Planowanie procedur i doświadczeń Zasady (prawo, praktyka i etyka)

Planowanie procedur i doświadczeń Zasady (prawo, praktyka i etyka) Część I Stefan Kasicki s.kasicki@nencki.gov.pl 2018 Planowanie procedur Po co? By sformułować hipotezę, którą chcemy odrzucić lub potwierdzić, By wiedzieć, co i jak będziemy robić, gdy chcemy rozwiązać problem naukowy, By zapewnić wiarygodność (w tym powtarzalność) uzyskanych wyników. Dlaczego? Bo tego wymaga wypełnienie aplikacji o finansowanie (wniosek grantowy), Bo tego wymaga wypełnienie wniosku do lke o zgodę 2 na wykorzystanie zwierząt w procedurach. Wnioski do lke (NOWE) Dokumenty wymagane do ubiegania się o zgodę na przeprowadzenie doświadczenia (od 1 lutego 2018 r.): Wzór wniosku o udzielenie zgody na przeprowadzenie doświadczenia + Instrukcja wypełnienia; Wzór uproszczonego wniosku o udzielenie zgody na przeprowadzenie doświadczenia + Instrukcja wypełnienia; Wzór wniosku o wydanie zgody na włączenie dodatkowych osób; Wzór wniosku uzupełniającego + Zał. A do wniosku uzupełniającego (dodatkowe zwierzęta), Zał. B do wniosku uzupełniającego (dodatkowe procedury). Źródło http://www.bip.nauka.gov.pl/dokumenty-wymagane-doubiegania-sie-o-zgode-na-przeprowadzenie-doswiadczenia/ 3

Podstawowe informacje Planowanie procedur i doświadczeń (prawo, praktyka i etyka). Elementy, które należy uwzględnić przy planowaniu: Cele doświadczenia (naukowe lub edukacyjne, dopuszczone prawem), Dobór właściwego gatunku zwierząt przy uwzględnieniu celu doświadczenia i zasada zastąpienia, metody alternatywne, Metodyka, czyli czynności (procedury), zapewniające jak najmniejszą zmienność wyników i uwzględniające zasadę 3R, Metodyka, czyli środki farmakologiczne, odczynniki itp., Analiza statystyczna wyników, Określenie minimalnej liczby zwierząt zapewniającej realizację celu, Określenie kategorii dotkliwości, Miejsce realizacji i współpracownicy. Nietechniczne streszczenie (jasny opis doświadczenia), Ocena retrospektywna doświadczenia (sposób gromadzenia 4 zawczasu, w trakcie wykonywania procedur, informacji dla lke). Powtarzalność/wiarygodność wyników (doświadczenie <> analiza statystyczna) Silberzahn, R., Uhlmann, E.L. 2015. Many hands make tight work. Nature, 526: 189-191. 20 9 5 Próba: 1576 badaczy Powtarzalność wyników www.nature.com/news/reproducibility-1.17552 6 M. Baker. 2016. Is there a reproducibility crisis? Nature, 533: 452-454

Powtarzalność wyników Brak powtarzalności wyników kosztuje Osoby planujące procedury (art. 21) Wykształcenie + Dodatkowo Ścieżka I II III Doktorat (biologia, farmacja, medycyna, weterynaria lub rolnictwo) Doktorat (dziedziny inne niż dla ścieżki I) Dyplom ukończenia studiów wyższych (biologia, farmacja, medycyna, weterynaria lub rolnictwo) Szkolenie w zakresie przeprowadzania doświadczeń na zwierzętach Tak Tak Nie Tak Nie Studia podyplomowe w zakresie przeprowadzania doświadczeń na zwierzętach Nie Nie Tak Nie Tak 7 M. Baker. 2016. Is there a reproducibility crisis? Nature, 533: 452-454 Freedman et al. The Economics of Reproducibility in Preclinical Research. PLOS Biology DOI:10.1371/journal.pbio.1002165 June 9, 2015 8 Staż pracy umożliwiający uzyskanie praktycznych umiejętności 3 lata 4 lata 4 lata 9

