9. Zastosowanie mikrofitobentosu w testach ekotoksykologicznych - metodologia

Transkrypt

1 9. Zastosowanie mikrofitobentosu w testach ekotoksykologicznych - metodologia Zuzanna Sylwestrzak, Aleksandra Zgrundo, Filip Pniewski 9.1. Wprowadzenie do pojęcia badań ekotoksykologicznych Termin ekotoksykologia został wprowadzony w 1969 roku przez Truhauta, a został zdefiniowany jako dział toksykologii poświęcony badaniom szkodliwego wpływu zanieczyszczeń pochodzenia naturalnego i antropogenicznego na elementy ekosystemów (zwierzęta, w tym ludzi, rośliny i mikroorganizmy) [Newman i Unger 2003]. Obecnie ekotoksykologia zajmuje się badaniem własności czynników toksycznych i negatywnymi skutkami ich oddziaływania na wszystkich poziomach organizacji przyrody począwszy od molekularnego poprzez komórkowy, organizmy, populacje i zbiorowiska do ekosystemów włącznie. Dzięki badaniom ekotoksykologicznym możliwe jest przewidzenie efektów wpływu zanieczyszczeń oraz podjęcie skutecznych i efektywnych działań w celu zapobieżenia rozprzestrzeniania się szkód w środowisku. Z kolei w ekosystemach, które już zostały zniszczone pod wpływem zanieczyszczeń, badania ekotoksykologiczne dają podstawy do stworzenia planu działań mających na celu odnowienie usług i funkcji realizowanych w ekosystemie. Pierwsze laboratoryjne testy toksyczności związków chemicznych opierające się o proste metody badawcze przeprowadzano już przed II wojną światową. Obecnie na świecie prowadzi się testy toksykologiczne na rozmaitych organizmach wchodzących w skład różnych poziomów piramidy troficznej, poczynając od. roślin, poprzez zwierzęta roślinożerne i drapieżne, kończąc na bakteriach. Testy prowadzone powszechnie na roślinach wykorzystują zarówno glony (zielenice, sinice, okrzemki), jak i rośliny wyższe wodne (np. rzęsa wodna) oraz lądowe (wykorzystując zarówno rośliny, jak i ich nasiona). Organizmy roślinne są szczególnie ważne dla ekosystemów ze względu na fakt, iż dostarczają tlenu, uczestniczą w obiegu materii oraz stanowią pożywienie dla innych organizmów. Stąd zmiany zachodzące w roślinach pod wpływem substancji toksycznych nie tylko będą ograniczać ich wzrost, ale również mogą bezpośrednio wpływać na strukturę i funkcjonowanie całego ekosystemu [Lewis 1995]. W testach ekotoksykologicznych prowadzonych na substancjach obecnych czy potencjalnie obecnych w środowisku wodnym coraz częściej jako materiał badawczy stosuje się tzw. mikrofitobentos czyli drobne organizmy tworzące specyficzną strukturę na dnie lub jego elementach. Formację tę tworzą między innymi mikroorganizmy, takie jak: sinice, drobne zielenice oraz okrzemki dominujące pod względem liczebności i biomasy [Round 1981]. Procesy zachodzące w mikrofitobentosie uważane są za analogiczne do tych, które zachodzą na poziomie organizmów posiadających wyższy stopień organizacji [Hoaglandi in. 1982, Bosserman 1983]. Organizmy tworzące tę formację doskonale nadają się do testów laboratoryjnych nie tylko ze względu na ich niewielkie rozmiary i prostą budowę, ale również na łatwość pozyskania materiału i względy etyczne Testy ekotoksykologiczne wykorzystujące mikroglony W testach ekotoksykologicznych wykorzystuje się najczęściej hodowle pojedynczych szczepów, które są stosunkowo łatwe do utrzymania w warunkach laboratoryjnych. Hodowle mikroorganizmów wykorzystywanych do fitotestów prowadzone są świecie powszechnie i często stanowią zasoby kolekcji kultur glonowych (np. Kolekcja Kultur Glonów Bałtyckich w Instytucie Oceanografii Uniwersytetu Gdańskiego, których celem jest izolacja i utrzymanie szczególnie rzadkich oraz endemicznych grup taksonomicznych, czy też o specyficznych właściwościach. Hodowla całych zbiorowisk jest rzadko spotykana. 74

