Skuteczność połączenia 2 szczepów probiotycznych, zawartych w preparacie dopochwowym o przedłużonym uwalnianiu, u kobiet z kandydozą sromu i pochwy

Transkrypt

1 Skuteczność połączenia 2 szczepów probiotycznych, zawartych w preparacie dopochwowym o przedłużonym uwalnianiu, u kobiet z kandydozą sromu i pochwy Badanie pilotażowe Lek. Franco Vicariotto*, lek. Mario Del Piano, lic. Luca Mogna i lic. Giovanni Mogna Z *Oddziału Ginekologii prywatnej kliniki Casa di Cura San Pio X w Mediolanie; Oddziału Gastroenterologii, Ospedale Maggiore Della Carità; Biolab Research Srl (Sp.zo.o.); i Probiotical SpA, Novara, Włochy. L.M. jest pracownikiem Biolab Research Srl. G.M. jest pracownikiem Probiotical S.p.A.. Pozostali autorzy deklarują, że nie mają nic do ujawnienia. Reprinty: Franco Vicariotto, MD, Gynaecology Unit, Casa di Cura San Pio X, Via Francesco Nava, 31, Mediolan, Włochy ( francovic@tin.it). Copyright 2012 Lippincott Williams & Wilkins Informacje ogólne: Kandydoza sromu i pochwy (ang. VVC) jest po bakteryjnej waginozie drugą pod względem częstości przyczyną zapalenia pochwy i jest rozpoznawana u aż do 40% kobiet z dolegliwościami ze strony pochwy w podstawowej opiece zdrowotnej. Wśród gatunków Candida, najczęstszym czynnikiem zakaźnym jest Candida albicans. Leczenie z wyboru w niepowikłanej VVC w ponad 90% przypadków jest jednodawkowe lub krótkoterminowe. Dostępnych jest kilka leków miejscowych lub doustnych i nie ma dowodów wyższości któregokolwiek leku lub drogi podania. W każdym razie, większość klasycznych metod leczenia nie jest w stanie zapewnić znaczącej ochrony przed możliwymi nawrotami. W ostatnich latach, probiotyki wyłaniają się jako nowa strategia przeciwdziałania VVC. W istocie, dobrze znana jest ich zdolność do obniżania ph pochwy, zapewniająca w ten sposób, barierę dla wielu rodzajów drożdżaków. Niektóre gatunki są także zdolne do wywierania dodatkowego i bardziej zogniskowanego działania antagonistycznego, w którym mediatorem są swoiste cząsteczki, takie jak nadtlenek wodoru i bakteriocyny. Na przykład, Lactobacillus fermentum LF5 (CNCM I-789) był z powodzeniem testowany w 4 badaniach na ludziach, obejmujących łącznie, w chwili rekrutacji, 340 kobiet z VVC. W każdym razie, kluczowo ważny jest sposób dostarczenia probiotyków do środowiska pochwy. Celem tej pracy był, po pierwsze wybór 1 lub więcej szczepów probiotycznych o aktywności in vitro przeciw drożdżakom Candida, a następnie przeprowadzenie pilotażowego badania in vivo u ludzi, z zastosowaniem połączenia najbardziej obiecujących i aktywnych bakterii. Metody: W tym celu wybrano 2 szczepy probiotyczne Probiotical S.p.A (Włochy), w oparciu o ich silną aktywność hamującą in vitro wzrost 4 swoistych gatunków Candida, mianowicie: Candida albicans, Candida glabrata, Candida parapsilosis i Candida krusei i następnie zbadano je w pilotażowym badaniu interwencyjnym u ludzi, obejmującym 30 kobiet z VVC. Stosowane probiotyki, L. fermentum LF10 (DSM 19187) i Lactobacillus acidophilus LA02 (DSM 21717), były podawane w musujących tabletkach dopochwowych o przedłużonym uwalnianiu (preparat ActiCand 30). Głównym punktem końcowym była ocena ustanowienia i utrzymania efektu barierowego przeciw drożdżakom Candida u kobiet cierpiących na VVC. Grupę 30 kobiet z rozpoznaniem VVC na podstawie badania mikroskopowego oraz posiewu drożdżaków, włączono do badania i poinstruowano, aby stosowały 1 tabletkę dopochwową dziennie przez 7 kolejnych dni, następnie 1 tabletkę co trzy noce przez kolejne 3 tygodnie (faza ostra) i, na koniec, 1 tabletkę na tydzień w celu utrzymania długotrwałej kolonizacji pochwy, zabezpieczającej przed możliwymi nawrotami. Badania lekarskie każdej pacjentki odbywały się w czasie rekrutacji (d 0 ), na koniec okresu pierwszych 4 tygodni leczenia (d 28 ) i na koniec drugiego miesiąca zapobiegania nawrotom (d 56 ). Ocenie wizualnej i mikroskopowej zawsze towarzyszyły analizy mikrobiologiczne wymazów z pochwy w celu oceny obecności Candida. Dokonano porównań statystycznych pomiędzy d 28 lub d 56 a d 0 oraz pomiędzy d 56 a d 28 w celu kwantyfikacji skuteczności zapobiegania możliwym nawrotom.

