powstałego w roztworach o ph 4-13, przeprowadzonego przed analizą w anion wodorowęglanowy HCO 3

Transkrypt

1 Stacjonarna γ-radioiza z detekcją chromatograficzną Wyznaczenie wydajności chemoradiacyjnych dekarboksyacji i fragmentacji, wykonałem oznaczając iość dwutenku węga i odpowiedniego adehydu (octowego bądź propionowego) powstałych podczas γ-radioizy wodnych roztworów badanych aminokwasów. Roztwory badanych związków, doprowadzone do żądanego ph i nasycone N 2 O, były napromieniane w źródłach gamma, po czym skład powstałych podczas napromieniania gazów był anaizowany metodami chromatograficznymi. (a) - Do oznaczeń CO 2 w roztworach aminokwasów o ph 1-4 oraz adehydów powstałych w roztworach o ph 5,8 stosowałem chromatografię gazową (GC). Stosowanym źródłem promieniowania gamma było znajdujące się w Instytucie Chemii i Techniki Jądrowej w Warszawie źródło kobatowe ISSLEDOVATEL, produkcji radzieckiej. Aktywność źródła wynosiła 16,6 kci (6,14 * 1 14 Bq) a moc dawki pochłoniętej 118 Gy/min. (b) - Do oznaczenia CO 2 powstałego w roztworach o ph 4-13, przeprowadzonego przed anaizą w anion wodorowęganowy HCO 3 -, stosowałem wysokosprawną chromatografię jonowykuczającą (HPICE). Stosowanym źródłem promieniowania gamma było znajdujące się w Hahn-Meitner-Institut (HMI) w Berinie źródło kobatowe o aktywności 3,7 kci (1,37 * 1 14 Bq) i mocy dawki pochłoniętej 1 Gy/min Chromatografia gazowa Oznaczanie CO 2 powstałego podczas napromieniania 1-2 mo dm -3 wodnych roztworów aminokwasów o ph w zakresie 1-4 wykonałem metodą adsorpcyjnej chromatografii gazowej. Do anaizy pobierałem próbkę mieszaniny gazowej znajdującej się w przestrzeni zamkniętej nad uprzednio napromienianym roztworem (tzw. metoda headspace). Chromatografia jest metodą, która opiera się na wieokrotnym, to jest powtarzającym się podziae rozdzieanych składników pomiędzy dwie nie mieszające się fazy. Przy tym jedna z nich, zwana fazą stacjonarną, ma dużą powierzchnię i jest nieruchoma. Druga (faza ruchoma) przepływa przez fazę stacjonarną w jednym kierunku. Adsorpcyjna chromatografia gazowa jest metodą, w której fazą stacjonarną jest aktywna substancja stała (adsorbent) a fazą ruchomą gaz (tzw. gaz nośny) (Röde i Wöm 1992, Witkiewicz 1992). Schemat ideowy aparatury do chromatografii gazowej (GC) przedstawia rysunek 4.1.3_1.

2 47 Rys _1 Schemat chromatografu gazowego; 1 - doprowadzenie gazu nośnego, 2 - reguator przepływu gazu, 3 - manometr, 4 - wot próbki (dozownik), 5 - termostat, 6 - koumna, 7 - detektor, 8 - wzmacniacz, 9 - rejestrator (komputer); inie kreskowane oznaczają zakresy objęte termostatowaniem. Do oznaczeń CO 2 posłużyły mi chromatografy gazowe Perkin Emer 87 i Shimadzu GC-14b, których sprzężenie z mikrokomputerem pozwaało na programowanie warunków pracy i anaizę matematyczną wyników (między innymi obiczanie poa powierzchni pików chromatogramu). W stosowanej przeze mnie technice eucyjnej gaz nośny (he) płynął nieprzerwanie przez aparaturę. Próbka badanej mieszaniny gazowej była wprowadzana strzykawką chromatograficzną do układu przez dozownik membranowy, przenoszona przez gaz nośny do koumny i tam rozdzieana na składniki. Przez cały czas anaizy temperatura koumny i prędkość przepływu gazu nośnego były stałe. Pojawienie się poszczegónych składników w detektorze wytwarzało sygnały eektryczne rejestrowane przez komputer sterujący pracą chromatografu. Wyniki na bieżąco były prezentowane na ekranie komputera, a po zakończeniu pomiaru drukowane przez drukarkę. Podstawowe parametry pracy chromatografów zawiera tabea 1. Do rozdzieenia CO 2 od N 2 O, N 2 i wody stosowałem koumnę pakowaną z wypełnieniem poimerowym Porapak-Q. Jest to wypełnienie uniwersane i bywa ono często stosowane do anaizy gazów (Witkiewicz 1992). Stosowanym detektorem był detektor ciepno-przewodnościowy (TCD). Duża różnica przewodnictwa ciepnego gazu nośnego (przewodnictwo wzgędne heu wynosi 5,97) i oznaczanej substancji (przewodnictwo wzgędne dwutenku węga, wynosi,65) pozwaa na oznaczanie stosunkowo niskich stężeń dwutenku węga (Witkiewicz 1992). Typowy