2 Pomimo to zbiorowiska mikrofitobentosu w łatwy sposób pozyskuje się ze środowiska w celu wykorzystania ich w testach ekotoksykologicznych [Dahl i Blanck 1995, Blanck i in. 2009, Sylwestrzak i Zgrundo w druku, Sylwestrzak i Pniewski w druku]. W ten sposób testowane były różnego rodzaju substancje pochodzenia antropogenicznego. Na przykład dla zbiorowisk morskiego mikrofitobentosu przeprowadzano testy na substancjach i farbach antyporostowych [Blanck i in. 2009, Arrhenius i in. 2014], lekarstwach [Pérez i in. 2009] i kosmetykach [Mason i in. 1996] Zalety i wady testów ekotoksykologicznych przeprowadzanych na zbiorowiskach mikrofitobentosu W światowej literaturze spotyka się liczne przykłady testów ekotoksykologicznych prowadzonych na kulturach mikroglonów [np. Walsh i in. 1985, Admiral 1997, Peterson i in. 1994, Briand 2009, Latała i in. 2009]. Testy prowadzone na monokulturach glonów są prostymi doświadczeniami laboratoryjnymi, ale wymagają dużego nakładu sił i środków przy izolacji szczepów ze środowiska i ich utrzymaniu w hodowlach. Ponadto eksperymenty na monokulturach prowadzone w warunkach laboratoryjnych nie są w pełni wiarygodne, gdyż nie odzwierciedlają niezwykle ważnych interakcji pomiędzy organizmami, które zachodzą w środowisku naturalnym [Arrhenius i in. 2014]. W prowadzonych dotychczas testach ekotoksykologicznych na monokulturach glonów stosuje się szeroki wachlarz różnorodnych technik badawczych, co nie pozwala na jednoznaczne porównanie wyników. Zazwyczaj w laboratoryjnych testach toksyczności z zastosowaniem pojedynczych szczepów mikroglonów testuje się organizmy reprezentujące zaledwie od 1 % do 5 % zbiorowisk naturalnych [Briand 2009]. Najczęściej są to organizmy łatwe w hodowli, o małych wymaganiach ekologicznych. Z kolei zbiorowiska mikroglonów występujące w środowisku są silnie zróżnicowane i dobrze dostosowane do warunków lokalnych. Stąd testy prowadzone na naturalnych zbiorowiskach umożliwiają poznanie i lepsze zrozumienie działania substancji chemicznych na szerokie spektrum organizmów tworzących skomplikowane struktury powiązań troficznych, konkurencyjnych i paratroficznych. Łatwiej też poprawnie przewidzieć toksyczny wpływ badanych substancji na środowisko. Korzystając z tej wiedzy można również tworzyć i produkować nowe substancje chemiczne o znikomym szkodliwym działaniu lub działające wybiórczo. Literatura dotycząca badań prowadzonych nad mikrofitobentosem jest bogata i daje szerokie podstawy do praktycznego zastosowania tej formacji [np. Dahl i Blanck 1995, Underwood i in. 1999, Cohn i McGuire 2000, Underwood i in. 2004, De la Iglesia 2013]. W ostatnich latach znacząco wzrosła ilość publikacji dotyczących zastosowania całych zbiorowisk mikrofitobentosu w badaniach ekotoksykologicznych [np. Blanck i in. 2009, Arrhenius 2014]. Podobnie jak w przypadku testów prowadzonych na kulturach mikrooglonów, do tej pory nie stworzono jednolitego systemu oceny toksyczności substancji chemicznych. Jednak bazując na dotychczas prowadzonych pracach można opracować standardową metodykę badań. Niewątpliwie głównymi zaletami metody wykorzystującej zbiorowiska mikrofitobentosu jest wiarygodna ocena stopnia toksyczności substancji chemicznych pozwalająca na przewidzenie prawdopodobnej odpowiedzi ekosystemów wodnych na wprowadzane substancje pochodzenia antropogenicznego oraz jej wysoka efektywność i niska kosztochłonność [Arrhenius i in. 2014]. 75

