Marek Kudła Rybozymy RNA nośnik informacji i narzędzie katalizy enzymatycznej
Właściwości RNA umożliwiają ce kataliz ę enzymatyczną Możliwo ść tworzenia skomplikowanej struktury II i III rzędowej przez parowanie krótkich odcinków w obrębie cząsteczki. Tworzenie niestandardowych par zasad. Obecno ść grupy hydroksylowej przy węglu 2` rybozy. Możliwo ść koordynacji kationów metali dwuwartościowych.
Rodzaje znanych rybozymów Rybozym Hammerhead HDV Hairpin Varkud sattelite Intron grupy I Intron grupy II Rnaza P Spliceosom (U2+U6 snrna) Rybosom (23 S rrna) Liczba znanych przykładów 11 2 1 1 >1500 >900 >500 70, 50 >900 Rozmiar 40 90 70 160 210 500 300 180, 100 2600
Właściwości i pochodzenie rybozymów naturalnych. Hammerhead, Hairpin, VS i HDV s ą rybozymami występującymi w wirusach i katalizuj ą reakcj ę specyficznego (uzależnionego od sekwencji) przecięcia nici RNA uczestnicząc w procesie namnażania si ę wirusa. RNAza P jest nukleoprotein ą, w której RNA tworzy centrum reakcji, a białko odpowiada za utrzymanie RNA w aktywnej konformacji. Jedynie 23S rrna przeprowadza odmienn ą reakcj ę tworzenie wiązania peptydowego. Rybozymy uzyskane metod ą ukierunkowanej ewolucji in vitro potrafi ą przeprowadza ć bardzo różnorodne reakcje enzymatyczne.
Hammerhead Hairpin HDV VS
Hairpin HDV Hammerhead
Mechanizm reakcji transestryfikacji katalizowanej przez rybozymy naturalne
Ogólny mechanizm reakcji transestryfikacji na przykładzie rybozymu typu Hammerhead
Kwasy i zasady Lewisa w cząsteczkach rybozymów porównanie z enzymami białkowymi. W przypadku enzymów białkowych (np. RNAza S) reszt ą aminokwasow ą pełniąc ą rol ę kwasu lub zasady Lewisa jest najczęściej histydyna, której pka 7, co oznacza, że w ph=7 w przybliżeniu tyle samo cząsteczek jest zjonizowanych (i ma właściwości kwasowe), co niezjonizowanych (z właściwościami zasadowymi). A:H+ - kwas Lewisa :B zasada Lewisa
Porównanie pka zasad azotowych z pka grup bocznych aminokwasów
Widok centrum reakcji rybozymu Hairpin z wskazaniem zasad uczestniczą cych w stabilizacji stanu przejściowego. P 2 OH
Stan przejściowy reakcji dla intronu grupy I Tetrahymena Strzałkami zaznaczono kationy metali uczetniczące w stabilizacji stanu przejściowego.
Zastosowania rybozymów Systemy badawcze służące do wyciszania genów przez specyficzne przecięcie produkowanego przez gen mrna. Możliwe zastosowanie w terapii przeciwretrowirusowej. Leczenie chorób związanych z ekspansj ą trójek nukleotydowych i anomalnymi długościami transkryptu np. w chorobie Huntingtona lub dystrofii mięśniowej.
Podstawowe problemy w zastosowaniu rybozymów Wektory dla rybozymów. Uzyskanie kolokalizacji rybozymów z docelowym mrna. Konieczno ść uwzględnienia interakcji mrna z białkami, które mog ą blokowa ć dostęp rybozymów do miejsc w kwasie nukleinowym przeciw którym s ą skierowane.
U16Rz rybozym do którego wstawiono sekwencje pochodzące z U16 snrna. Wykazuje on tak ą sam ą lokalizacj ę jak U3 snrna na terenie jądra. Uzyskane wyniki świadcz ą o możliwości sterowania lokalizacj ą cząsteczek RNA.