2 Wyniki: Podawanie preparatu ActiCand 30 umożliwiło znaczące wyeliminowanie objawów zakażenia drożdżakami Candida po 28 dniach u 26 spośród 30 pacjentek (86,6%, p<0,001). Na koniec drugiego miesiąca nawroty odnotowano, chociaż nie bardzo poważne, tylko u 3 spośród 26 pacjentek (11,5%, p=0,083), które były całkowicie wyleczone na koniec pierwszego miesiąca leczenia. Stanowi to kolejne potwierdzenie długotrwałego działania barierowego, wywieranego przez preparat. Wnioski: Częstość występowania VVC jest bardzo wysoka, ponieważ 70% do 75% kobiet zgłasza co najmniej 1 epizod w okresie ich życia. Obecnie dostępnych jest wiele metod leczenia, ale pomimo względnie wysokiej skuteczności w łagodzeniu objawów typowo związanych z ostrymi zakażeniami, są one na ogół niezdolne do zapewnienia długotrwałej bariery ochronnej przed możliwymi nawrotami. Badanie to wykazało zdolność ActiCand 30 nie tylko do eliminowania zakażeń Candida u bardzo wysokiego odsetka kobiet, ale także do zapewniania długotrwałej fizjologicznej ochrony, z powodu kolonizacji pochwy florą bakteryjną i przylegania do komórek nabłonka błony śluzowej. Specjalna formulacja ActiCand 30 oparta na musującej tabletce dopochwowej o przedłużonym uwalnianiu, może pośredniczyć w dwóch rodzajach efektów barierowych: pierwszym, polegającym na wytworzeniu środowiska beztlenowego z powodu uwolnienia CO 2, i drugim, zapewnianym przez kolonizację i przyleganie do nabłonka pochwy dwóch probiotyków L.fermentum LF10 i L.acidophilus LA02. Słowa kluczowe: kandydoza sromu i pochwy (VVC), flora bakteryjna pochwy, szczep probiotyczny, efekt barierowy (J Clin Gastroenterol 2012;46:S73-S80) Skład mikroflory układu moczopłciowego ma kluczowe znaczenie dla zdrowia i dobrego samopoczucia kobiet. 1 W środowisku pochwy wiele różnych grup drobnoustrojów, zarówno komensali, jak i oportunistycznych patogenów oraz probiotyków, współistnieje w równowadze ze sobą i z organizmem gospodarza. Z upływem lat, a także w odpowiedzi na czynniki zewnątrzpochodne i wewnątrzpochodne, podlegają one zmianom jakościowym i ilościowym. Ponieważ narażenie na czynniki behawioralne może zagrozić utrzymaniu się populacji bakterii Lactobacillus, wewnętrzna stabilność osiadłej mikroflory ma pierwszorzędne znaczenie dla zdrowia kobiet. 2 Kilka czynników może spowodować zaburzenia równowagi mikroflory pochwy, które z kolei mogą prowadzić do wystąpienia zapalenia pochwy lub przewlekłych postaci waginozy. Bardzo częste są te wynikające z nieograniczonego wzrostu drożdżaków należących do rodzaju Candida, z których najlepiej poznanym gatunkiem jest Candida albicans. Ten dwupostaciowy drożdżak jest komensalem kolonizującym skórę, przewód pokarmowy i drogi rodne. 3,4 Jest on głównym czynnikiem wywołującym grzybicze zapalenie sromu i pochwy, chociaż w ostatnich latach stale zwiększała się częstość zakażeń wywołanych różnymi gatunkami, takimi jak Candida glabrata, Candida tropicalis, Candida parapsilosis i Candida krusei. 5,6 Patogeneza zakażeń drożdżakowych i rokowanie w nich zależą od stanu układu odpornościowego gospodarza i różnią się znacznie w zależności od postaci choroby. Częstość występowania jest bardzo wysoka, ponieważ 70% do 75% kobiet ma przynajmniej 1 epizod kandydozy sromu i pochwy (VVC) w swoim życiu. 7,8 Równie ważny jest fakt, że 40% do 50% pacjentek ma 1 lub więcej nawrotów po pozornym ustąpieniu pierwszego epizodu zakażenia. 9 Ponadto, 25% do 40% kobiet z dodatnim wynikiem posiewu w kierunku gatunków Candida z okolicy pochwy jest bezobjawowymi nosicielkami. 10

3 VVC jest uważana za zakażenie oportunistyczne pochodzenia endogennego, dlatego nie jest to choroba przenoszona drogą płciową. 11 Po bakteryjnej waginozie VVC jest drugim najczęstszym rodzajem zapalenia pochwy, które to stany są wiodącą przyczyną badań ginekologicznych w krajach zachodnich. 12 Rozpoznanie należy stawiać na podstawie obserwacji klinicznych zgłaszanych przez ginekologów oraz, jeżeli pozostają wątpliwości, należy je potwierdzić badaniem mikroskopowym świeżej tkanki i wykonaniem posiewu bakteryjnego przed rozpoczęciem swoistej farmakoterapii. 13 Niektóre badania zidentyfikowały niektóre predysponujące stany, które często, konkretnie przez zachwianie równowagi ekosystemu pochwy, umożliwiają rozwój tego zakażenia, pojawienie się typowych objawów zakażenia i decydują o nawrotach. Czynnikami przyczyniającymi się mogłoby być stosowanie antybiotyków, kortyzonu, czynniki genetyczne i rasowe, choroby układu odpornościowego, stres, cukrzyca, lokalnie podwyższona temperatura i wilgoć (mokre kostiumy kąpielowe, mokra bielizna na sali gimnastycznej), nadmierne stosowanie prysznica i detergentów lub dieta bogata w glikogen oraz hormonalne środki antykoncepcyjne Nawroty są częstsze w okresie okołomenstruacyjnym. Menopauza, starzenie się i ciąża, z powodu wywołanych zmian hormonalnych, są stanami mogącymi sprzyjać wzrostowi Candida. W istocie, wiele kobiet ma swój pierwszy epizod lub nawrót właśnie w tych okresach. 19 Drożdżaki Candida powodują pieczenie, świąd i dyskomfort oraz, w przypadku nawrotów, często mają poważny wpływ na jakość społecznego, psychicznego i seksualnego życia kobiety. Podejścia terapeutyczne obejmują leczenie każdego epizodu lub stosowanie profilaktycznych środków przeciwgrzybiczych. 20 Wcześniej opowiadano się za kilkoma schematami postępowania profilaktycznego, obejmującymi stosowanie dopochwowych środków przeciwgrzybiczych albo codziennie, albo co tydzień, lub doustne podawanie ketokonazolu przez około 6 miesięcy. 21,22 Chociaż środki te są na ogół uważane za skuteczne w leczeniu zakażeń ostrych, to często są niezdolne do zapewnienia istotnej ochrony przed możliwymi nawrotami VVC. Co więcej, są niewygodne w użyciu i drogie, a doustny ketokonazol wiązał się z niemożliwym do zaakceptowania ryzykiem działania hepatotoksycznego. 23 W nawrotach oraz w profilaktyce i prewencji zwiększa się stosowanie swoistych drobnoustrojów probiotycznych, mające na celu przywrócenie fizjologicznej równowagi ekosystemu pochwy, związanej głównie z obecnością pałeczek kwasu mlekowego i tzw. kompleksu Döderleina. 24 Stosowanie żywych drobnoustrojów o wartości probiotycznej jest w istocie zalecane od kilku lat przez wielu ginekologów jako terapia alternatywna lub uzupełniająca do stosowania tradycyjnych leków miejscowych o działaniu przeciwbakteryjnym lub przeciwgrzybiczym. 25 Doustne i dopochwowe podawanie probiotyków bierze się także pod uwagę w czasie ciąży. 26 Probiotyki są dobrze znane ze swojej zdolności do obniżania ph pochwy i tworzenia w ten sposób efektu barierowego dla wielu rodzajów drożdżaków. 27 Niektóre szczepy są także zdolne do wywierania dodatkowego i bardziej zogniskowanego działania antagonistycznego, w którym mediatorem są swoiste cząsteczki takie jak nadtlenek wodoru i bakteriocyny. 28 Na przykład Lactobacillus fermentum LF5 (CNCM I-789) był z powodzeniem testowany w 4 badaniach na ludziach, obejmujących w chwili rekrutacji łącznie 340 kobiet z VVC (dane nie publikowane).