3 9.4. Testy ekotoksykologiczne prowadzone na mikrofitobentosie pozyskanym z Zatoki Gdańskiej W badaniach prowadzonych na zbiorowiskach mikrofitobentosu pozyskanego z Zatoki Gdańskiej wykazano, iż testy toksykologiczne prowadzone na tej formacji ekologicznej dają miarodajne wyniki. Eksperymenty laboratoryjne prowadzono na chlorku 1-butylo-3-metyloimidazoliowym [BMIM]Cl z grupy cieczy jonowych. Związek ten ma szerokie zastosowanie w przemyśle, jest np. stosowany w przetwórstwie celulozy. Niewątpliwą zaletą tej substancji jest jej szybka biodegradacja. Fakt ten ma duże znaczenie zwłaszcza dla ekosystemów wodnych, które stanowią ostateczne odbiorniki wszelkiego rodzaju zanieczyszczeń. W trakcie badań eksperymentalnych zastosowano szerokie spektrum stężeń badanej substancji toksycznej (od 10-5 do 10-2 M). Stężenia w zakresie od 10-3 do 10-2 M wywoływały jednoznaczną reakcję zbiorowisk. W badaniach wykazano, że testowana ciecz jonowa [BMIM]Cl powoduje drastyczne zmiany w składzie i strukturze zbiorowisk mikrofitobentosu, które można porównać do zmian sukcesyjnych spowodowanych działaniem czynnika stresującego. Spośród standardowo stosowanych metod służących do oceny kondycji organizmów fotosyntetyzujących wykorzystano również analizy zawartości barwników fotosyntetycznych (metodą spektofotometryczną) oraz aktywność fotosyntezy (fluorescencja typu PAM). Wyniki eksperymentów prowadzonych na mikrofitobentosie wykazały, że [BMIM]Cl nie wpływa na aktywność fluorescencji, ale znacząco wpływa na zawartość chlorofili a i c w komórkach badanych mikroorganizmów. Testowana substancja chemiczna wywoływała również obniżenie aktywności mobilnych form okrzemek oraz powodowała negatywne zmiany w budowie chloroplastów. Na tej podstawie podjęto prace prowadzące do opracowania nowych wskaźników kondycji opierających się o analizę aktywności mobilnych form okrzemek oraz zmiany kształtu chloroplastów. Ich potencjał wskaźnikowy jest wysoki, gdyż są łatwe do zastosowania oraz dają jednoznaczne i łatwe w interpretacji rezultaty. W prowadzonych badaniach wykazano również, iż, najlepszym medium hodowlanym jest filtrowana woda morska, a najbardziej optymalnym czasem prowadzenia eksperymentów jest okres maksymalnie 7 dni [Sylwestrzak i Zgrundo w druku, Sylwestrzak i Pniewski w druku]. Poniżej opisano metodykę wykorzystywaną w dotychczas prowadzonych pracach w Instytucie Oceanografii Uniwersytetu Gdańskiego [lit. cyt.], która ma na celu prześledzenie wpływu substancji toksycznych na całe zbiorowiska mikroorganizmów fotosyntetyzujących kluczowych dla strefy przybrzeżnej mórz i oceanów. Ze zrozumiałych względów metoda ta uwzględnia szeroki wachlarz technik analitycznych i w zależności od celu testu, potrzeb i możliwości można zastosować wszystkie lub wybrane Metodyka badań Prace terenowe Mikrofitobentos do badań laboratoryjnych pozyskuje się ze szkiełek podstawowych eksponowanych w środowisku morskim od 14 dni w okresie ciepłym do 21 dni w okresie chłodnym. Panele hodowlane o wymiarach 100 cm x 40 cm wykonane zostały z elementów ze stali nierdzewnej, polistyrenu, PCV (ryc. 1). Pojedynczy panel może pomieścić od 80 do 100 szkiełek podstawowych o wymiarach 26 x 76 mm. Sposób mocowania szkiełek podstawowych umożliwia pozyskanie dużej ilości mikroorganizmów. Dodatkową zaletą jest również konstrukcja panelu pozwalająca na prostą i szybką wymianę poszczególnych elementów, co jest niezwykle istotne podczas prac terenowych. Panel hodowlany wraz ze szkiełkami podstawowymi umieszcza się w prześwietlonej strefie wód na głębokości maksymalnie do 2 metrów. Po uzyskaniu 76

