ekstrakt ze szczepu B.b. sensu stricto z dodatkiem czystego antygenu OspC 88% (nie podano testu 97% (nie podano testu brak danych VIDAS Lyme IgM II (LYM) BioMerieux [33] VIDAS Lyme IgG II (LYG) BioMerieux [34] Mieszanina rekombinowanych białek fuzyjnych (DbpA OspC) pochodzących ze szczepów B.b. sensu stricto, B. afzelii, B. garinii Mieszanina rekombinowanych białek fuzyjnych (VlsE, DbpA OspC) pochodzących ze szczepów B.b. sensu stricto, B. afzelii, B. garinii 59,4% 87% 202/200** 64,9% 98,5% 202/ 200** Tab. 3. Dane dotyczące charakterystyki najczęściej używanych testów ELISA; udostępniane przez producentów [21-34] * Producent podaje wyłącznie czułość dla poszczególnych stadiów choroby, wyznaczoną w badaniu pacjentów z rozpoznaną boreliozą w różnych jej stadiach. Dane te zostały przedstawione w osobnej tabeli (tab. 4). ** Do wyznaczenia czułości i swoistości przeprowadzono 2 odrębne doświadczenia na 2 różnych próbach badanych. Wartość pierwsza dotyczy czułości pacjenci z rozpoznaną boreliozą w różnych stadiach; druga swoistości osoby zdrowe. 2/2018 11

I STADIUM II STADIUM III STADIUM TEST Anti-Borrelia ELISA IgM (Euroimmun) ERYTHEMA MIGRANS FACIAL PARALYSIS LYMPHOCYTIC MENINGORADICULITIS LYME ARTHRITIS ACRODERMATITIS CHRONICA ATROPHICANS NEUROBORRELIOSIS N % N % N % N % N % N % 68% 50% 43% 21% 49% Anti-Borrelia plus VlsE ELISA IgG(Euroimmun) IgM/IgG ELISA (Euroimmun) 205 76% 16 100% 49 84% 14 93% 80 90% 91% 100% 94% 93% 96% Borrelia + VlsE IgG ELISA (IBL) 116 49% 38 74% IgM (MIKROGEN) 86% 50% 59% 64% IgG(MIKROGEN) IgM/IgG ELISA MIKROGEN 64 53% 46 100% 17 100% 81 99% 86% 100% 100% 100% IDEIA Borrelia IgM (Oxoid) 45 IDEIA Borrelia IgG (Oxoid) 36% 5% 39% 38 20 38% 100% 79% Anti-Borrelia rec. IgM/IgG ELISA Biotest VIDAS Lyme IgM II (LYM) BioMerieux VIDAS Lyme IgG II (LYG) BioMerieux 45 80% 92 100% 22 68% 119 43,7% N = 62 87,6% N = 21 66,7% 119 80% N = 62 83,9% N = 21 95,2% Tab. 4. Dane dotyczące czułości najczęściej używanych testów ELISA; badanie przeprowadzono na grupie pacjentów z rozpoznaną boreliozą w różnych stadiach. W przypadku testów VIDAS dane dotyczą poszczególnych stadiów choroby, a nie rozpoznanych objawów [21-34] żenia Borrelią metoda ta charakteryzuje się zbyt niską czułością (50-70% bioptaty skóry; 10-30% PMR; ok. 1% - płyn stawowy). Metoda PCR, która wykrywa materiał genetyczny bakterii, jest skuteczniejsza jedynie w przypadku płynu stawowego (50-70%) [20]. Dlatego też z wyboru stosowane są metody serologiczne, wykrywające w badanym organizmie przeciwciała wytwarzane w odpowiedzi na kontakt z patogenem. Jest to jednak pośrednia diagnostyka, co powoduje, że wykrycie przeciwciał nie jest równoznaczne z obecnością patogenu w danym momencie. Wskazuje jedynie na kontakt z bakterią w przeszłości. Problematyczne jest również to, że metody badań stosowane w diagnostyce serologicznej boreliozy często nie posiadają standaryzacji [19]. Niejednoznaczny obraz kliniczny boreliozy oraz zróżnicowana odpowiedź immunologiczna na występujące w środowisku gatunki Borrelia burgdorferi stwarzają trudności w rozpoznaniu zakażenia. Diagnostyka laboratoryjna oparta jest na wykrywaniu przeciwciał klasy IgM i IgG. Antygeny do wykrywania przeciwciał pozyskiwane są z ekstraktów z hodowli trzech genogatunków Borrelii, tj.: B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii i B. garinii lub też metodą rekombinacji. W wielu przypadkach występują reakcje krzyżowe z antygenami innych rodzajów bakterii, co wymaga przeprowadzenia kolejnych badań z wykorzystaniem metody western blot (immunoblottingu). W ofercie różnych firm są zestawy wykrywające