Ziemniak Polski 2017 nr 1 25 SUCHA ZGNIILIIZNA BULW ZIIEMNIIAKA NIIEUSTAJĄCE ZAGROŻENIIE OKRESU PRZECHOWALNIICZEGO DRY ROTT OFF TTUBERS TTHE CONTTI INUING TTHREATT DURING TTHE STTORAGE PERIOD mgr inż. Anna Łozowska, dr inż. Jerzy Osowski, mgr inż. Hanna Gawińska-Urbanowicz IHAR-PIB Oddział w Boninie, e-mail: lozowska@ziemniak-bonin.pl Streszczenie Podczas przechowywania niezwykle ważne jest stworzenie optymalnych warunków wilgotnościowo- -termicznych, dostosowanych do kierunku przeznaczenia ziemniaków (jadalne, sadzeniaki, przetwórstwo). W celu ograniczenia strat finansowych konieczne jest minimalizowanie ubytków naturalnych oraz ograniczanie uszkodzeń mechanicznych wynikających z błędów popełnionych podczas zbioru i przygotowania bulw do przechowywania, a także zmniejszanie strat na skutek rozwoju chorób okresu przechowalniczego. Sprawcami suchej zgnilizny bulw są grzyby z rodzaju Fusarium, m.in.: F. avenaceum, F. sambucinum i F. solani. Podczas przechowywania bulwy są często infekowane jednocześnie przez kilku sprawców i powstają tzw. zgnilizny mieszane. Wraz z Fusarium są to bakterie z rodzaju Pectobacterium oraz organizm grzybopodobny Phytophthora infestans sprawca zarazy ziemniaka. Do wczesnego wykrywania patogenów stosuje się obecnie nowoczesne metody molekularne, oparte głównie na technice PCR, które znajdują zastosowanie również w diagnostyce chorób powodowanych przez grzyby z rodzaju Fusarium. Słowa kluczowe: identyfikacja patogenów, ochrona, przechowywanie, ziemniak Abstract During the period of storage it is extremely important to create optimal temperature and humidity conditions adapted to the purpose of tubers (edible seed, processing). In order to limit the financial losses, it is important to avoid natural losses (due to respiration or evaporation tubers), mechanical damage resulting from errors made during harvesting and preparing the tubers for storage, as well as losses caused by the development of diseases during the storage (tuber skin rot diseases). One of the diseases presenting a serious threat during this period is the dry rot of potato tubers, whose culprits are fungi of the genus Fusarium F. avenaceum, F. sambucinum or F. solani. Sometimes it happens that during the period of storage, tubers are infected simultaneously by multiple pathogens, causing the formation of the so-called mixed rots. Along with fungi of the genus Fusarium, the most common cause of mixed rots are bacteria of the genus Pectobacterium, and fungi-like organism Phytophthora infestans potato late blight culprit. Proper diagnosis of pathogens is important for reduction of the loses caused by their development. Currently, for early detection of pathogens, including fungi of the genus Fusarium, modern molecular methods are used, mainly based on PCR. Keywords: dry rot, Fusarium, PCR, potato, protection, spores, storage O kres przechowywania ziemniaków jest ściśle uzależniony od ich przeznaczenia i wynosi zazwyczaj od 6 do 9-10 miesięcy. Aby możliwe było tak długie przechowywanie, należy odpowiednio przygotować bulwy. Wymaga to stworzenia takich warunków, dzięki którym straty masy bulw będą znacznie ograniczone, a ich jakość pozostanie nadal na wysokim poziomie, co zapewni późniejsze wykorzystanie zgodnie z przeznaczeniem na konsumpcję lub sadzeniaki (Osowski 2016). Okres przygotowania bulw do składowania i składowanie można podzielić na kilka etapów (dla wszystkich kierunków użytkowania ziemniaków): osuszanie od 1 do 7 dni, w temperaturze 12-18 o C, przy wilgotności powietrza 75- -95% i średnim czasie wentylacji 10-24 h/dobę;