3 48 zapis chromatogramu uzyskanego w wyżej przedstawionej konfiguracji przedstawia rysunek 4.1.3_2. W ceu iościowej anaizy wyników wykonałem kaibrację metodą wzorca zewnętrznego. Dozowałem ściśe okreśone objętości dwutenku węga a zmierzone wartości poa piku CO 2 wykreśałem w funkcji objętości zadozowanego CO 2. Współczynnik korekcyjny k E jest współczynnikiem kierunkowym nachyenia prostej, okreśonej równaniem (VI). A i = k E* V i (VI) gdzie: A i - poe powierzchni piku CO 2 [mm 2 ], V i - objętość zadozowanego CO 2 [µ], k E - współczynnik korekcyjny. Tak obiczony współczynnik korekcyjny k E wykorzystywałem przy obiczaniu stężenia dwutenku węga w badanej próbce. W tym ceu posługiwałem się wzorem (VII). C G = A i /(k E* V ) (VII) p gdzie: C G - stężenie CO 2 w badanej próbce gazowej, ułamek objętościowy, Vp - objętość badanej próbki gazowej [µ]. Tabea 1 Parametry pracy chromatografów gazowych PE 87 i GC-14B. Parametr Gaz nośny Temperatura termostatu Temperatura dozownika Temperatura detektora Prędkość przepływu gazu nośnego Ciśnienie gazu nośnego Czas pomiaru Czas retencji CO 2 Wiekość he 9 o C 22 o C 22 o C 4 m/min 6, PSIG 6 min ~2 min

4 49 Anaizowane próbki gazowe były pobierane strzykawką chromatograficzną z zamkniętej przestrzeni znajdującej się w górnej części naczynek, w których odbywało się napromienianie (rysunek 4.1.3_3). Przed pobraniem próbki do anaizy naczynka były termostatowane w temperaturze 3 o C przez czas nie krótszy od 2 minut. Da tzw. próbki śepej mieszanina gazowa nad roztworem zawierała tyko N 2 O, N 2 i parę wodną. Stężenie CO 2 w próbce gazowej (C G ) jest powiązane ze stężeniem CO 2 powstałego podczas napromieniania w całej objętości roztworu (C ), wynikającą z prawa Raouta zaeżnością (VIII) (Vitenberg 1991). C =C G * (K +r) (VIII) gdzie: r - stosunek objętości fazy gazowej do ciekłej, K - współczynnik rozpuszczaności, który wyraża Rys.4.1.3_2 objętość gazu (CO 2 ) rozpuszczoną w jednostce objętości Chromatogram GC rozpuszczanika w danej temperaturze pod ciśnieniem wykonany da próbki S- cząstkowym równym 76 mmhg. karboksyetyo-l-cysteiny o Współczynnik rozpuszczaności K da roztworów stężeniu 1-2 mo dm -3 i ph wodnych w zakresie ph 1-4, w temperaturze 3 o C, 1,7 napromienionej dawką wyznaczyłem doświadczanie. W tym ceu do przestrzeni,47 kgy. gazowej śepej próbki dodawałem okreśoną iość dwutenku węga, próbkę wytrząsałem i pozostawiałem w termostacie na około pół godziny da ustaenia równowagi. Oznaczałem C G i znając parametry C i r wyznaczałem K z równania (VIII). Otrzymaną zaeżność współczynnika rozpuszczaności CO 2 w roztworach wodnych, w zaeżności od ph przedstawia rysunek 4.1.3_4. Z praktyki aboratoryjnej wynika, że współczynnik ten wraz z rozpuszczaniem badanych aminokwasów w iości 1-2 mo dm -3 zmienia się tyko w granicach błędu doświadczanego. Stężenie CO 2 powstałego Rys..1.3_3 podczas napromieniania C było wiekością wyjściową do obiczenia wydajności chemoradiacyjnej dekarboksyacji (patrz punkt ).