przeciwciała przeciw różnym antygenom Borrelii, które pozwalają z dużą dokładnością potwierdzić obecność swoistych przeciwciał przeciw antygenom Borrelii. W tab. 3 przedstawione zostały dane dotyczące charakterystyki najczęściej używanych testów ELISA, udostępniane przez producentów w instrukcjach do testów czy też w formie skróconej charakterystyki danego testu. Forma tabeli pozwala w prosty sposób porównać testy oferowane komercyjnie, chociażby pod względem składu antygenowego danego testu czy też pochodzenia tych anty- 12 LABORATORIUM MEDYCZNE

genów. Interesujący jest również fakt braku systematyki w przekazywaniu informacji co do czułości i swoistości wielu testów. Niektórzy producenci podają ją jedynie w procentach, bez podawania szczegółów, takich jak test użyty do porównania, wielkość próby badanej. W niektórych przypadkach nie ma w ogóle informacji wprost o czułości i/lub swoistości danego testu. Czułość często podawana jest w dość zawoalowany sposób, tzn. w formie tabeli przedstawiającej wyniki badania próbek pacjentów z rozpoznaną boreliozą w różnych stadiach choroby. Tab. 4 prezentuje dane dotyczące czułości najczęściej używanych testów ELISA; badanie przeprowadzono na grupie pacjentów z rozpoznaną boreliozą w różnych stadiach. Z przedstawionej tabeli wynika, że we wczesnym stadium choroby najwyższą czułość osiąga test IgM (Mikrogen) 86% oraz skojarzenie dwóch testów dla obu klas przeciwciał Anti-Borrelia ELISA IgM i Anti-Borrelia plus VlsE ELISA IgG (Euroimmun) 91%. W późniejszych stadiach najwyższą czułość osiągają testy: recomwell Borrelia IgG (Mikrogen) oraz skojarzenie dwóch testów Anti-Borrelia rec. IgM i IgG ELISA Biotest. PODSUMOWANIE Podsumowując, bardzo istotny jest fakt walidacji danej metody w laboratorium medycznym. Informacje zawarte w materiałach dostarczanych przez producentów często mają charakter marketingowy. Stosowanie w laboratoriach testów w oparciu wyłącznie o charakterystykę podaną przez producenta może być źródłem wyników fałszywie ujemnych. Jest to szczególnie istotne u pacjentów, u których w wywiadzie brak jest typowych objawów klinicznych choroby. Piśmiennictwo 1. Richter D., Schlee D.B., Allgower R., Matuschka F.R.: Relationships of a novel Lyme disease spirochete, Borrelia spielmani sp. nov., with its hosts in Central Europe. Appl Environ Microbiol, 2004, 70, 6414-6419. 2. Mączka I., Tylewska-Wierzbanowska S.: Cykl krążenia krętków Borrelia burgorferi w środowisku. Post Mikrobiol, 2010, 49, 1, 25-32. 3. Hubálek Z., Halouzka J.: Distribution of Borrelia burgdorferi sensu lato genomic groups in Europe, a review. European Journal of Epidemiology, 1997, 13, 951-957. 4. Zakovska A., Janouskovcova E., Pejchalova K., Halouzka J., Dendis M.: Identification and characterization of 31 isolates of Borrelia burgdorferi (Spirochaetales, Spirochaetaceae) obtained from various hosts and vectors using PCR-RFLP and SDS-PAGE analysis. Acta Parasitologica, 2008, 53, 2, 186-192. 5. Kosik-Bogacka D.I., Kuźna-Grygiel W., Jaborowska M.: Ticks and Mosquitoes as Vectors of Borrelia burgdorferi s.l. in the Forested Areas of Szczecin. Folia Biologica, Kraków, 2007, vol. 55, 3-4. 6. Zeman P.: Borrelia-infection rates in tick and insect vectors accompanying human risk of acquiring Lyme borreliosis in a highly endemic region in Central Europe. Folia Parasitologica, 1998, 45, 319-325. 7. Žákovská A., Jörková M., Šerý O., Dendis M.: Spirochaetes in Culex (C.) pipiens s.l. larvae. Biologia, Bratislava, 2004, 59/2, 283-287. 8. Lindgren E., Jaenson T.G.T.: Lyme borreliosis in Europe: influences of climate and climate change, epidemiology, ecology and adaptation measures. World Health Organization, Copenhagen 2006. 