Molekularna diagnostyka sepsy i sekwencjonowanie następnej generacji. (NGS) - czyli co możemy jeszcze zrobić? Dr hab.

HTML
DOWNLOAD

Wielkość: px

Rozpocząć pokaz od strony:

Download "Molekularna diagnostyka sepsy i sekwencjonowanie następnej generacji. (NGS) - czyli co możemy jeszcze zrobić? Dr hab."

Nadzieja Bednarczyk
7 lat temu
Przeglądów:

1 Molekularna diagnostyka sepsy i sekwencjonowanie następnej generacji Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum Wydział Lekarski (NGS) - czyli co możemy jeszcze zrobić? Katedra Mikrobiologii Zakład Molekularnej Mikrobiologii Medycznej Dr hab. Tomasz Gosiewski

2 SEPSA Sepsa (dawniej posocznicą) jest częstym i niejednorodnym zespołem klinicznym, który definiuje się jako całokształt zjawisk patofizjologicznych określanych mianem ogólnoustrojowej reakcji zapalnej (systemic inflammatory response syndrome SIRS), wywołanych zakażeniem Sepsa jest stanem zagrażającym życiu, który powstaje, gdy reakcja organizmu na zakażenie uszkadza własne tkanki i narządy SOFA (sequential organ failure assessment score)

3 Postacie sepsy ze względu na patogenezę SEPSA drobnoustroje toksemia DNAemia bakteriemia fungemia

4 Czy sepsa nadal jest poważnym problemem? Antybiotyki, chemioterapeutyki diagnostyka Zaawansowana chirurgia Technologie terapeutyczne

5 Sepsa czy to nadal istotny problem?

6 Skuteczna walka z sepsą Podejrzenie - SOFA (klinika) diagnostyka (laboratorium) leczenie

Diagnostyka sepsy tzw. klasyczna. Do tej pory tzw. złotym standardem diagnostycznym są hodowle krwi prowadzone na specjalnych podłożach, najlepiej w systemach hodowli automatycznej.

7 Diagnostyka sepsy tzw. klasyczna. Do tej pory tzw. złotym standardem diagnostycznym są hodowle krwi prowadzone na specjalnych podłożach, najlepiej w systemach hodowli automatycznej. Do zalet tych metod należy ich prostota oraz względnie niski koszt wykonania badania. Słabą stroną metody opartej na hodowli krwi jest jej czasochłonność, sięgająca nawet 5 dni (do czasu wydania wyniku badania) oraz niska czułość, która powoduje że jedynie w ok % hodowli udaje się uzyskać wzrost mikroorganizmów. KOMÓRKI MIKROORGANIZMÓW MUSZĄ CHCIEĆ SIĘ HODOWAĆ

8 Aparat BACTEC 9050 (Becton-Dickinson)

9 Aparat BacT/ALERT oraz podłoża

10 Źródła infekcji w sepsie

11 Mikrobiom człowieka Powszechnie znane nisze ekologiczne

12 Czy pozostałe rejony ciała są rzeczywiście fizjologicznie jałowe? Dolne drogi oddechowe (drzewo oskrzelowe)? Płyn owodniowy w macicy i łożysko? Centralny układ nerwowy (PMR)? Łożysko naczyniowe (krew)?

Scher JU, Joshua V, Artacho A, Abdollahi-Roodsaz S, Öckinger J,

13 Drzewo oskrzelowe The lung microbiota in early rheumatoid arthritis and autoimmunity. Scher JU, Joshua V, Artacho A, Abdollahi-Roodsaz S, Öckinger J, Kullberg S, Sköld M, Eklund A, Grunewald J, Clemente JC, Ubeda C, Segal LN, Catrina AI. Microbiome Nov 17;4(1):60.

14 Płyn owodniowy i łożysko Maternal microbiome - A pathway to preterm birth. Vinturache AE, Gyamfi-Bannerman C, Hwang J, Mysorekar IU, Jacobsson B; Preterm Birth International Collaborative (PREBIC).Semin Fetal Neonatal Med Apr;21(2):94-9. doi: /j.siny Epub 2016 Feb 28. Review.

Centralny układ nerwowy (PMR) 48 próbek PMR pacjenci z MS; 30 próbek zdrowi (kontrola) Cerebrospinal Fluid in a Small Cohort of Patients with Multiple Sclerosis Was Generally Free of Microbial

15 Centralny układ nerwowy (PMR) 48 próbek PMR pacjenci z MS; 30 próbek zdrowi (kontrola) Cerebrospinal Fluid in a Small Cohort of Patients with Multiple Sclerosis Was Generally Free of Microbial DNA. Jovel J, O'keefe S, Patterson J, Bording-Jorgensen M, Wang W, Mason AL, Warren KG, Wong GK. Front Cell Infect Microbiol Jan 6;6:198. doi: /fcimb ecollection 2016.