4 W każdym razie, postać dawkowania i strategia dostarczania probiotyków do środowiska pochwy ma kluczowe znaczenie. Preparaty na bazie oleistych zawiesin probiotyków najczęściej nie są w stanie zagwarantować największej skuteczności stosowanych dobroczynnych bakterii. Z tego względu, niedawno badano postacie alternatywne, a konkretnie hydrożele, kapsułki i tabletki. 29 W świetle powyższego wybrano in vitro połączenie szczepów probiotyków na podstawie ich zdolności do bezpośredniego działania antagonistycznego na różne gatunki Candida. Drugim krokiem było badanie in vivo połączenia 2 swoistych szczepów probiotycznych L. fermentum LF10 (DSM 19187) i Lactobacillus acidophilus LA02 (DSM 21717), podawanego w postaci nowego handlowego produktu AntiCand 30 z uwagi na jego zdolność do tworzenia i utrzymywania mikrośrodowiska pochwy, które nie sprzyja powstawaniu, rozwojowi lub utrzymywaniu się zakażenia drożdżakami Candida. MATERIAŁY I METODY Ocena aktywności antagonistycznej in vitro wybranych szczepów probiotyków względem drożdżaków Candida Aktywność 3 szczepów probiotycznych, mianowicie L. fermentum LF10 (DSM 19187), L. fermentum LF11 (DSM 19188) i L. acidophilus LA02 (DSM 21717), hamująca wzrost 5 drożdżaków należących do 4 różnych gatunków Candida została zmierzona ilościowo w Biolab Research (Novara, Włochy). Używane szczepy probiotyczne były charakteryzowane się na poziomie gatunku przez swoistą dla gatunku reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) z zastosowaniem starterów Lfpr/Ferm II dla L. fermentum 30 i ACI/16S II dla L. acidophilus. 31 W odniesieniu do poszczególnych biotypów, molekularne odciski palców uzyskiwano z zastosowaniem analizy elektroforezy żelu w polu pulsującym dla wszystkich szczepów. 32 Dokładniej mówiąc, zastosowano drożdżaki C. albicans ATCC 10231, C. parapsilosis ATCC 22019, C. krusei ATCC6258, C. albicans ATCC i C. glabrata ATCC Wyniki działania hamującego świeżych hodowli bulionowych poszczególnych szczepów probiotycznych wzrastających przez noc w bulionach De Man, Rogosa i Sharpe (MRS) (MerckChemicals, Mediolan, Włochy), porównano z liofilizowanymi kulturami tych samych bakterii. W szczególności świeże hodowle bulionowe stosowano przy wszystkich szczepach Candida, podczas gdy próbki liofilizowane badano względem C. albicans ATCC 10231, szczepu wybranego jako wskaźnik aktywności. Przed zastosowaniem w tym eksperymencie, poszczególne szczepy Candida wzrastały w Bulionie Sabouraud z Dekstrozą (BD Italia, Mediolan, Włochy), optymalnym podłożu dla drożdżaków, przez 48 godzin w warunkach tlenowych. Każdy probiotyk był następnie współhodowany w tym samym bulionie (MRS), na który posiano jeden z wyżej wymienionych drobnoustrojów Candida. Stosunek materiałów inokulacyjnych probiotyków do drożdżaków wynosił 1:3 na korzyść tych ostatnich. Inkubację prowadzono w warunkach aerobiozy w temperaturze 37 C przez 48 godzin. Z każdej hodowli pobrano próbkę (1 ml) po 24 i 48 godzinach inkubacji, w celu wybiórczego policzenia drożdżaków wykonywanego na podłożu agarowym z ekstraktem drożdżowym, glukozą i chloramfenikolem (YGC) (Sigma-Aldrich, Mediolan, Włochy). Płytki z agarem YGC inkubowano w warunkach tlenowych w temperaturze 25 C przez 24 do 48 godzin dla umożliwienia wzrostu wszelkich obecnych drożdżaków. Następnie, kolonie zliczano a wynik podawano jako liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU)/mL.

5 Plan badania in vivo Do badania rekrutowano 30 pacjentek (wieku od 23 do 64 lat, średnia 40,9 ± 11,1 lat, 8 kobiet po menopauzie) w maju i czerwcu 2011 r. w prywatnej klinice Casa di Cura San Pio X (Mediolan, Włochy). Od wszystkich pacjentek włączonych do badania uzyskano świadomą zgodę na piśmie. Osoby spełniające wymogi były w wieku co najmniej 18 lat, miały aktywną kandydozę sromu i pochwy (całkowita punktacja ciężkości = 3), dodatni wynik badania mikroskopowego wydzieliny z pochwy z 10% wodorotlenkiem potasowym i miały co najmniej 4 udokumentowane epizody kandydozy sromu i pochwy w okresie ostatnich 12 miesięcy. Punktacja ciężkości opierała się na obecności objawów subiektywnych (np. świąd, podrażnienie i pieczenie) i obiektywnych (np. rumień, obrzęk i starcie naskórka lub pęknięcia naskórka) ze strony sromy i pochwy. Ciężkość każdego objawu obiektywnego lub subiektywnego punktowano w skali od 0 (brak lub prawidłowy) do 3 (ciężki). 33 Nie oceniano punktowo ilości wydzieliny ze sromu i pochwy. Pacjentki wykluczano z badania, jeżeli wyników badania mikroskopowego nie udało się potwierdzić posiewem. Innymi kryteriami wykluczenia były: ciąża, zakażenia mieszane, znany stan seropozytywności dla ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) oraz leczenie środkami przeciwgrzybiczymi lub innymi produktami zawierającymi probiotyki, nawet przyjmowanymi doustnie, w okresie poprzednich 2 miesięcy. Po włączeniu do badania, wszystkie pacjentki otrzymały preparat ActiCand 30 (Probiotical, Novara, Włochy) w postaci lekko musujących tabletek dopochwowych o przedłużonym uwalnianiu, zawierających co najmniej 0,4 miliarda żywych komórek każdego probiotyku L. fermentum LF10 i L. acidophilus LA02. Dodatkowo, każda tabletka zawierała 273 mg arabinogalaktanu i 332 mg frukto-oligosacharydów, 2 włókna prebiotyczne sprzyjające kolonizacji pochwy przez te 2 probiotyki. Niewielkie musowanie spowodowane było obecnością 64 mg kwasu cytrynowego i 56 mg wodorowęglanu sodu, a jego celem było szybkie stworzenie beztlenowego mikrośrodowiska pochwy, sprzyjającego wzrostowi probiotyków oraz z drugiej strony wywołującego efekt barierowy dla drożdżaków Candida, które, ze względu na fakt iż są drobnoustrojami oddychającymi, nie są zdolne do wzrostu w warunkach beztlenowych. 34 Przyjęty protokół był przeważnie zgodny z instrukcjami stosowania tego handlowego preparatu, dlatego pacjentki poinstruowano, aby stosowały tabletkę dopochwową raz dziennie przez 7 kolejnych dni, najlepiej przed udaniem się do łóżka. Następnie, aby utrzymać kolonizację pochwy 2 probiotykami, pacjentki stosowały 1 tabletkę co 3 noce przez kolejne 3 tygodnie leczenia. Dlatego ostra faza leczenia trwała łącznie 4 tygodnie. W kolejnym miesiącu, aby utrzymać długoterminową kolonizację pochwy chroniącą przed możliwymi nawrotami, pacjentki stosowały 1 tabletkę na tydzień. Pacjentkom zabroniono stosowania innych miejscowych dopochwowych lub ogólnoustrojowych leków przeciwgrzybiczych w jakimkolwiek okresie podczas trwania badania. Zabroniono im także stosowania antybiotyków lub innych probiotyków, nawet tych, przyjmowanych doustnie, przez cały czas trwania badania. Badanie lekarskie pochwy u każdej pacjentki, obejmujące pobranie wymazów z pochwy do hodowli drożdżaków, było wykonywane bezpośrednio w Oddziale Ginekologicznym prywatnej kliniki na początku, po zakończeniu pierwszych 4 tygodni leczenia i na koniec drugiego miesiąca prewencji przeciwnawrotowej.