5 5 K ph Rys _4 Współczynnik rozpuszczaności dwutenku węga w roztworach wodnych w funkcji ph. Oznaczenia adehydów octowego i propionowego powstałych podczas napromieniania 3 * 1-2, 3,5 * 1-2 i 5 * 1-2 mo dm -3 wodnych roztworów aminokwasów o ph 5,8 wykonałem metodą podziałowej chromatografii gazowej, w której fazą stacjonarną jest aktywna substancja ciekła naniesiona na stały nośnik a fazą ruchomą gaz (Röde i Wöm 1992, Witkiewicz 1992, Bieriezkin 1992). Do oznaczeń posłużył mi chromatograf gazowy HP 589 Series II. Połączenie chromatografu z integra-torem HP 3396 Series II pozwaało na anaizę matematyczną wyników. Podobnie jak da oznaczeń CO 2, próbka badanej mieszaniny ciekłej (napromienianego roztworu) była wprowadzana strzykawką chromatograficzną do układu przez dozownik membranowy, przenoszona przez gaz nośny do koumny i tam rozdzieana na składniki. Przez cały czas anaizy prędkość przepływu gazu nośnego była stała. Temperatura koumny zmieniała się w trakcie pomiaru od wartości początkowej 5 o C z szybkością 5 o C/min Podstawowe parametry pracy chromatografu zawiera tabea 2. Do rozdzieenia próbki stosowałem koumnę kapiarną CP-SIL 5CB firmy Chrompack o długości 5 m i średnicy,25 mm z naniesioną,4 µm średniopoarną, siikonową warstwą ciekłą. Stosowanym detektorem był detektor płomieniowojonizacyjny (FID), którego zasada działania poega na zmianie przewodnictwa eektrycznego płomienia wodoru w pou eektrycznym po wprowadzeniu substancji organicznej (Röde i Wöm 1992, Witkiewicz 1992).

6 51 Tabea 2 Parametry pracy chromatografu gazowego HP 589. Parametr Gaz nośny Temperatura termostatu Szybkość zmiany temperatury Temperatura dozownika Temperatura detektora Prędkość przepływu gazu nośnego Ciśnienie gazu nośnego Ciśnienie wodoru Ciśnienie powietrza Czas pomiaru Czas retencji adehydu octowego Czas retencji adehydu propionowego Czas retencji standardu wewnętrznego (n-propanou) Wiekość he 5-1 o C 5 o C/min 18 o C 22 o C 2 m/min 4 PSIG 25 PSIG 35 PSIG 8 min 3,1 min 3,4 min 3,8 min Typowy zapis chromatogramu uzyskanego w wyżej przedstawionej konfiguracji przedstawia rysunek 4.1.3_5. W ceu iościowej anaizy wyników wykonałem kaibrację metodą wzorca wewnętrznego, dodając przed pomiarem chromatograficznym do każdej z badanych próbek okreśone iości n-propanou. Stężenie oznaczanego adehydu wyznaczałem ze wzoru (IX) C = Ai C A k w w F (IX) gdzie: C - stężenie oznaczanej substancji, Ai - powierzchnia piku badanej substancji, C w - stężenie substancji wzorcowej, A w - powierzchnia piku substancji wzorcowej, k F - współczynnik korekcyjny (wyznaczony ze wzoru (IX) da uprzednio przygotowanych próbek wzorcowych o znanym składzie).

7 52 Stężenie adehydu powstałego podczas napromieniania (C ) było wiekością wyjściową do obiczenia wydajności chemoradiacyjnej fragmentacji rodników α-aminoakiowych (patrz punkt ) Wysokosprawna chromatografia jonowykuczająca (HPICE) Rys.4.1.3_5 Chromatogram GC wykonany da próbki S- metyo-l-cysteiny o stężeniu 5 * 1-2 mo dm -3 Oznaczanie CO 2 powstałego podczas napromieniania 2 * 1-3 mo dm -3 wodnych roztworów aminokwasów o ph w zakresie 4-13 wykonałem metodą wysokosprawnej chromatografii jono-wykuczającej (HPICE). Do anaizy pobierałem próbkę roztworu napromienionego i doprowadzonego do ph > 12, w ceu pełnej konwersji dwutenku węga w anion wodorowęganowy w reakcji [36] CO 2 HCO OH - [36] i ph 5,8 napromienionej Wysokosprawna chromatografia jonowykuczająca dawką 7,9 kgy. jest wariantem chromatografii jonowej, w którym wykorzystuje się zjawisko równowagi membranowej Donnana (Kamieński 198, Haddad i Jacson 199). Porowata żywica jonowymienna pełni tutaj roę półprzepuszczanej membrany oddzieającej dwie fazy wodne, fazę ruchomą od fazy stacjonarnej zawartej w porach żywicy. Membrana ta jest przepuszczana tyko da substancji niezjonizowanych ub słabozjonizowanych, które uegają podziałowi pomiędzy dwie fazy wodne a ich migracja przez koumnę jest opóźniona. Natomiast substancje zjonizowane, nieprzenikające do wnętrza porów, nie są zatrzymywane w koumnie i opuszczają ją w pierwszej koejności (Fritz 1982, Brandt i Kettrup 1985, Weiss 1985, Sma 1987, Haddad i Jacson 199). Schemat ideowy aparatury do chromatografii jonowej przedstawia rysunek 4.1.3_6. Do oznaczeń posłużył mi chromatograf jonowy Dionex 21i. Połączenie chromatografu z integratorem Shimadzu C-R1B pozwaało na anaizę matematyczną wyników.