9. Pawełczyk A., Ogrzewalska M., Zadrożna I., Siński E.: The zoonotic reservoir of Borrelia burgorferi sensu lato in the Mazury Lakes district of North-Eastern Poland. Int J Med Microbiol, 2004, 293, 37, 167-171. 10. Wegner Z., Stańczak J.: Rola kleszczy w epidemiologii boreliozy z Lyme. Przeg Epid, 1995, 49, 3, 245-250. 11. Wegner Z., Racewicz M., Kubica-Biernat B., Kruminis-Łozowska W., Stańczak J.: Występowanie kleszczy Ixodes Ricinus (Acari, Ixodidae) na zalesionych obszarach trójmiasta i ich zakażenie krętkami Borrelia Burgdorferi. Przeg Epid, 1997, 51, 1-2, 11-20. 12. Wodecka B.: Znaczenie jeleni (Cervus elaphus) w ekologii Borrelia burgdorferi sensu lato. Wiad Parazytol, 2007, 53, 3, 231-237. 13. Michalik J., Rejmenciak A.: Occurrence of Ixodes ricinus in different types of forest habitats of the city of Poznan and their infection rate with Borrelia burgdorferi sensu lato. Wiad Parazytol, 1998, 44, 3, 388. 14. Petko B., Siuda K., Stanko M., Tresova G., Karbowiak G., Fricova J.: Borrelia burgdorferi sensu lato in the Ixodes ricinus ticks in Southern Poland. Ann Agric Environ Med, 1997, 4, 263-269. 15. Stańczak J., Cieniuch S., Racewicz M., Kubica-Biernat B.: Występowanie, aktywność i zagrożenie atakami kleszczy Ixodes ricinus na rekreacyjnych terenach Trójmiasta i Pojezierza Kaszubskiego. [W:] Buczek A., Błaszak C.: Stawonogi. Znaczenie medyczne i gospodarcze, 2012, 63-79. 16. Štefančíková A. i wsp.: Some epidemiological and epizootiological aspects of Lyme borreliosis in Slovakia with the emphasis on the problems of serological diagnostics. Biologia, 2008, 63/6, 1135-1142. 17. Strzelczyk J.K. i wsp.: Prevalence of Borrelia burgdorferi sensu lato in Ixodes ricinus ticks collected from southern Poland. Acta Parasitol, 2015, 60, 666-74. 18. Choroby zakaźne i zatrucia w Polsce 1998-2016 [www.pzh. gov.pl/oldpage/epimeld/index_p.html, DOI: 18.03.2018]. 19. Raczkiewicz A., Tłustochowicz W.: Borelioza (choroba z Lyme). Medycyna po Dyplomie, 2013, 11. 20. Wilske B. i wsp.: MIQ 12 Lymeborreliose. [W:] Qualitaetsstandards in der mikrobiologisch infektiologischen Diagnostik. Red. H. Mauch, R. Luetticken, Monachium 2000. 21. Charakterystyka testu firmy Euroimmun do zestawu Anti-Borrelia ELISA IgM EI2132-9601 M. Luebeck (Germany). 22. Charakterystyka testu firmy Euroimmun do zestawu Anti-Borrelia plus VlsE ELISA IgG EI2132-9601-2 G. Luebeck (Germany). 23. Instrukcja firmy IBL do zestawu Borrelia 14kDa+ OspC IgM ELISA RE57211. Hamburg (Germany). 24. Instrukcja firmy IBL do zestawu Borrelia + VlsE IgG ELISA RE57201. Hamburg (Germany). 25. Instrukcja firmy Mikrogen do zestawu IgM 4205. Neuried (Germany). 26. Instrukcja firmy Mikrogen do zestawu IgG 4204. Neuried (Germany). 27. Instrukcja firmy Oxoid do zestawu IDEIA Borrelia burgdorferi IgM K603011-2. Hampshire (UK). 28. Instrukcja firmy Oxoid do zestawu IDEIA Borrelia burgdorferi IgG K602911-2. Hampshire (UK). 29. Instrukcja firmy Biotest do zestawu Anti-Borrelia rec. IgM ELISA 807 023. Dreieich (Germany) 30. Instrukcja firmy Biotest do zestawu Anti-Borrelia rec. IgG ELISA 807 024. Dreieich (Germany) 31. Instrukcja firmy Demeditec do zestawu Borrelia burgdorferi IgM ELISA DEBOR03. Kiel (Germany). 32. Instrukcja firmy Demeditec do zestawu Borrelia burgdorferi IgG ELISA DEBOR01. Kiel (Germany). 33. Instrukcja firmy BioMerieux do zestawu VIDAS Lyme IgM II (LYM) 416436. Marcy-l Etoile (France). 34. Instrukcja firmy BioMerieux do zestawu VIDAS Lyme IgG II (LYG) 417401. Marcy-l Etoile (France). 2/2018 13