6 Pobieranie wymazów z pochwy i hodowle drożdżaków Podczas każdej wizyty (wyjściowo, d 0 ; koniec fazy ostrego leczenia, d 28 ; koniec drugiego miesiąca, d 56 ), pobierano wymazy z pochwy na posiew. Po pobraniu wymazu, był on natychmiast umieszczany w polipropylenowej probówce transportowe ESwab z nakrętką, wypełnionej 1 ml podłoża transportowego Liquid Amies (BD Italia), przechowywany w temperaturze 4 C i dostarczany do laboratorium w ciągu 24 godzin od pobrania. Przy odbiorze izolatów klinicznych, probówki ESwab z próbkami były krótko wytrząsane na wytrząsarce vortex i następnie wacik był usuwany, zgodnie z instrukcjami producenta. Podłoże z wymazem (100 μl) było posiewane na agar z ekstraktem drożdżowym, glukozą i chloramfenikolem (YGC) (Sigma-Aldrich). Wszystkie płytki z agarem inkubowano w warunkach tlenowych w temperaturze 25 C przez 24 do 48 godzin dla umożliwienia wzrostu wszelkich obecnych drożdżaków. Następnie dokonywano identyfikacji na poziomie gatunku przy użyciu systemu API 20C AUX (BioMérieux, Florencja, Włochy). Dokładniej mówiąc, 2 kolonie drożdżaków zbierano z każdej płytki agarowej, osobno posiewano do ampułek z roztopionym (50 C) podstawowym podłożem API i każdą zawiesinę standaryzowano do gęstości poniżej 1+ (linie można wyraźnie odróżnić) na karcie Wickerhama. Posiew wykonywano w każdej miseczce na pasku (20 miseczek; około 0,2 ml w każdej) za pomocą pipety Pasteura i tacki inkubowano przez 72 godziny w temperaturze 30 C. Miseczki wykazujące zmętnienie nieznacznie wyraźniejsze niż w miseczce z kontrolą ujemną (miseczka 0 ), były uważane za dodatnie. Identyfikacji dokonywano generując mikrokod i wykorzystując Wskaźnik Profilu Analitycznego API 20C AUX. 35 Aby mieć większą wiarygodność wyniku, wykorzystywano 2 kolonie. Oceny obecności drożdżaków w wymazach z pochwy oraz identyfikacji Candida na poziomie gatunku dokonywano w Biolab Research. Analiza statystyczna Osoba z zakażeniem Candida, potwierdzonym zarówno badaniem mikroskopowym jak i hodowlą drożdżaków, była oznaczana X. Analizę statystyczną testem t dla par stosowano dla zważenia wyników i porównania ich pomiędzy d 28 a d 0, d 56 a d 0 oraz pomiędzy d 56 a d 28. Różnice były uważane za znamienne przy wartości p 0,05. WYNIKI Aktywność antagonistyczna in vitro wybranych szczepów probiotyków względem drożdżaków Candida Molekularne odciski palców 3 szczepów badanych pod kątem ich aktywności in vitro przeciw Candida, są przedstawione na Rycinie 1. Wszystkie probiotyki wykazywały znaczną aktywność antagonistyczną w stosunku do 5 badanych szczepów Candida, przy czym 2 szczepy L. fermentum wykazywały znacznie większa aktywność niż L. acidophilus LA02. Nie odnotowano istotnych różnic pomiędzy świeżymi hodowlami bulionowymi a próbkami liofilizowanymi żadnej z bakterii probiotycznych, wykazując w ten sposób, że pomimo rozsądnie umiarkowanie dłuższej fazy opóźnienia na samym początku inkubacji, działanie bakterii probiotycznej przeciw swoistemu organizmowi docelowemu może być także w pełni wywierane przez kulturę liofilizowaną, postać powszechnie stosowaną w produktach dostępnych na rynku. Wyniki są wyrażone jako odsetki hamowania wzrostu Candida po 24 i 48 godzinach inkubacji oraz jako stopień hamowania wyrażony jako log 10. Przedstawiono także porównanie pomiędzy zliczeniami