Osoby mogące wziąć udział w doświadczeniu Ustawa (art. 21) określa kategorie i kwalifikacje osób, które mogą brać udział w realizacji doświadczenia i jakie mogą sprawować funkcje: Osoby planujące procedury i doświadczenie oraz odpowiedzialne za ich przeprowadzenie, Osoby wykonujące procedury, Osoby uczestniczące w wykonywaniu procedur, Osoby uśmiercające zwierzęta wykorzystywane w procedurach. W związku z tym należy upewnić się, czy osoby planowane do udziału w wykonywaniu procedur i uśmiercania zwierząt spełniają wymogi formalne przed wpisaniem ich do wniosku do lke. 10 Strony doświadczenia Zwierzę Prawo Wynik Etyka Człowiek, czyli eksperymentator 11 Zwierzę jako aparatura pomiarowa Doświadczenie wymaga zastosowania odpowiedniej aparatury pomiarowej. Z punktu widzenia eksperymentatora zwierzę doświadczalne jest takim, wyjątkowo skomplikowanym i delikatnym, przyrządem pomiarowym. Dlaczego wyjątkowym? Bo CZUJE i się ZMIENIA! Aparat ten NIE jest kalibrowany, nie ma też bezpiecznika Każdy pomiar tego samego wskaźnika różni się między pojedynczymi przyrządami - zwierzętami 12

Podatność na ból tkanek i narządów Oczy, uszy, zęby +++ Nerwy +++ Narządy rozrodcze +++ Rdzeń kręgowy ++ do +++ Skóra ++ do +++ Okostna ++ do +++ Naczynia krwionośne ++ do +++ Wnętrzności + do +++ Mięśnie + do ++ Stawy i kości + do ++ Tkanka nerwowa -- Mózg jako umysł (stres i dystres) +++ 13 czas Zasada 3 R w prawie (art. 5.1. ustawy) Art. 5. 1. Wykonywanie procedur jest dopuszczalne tylko wtedy, gdy: 1) nie można zastosować metody badawczej zapewniającej osiągnięcie celów określonych w ustawie bez wykorzystania zwierząt (zasada zastąpienia); 2) liczba wykorzystywanych w nich zwierząt została ograniczona do poziomu niezbędnego do osiągnięcia celów określonych w ustawie (zasada ograniczenia); 3) wykorzystywane zwierzęta są utrzymywane w warunkach odpowiednich dla ich gatunku, a metody badawcze zastosowane w procedurach zostały wybrane tak, aby ograniczały do minimum albo eliminowały ból, cierpienie, dystres lub możliwość trwałego uszkodzenia organizmu tych zwierząt (zasada udoskonalenia). 2. Niedopuszczalne jest wykonanie procedury jeżeli wiąże się ona z dotkliwym bólem, cierpieniem lub dystresem, który może mieć długotrwały charakter i nie można go załagodzić. 14 Uchwała KKE 14/2017 Wprowadza się do wniosku oświadczenie dotyczące maksymalnej realizacji zasad zastąpienia, ograniczenia i udoskonalenia (3R) w przypadku projektów o charakterze naukowym. Należy przez to rozumieć bieżącą aktualizację wiedzy w ww. zakresie oraz wprowadzanie nowo pojawiających się metod, środków, udogodnień etc. także do trwających już doświadczeń. Jednocześnie modyfikacja projektu powinna nastąpić w sposób wykluczający zniweczenie jego efektów naukowych. Dotyczy to w szczególności przypadków, gdy wiązałoby się to z nieuzyskaniem wyników, do których osiągnięcia zmierzano wykonując procedury z wykorzystaniem zwierząt. Należy rozważyć, czy modyfikacja nie powinna być przedmiotem wniosku do właściwej komisji etycznej o wyrażenie zgody na wprowadzenie do projektu zmian wynikających z planowanej modyfikacji. 15