16 Centralny układ nerwowy (PMR) W dwóch próbkach: 3C i 26MS wykryto duże ilości DNA bakteryjnego DOWÓD NA ISTNIENIE MIKROBIOTA PMR???

fizjologicznej jałowości krwi w warunkach fizjologicznej homeostazy czy prawdziwy

17 Łożysko naczyniowe (krew) Sepsa nierozłącznie wiąże się z pojęciem bakteriemii lub toksemii Fizjologiczna bakteriemia Dogmat o tzw. fizjologicznej jałowości krwi w warunkach fizjologicznej homeostazy czy prawdziwy czy może podtrzymywany niedoskonałością klasycznej metody diagnostycznej opartej o hodowlę krwi (złoty standard)?

18 Metody biologii molekularnej KOMÓRKI MIKROORGANIZMÓW NIE MUSZĄ CHCIEĆ SIĘ HODOWAĆ

19 Zalety metod molekularnych w diagnostyce mikrobiologicznej Znaczne zwiększenie czułości wykrywania patogenu Możliwość wykrywania obecności bakterii nienamnażających się lub martwych - antybiotykoterapia Skrócenia czasu oczekiwania na wyniki badania do nawet kilku godzin.

20 Na rynku obecne są bardzo nieliczne zestawy diagnostyczne stosowane w molekularnej diagnostyce sepsy, takie jak np. SeptiFast (Roche), Magicplex Sepsis Real-time Test. Umożliwiają one detekcję wybranych gatunków lub grup drobnoustrojów, co umożliwia jedynie potwierdzenie zakażenia, lecz nie pozwala na jego wykluczenie

21 SeptiFast (Roche)

22 Magicplex Sepsis Real-time Test

23 Możliwe jest także alternatywne podejście, które polega na wykrywaniu wszystkich drobnoustrojów, (potwierdzenie, jak i wykluczenie sepsy) - pozwala na ogólne identyfikowanie drobnoustrojów jako Gram ujemnych i Gram dodatnich bakterii oraz grzybów drożdżowych i pleśniowych. Opracowanie skutecznych molekularnych metod wykrywania obecności bakterii i grzybów we krwi jest wciąż problemem wymagającym prac badawczych

24 Materiały: W badaniu wykorzystano krew od pacjentów wykazujących kliniczne objawy sepsy (n=62) oraz zdrowych wolontariuszy (n=23). Próbki pochodziły od pacjentów hospitalizowanych Krakowskim Szpitalu Specjalistyczny im. Jana Pawła II Projekt MNiSW ( ) N N Zgoda Komisji Bioetycznej UJ: KBET/94/B/2009

25 Opracowane metody molekularnej diagnostyki sepsy: 1. Wydajna metoda izolacji DNA drobnoustrojów z krwi 2. Detekcja DNA drobnoustrojów za pomocą Nestedmultipleks-PCR w czasie rzeczywistym (nmpcr). 3. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w pełnej krwi (FISH). 4. Sekwencjonowanie następnej generacji (NGS)

27 FISH Kontrola negatywna krew od zdrowej osoby Grupa badana pacjent z klinicznymi objawami sepsy

28 Grupa badana pacjent z klinicznymi objawami sepsy Grupa badana pacjent z klinicznymi objawami sepsy

29 Czy nie byłoby dobrze wykrywać wszystkie bakterie we krwi jednocześnie określając ich szczegółową taksonomię? Sekwencjonowanie następnej generacji NGS (Next-Generation Sequencing)

31 Izolacja DNA Próbka krwi Oczyszczone DNA sekwencjonowanie Sekwencjonowanie bibliotek 16S Namnożone regiony V4 i V3 16rRNA

32 Taksonomia bakterii Sekwencjonowanie NGS 16S umożliwia uzyskanie wiarygodnych wyników składu taksonomicznego bakterii do poziomu RODZAJU (genus). Różnicowanie na poziomie gatunków (species) jest mniej dokładne.

33 Metodyka

34 Metodyka Izolacja DNA bakteryjnego z próbek krwi Przygotowanie biblioteki

35 Sekwencjonowanie metodą NGS (sekwencjonowanie mostkowe przez syntezę z odwracalną terminacją) platforma MiSeq

36 Analiza danych QIIME

37 Rezultaty sekwencjonowania ngs 16S próbek krwi

38 Wyniki 1. W wyniku posiewu i hodowli krwi wykazano 30,6% pozytywnych próbek 2. Metoda NGS pozwoliła uzyskać potwierdzenie obecności DNA bakteryjnego we wszystkich badanych próbkach krwi (100%). 3. Bakteryjne DNA wykryto także w 100 % próbek krwi pobranych od osób zdrowych!!!