Introny grupy I i II
* ** Splicing autokatalityczny intronów grupy I i II - szczegóły * - GTP inicjujące reakcj ę transestryfikacji ** - aktywna reszta adeniny decydująca o właściwościach katalitycznych. linie ciągłe introny linie przerywane - egzony
C5 C4 Aktywno ść transferazowa intronu L19 RNA IVS C5 C6
Aktywno polimerazowa ść intronu L21 RNA Sca1
Polimeryzacja DNA katalizowana przez rybozym Wycięty intron grupy II genu bi1 pochodzący z Saccharomyces cerevisiae ma zdolno ść do katalizowania polimeryzacji DNA in vitro. Reakcja przebiega w kierunku 3` 5`. Poszczególne deoksyrybonukleotydy s ą włączane do powstającej cząsteczki ze zróżnicowan ą efektywności ą.
Aktywno ść ligazy Aktywno ść polimerazy DNA
Efektywno ść inkorporacji poszczególnych deoksyrybonukleotydów
Samoreplikuj ący si ę rybozym Rybozym R3C o aktywności ligazy, która katalizuje tworzenie si ę wiązania 3`-5` fosfodiestrowego otrzymany drog ą ewolucji in vitro. Rybozym ten zosta ł przekonstruowany tak, by katalizowa ł reakcj ę łączenia si ę dwóch substratów oligonukleotydowych w produkt będący identyczny z rybozymem. Substraty s ą rozpoznawane dzięki komplementarnemu łączeniu si ę z rybozymem służącym jako matryca.
Kompleks rybozymu R3C z substratami Miejsce ligacji substratów A + B T
Cykl autoreplikacji rybozymu R3C
Szybko ść reakcji ligacji katalizowanej przez rybozym R3C
Ukierunkowana ewolucja in vitro a rybozym R3C Ewolucja in vitro Uleganie ewolucji według zasad Darwinowskich. Replikacja przeprowadzana jest przez cząsteczki, które nie s ą części ą ewoluującego systemu. Rybozym R3C Ze względu na prostot ę reakcji przeprowadzanej przez R3C nie podlega on ewolucji. Rybozym katalizuje reakcj ę autoreplikacji. Żaden z tego rodzaju systemów nie odzwierciedla prawdopodobnych pierwotnych etapów ewolucji życia na Ziemi. Rybozym, który mógłby funkcjonowa ć jako pełny model samopowielaj ących si ę moleku ł z ery świata RNA musiałby posiada ć właściwości charakterystyczne dla obu tych systemów.
Transferaza peptydylowa dużej podjednostki rybosomu Centrum reakcji tworzenia wiązania peptydowego jest cząsteczka 23S rrna. Pomimo, że za katalityczn ą aktywno ść transferazy odpowiada RNA, nie udało si ę jeszcze skonstruowa ć cząsteczki 23S rrna, która wykazywałaby aktywno ść w nieobecności towarzyszą cych białek. Niezbędna do aktywności katalitycznej okazała si ę sekwencja CCA na 3` końcu cząsteczek trna, a w szczególno ści adenina.
Bibliografia: 1. The chemical repertoire of natural ribozymes J.A. Doudna, T.R. Cech, Nature, lipiec 2002, vol.418, ss.222-228 2. Intracellular ribozyme applications D. Castanotto et alles, Biochemical Society, 2002, ss.1140-1145 3. After the ribosome structures: How does peptidyl transferase work? P.B. Moore, T.A. Steitz, RNA, 2003, ss.155-159 4. DNA polymerization catalysed by a group II intron RNA in vitro M. Hetzer, R.J. Schweyen, M.W. Mueller, Nucleic Acids Research, 1997, Vol.25, No.9, ss.1841-1844 5. Crystal structure of a hairpin ribozyme-inhibitor complex with implications for catalisys P.B. Rupert, A.R. Ferré- D Amaré, Nature, kwiecie ń 2001, vol.410, ss.780-786
Bibliografia: 1. In vitro evolution suggests multiple origins for the hammerhead ribozyme K. Salehi-Ashtiani, J. W. Szostak, Nature, październik 2001, vol. 414, ss. 82-85 2. A self-replicating ligase ribozyme N. Paul, G. F. Joyce, PNAS, październik 2002, vol. 99, no. 20, ss. 12733-12740 3. Tajemnice ewolucji molekularnej Aleksandra Kubicz, PWN Warszawa-Wroc ław 1999 4. Biofizyka kwasów nukleinowych dla biologów pod red. Marii Bryszewskiej, Wandy Leyko, PWN Warszawa 2000