Zasada 3 R (3Rs principle) Zasada 3R jest swego rodzaju bezpiecznikiem mającym chronić zwierzę przed nadmiernym obciążeniem wykonywaną na nim procedurą. Zasada 3R powinna być używana nie tylko jako etyczny drogowskaz przy planowanie procedur doświadczalnych. Jej stosowanie jest wymagane obecnie prawem. Stosowanie zasady 3R przy planowaniu procedur ma pomóc eksperymentatorowi w wybraniu procedury najlepszej z punktu widzenia ochrony zwierząt przed bólem i cierpieniem. Często też daje praktyczne korzyści samemu eksperymentatorowi. 16 Planowanie doświadczenia Obecny stan wiedzy (przegląd piśmiennictwa naukowego); Wykorzystanie właściwej metodyki naukowej: obserwacja i opis zjawiska naukowego, sformułowanie problemu i hipotezy, wykorzystanie hipotezy dla przewidzenia wyników doświadczenia, wykorzystanie naukowych metod i procedur w celu zweryfikowania hipotezy (analiza statystyczna); Dobór odpowiedniego modelu zwierzęcego (albo rezygnacja): wykorzystanie zwierząt o jak najniższym (ale umożliwiającym rozwiązanie problemu) rozwoju aspekt etyczny, ale i praktyczny, uwzględnienie kosztu zakupu i utrzymania zwierząt przez okres doświadczenia (źródła zwierząt), konsultacja z kierownikiem zwierzętarni przed zakupem zwierząt. Ustalenie ewentualnych współpracowników (uprawnienia). 17 Planowanie doświadczenia (procedur) Planowanie ma na celu uzyskanie odpowiedzi na zadane pytanie (weryfikacja hipotezy) w sposób pewny (istotność statystyczna). Zapewnia to, m. in.: używanie aparatury, środków farmakologicznych, odczynników itd. umożliwiających uzyskanie wiarygodnych wyników, wykorzystanie właściwej (niezbędnej, ale minimalnej) liczby wystandaryzowanych zwierząt odpowiedniego dla realizacji celu gatunku. Ale jest jeszcze warunek etyczno-prawny minimalizacja dotkliwości procedur (zasada 3R). Nie jest on w swojej idei sprzeczny z celami merytorycznymi, choć uniemożliwia wykonanie pewnych procedur (dotkliwość przekraczająca dozwolony poziom). 18

Zmienność a powtarzalność wyników Zmienność środowiska: patogeny, cykl dobowy, karma, temperatura, wyściółka, partnerzy, wzbogacenie środowiska itp. Różnice genetyczne Zmienność zwierząt Zmienność w wynikach doświadczenia Zmienność czynników doświadczalnych, np. stres, dystres, sposób traktowania zwierzęcia, środki farmakologiczne, Problem zdarzeń losowych Zmienność w procedurach doświadczalnych 19 Minimalizacja zmienności (σ) - zwierzęta Szczepy jednorodne genetycznie (hodowle wsobne, inbred) - zwłaszcza szczury i myszy, Zwierzęta typu SPF (specified pathogen free). Infekcje subkliniczne (niewykryte) dramatycznie zwiększają zmienność reakcji zwierząt, Stabilna pasza i środowisko odpowiednie dla danego gatunku i stanu zwierzęcia (temperatura, wilgotność, oświetlenie, cykl dzień-noc, wyściółka klatek), Jednorodność grupy (wiek, masa ciała, płeć). Unikać zwierząt odbiegających od średniej, Zapewnić zwierzętom czas na aklimatyzację do nowych warunków po ich dostarczeniu czy przeniesieniu z lokalnej hodowli (również przy badaniu tkanek/narządów). 20 Minimalizacja zmienności (σ) - zwierzęta Doświadczenia chroniczne - szczególne wymogi: ta sama osoba przez cały czas eksperymentu, właściwe podejście do zwierząt, zachowanie reżimu czasowego i procedur, oznakowanie klatek, zwierząt, niepomylenie zwierząt, przestrzeganie zaleceń eksperymentatora, zgłaszanie wszelkich odchyleń od norm (cykl świetlny, hałasy w otoczeniu itp.), czyli maksymalna współpraca z personelem zwierzętarni. Personel zwierzętarni jest równie ważny jak wykonawcy doświadczeń. Dokładność i sumienność jest tym ważniejsza, że eksperymentatorzy nie kontrolują w ciągły sposób postępowania osób opiekujących się zwierzętami. 21