8 53 Podobnie jak w przypadku chromatografii gazowej euent płynął nieprzerwanie przez aparaturę. Badana próbka była wprowadzana strzykawką do pęti dozowniczej o pojemności 1 µ, przenoszona przez euent do koumny i tam rozdzieana. Podstawowe parametry pracy chromatografu zawiera tabea 3. Do rozdzieania próbki stosowałem koumnę jonowymienną Dionex IonPac ICE- AS1. Stosowanym detektorem był detektor konduktometryczny. Odpowiedź tego detektora jest proporcjonana do przewodnictwa eektrycznego euentu przepływającego pomiędzy eektrodami naczynka konduktometrycznego. Zmiany natężenia prądu eektrycznego przepływającego przez naczynko, wywołane Rys _6 Schemat chromatografu jonowego; wynikającymi z pojawienia się w objętości naczynka jonów zmianami przewodnictwa, są 1- rezerwuar euentu, 2 - pompa, 3 - rejestrowane w postaci chromatogramu. dozownik, 4 - strzykawka, 5 - koumna separacyjna, 6 - układ Stosowany chromatograf był wyposażony w układ eektronicznego tłumienia prądu nośnego tłumienia prądu nośnego tzw. wynikającego z przewodnictwa jonów euentu suppressor, 7 - kuweta (tzw. suppressor). konduktometryczna, 8 - integrator. Tabea 3 Parametry pracy chromatografu jonowego Dionex 21i. Parametr Wiekość Euent H 2 O (ph 6,7) Prędkość przepływu euentu 1,5 m/min Ciśnienie euentu PSIG Czas pomiaru 12 min Czas retencji HCO - 3 ~ 7 min

9 54 Typowy zapis chromatogramu uzyskanego wyżej przedstawioną metodą iustruje rysunek 4.1.3_7. W ceu iościowej anaizy wyników wykonywałem kaibrację metodą wzorca zewnętrznego. W tym ceu do roztworów badanych aminokwasów o ph 12,2 dozowałem ściśe okreśone objętości dwutenku węga, a zmierzone wartości poa piku HCO - 3 wykreśałem w funkcji objętości zadozowanego CO 2. Współczynnik korekcyjny k E jest współczynnikiem kierunkowym nachyenia prostej, okreśonej równaniem (X). A i = ke Vi V w (X) Rys _7 Chromatogram HPICE da próbki Tiaproiny 2 * 1-3 mo dm -3, ph 6,7 napromienionej dawką,12 kgy. gdzie: A i - poe powierzchni piku HCO - 3 [mm 2 ], V i - objętość zadozowanego CO 2 [µ], V w - całkowita objętość roztworu wzorcowego [m], k E - współczynnik korekcyjny. Tak obiczony współczynnik korekcyjny k E wykorzystywałem przy obiczaniu stężenia dwutenku węga (jonu wodorowęganowego) wygenerowanego w badanej próbce. W tym ceu posługiwałem się wzorem (XI). C = A i /k E (XI) gdzie: C - początkowe stężenie CO 2 w roztworze po napromienianiu, objętość CO 2 rozpuszczona w jednostce objętości roztworu. Anaizowane próbki ciekłe były pobierane strzykawką z zamkniętych septą gumową naczynek, w których odbywało się napromienianie. Stężenie dwutenku węga powstałego podczas napromieniania C było wiekością wyjściową do obiczenia wydajności chemoradiacyjnej dekarboksyacji (patrz punkt ).