26 Ziemniak Polski 2017 nr 1 dojrzewanie od 10 do 15 dni, w temperaturze 12-18 o C, przy wilgotności powietrza 90-95% i średnim czasie wentylacji 1-4 h/dobę; schładzanie od 15 do 20 dni, w temperaturze obniżanej 0,3 o C na dobę, przy wilgotności powietrza 90-95% i średnim czasie wentylacji 6-10 h/dobę; długotrwałe przechowywanie do ok. 250 dni, w temperaturze: dla sadzeniaków 3-4 o C, ziemniaków jadalnych 4-5 o C, przeznaczonych do przetwórstwa spożywczego 6-9 o C, dla przemysłu 3-4 o C; wilgotność powietrza powinna wynosić 90-95%, średni czas wentylacji 2-6 h/dobę; przygotowanie do użytkowania średnio 10 dni, w temperaturze 10-12 o C dla ziemniaków przeznaczonych do konsumpcji i przetwórstwa oraz 12-15 o C dla sadzeniaków, przy średnim czasie wentylacji 1-4 h/dobę (Czerko 2014). Ubytki masy bulw podczas przechowywania w dużym stopniu powstają wskutek odparowywania wody oraz oddychania, jednak główną przyczyną strat są choroby wywołane różnymi patogenami, jak grzyby, bakterie czy organizm grzybopodobny Phytophthora infestans, wywołujący zarazę ziemniaka. Jedną z ważniejszych chorób tego okresu jest sucha zgnilizna bulw ziemniaka (Osowski 2016). Objawy i przebieg choroby Zakażenie bulw następuje najczęściej w wyniku uszkodzeń mechanicznych powstających w czasie zbioru, transportu i sortowania. Stąd też intensywna (wysokotowarowa) uprawa może sprzyjać suchemu gniciu bulw, które szczególnie silnie rozwija się podczas przechowywania. Podwyższona temperatura (ok. 10 o C) i wysoka wilgotność, panujące wiosną (w końcowym okresie przechowywania), zaostrzają przebieg choroby, prowadząc często do dużych ubytków bulw osłabionych przez okres spoczynku (Wale i in. 2008). Pierwsze objawy to ciemne zagłębienia na powierzchni bulw. W miarę rozwoju choroby skórka się marszczy i tworzą się koncentryczne pierścienie. Uszkodzona tkanka ulega mumifikacji, a w końcowym efekcie wysycha. Często tym objawom zewnętrznym towarzyszy tworzenie się na powierzchni skórki poduszeczek grzybni o różnym zabarwieniu (zależnie od gatunku sprawcy), co stanowi istotny element diagnostyczny w identyfikacji patogenów (fot. 1 i 2). Zainfekowany miąższ w miarę rozwoju choroby zmienia zabarwienie od jasnobeżowego do czekoladowobrązowego, niekiedy nawet do czarnego. Martwa tkanka stopniowo wysycha, a w jej wnętrzu tworzą się różnego kształtu i wielkości kawerny, które bardzo często wyścielone są silnie zarodnikującą grzybnią, barwy od żółtej do białej lub różowej (Wharton i in. 2007). Chore bulwy oraz obecne w nich zarodniki konidalne i grzybnia Fusarium stają się źródłem infekcji dla innych przechowywanych bulw, a pozostawione na polu resztki zakażają glebę (Sobkowiak, Śliwka 2013). Fot. 1. Typowe objawy suchej zgnilizny na powierzchni bulwy ziemniaka (fot. J. Osowski) Fot. 2. Poduszki grzybni grzybów z rodzaju Fusarium na skórce (fot. A. Łozowska)