Doświadczenia na zwierzętach W doświadczeniach na zwierzętach jesteśmy w stanie / staramy się standaryzować (stabilizować) większość czynników powodujących zmienność zwierząt i ich odpowiedzi na stosowane procedury: środowisko (kontrolowane warunki) czynniki wywołujące choroby (SPF) czynniki genetyczne (szczepy wsobne) pasza itd. Dlatego możemy wykorzystywać względnie małe liczby zwierząt. ALE ma to konsekwencje, nie ma możliwości wykrycia różnic małych lub rzadkich. Problem, gdy zależy nam na zbadaniu właśnie takich różnic. 22 Wpływ aparatury i używanych środków Czy czułość (dokładność) aparatury pozwala na wykrycie oczekiwanych zmian/efektów? Czy używane przyrządy mierzą tak samo? Czy środki farmakologiczne działają tak samo (producent, seria)? Czy odczynniki są takie same? Czy częstość próbkowania/pomiarów jest właściwa dla wykrycia oczekiwanych różnic/zmian? Badany czynnik czas Badany czynnik czas 23 Wpływ eksperymentatora (koń Hans i jego właściciel - von Osten, 1909 r.) Ludzki mózg jest skłonny do widzenia/znajdowania tego, co chce widzieć/znaleźć. Jest to kluczowy problem w badaniach naukowych. Ustanowienie solidnych metod dla unikania takiego obciążenia uczyni wyniki bardziej powtarzalnymi. http://www.nature.com/news/reproducibility-1.17552 24

Wpływ eksperymentatora (koń Hans i jego właściciel - von Osten, 1909 r.) 25 Badania psychologa Pfungsta pokazały, że mądrość konia polegała na tym, iż jego odpowiedzi były uwarunkowane na nieznaczne ruchy głowy i oczu prowadzącego eksperyment, który w ten sposób nieświadomie wpływał na odpowiedzi (ruchy) zwierzęcia. Pfungst, O. (1911). Clever Hans (the horse of Mr. von Osten): A contribution to experimental, animal, and human psychology. New York: Holt, Rinehart and Winston. 26 Wpływ eksperymentatora Uzyskasz to, czego oczekujesz What You Expect Is What You Get Wpływ nastawienia eksperymentatora na wynik doświadczenia - efekt oczekiwań badacza (experimenter expectancy effect). Rosenthal pokazał, że nastawienie badacza może rzutować na wynik. Dwóm grupom studentów zlecił wykonać doświadczenia nad uczeniem się szczurów dobranych ze względu na łatwe lub trudne uczenie się drogi w labiryncie (tzn. mądrych lub głupich ). Wyniki były zgodne z oczekiwaniami, bo studenci nieświadomie inaczej traktowali szczury z obu grup. Rosenthal nazwał to zjawisko efektem Pigmaliona. Jak rozwiązać problem? Rosenthal R, Fode K. 1963. The effect of experimenter bias on the performance of the albino rat. Behav Sci, 8, 183-189. Rosenthal R, Lawson R. 1963. A longitudinal study of the effects of experimenter bias on the 27 operant learning of laboratory rats. J Psychiatr Res 1963; 2:61 72

Rozwiązanie: ślepe (zaślepione) doświadczenie (blind experiment) Nastawienie badacza może wpływać na: przebieg doświadczenia (badania behawioralne, ale nie tylko), akceptację lub odrzucanie wyników z dalszej analizy. Modyfikacje metod analizy. Rozwiązanie (?): Ślepy eksperyment - eksperymentator nie wie, z jaką próbką lub procedurą ma do czynienia. (W doświadczeniach na ludziach dochodzi problem osób badanych i ich oczekiwań - próby podwójnie ślepe). Przynajmniej 2 osoby oceniające, jeśli stosuje się skalę uznaniową. Jak często prowadzone są badania z wykorzystaniem metodyki ślepych procedur? R. Sheldrake. 1998. Experimenter effects in scientific research: how widely are they neglected? J Scientific Exploration, Vol. 12, No. 1, pp. 73-78. Analiza publikacji z okresu X.1996-II.1997. 28 Redukcja wpływu eksperymentatora Efekt oczekiwań eksperymentatora (np. efekt Rosenthala) jednakowe traktowanie wszystkich zwierząt, również kontrolnych; Właściwa analiza wyników (właściwe testy statystyczne) przyjęcie pewnych założeń przed rozpoczęciem analizy i niezmienianie ich, problem z radzeniem sobie ze zmiennością wyników, rzeźbieniem danych. 29 Plan badań: Projekt doświadczenia cele doświadczenia, opis procedur doświadczalnych mających na celu rozwiązanie problemu, w tym określenie: zmiennych doświadczalnych, mierzonych prarametrów dla uzyskania odpowiedzi, najlepszej metody ich pomiaru (próbki) i czasu trwania eksperymentu, hipotezy, sposób analizy danych (metody statystyczne), Jednostka doświadczalna (zwierzę, grupa zwierząt); Czynnik N - wielkość grupy, ze względu na metody statystyczne, ale również np. wielkość klatek (liczba zwierząt/klatkę); Grupy kontrolne. 30