4 odpowiedniej warstwy biofilmu widocznego gołym okiem panele wyjmuje się, umieszcza w specjalnie przygotowanej komorze transportowej wypełnionej wodą pochodzącą ze środowiska i przenosi do laboratorium. Podczas prac terenowych związanych z umieszczaniem oraz wyciąganiem panelu z środowiska morskiego zaleca się przeprowadzenie pomiarów podstawowych parametrów środowiska jak: temperatura, zasolenie, mętność. Dodatkowo można pobrać próby wody do oznaczeń soli biogenicznych (związków azotu i fosforu oraz krzemianów). Pomiary wymienionych czynników środowiskowych pozwolą na optymalne ustawienie warunków hodowli w laboratorium oraz wspomogą interpretację uzyskanych wyników. Ryc. 1. Wizualizacja graficzna panelu hodowlanego zawieszonego w toni wodnej (a) zdjęcie konstrukcji umieszczanej w środowisku (b) oraz fragment panelu ze szkiełkami podstawowymi porośniętymi dobrze wykształconym biofilmem (c) Prace laboratoryjne W pierwszym etapie prac laboratoryjnych porośnięte mikrofitobentosem szkiełka umieszcza się w płytkich pojemnikach (kwadratowe szalki DURAN o wymiarach 120 mm x 120 mm x 17 mm) wypełnionych ok. 100 ml wody morskiej pobranej in situ filtrowanej na sączku GF/C firmy Whatman. Aklimatyzację zbiorowisk przeprowadza się w komorze termostatycznej w ciągu 72 godzin w temperaturze zbliżonej do panującej w środowisku. Warunki świetlne ustawia się zgodne ze standardami hodowli mikroorganizmów roślinnych w warunkach laboratoryjnych tj. natężenie napromieniowania sztucznym źródłem światła PAR 60 μmol fotonów m -2 s -1, fotoperiod L:D 16:8. Po okresie aklimatyzacji zbiorowiska porastające szkiełka są gotowe do wykorzystania w doświadczeniach. W badaniach eksperymentalnych można zastosować różne rodzaje medium hodowlanego filtrowaną wodę morską, filtrowaną wodę morska wzbogaconą solami biogenicznymi czy pożywkę hodowlaną f/10. W dotychczas prowadzonych 77

5 pracach wykazano, iż najprostszy wariant tj. filtrowana woda morska, jest optymalnym medium nie tylko idealnie imitującym warunki panujące w środowisku, ale również niewymagającym dużego nakładu sił i środków. Ryc. 2. Szalka wraz z szkiełkami porośniętymi biofilmem wykorzystywanymi w opisywanych badaniach ekotoksykologicznych Reakcję zbiorowisk na działanie badanej substancji chemicznej analizuje się w momencie rozpoczęcia eksperymentu tzw. doba 0 oraz po 1, 3, 7 dniach. Odstęp czasu pomiędzy kolejnymi analizami dobrano w taki sposób, aby rejestrować zmiany zachodzące w zbiorowiskach mikrofitobentosu przy jak najbardziej zoptymalizowanym harmonogramie prac laboratoryjnych. Istnieje wiele wskaźników, które potencjalnie można wykorzystać do prześledzenia zmian zachodzących w zbiorowiskach mikrofitobentosu pod wpływem substancji toksycznych. Najczęściej stosowanymi są metody opierające się o analizy aktywności fotosyntetycznej (np. typu PAM) czy zawartości barwników fotosyntetycznych (np. z wykorzystaniem HPLC) (Arrhenius i in. 2014). Na podstawie przeprowadzonych badań zaproponowano poszerzenie wykorzystywanych metod o nowe techniki dotychczas niestosowane związane bezpośrednio z obserwacją komórek mikrofitobentosu w mikroskopie świetlnym. Ostatecznie do rejestracji zmian w badanych zbiorowiskach zaproponowano uwzględnienie analiz: składu taksonomicznego i struktury zbiorowisk, przeżywalności czyli określenie stosunku żywych komórek przedstawicieli danego taksonu do wszystkich zidentyfikowanych komórek tego taksonu (zarówno żywych jak i martwych), zmian kształtu chloroplastów w komórkach wybranych przedstawicieli mikrofitobentosu, zmian aktywności mobilnych form okrzemek, koncentracji barwników fotosyntetycznych (chlorofile a i c). Do analiz mikroskopowych tj. dotyczących składu taksonomicznego i struktury zbiorowisk, przeżywalności, kształtu chloroplastów oraz aktywności mobilnych form okrzemek najlepiej wykorzystać mikroskop świetlny o dobrej optyce wyposażony dodatkowo w kontrast fazowy wyposażony w kamerę umożliwiającą wykonywanie dokumentacji fotograficznej oraz zapis zmian w ruchu komórek. Identyfikację mikroorganizmów roślinnych przeprowadza się pod powiększeniem x200, x400 oraz x600 na bazie dostępnych kluczy i flor dla danego typu wód i rejonu, z którego pozyskano 78