39 4. Generalnie obserwowano różnice w ilościowym składzie taksonomicznym między grupą zdrowych i pacjentów z sepsą 5. Bakterie z gromady Actinobacteria (głównie beztlenowe, Gram dodatnie) były bardziej liczne w grupie zdrowych niż w grupie z sepsą (od 76,3% do 31,0%) (P<0,001) 6. Podczas gdy liczebność Proteobacteria (głównie tlenowe pałeczki, Gram ujemne) wzrastała (zdrowi 16,4%, sepsa 60,1%); P<0,001)

40 Różnorodność bakterii na poziomie gromady w dwóch grupach pacjentów Gram ujemne tlenowe pałeczki Gram dodatnie tlenowe i beztlenowe ziarniaki i laseczki Gram dodatnie beztlenowe

41 Różnorodność bakterii na poziomie gromady w poszczególnych próbkach krwi

42 7. W grupie zdrowych osób istotnie dominowały bakterie beztlenowe (76,2%), z których większość należała do rzędu Bifidobacteriales (73,0%). 8. W grupie z sepsą, większość bakterii wywodziła się z grupy tlenowych i mikroaerofilnych mikroorganizmów (75,1%), t.j. Pseudomonadales, Rhizobiales, Enterobacteriales, Aeromonadales, Bacillales and Sphingomonadales i Cellulosimicrobium

43 Różnorodność bakterii na poziomie rzędu w dwóch grupach pacjentów

44 Zróżnicowanie taksonomiczne było istotnie różne (p = 0,002) Ocena stopnia a zróżnicowania taksonomicznego (w ramach grup badanych pacjentów) na podstawie wykresu PD whole tree. Czerwony kolor - próbki krwi zdrowych wolontariuszy; niebieski kolor - próbki krwi pacjentów z sepsą.

45 Zróżnicowanie taksonomiczne między grupami było istotnie różne (p < 0,001) Ocena stopnia β zróżnicowania taksonomicznego (pomiędzy badanymi grupami pacjentów) na podstawie wykresu PCoA (Principal Coordinates Analysis). Czerwony kolor - próbki krwi zdrowych wolontariuszy; niebieski kolor - próbki krwi pacjentów z sepsą.

46 Zastosowano kontrolę negatywną (NTC) w postaci próbki jałowej soli fizjologicznej. Jej celem było stwierdzenie, czy dochodzi do kontaminacji próbek krwi i odczynników w trakcie prowadzenia prac laboratoryjnych. Na żelu widoczne są wyniki amplifikacji bibliotek 16S uzyskanych z próbek krwi oraz negatywny wynik z kontroli NTC

47 Wnioski 1. Nasze badania wykazały, że we wszystkich próbkach występowało DNA bakteryjne (DNAemia).

48 PCT/IB2015/ zgłoszenie patentowe 2. Nasze badania przy wykorzystaniu metody NGS sugerują, że mikrobiota jelitowa w sposób ciągły może przedostawać się do krwi, na drodze translokacji, co ma miejsce u zdrowych osób (dominacja beztlenowców). 3. W grupie pacjentów z sepsą dominują tlenowe mikroorganizmy, co może wskazywać na zaburzenia układu immunologicznego, który nie eliminuje egzogennych czynników etiologicznych lub zwiększenie przepuszczalności śródbłonka. 3. Być może w sepsie mamy do czynienia z polietiologicznym zakażeniem, które nie jest wykrywane za pomocą obecnie stosowanych metod diagnostycznych.

49 Jałowa krew u pacjentów z sepsą i u zdrowych osób prawda czy mit?

51 Zespół badawczy Dr Dominika Salamon Mgr Agnieszka Sroka-Oleksiak Dr Paweł Wołkow Dr Agnieszka Ludwig-Gałęzowska Prof. Małgorzata Bulanda Prof. Rafał Drwiła Lek. Agnieszka Flis

Podobne dokumenty

Diagnostyka mikrobiologiczna zakażeń krwi Paweł Zwierzewicz

Diagnostyka mikrobiologiczna zakażeń krwi Paweł Zwierzewicz Diagnostyka mikrobiologiczna sepsy oferta firmy biomerieux Automatyczne analizatory do posiewów krwi Automatyczne analizatory do identyfikacji