Grupa kontrolna Zwierzę jest instrumentem niekalibrowalnym. Zastosowanie grupy zwierząt poprawia jakość (dokładność) pomiaru (wyniku). Grupa kontrolna pozwala ocenić / zmierzyć wpływ badanego czynnika, jeżeli pozostałe czynniki są identyczne (np. pasza, zmiany w środowisku zewnętrznym itp.). Prawdziwa grupa/grupy kontrolne - w tym samym czasie, co badanie właściwe. Grupy kontrolne mogą służyć rozmaitym celom. 31 Planowanie - grupy kontrolne Założenie ogólne (optymalne) - do każdego doświadczenia powinno się korzystać z grupy kontrolnej. Rodzaje grup kontrolnych: Kontrola pozytywna. Oczekuje się w nich zmian i służą jako standard, w stosunku do którego mierzy się różnice w nasileniu objawów u grupy doświadczalnej. Przykład: podawanie zwierzętom toksyn powodujących zmiany fizjologiczne lub uszkodzenia. Grupy doświadczalne otrzymują środek mający zapobiec tym zmianom bądź spowodować wyleczenie. Kontrola negatywna. Oczekuje się, że u zwierząt nie wystąpią żadne zmiany. Zapobiega wpływowi nieznanej zmiennej na przebieg doświadczenia, a więc wyciąganiu błędnie pozytywnych wniosków. Kontrola z pozorowaną ingerencją (sham control) - placebo, operacja. Kontrola nośnika (rozpuszczalnika). 32 Kontrola porównawcza, często pozytywna - badanie nowego leku. Planowanie randomizacja grup Randomizacja zwierząt przy przydzielaniu ich do różnych grup. Wpływ rodzaju populacji na wynik: homogenna, czyli zwierzęta mające takie same cechy charakterystyczne (np. płeć, masa ciała, stado, szczep), co daje mniejszą zmienność wyników, heterogenna, zwierzęta mogą mieć pewne cechy wspólne, ale nie są takie same. Sposoby randomizacji: przypisanie każdemu zwierzęciu numeru identyfikacyjnego, a następnie wyciąganie z kapelusza liczb i przydzielanie ich do poszczególnych grup, na przykład parzyste do grupy 1, nieparzyste do grupy 2. Korzystanie z tablic liczb losowych. 33

Planowanie kroki końcowe Wykonawcy doświadczenia - czy wszyscy mający brać udział w doświadczeniu spełniają formalne wymogi (wyznaczenia do wykonywania procedur lub do uczestniczenia w nich); Uzyskanie zgody na przeprowadzenie doświadczeń od lokalnej komisji etycznej, czyli przygotowanie wniosku o wydanie zgody na przeprowadzenie doświadczeń; Przeprowadzenie doświadczeń pilotażowych; Wykonanie doświadczeń zgodnie z planem: bardzo często potrzeba wprowadzenia zmian (nie zapomnieć o dodatkowej zgodzie lokalnej komisji etycznej). Kontakt ze zwierzętarnią i lekarzem weterynarii (stan zwierząt). 34 Zasady korzystania ze zwierząt doświadczalnych (zgodnie z zasadą 3 R) 1. Ograniczać liczbę zwierząt doświadczalnych. 2. Nie narażać ich na zbędny strach, ból, cierpienie lub trwałe uszkodzenia ich organizmów. 3. Ograniczać do niezbędnego zakresu doświadczenia powodujące u zwierząt długotrwały i silny ból, cierpienie, strach lub trwałe uszkodzenia ich organizmów. 4. Jeżeli istnieje możliwość wyboru między doświadczeniami, wybierać to, które można przeprowadzić: - powodując najmniej bólu, cierpienia, stresu i trwałych uszkodzeń u zwierząt, w szczególności przez wybór najmniej inwazyjnych technik oraz zwierząt o najniższym stopniu wrażliwości neurofizjologicznej; - korzystając z najmniejszej liczby zwierząt; przy największym prawdopodobieństwie uzyskania pożądanych (wiarygodnych) wyników. 35 Zastosowanie zasady 3 R Rutynowe testy wykonywane w przemyśle farmaceutycznym przy produkcji leków, testy toksyczności produktów chemicznych, badania przesiewowe (stosowanie organów na czipie), badania podstawowe (wykorzystanie układu kwadratu łacińskiego), dydaktyka. 36