7 żywych komórek Candida po 24 lub 48 godzinach i w materiale inokulacyjnym czasu 0 (Tabela 1). RYCINA 1. Profil odcisków palców (elektroforeza żelu w polu pulsującym) szczepów Lactobacillus fermentum LF10 (DSM 19187), L. fermentum LF11 (DSM 19188) oraz Lactobacillus acidophilus LA02 (DSM 21717). A, L. fermentum LF10 i L. fermentum LF11 (enzym Xbal), (1) Marker elektroforetyczny, Sigma 50 do 1000kb; (2) szczep porównawczy, L. fermentum ID 1323; (3) szczep porównawczy, L. fermentum LF5 (CNCM I-789); (4) szczep badany, L. fermentum LF10; (5) szczep badany, L. fermentum LF11; (6) szczep porównawczy, L. fermentum DSM B, L. acidophilus LA02 (enzym Smal). (1) Marker elektroforetyczny, Sigma 50 do 1000kb; (2) szczep porównawczy, L. acidophilus DSM 20079; (3) szczep badany, L. acidophilus LA02. L. acidophilus LA02, dołączony jako kontrola ujemna, jest probiotykiem zdolnym do wywoływania tylko nieswoistych efektów hamujących, w których mediatorami są wytwarzane kwasy organiczne i następowe obniżenie wartości ph. Ponieważ gatunek L. acidophilus ma metabolizm homofermentacyjny, jedynym wytwarzanym kwasem organicznym jest kwas mlekowy. Najistotniejsze różnice odnotowano po 24 godzinach, kiedy L. acidophilus LA02 był na ogół zdolny do hamowania wzrostu jedynie 56,7% do 93,3% komórek Candida w porównaniu do próbek drożdżaków hodowanych bez dodatków. L. fermentum LF10 i LF11 były zdolne do hamowania nie mniej niż 98% Candida po 24 godzinach, średnie wartości wynosiły około 99,8%. Różnice te są znacznie wyraźniejsze, gdy są wyrażone w postaci logarytmów dziesiętnych, w zakresie od 1,70 do 4,19 po 24 godzinach w przypadku L. fermentum, w porównaniu do wartości od 0,37 do 1,17, odnotowanych w przypadku L. acidophilus LA02. Co więcej, po 24 godzinach zaobserwowano znaczny wzrost Candida we wspólnej hodowli z L. acidophilus LA02 (różnica w stosunku do czasu 0 od 83,9 do 2280 razy), podczas gdy w obecności żadnego ze stosowanych szczepów L. fermentum nie odnotowano istotnego wzrostu w stosunku do materiału inokulacyjnego. W istocie, różnice wynosiły od 0,10, co oznaczało 10-krotne zmniejszenie, do wartości 61,0 odnotowanej w przypadku C. glabrata ATCC 2001, rzeczywiście najbardziej opornego szczepu drożdżaków.

8 Po 48 godzinach, bakteria L. acidophilus LA02 była zdolna do wywołania niewielkiej śmiertelności tylko drożdżaków C. krusei ATCC 6258 (różnica w stosunku do czasu 0=0,8), podczas gdy wszystkie pozostałe szczepy Candida były zdolne do wzrostu (różnica w stosunku do czasu 0 wynosiła od 24,9 do 1170). W każdym razie, zliczenia żywych komórek Candida były zawsze wyższe po 24 godzinach niż po 48 godzinach, co oznaczało, że kwas mlekowy wytwarzany przez L. acidophilus LA02 potrzebuje trochę czasu, aby nieswoiście ograniczyć wzrost drożdżaków. W przeciwieństwie do tego, oba probiotyki L. fermentum wykazały bardzo silne hamowanie wzrostu wszystkich szczepów Candida po 48 godzinach. W wielu próbkach, odzyskiwano <10 CFU/mL bulionu. C. parapsilosis ATCC wydawał się być względnie najbardziej opornym szczepem, nawet jeśli odnotowano zahamowanie o 3,5 log 10 w przypadku obu bakterii L. fermentum, w porównaniu do 1,46 w przypadku L. acidophilus. Rycina 2 przedstawia kinetykę wzrostu szczepu C. albicans ATCC 10231, hodowanego albo bez albo w obecności poszczególnych probiotyków, stosowanych w postaci próbek liofilizowanych. Wyniki dla kultur liofilizowanych, oceniane przy użyciu C. albicans ATCC jako wskaźnika aktywności, są podobne do wartości odnotowanych dla świeżych hodowli bulionowych, sugerując w ten sposób, że status fizyczny populacji bakterii nie może wpływać ilościowo na jej zdolność do wywoływania silnego ochronnego efektu barierowego w stosunku do Candida. Większy materiał inokulacyjny C. albicans ATCC 10231, w porównaniu do poprzedniego eksperymentu, czynił różnicę w stopniach hamowania pomiędzy obiema bakteriami L. fermentum a L. acidophilus, jeszcze wyraźniejszą. Wyniki badania skuteczności in vivo u ludzi Wszystkie pacjentki ukończyły leczenie, co oznaczało, że nie było żadnych wypadnięć, co potwierdza bardzo dobry profil tolerancji preparatu ActiCand 30. W badaniu na koniec pierwszych 4 tygodni stosowania produktu, przeprowadzonym zarówno z oceną mikroskopową, jak i hodowlą drożdżaków, pełne wyleczenie i zniknięcie zakażenia Candida stwierdzono u 26 pacjentek spośród 30 (86,6%, p <0,001) (Tabele 2 i 3). Ponadto, nie wystąpił ani nie był zgłaszany żaden nawrót po pierwszym tygodniu leczenia 1 tabletką dziennie, co sugeruje, że stosowanie 1 tabletki co 3 noce w okresie kolejnych 3 tygodni jest wystarczające dla całkowitego zapobieżenia nawrotom, gdy probiotyki z ActiCand 30 są już zintegrowane z florą bakteryjną pochwy. Na koniec drugiego miesiąca, podczas którego pacjentkom nakazano stosowanie 1 tabletki co 7 dni, odnotowano epizod nawrotu, chociaż niezbyt poważny, tylko u 3 spośród 26 pacjentek (11,5%, p = 0,083), które były w pełni wyleczone na koniec pierwszego miesiąca leczenia. W każdym razie, porównanie statystyczne pomiędzy wynikami na koniec drugiego miesiąca a czasem 0, ciągle jest istotne (p <0,001) (Tabela 3). Gatunki Candida, odpowiedzialne za VVC rozpoznaną w czasie rekrutacji zostały zidentyfikowane (Tabela 4). OMÓWIENIE Wyniki hamowania in vitro silnie sugerowały, że mechanizm działania probiotyków L. fermentum jest przynajmniej częściowo oparty na swoistych cząsteczkach, innych niż kwasy organiczne, takich jak bakteriocyny, białka zewnątrzkomórkowe lub nadtlenek wodoru. Innymi słowami, sama tylko kwasowość nie hamowała wzrostu poszczególnych szczepów Candida w takim samym stopniu co L. fermentum LF10 i LF11. Główną różnicą było to, że L. acidophilus