6 materiał do badań. Analizę zmian w budowie chloroplastów wykonuje się w 50 polach widzenia poprzez obserwację i porównanie kształtu. Za zmiany w kształcie chloroplastów uznaje się wszelkie zmiany i deformacje będące odstępstwem od kształtów przedstawianych w literaturze jako typowe dla danych taksonów. Obserwacje ruchu u okrzemek prowadzi się na szkiełkach przed rozpoczęciem eksperymentu i szacuje ich prędkość oraz opisuje sposób poruszania się (np. ruch ślizgowy, obrotowy). Obniżenie aktywności lub zanik ruchu u tych organizmów podczas prowadzonych analiz mikroskopowych w trakcie eksperymentu uznaje się za zmianę. Oznaczenia koncentracji barwników fotosyntetycznych wykonuje się metodą spektrofotometryczną. Stężenia barwników wylicza się wykorzystując wzór podany przez Jeffrey a i Humphrey a [Jeffrey i in. 1997], które następnie przelicza na powierzchnię szkiełka badawczego. Do wykonania analiz statystycznych wykorzystuje się dostępne pakiety komputerowe przeprowadzające szereg prostych testów statystycznych jak np. STATISTICA ( czy bardziej zaawansowane metody kanoniczne jak np. CANOCO wersja 4.5 [ter Braak i Šmilauer 2002], PRIMER, PC-ORD Podsumowanie Przedstawiona metodyka wykorzystująca zbiorowiska mikrofitobentosu w badaniach ekotoksykologicznych ma ogromny potencjał badawczy. Pozwala na oszacowanie toksyczności różnorodnych substancji wprowadzanych do środowiska wodnego począwszy od substancji stosowanych w przemyśle, gospodarstwie domowym, poprzez lekarstwa, pestycydy, środki i farby antyporostowe itd. Dzięki wykorzystaniu naturalnych zbiorowisk oszacowanie ekotoksyczności testowanych substancji chemicznych jest dużo bardziej wiarygodne w porównaniu z monokulturami glonów. Metodyka badań jest prosta i pozwala na stosunkowo szybkie otrzymanie satysfakcjonujących wyników dla dużej ilości testowanych substancji. Nie wymaga intensywnych wysiłków w celu wyizolowania odpowiedniego materiału ze środowiska i prowadzenia hodowli monokultur, ale opiera się o mało kosztownym pozyskiwaniu naturalnych zbiorowisk. Literatura: Admiral W Tolerance of estuarine benthic diatoms to high concentration of amonia, nitrite ion, nitrate and orthophosphate. Marine Biology 43: Arrhenius A., Backhaus T., Hilvarsson A., Wendt I., Zgrundo A., Blanck H A novel rapid assay for evaluating the efficacy of biocides to inhibit the development of marine photoautotrophic biofilms. Biofouling 25. Bosserman R.W Elemental composition of Utricularia periphyton ecosystems from Okefenokee swamp. Ecology 64: ter Braak C.J.F., Šmilauer P CANOCO reference manual and CanoDraw for windows user's guide: software for canonical community ordination (version 4.5). Ithaca, NY, USA ( 48. Briand J.F Marine antifouling laboratory bioassays: an overview of their diversity. Biofouling. 25: Blanck H., Eriksson K.M., Grönvall F., Dahl B., Guijarro K.M., Birgersson G., Kylin H A retrospective analysis of contamination and periphyton PICT patterns for the antifoulantirgarol 1051, around a small marina on the Swedish west coast, Mar. Poll. Bull. 58: Cohn S. A., McGuire J. M Using diatom as an indicator of environmental stress: effects of toxic sediment elutriates. Diatom Research 15:

7 Dahl B., Blanck H Pollution-induced community tolerance (PICT) in periphyton communities established under tri-n-butyltin (TBT) stress in marine microcosms. Aquatic toxicology 62: De la Iglesia P., Fernández-Tejedor M., Trobajo R., Diogène J An analytical perspective on detection, screening and confirmation in phycology, with particular reference to toxins and toxin-producing species. Journal of Phycology 49: Hoagland K.D., Roemer S.C., Rosowski J.R Colonization and community structure of two periphyton assemblages, with emphasis on the diatoms (Bacillariophyceae). Am. J. Bot. 69: Jeffrey S.W., Mantoura R.F.C., Wright S.W Phytoplankton pigments in oceanography: guidelines to modern methods, UNESCO Publishing: 661. Karle I.M., Agrenius S., Molander S., Magnusson K., Blanck H., Dahl B., Hall P., Dahllöf I Verificationof a benthic boxcosm system with potential of extrapolating experimental results to the field. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 353: Latała A., Nędzi., Stepnowski P Toxity of imidazolim and pyridinium based ionic liquids towards algae. Bacillaria paxillifer (a microphytobenthic diatom) and Geitlerinema amphibium (a microphytobenthic blue green alga), Green Chemistry 42(2): Latała A., Nędzi., Stepnowski P Toxity of imidazolim and pyridinium based ionic liquids towards algae. Chlorella vulgaris, Oocystis submarina (green algae) and Cyclotella meneghiniana, Skeletonema marinoi (diatoms), Green Chemistry 73: Lewis M.A Use of freshwater plants for phytotoxicity testing: A review. Enviromental Pollution 87: Mason R. P., Reinfelder J.R., Morel F.M.M Uptake, toxicity, and trophic transfer of mercury in a coastal diatom. Environmental Science Technolology 30: Newman M.C, Unger M.A Fundamental of ecotoxicology. Lewis Publishers: 458. Pérez P., Fernández E., Beiras R Toxicity of benzalkonium chloride on monoalgal cultures and natural assemblages of marine phytoplankton. Water, Air, and Soil Pollution 201/1-4: Peterson H. G., Boutin C., Martinc P.A., Freemark K. E., Rueckera N. J., Moodya M. J Aquatic phyto-toxicity of 23 pesticides applied at expected environmental concentrations. Aquatic Toxicology 28: Round F.E., Crawford R.M The lines of evolution of the Bacillariophyta. I. Origin. Proceedings of the Royal Society of London, B 211: Sylwestrzak Z, Zgrundo A. w druku. Wstępne wyniki badań laboratoryjnych wykorzystujących zbiorowiska mikrofitobentosu Zatoki Gdańskiej do testowania toksyczności cieczy jonowych. Dokonania Młodych Naukowców. Sylwestrzak Z, Pniewski F. w druku. Wpływ medium hodowlanego na wyniki eksperymentów testujących oddziaływanie substancji toksycznej na zbiorowiska mikrofitobentosu. Dokonania Młodych Naukowców Underwood G. J. C., Nillson C., Sundback K., Wulff, A Short-term effects of UV-B radiation on chlorophyll fluorescence, biomass, pigments, and carbohydrate fractions in a benthic diatom mat. Journal of Phycology 35: Underwood G. J. C., Boulcott M., Raines, C. A., Waldron K Environmental effects on exopolymer production by marine benthic diatoms dynamics, changes in composition and pathways of production. Journal of Phycology 40:

8 Walsh G. E., McLaughlan L. L., Lores E.M., Louie M. K., Deans C.H Effects of organotins on growth and survival of two marine diatoms Skeletonema costatum and Thalassiosita pseudonana. Chemosphere 14/ 3 4: Nazwa instytucji: Uniwersytet Gdański, Wydział Oceanografii i Geografii, Zakład Funkcjonowania Ekosystemów Morskich Opiekun naukowy: Prof. dr hab. Adam Latała, Adres do korespondencji: z.sylwestrzak@ug.edu.pl 81