Istotność statystyczna i praktyczna Duża liczba zwierząt pozwala czasem uzyskać istotność statystyczną nawet przy bardzo małych różnicach (tylko czy zawsze o to chodzi?); Mała liczba zwierząt może uniemożliwić wykazanie istotnej różnicy, np. różnic istotnych dla kliniki; Użycie zbyt małej lub zbyt dużej liczby zwierząt jest nieetyczne (również nieopłacalne). Humanitarne zakończenie doświadczenia Zabicie zwierzęcia w sposób humanitarny, tzn. szybko, przy minimalizacji cierpienia i metodą dopuszczoną przez prawo, gdy: nie powinno się, lub nie ma potrzeby czekać na jego naturalną śmierć. Planowanie procedur w edukacji Planowanie procedur w celu kształcenia na poziomie szkolnictwa wyższego lub szkolenia w celu nabycia lub doskonalenia kompetencji zawodowych, których wykonanie jest dopuszczone przepisami art. 3 pkt 5 ustawy. Duży zakres metod alternatywnych. Ograniczenie do osób mających w przyszłości wykonywać procedury lub techniki inwazyjne (np. lekarze weterynarii). 37 38 Szkolenia w stosowaniu technik operacyjnych. 39

Użyteczność modelu zwierzęcego Doświadczalny model zwierzęcy daje konkretną odpowiedź na konkretne pytanie związane z badanym gatunkiem i danymi okolicznościami przeprowadzonego badania. Doświadczalny model zwierzęcy nie zapewnia odpowiedzi na pytanie, czy dana sytuacja lub zjawisko wystąpią tak samo u innych gatunków, w tym i człowieka. 40 Praktyczne aspekty postępowania ze zwierzętami Jednakowe traktowanie wszystkich zwierząt, zarówno z grup doświadczalnych, jak i kontrolnych, poza czynnikami badanymi w eksperymencie. Przestrzeganie przepisów ustawy. Randomizacja podziału zwierząt na grupy doświadczalne i kontrolne. Jeżeli procedura doświadczalna może spowodować ból lub inne cierpienia zwierzęcia, należy zwrócić na nie szczególną uwagę i sprawdzać, czy nie manifestuje ono objawów typowych dla takiego stanu. Konsultacje z lekarzem weterynarii. Zawsze, gdy jest to możliwe należy stosować wczesne i humanitarne zakończenie doświadczenia. Takie postępowanie ma uzasadnienie nie tylko etyczne (zmniejszanie cierpienia), ale i praktyczne (lepsza jakość i 41 powtarzalność wyników). Dlatego warto je stosować. Warto pomyśleć również o Nietechnicznym streszczeniu doświadczenia: Będzie ono publikowane i dostępne publicznie dla społeczeństwa (głównie organizacji zajmujących się ochroną zwierząt doświadczalnych. Dlatego ma być anonimizowane, czyli pozbawione chronionych informacji osobowych. Wzór nietechnicznego streszczenia jest na stronie KKE. Ocenie retrospektywnej doświadczenia (Uchwała 16/2016 KKE). Użytkownik prowadzi i przechowuje dokumentację doświadczenia, w tym wniosek o udzielenie zgody na jego przeprowadzenie, wnioski o zgodę na zmiany i uchwałę o udzieleniu zgody na przeprowadzenie doświadczenia do czasu zakończenia oceny, nie krócej niż 3 lata od dnia zakończenia 42 doświadczenia.

Podsumowanie Właściwe zaprojektowanie i wykonanie doświadczenia oraz odpowiednia analiza statystyczna dają dużą szansę na uzyskanie odpowiedzi na zadane pytanie (weryfikację hipotezy) w sposób pewny (istotność statystyczna, moc testu) i przy wykorzystaniu właściwej (minimalnej = niezbędnej) liczby zwierząt, Bardzo pomocny adres https://nc3rs.org.uk/experimental-design 43