9 LA02 był zdolny jedynie do ograniczania wzrostu Candida we wspólnej hodowli, w porównaniu do wzrostu hodowli samych drożdżaków, podczas gdy oba szczepy L. fermentum nie tylko zapobiegały wszelkiemu znaczącemu wzrostowi Candida po 24 godzinach, ale także wykazywały zauważalną drobnoustrojobójczą aktywność po 48 godzinach. TABELA 1. Aktywność Lactobacillus fermentum LF10, L. fermentum LF11 i Lactobacillus acidophilus LA02 hamująca wzrost 5 drożdżaków Candida (A) lub Candida albicans ATCC (B) Czas Próbka C.albicans ATCC Candida parapsilosis ATCC Candida krusei ATCC 6258 C.albicans ATCC Candida glabrata ATCC 2001 (A) Świeże hodowle bulionowe Tylko drożdżaki Czas 0 (materiał inokulacyjny) 24 godz. Tylko drożdżaki Drożdżaki + LF % zahamowania wzrostu* 99,994 99,550 99,636 99,917 99,895 Hamowanie jako log 10 4,19 2,35 2,44 3,08 2,98 Zmiana w stosunku do 0,10 0,87 1,28 3,08 12,60 Drożdżaki + LF % zahamowania wzrostu* 99,987 98,000 99,909 99,907 99,492 Hamowanie jako log 10 3,87 1,70 3,04 3,03 2,29 Zmiana w stosunku do 0,21 3,87 0,32 3,45 61,00 Drożdżaki + LA % zahamowania wzrostu* 93,264 56,667 57,576 90,208 81,000 Hamowanie jako log 10 1,17 0,36 0,37 1,01 0,72 Zmiana w stosunku do 106,12 83,87 149,73 361, ,00 48 godz. Tylko drożdżaki Drożdżaki + LF % zahamowania wzrostu* 100,000 99,969 99, , ,000 Hamowanie jako log 10 5,81 3,50 3,48 5,64 5,39 Zmiana w stosunku do 0,003 0,355 0,481 0,015 0,137 Drożdżaki + LF % zahamowania wzrostu* 100,000 99, , , ,000 Hamowanie jako log 10 6,65 3,50 5,95 5,99 6,45 Zmiana w stosunku do 0,000 0,355 0,002 0,007 0,012 Drożdżaki + LA % zahamowania wzrostu* 98,644 96,571 99,944 99,330 96,559 Hamowanie jako log 10 1,87 1,46 3,26 2,17 1,46 Zmiana w stosunku do 24,90 38,71 0,80 45, ,00 (B) Kultury liofilizowane Tylko drożdżaki Czas 0 (materiał inokulacyjny) 24 godz. Tylko drożdżaki Drożdżaki + LF % zahamowania wzrostu* 99,996 Hamowanie jako log 10 4,44 Zmiana w stosunku do 0,006 Drożdżaki + LF11 60 % zahamowania wzrostu* 99,999 Hamowanie jako log 10 5,16 Zmiana w stosunku do 0,001 Drożdżaki + LA % zahamowania wzrostu* 96,860 Hamowanie jako log 10 1,50 Zmiana w stosunku do 5, godz Tylko drożdżaki Drożdżaki + LF10 1 % zahamowania wzrostu* 100,000 Hamowanie jako log 10 8,04 Zmiana w stosunku do 0,000 Drożdżaki + LF11 0 % zahamowania wzrostu* 100,000 Hamowanie jako log 10 8,04

10 Zmiana w stosunku do 0,000 Drożdżaki + LA % zahamowania wzrostu* 99,891 Hamowanie jako log 10 2,96 Zmiana w stosunku do 2,400 Probiotyki stosowano albo w postaci świeżych hodowli bulionowych, albo w postaci kultur liofilizowanych. Zliczenia żywych komórek Candida (wartości podane wytłuszczonym drukiem) są wyrażone jako CFU/mL. *Odsetek komórek Candida niezdolnych do wzrostu w obecności szczepu probiotycznego po 24 lub 48 godzinach inkubacji. Porównanie przeprowadzono w stosunku do liczby komórek Candida hodowanych bez dodatku, przez ten sam okres. Liczba logarytmów dziesiętnych hamowania, spowodowanego każdym z probiotyków po 24 lub 48 godzinach inkubacji. Wartości <1 przedstawiają hamowanie o <1 rząd wielkości, podczas gdy wartości >1 oznaczają zmniejszenie liczby komórek Candida co najmniej >10-krotne. Porównanie przeprowadzono w stosunku do liczby komórek Candida hodowanych bez dodatku, przez ten sam okres. Krotność zmiany w stosunku do czasu 0 (materiał inokulacyjny). Wartości <1 przedstawiają zmniejszenie liczby drożdżaków, podczas gdy liczby >1 oznaczają wzrost badanych szczepów Candida w porównaniu do materiału inokulacyjnego w czasie 0. Jeden z dwóch szczepów L. fermentum został wybrany do stworzenia nowego dopochwowego preparatu probiotycznego ActiCand 30 wraz ze szczepem L. acidophilus LA02, zastosowanym w celu znaczniejszego odtwarzania kompleksu pochwowych pałeczek Döderleina. 36 Przy określaniu formulacji preparatu dopochwowego, zawsze należy brać pod uwagę fakt, że sposób dostarczenia probiotyków do środowiska pochwy na znaczenie kluczowe. Wyniki uzyskane w tym pilotażowym badaniu skuteczności u ludzi wykazują skuteczność ActiCand 30 w ustanawianiu i utrzymywaniu efektu bariery ochronnej przeciw zakażeniom pochwy drożdżakami Candida, dobrze znanymi jako czynniki wywołujące nawet ciężkie zapalenie pochwy, zdolne do nawrotów i ciężkiego upośledzenia ogólnej jakości życia zakażonych kobiet. Wyniki wykazały, że większość zakażeń drożdżakowych była wywołana gatunkami C. albicans (80,0%) i jest to zgodne z danymi opisywanym i w literaturze. Dwa z trzech nawrotów odnotowanych w drugim miesiącu badania zostały przypisane C. albicans, a pozostały przypadek gatunkowi C. krusei, nawet jeżeli nie był to prawdziwy nawrót tej samej, wcześniej istniejącej infekcji. W czasie rekrutacji nie stwierdzono żadnego dodatniego posiewu w kierunku C. krusei. Kobieta, która miała dodatni wynik dla C. krusei w d 56, miała rozpoznanie zakażenia C. albicans w d 0. Zakażenie to zostało całkowicie wyleczone na koniec pierwszego miesiąca (d 28 ) leczenia, dlatego należałoby to rozpatrywać raczej jako nowe zakażenie, niż klasyczny nawrót. W każdym razie, liczba komórek C. krusei zliczonych na agarze YGC wynosiła <10, a badanie wzrokowe błony śluzowej pochwy także sugerowało bardzo łagodne zakażenie. Zdyscyplinowanie pacjentek i profil tolerancji były bardzo dobre, ponieważ przez cały czas trwania badania nie odnotowano przypadku wypadnięcia z badania. Preparat ActiCand30 został specjalnie opracowany w postaci tabletek musujących o przedłużonym uwalnianiu tak, aby szybko tworzył beztlenowe mikrośrodowisko pochwy po podaniu, które byłoby zdolne do utrzymywania się przez co najmniej 40 do 60 minut, ponieważ czas rozpadu pojedynczej tabletki wynosi około 30 minut. Anaerobioza jest dobrze znanym czynnikiem sprzyjającym kolonizacji i proliferacji pałeczek kwasu mlekowego i ogólnie endogennej mikroflory Döderleina, równocześnie ograniczającym wzrost Candida spp. ze względu na wymagania tlenowe drożdżaków. W przeciwieństwie do tego, do ustanowienia ochronnego działania barierowego, wywieranego przez 2 probiotyki, L. fermentum LF10 i L. acidophilus LA02, potrzebny jest dłuższy czas.