Ziemniak Polski 2017 nr 1 27 Patogeny odpowiedzialne za rozwój choroby Po raz pierwszy rodzaj Fusarium został wprowadzony do literatury światowej w roku 1809 przez Linka. Polska nazwa tego rodzaju sierpik pochodzi od bardzo charakterystycznego kształtu zarodników konidialnych, który przypomina sierp. Rozprzestrzenianiu się Fusarium sprzyjają opady deszczu i ruch powietrza, dzięki którym zarodniki mogą być przenoszone na duże odległości. Zakażeniu bardzo często sprzyja mechaniczne uszkodzenie tkanki. Grzyby z tego rodzaju wywołują wiele chorób, takich jak: więdnięcie, plamistości liści, zgorzel siewek czy zgnilizna części podziemnych roślin (Kwaśna i in. 1991). Grzyby z rodzaju Fusarium są zdolne do tworzenia stadium doskonałego, które rozmnaża się płciowo, a także form rozmnażających się bezpłciowo, które występują znacznie częściej. Grzybnia składa się z obficie występujących strzępek, o watowatej lub śluzowatej strukturze. Barwa strzępek należy do cech gatunkowych warunkowanych zasobnością w składniki pokarmowe (głównie cukrów) podłoża, w którym następuje ich rozwój. Sprawcy wytwarzają trzy typy zarodników: makrokonidia wielokomórkowe, o sierpowatym kształcie; mikrokonidia 1-3-komórkowe, owalne, cytrynkowate lub wydłużone; chlamidospory stanowiące formy przetrwalnikowe wytworzone z komórek grzybni w okresach niekorzystnych dla wzrostu grzyba. Grzyby z rodzaju Fusarium występują powszechnie w glebie jako saprotrofy żywiące się martwą materią organiczną. Charakteryzują się zdolnością do zmiany metabolizmu oraz szybkiego dostosowywania się do podłoża, na którym żyją. Pozwala im to na bardzo szybkie porażanie wielu gatunków roślin uprawnych. Zalicza się je do organizmów ubikwistycznych, tzn. takich, które łatwo przystosowują się do zmiennych warunków atmosferyczno-glebowych (Wolny- Koładka 2014). Głównymi sprawcami suchej zgnilizny bulw ziemniaka na świecie są trzy gatunki Fusarium: F. coeruleum (Libert) Sacc. (syn. F. solani var. coeruleum), F. sulphureum Schlechtend. (syn. F. sambucinum Fuckel), F. avenaceum (Fr.) Sacc. (Sobkowiak, Śliwka 2013). Fusarium avenaceum uznawany jest powszechnie za słabszy patogen w porównaniu z innymi gatunkami tego rodzaju. Jego rozwojowi sprzyjają umiarkowane warunki termiczne (od 10 do 25 o C) oraz okresy wilgotne podczas wegetacji. Kultury Fusarium avenaceum charakteryzują się dużą zmiennością morfologiczną. Grzybnia najczęściej jest bardzo puszysta, gęsta i watowata. Dominują kolory od białego przez łososiowy do koralowego. W miarę upływu czasu grzybnia staje się filcowata, zapada się do środka, a jej barwa zmienia się w ciemnoszarą lub żółtobrązową. Gatunek ten tworzy zróżnicowane zarodniki, zarówno mikro-, jak i makrokonidia. Mikrokonidia powstają dość rzadko i tylko u niektórych szczepów. Makrokonidia są zazwyczaj proste, wrzecionowate lub sierpowate (Pieczul i in. 2012). Fusarium sambucinum jest gatunkiem uznawanym za silnie patogeniczny. Jego grzybnia jest obfita, wełnista. Przybiera barwy od białej aż do różowej lub czerwonobrązowej. Wygląd całej kultury w dużej mierze uzależniony jest od ph podłoża. Makrokonidia widoczne są pod mikroskopem jako krótkie, grube, o wyraźnie zaznaczonych przegrodach i grubej ścianie (Kurzawińska 2012). Fusarium solani uznawany jest za sprawcę zgorzeli podstawy łodyg i korzeni. Tworzy on długie komórki konidiotwórcze. Trudności w dokładnej identyfikacji gatunków