11 Kinetyka wzrostu C. albicans ATCC hodowanego bez i w obecności różnych szczepów probiotycznych Liczba komórek Same drożdżaki Drożdżaki + LF10 Drożdżaki + LF11 Drożdżaki + LA02 Czas (godz.) RYCINA 2. Kinetyka wzrostu szczepu Candida albicans ATCC inkubowanego albo bez, albo w obecności poszczególnych szczepów Lactobacillus fermentum LF10, L. fermentum LF11, lub Lactobacillus acidophilus LA02. TABELA 2. Częstość występowania zakażeń Candida na początku badania (Czas 0), po 4 tygodniach leczenia (Czas 28) i na koniec drugiego miesiąca badania (Czas 56) Zakażenie Candida Pacjentki Wiek Menopauza Czas 0 Czas 28 Czas 56 A.R. 45 Nie X L.C 36 Nie X X M.T 51 Nie X L.M. 58 Tak X R.R. 23 Nie X X X L.C. 32 Nie X T.T. 38 Nie X M.R. 61 Tak X L.S 26 Nie X M.S. 28 Nie X X O.R. 36 Nie X P.M. 44 Nie X S.D. 40 Nie X X X A.B. 49 Tak X D.U. 52 Tak X M.F. 32 Nie X X X V.L. 30 Nie X V.M. 38 Nie X P.L. 55 Tak X S.A. 27 Nie X M.B. 33 Nie X S.R. 36 Nie X T.I. 39 Nie X A.B. 64 Tak X X J.P. 54 Tak X R.F. 43 Nie X E.S. 30 Nie X E.T. 53 Tak X F.B. 32 Nie X X X F.G. 41 Nie X Podsumowując, ActiCand 30 pośredniczy w 2 swoistych, chronologicznie odrębnych działaniach: Krótkotrwałe działanie barierowe, wywoływane przez CO 2 uwalniany podczas powolnego rozpadu tabletki. CO 2 częściowo może także obniżać wartość ph pochwy po uwodnieniu i

12 późniejszym wytworzeniu kwasu węglowego, będącego kwasem dwuzasadowym, mogącym dysocjować na jon wodorowęglanowy HCO 3 - i H + ; Długotrwałe, ochronne działanie barierowe, zapewniane przez kolonizację pochwy mikroflorą 2 probiotyków, zdolnych do odtworzenia kompleksu pałeczek Döderleina, zwykle eliminowanego w przypadkach kandydozy. Te dobroczynne bakterie mogą pośredniczyć zarówno w działaniu mechanicznym (współzawodnictwo o miejsca przylegania do błony śluzowej), jak i w aktywności metabolicznej polegającej na wytwarzaniu kwasów organicznych i innych, bardziej swoistych cząsteczek, zwłaszcza bakteriocyn. 37 Szczególnie interesująca jest także zdolność tego preparatu do zapobiegania nawrotom, które są bardzo częstym problemem w VVC. Całkowita skuteczność ActiCand 30 może być rozpatrywana jako bardzo podobna do większości dostępnych na rynku produktów tradycyjnie stosowanych i stosowanych w przeszłości w leczeniu zapalenia sromu i pochwy lub w zapobieganiu temu zapaleniu wywołanemu przez Candida. Ponadto, preparat ten posiada cenną zaletę braku jakichkolwiek działań niepożądanych, ponieważ pałeczki kwasu mlekowego stanowią integralną i pożądaną cześć endogennej flory bakteryjnej pochwy. TABELA 3. Przegląd danych i analiza statystyczna Parametry Czas 0 Czas 28 p (Cz 28 wobec Cz0) Czas 56 p (Cz 56 wobec Cz0) p (Cz 56 wobec Cz28) Łączna liczba kobiet z 30 4 <0,001 7 <0,001 zakażeniem Łączna liczba kobiet bez zakażenia Odsetek wyleczeń 86,67% 76,67% Łączna liczba kobiet z 0 3 0,083 nawrotami Odsetek nawrotów 11,54% TABELA 4. Identyfikacja gatunków w izolatach drożdżaków z pochwy. Odsetki poszczególnych gatunków Candida w Czasie 28 i 56 odnoszą się do całkowitej liczby kobiet z dodatnim wynikiem posiewu w kierunku drożdżaków Gatunek Candida Czas 0 N = 30 Czas 28 N = 4 Czas 56 N = 7 Candida albicans 24 (80,0%) 1 (25,0%) 3 (42,8%) Candida glabrata 2 (6,7%) 1 (25,0%) 1 (14,3%) Candida parapsilosis 1 (3,3%) 0 0 Candida tropicalis 1 (3,3%) 1 (25,0%) 1 (14,3%) Candida krusei (14,3%) Inne gatunki Candida 2 (6,7%) 1 (25,0%) 1 (14,3%) Drobnoustroje inne niż Candida Łączna liczba dodatnich posiewów na Candida 30 (100,0%) 4 (100,0%) 7 (100,0%) Potrzebne będą dalsze oceny dla pełnej identyfikacji i scharakteryzowania cząsteczek leżących u podstaw mechanizmu działania L. fermentum LF10 i LF11 na drożdżaki Candida. Badanie to jeszcze bardziej wzmacnia siłę dowodów popierających stosowanie swoistych szczepów probiotycznych o dobrze wykazanych właściwościach, w celu wytworzenia i utrzymania mikrośrodowiska pochwy, które nie będzie sprzyjać pojawianiu się, rozwojowi lub utrzymywaniu się zakażeń wywołanych przez Candida, nie tylko w odniesieniu do gatunku C. albicans, ale także C. glabrata, C. parapsilosis i C. krusei.