z rodzaju Fusarium są spowodowane dużą zmiennością wyglądu kultur, zdolnością wytwarzania różnego rodzaju zarodników oraz dużą liczbą opisanych gatunków (Marcinkowska 2003). Występowanie zgnilizn mieszanych Podczas przechowywania bulw bardzo często dochodzi do ich zakażenia więcej niż jednym patogenem. Infekcja mieszana znacznie przyspiesza powstawanie dużych strat plonu (Czerko 2015). Składowanie dużej ilości ziemniaków w niesprzyjających warunkach może prowadzić do masowego gnicia. Wraz z grzybami z rodzaju Fusarium najczęstszymi sprawcami mieszanych zgnilizn są bakterie należące do rodzaju Pectobacterium oraz Phytophthora infestans (Bernat 2012). Obecność kilku patogenów może
28 Ziemniak Polski 2017 nr 1 utrudnić właściwe zdiagnozowanie suchej zgnilizny. W warunkach wysokiej wilgotności powietrza, lub w przypadku gdy bulwy są mokre, tkankę porażoną przez patogeny suchej zgnilizny zasiedlają często również bakterie wywołujące mokra zgniliznę (Wharton i in. 2007) fot. 3. Fot. 3. Bulwa porażona przez patogeny suchej i mokrej zgnilizny (fot. A. Łozowska) Czynniki sprzyjające rozwojowi suchej zgnilizny Grzyby z rodzaju Fusarium atakują bulwy najczęściej jesienią, w okresie zbiorów, kiedy skórka nie jest jeszcze całkowicie dojrzała. Infekcjom sprzyja również zbiór przy wysokiej wilgotności powietrza oraz w temperaturze niższej niż 10 o C. Podczas przechowywania czynnikami sprzyjającymi rozprzestrzenianiu się grzybów z rodzaju Fusarium są: temperatura powyżej 3 o C, duża koncentracja dwutlenku węgla, uszkodzenia mechaniczne oraz brak odpowiedniego przygotowania do przechowywania (Osowski 2016). Innym czynnikiem sprzyjającym rozwojowi suchej zgnilizny jest zastosowanie w przechowalni intensywnej wentylacji w niskiej temperaturze (Czerko 2010). Ograniczanie rozwoju choroby Bardzo duży wpływ na rozwój suchej zgnilizny w przechowalni mają warunki termiczno- -wilgotnościowe. Niska temperatura (4-6 o C) może ograniczyć jej rozwój. Istnieją jednak również przypadki, gdy pomimo niskiej temperatury porażenie wzrasta. Może to być spowodowane zwiększaniem się zawartości cukru w bulwach. Rozwój choroby można zahamować, ograniczając intensywną wentylację w przypadku gdy w przechowalni utrzymywana jest niska temperatura. Niezbędna jest ciągła obserwacja stanu składowanych bulw i odpowiednie korekty w technologii przechowywania (Czerko 2010). Wiosną i w okresie wegetacji do ważnych czynników ograniczających możliwość infekcji bulw jest uprawa ziemniaków na tym samym polu po 3-5-letniej przerwie, w szerokich międzyrzędziach (75 cm i powyżej). Bardzo ważna jest ochrona, dostosowana do stanu zachwaszczenia, tempa rozwoju chorób oraz potrzeb odmiany lub kierunku uprawy. Nawożenie mineralne i wapnowanie powinno być dostosowane do potrzeb odmiany lub jej przeznaczenia (Wale i in. 2008). Przed złożeniem do długotrwałego przechowywania niezbędne jest odparowanie nadmiaru wilgoci oraz zabliźnienie ran i uszkodzeń mechanicznych, a w wypadku bulw przeznaczonych na sadzeniaki dodatkowo wskazane jest ich zaprawienie środkami grzybobójczymi (Bernat 2012). Nowoczesne metody diagnostyczne identyfikacji grzybów z rodzaju Fusarium W dużej części przypadków rozpoznanie sprawców choroby na podstawie objawów na roślinie jest niemożliwe, np. ze względu na stan materiału roślinnego lub wtórne infekcje spowodowane przez innych sprawców. Rozwiązaniem, które pozwala na identyfikację sprawców, są badania laboratoryjne. Duża część grzybów występujących na ziemniaku nadaje się do badań laboratoryjnych bez specjalnego ich przygotowania (Kiraly i in. 1977). Stopień porażenia bulw przez sprawców zgnilizn można ocenić po zbiorze na próbach wielkości ok. 10 kg pobieranych z każdego poletka podczas zbioru. Ocenę można wykonywać zarówno jesienią po zbiorach, jak i wiosną po okresie przechowywania (Gawińska-Urbanowicz 2007). Najnowocześniejsze metody stosowane obecnie w celu wykrycia i identyfikacji patogenów ziemniaka oparte są na technice PCR. Zalicza się je do metod molekularnych, które cieszą się popularnością głównie ze względu na dużą czułość i znaczne skrócenie procedury badawczej. Metoda PCR jest oparta na łańcuchowej reakcji termostabilnego enzymu, jakim jest polimeraza. Doprowadza się do powielenia, czyli amplifikacji fragmentu genomu, który pochodzi z poszu-
Ziemniak Polski 2017 nr 1 29 kiwanego organizmu. W wyniku amplifikacji uzyskuje się miliardy kopii fragmentu genomu, który jest badany. W teście PCR analizuje się, a także wykorzystuje określone sekwencje kwasów nukleinowych (Chołuj, Przewodowski 2014). Metodę PCR z biegiem czasu zaczęto ulepszać w celu uzyskania jak najwyższej czułości, a także eliminacji błędnych wyników. Powstało wiele nowych wariantów testu. Ograniczeniami wszystkich wymienionych wcześniej metod opartych na technice PCR mogą stać się inhibitory polimerazy DNA czy zanieczyszczenie obcym, obecnym w laboratorium DNA (Przewodowski, Przewodowska 2012). Do najczęściej wykorzystywanych metod molekularnych służących wykrywaniu, identyfikacji oraz klasyfikacji patogenów należących do rodzaju Fusarium zaliczamy techniki: SCAR, RT-PCR, Real-Time PCR. Metoda SCAR polega na powielaniu ściśle zdefiniowanego obszaru genomu za pomocą pary starterów. Startery te mogą być uzyskane z badań metodą RAPD. Ich długość to 17-24 nukleotydy. Analizę SCAR stosuje się jako analizę porównawczą genomów organizmów do weryfikowania lub ustalania przynależności gatunkowej izolatów, które podlegały badaniom. Metoda RT-PCR (Reverse-transcription PCR) pozwala badaczom stwierdzić, czy określony grzyb wykazuje aktywność w produkcji mykotoksyn. Wykorzystuje się tu odwrotną transkryptazę, enzym służący do przemiany RNA w cdna, przez amplifikację PCR. Real-Time PCR to technika, która umożliwia w czasie analizy pomiar powstających produktów automatycznie, po każdym cyklu reakcji, za pomocą specjalnych sond DNA (Suchorzyńska, Misiewicz 2009). Mykotoksyny fuzaryjne Grzyby z rodzaju Fusarium stanowią najczęściej izolowaną grupę patogenów z roślin uprawianych na świecie. Wykazują zdolność do syntezy bardzo niebezpiecznych i wysoce toksycznych związków, tzw. mykotoksyn fuzaryjnych. Wykrywane w środowisku naturalnym różne klasy mykotoksyn fuzaryjnych to: zearalenon, trichoteceny, fumonizyny, moniliforminy oraz bowerycyny. Uważa się, że do najbardziej toksynotwórczych gatunków należą F. culmorum i F. graminearum. Mykotoksyny wywołują zaburzenia w procesach mitozy oraz metabolizmie białkowym u roślin. Występowanie ich w strefie korzeniowej może powodować zmiany w pobieraniu oraz rozmieszczaniu składników pokarmowych w roślinach. Mykotoksyny fuzaryjne mogą kumulować się w komórkach roślinnych, które zostały zainfekowane, i w ten sposób przedostawać się do łańcucha pokarmowego ludzi i zwierząt. Udowodniono, że mykotoksyny mogą być wytwarzane w trudnych warunkach dla wzrostu grzyba. Stosowanie środków grzybobójczych może nie wpływać hamująco na wytwarzanie mykotoksyn, możliwe jest nawet spowodowanie odwrotnego efektu. Zastosowanie fungicydów poddaje grzyby nadmiernemu szokowi, co może skutkować większą produkcją mykotoksyn (Suchorzyńska, Misiewicz 2009). Literatura 1. Bernat E. 2012. Występowanie chorób przechowalniczych ziemniaka i ograniczanie ich rozwoju. Ziemn. Pol. 3: 39-42; 2. Chołuj J., Przewodowski W. 2014. Technika PCR i jej modyfikacje w identyfikacji patogenów ziemniaka. Ziemn. Pol. 3: 40-45; 3. Czerko Z. 2010. Straty ilościowe ziemniaków podczas przechowywania w różnych warunkach termiczno-wilgotnościowych. Ziemn. Pol. 3: 1-6; 4. Czerko Z. 2014. Wentylacja na każdym etapie przechowywania ziemniaków. Ziemn. Pol. 3: 50-57; 5. Czerko Z. 2015. Jak przechowywać ziemniaki, stosując integrowaną ochronę roślin. Ziemn. Pol. 1: 24-30; 6. Gawińska-Urbanowicz H. 2007. Ocena występowania chorób grzybowych i bakteryjnych ziemniaka w warunkach polowych. Biul. IHAR 243: 191-197; 7. Kiraly Z., Klement Z., Solymosy F., Voros J. 1977. Fitopatologia. Wybór metod badawczych. PWRiL Warszawa: 257- -269; 8. Kurzawińska H. 2012. Fusarium sambucinum. [W:] Kompedium symptomów chorób roślin i morfologii ich sprawców. Red. Rataj-Guranowska M., Pukacka A. Bogucki Wyd. Nauk. Poznań: 103-106; 9. Kwaśna H., Chełkowski J., Zajkowski P. 1991. Sierpik (Fusarium). [W:] Flora Polska Rośliny Zarodnikowe Polski i Ziem Ościennych. Grzyby (Mycota). T. XXII Wyd. Inst. Bot. PAN/PWN Warszawa-Kraków: 137 s.; 10. Marcinkowska J. 2003. Oznaczanie rodzajów grzybów ważnych w patologii roślin. Fundacja Rozwój SGGW Warszawa; 11. Osowski J. 2016. Choroby przechowalnicze ziemniaka. Ziemn. Pol. 1: 30-34; 12. Pieczul K., Łukaszewska-Skrzypniak N.,
30 Ziemniak Polski 2017 nr 1 Stępniewska-Jarosz S. 2012. Fusarium avenaceum (Corda ex Fr.) Sacc. [W:] Kompedium symptomów chorób roślin i morfologii ich sprawców. Red. Rataj- Guranowska M., Pukacka A. Bogucki Wyd. Nauk. Poznań: 71-75; 13. Przewodowski W., Przewodowska A. 2012. Wykorzystanie biochemicznych i molekularnych metod w diagnostyce patogenów oraz identyfikacji jednorodności odmianowej ziemniaka. [W:] Produkcja i rynek ziemniaka. Red. nauk. J. Chotkowski. Wyd. Wieś Jutra Warszawa: 57-66; 14. Sobkowiak S., Śliwka J. 2013. Grzyby z rodzaju Fusarium powodujące suchą zgniliznę bulw ziemniaka. Ziemn. Pol. 4: 18-24; 15. Suchorzyńska M., Misiewicz A. 2009. Mikotoksynotwórcze grzyby fitopatogeniczne z rodzaju Fusarium i ich wykrywanie technikami PCR. Post. Mikrobiol. 48. 3: 221-230; 16. Wale S., Platt H. W., Cattlin N. 2008. Fusarium dry rot/wilt. Diseases, Pests and Disorders of Potatoes. A colour handbook. Manson Publ. London: 36-39; 17. Wharton P., Hammerschmidt R., Kirk W. 2007. Fusarium dry rot. http://www.potatodiseases.org/pdf/fusa rium dry rot bulletin.pdf; 18. Wolny-Koładka K. 2014. Grzyby z rodzaju Fusarium występowanie, charakterystyka i znaczenie w środowisku. Kosmos. Probl. Nauk Biol. 63, 4: 623-633