13 PIŚMIENICTWO 1. Marelli G, Papaleo E, Ferrari A. Lactobacilli for prevention of urogenital infections: a review. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2004;8: Verstraelen H. Cutting edge: the vaginal microflora and bacterial vaginosis. Verh K Acad Geneeskd Belg. 2008;70: Kim J, Sudbery P. Candida albicans, a major human fungal pathogen. J Microbiol. 2011;49: Achkar JM, Fries BC. Candida infections of the genitourinary tract. Clin Microbiol Rev. 2010;23: Mahmoudi Rad M, Zafarghandi S, Abbasabadi B, et al. The epidemiology of Candida species associated with vulvovaginal candidiasis in an Iranian patient population. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2011;155: Cetin M, Ocak S, Gungoren A, et al. Distribution of Candida species in women with vulvovaginal symptoms and their association with different ages and contraceptive methods. Scand J Infect Dis. 2007;39: Sobel JD, Faro S, Force RW, et al. Vulvovaginal candidiasis: epidemiologic, diagnostic, and therapeutic considerations. Am J Obstet Gynecol. 1998;178: Sobel JD. Epidemiology and pathogenesis of recurrent vulvovaginal candidiasis. Am J Obstet Gynecol. 1985;152: Sobel JD, Wiesenfeld HC, Martens M, et al. Maintenance fluconazole therapy for recurrent vulvovaginal candidiasis. N Engl J Med. 2004;351: Babic M, Hukic M. Candida albicans and non-albicans species as etiological agent of vaginitis in pregnant and nonpregnant women. Bosn J Basic Med Sci. 2010;10: Fidel PL Jr, Sobel JD. Immunopathogenesis of recurrent vulvovaginal candidiasis. Clin Microbiol Rev. 1996;9: Anderson MR, Klink K, Cohrssen A. Evaluation of vaginal complaints. JAMA. 2004;291: Pappas PG, Kauffman CA, Andes D, et al. Infectious Diseases Society of America. Clinical practice guidelines for the management of candidiasis: 2009 update by the Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis. 2009;48: Hill DR, Brunner ME, Schmitz DC, et al. In vivo assessment of human vaginal oxygen and carbon dioxide levels during and post menses. J Appl Physiol. 2005;99: Wira CR, Fahey JV, Ghosh M, et al. Sex hormone regulation of innate immunity in the female reproductive tract: the role of epithelial cells in balancing reproductive potential with protection against sexually transmitted pathogens. Am J Reprod Immunol. 2010;63: Nansel TR, Riggs MA, Yu KF, et al. The association of psychosocial stress and bacterial vaginosis in a longitudinal cohort. Am J Obstet Gynecol. 2006;194: Geiger AM, Foxman B. Risk factors for vulvovaginal candidiasis: a case-control study among university students. Epidemiology. 1996;7: Kent HL. Epidemiology of vaginitis. Am J Obstet Gynecol. 1991;165: Parveen N, Munir AA, Din I, et al. Frequency of vaginal candidiasis in pregnant women attending routine antenatal clinic. J Coll Physicians Surg Pak. 2008;18: Quan M. Vaginitis: diagnosis and management. Postgrad Med.2010;122: Sobel JD. Recurrent vulvovaginal candidiasis: a prospective study of the efficacy of maintenance ketoconazole therapy.n Engl J Med. 1986;4: Merkus JM, Van Heusden AM. Chronic vulvovaginal candidosis: the role of oral treatment. Br J Clin Pract Suppl. 1990;71: Lewis JH, Zimmerman HJ, Benson GD, et al. Hepatic injury associated with ketoconazole therapy: analysis of 33 cases. Gastroenterology. 1984;86: Do derlein A. Vaginal Secretions and their Impotance in the Postpartum Period. Leipzig Falagas ME, Betsi GI, Athanasiou S. Probiotics for prevention of recurrent vulvovaginal candidiasis: a review. J Antimicrob Chemother. 2006;58: Nishijima K, Shukunami K, Kotsuji F. Probiotics affects vaginal flora in pregnant women, suggesting the possibility of preventing preterm labor. J Clin Gastroenterol. 2005;39: Ro nnqvist PD, Forsgren-Brusk UB, Grahn-Ha kansson EE. Lactobacilli in the female genital tract in relation to other genital microbes and vaginal ph. Acta Obstet Gynecol Scand. 2006;85: Strus M, Kucharska A, Kukla G, et al. The in vitro activity of vaginal Lactobacillus with probiotic properties against Candida. Infect Dis Obstet Gynecol. 2005;13: Mastromarino P, Brigidi P, Macchia S, et al. Characterization and selection of vaginal Lactobacillus strains for the preparation of vaginal tablets. J Appl Microbiol. 2002;93: Byun R, Nadkarni MA, Chhour KL, et al. Quantitative analysis of diverse Lactobacillus species present in advanced dental caries. J Clin Microbiol. 2004;42: Walter J, Tannock GW, Tilsala T, et al. Detection and identification of gastrointestinal Lactobacillus species by using denaturing gradient gel electrophoresis and species-specific PCR primers. Appl Environ Microbiol. 2000;66: Tynkkynen S, Satokari R, Saarela M, et al. Comparison of ribotyping, randomly amplified polymorphic DNA analysis, and pulsed-field gel electrophoresis in typing of Lactobacillus rhamnosus and L. casei strains. Appl Environ Microbiol. 1999; 65: Sobel JD, Kapernick PS, Zervos M, et al. Treatment of complicated Candida vaginitis: comparison of single and sequential doses of fluconazole. Am J Obstet Gynecol. 2001; 185: Walker GM. Yeast Physiology and Biotechnology. Baffins Lane, Chichester, UK: John Wiley & Sons Ltd; Espinel-Ingroff A, Stockman L, Roberts G, et al. Comparison of RapID yeast plus system with API 20C system for identification of common, new, and emerging yeast pathogens. J Clin Microbiol. 1998;36: Lepargneur JP, Rousseau V. Protective role of the Doderleı n flora. J Gynecol Obstet Biol Reprod (Paris). 2002;31:

14 37. Gillor O, Etzion A, Riley MA. The dual role of bacteriocins as anti- and probiotics. Appl Microbiol Biotechnol. 2008;81: