MIKROSPORYDIA I GREGARYNY, WYSTĘPUJĄCE U KIEŁŻY NA WSCHODNIM ODCINKU POLSKIEJ CZĘŚCI CENTRALNEGO KORYTARZA MIGRACYJNEGO

Transkrypt

1 S ł u p s k i e P r a c e B i o l o g i c z n e MIKROSPORYDIA I GREGARYNY, WYSTĘPUJĄCE U KIEŁŻY NA WSCHODNIM ODCINKU POLSKIEJ CZĘŚCI CENTRALNEGO KORYTARZA MIGRACYJNEGO MICROSPORIDIA AND GREGARINES INFECTING GAMMARID AMPHIPODS IN EASTERN PART OF POLISH FRAGMENT OF CENTRAL MIGRATION CORIDOR Mykola Ovcharenko 1, 2 Piotr Wróblewski 2 Karolina Niciejewska 1 Agnieszka Cyrson 1 1 Akademia Pomorska w Słupsku Instytut Biologii i Ochrony Środowiska Zakład Zoologii ul. Arciszewskiego 22b, Słupsk mykola@twarda.pan.pl 2 Zakład Bioróżnorodności Pasożytów Instytut Parazytologii im. W. Stefańskiego PAN ul. Twarda 51/55, Warszawa ABSTRACT Six taxa of unicelular parasites belonging to Apicomplexa and Microsporidia were detected during parasitological study of gammarids (Amphipoda, Gammaroidea) inhabiting some fragments of rivers Bug, Narew and Vistula in Poland. About 300 gammarid speciments collected on 7 sites were dissected. Apicomplexa were presented by gregarinid parasites: Cephaloidophora gammari, C. similis, Uradiophora ramose and U. longissima. Native (Gammarus varsoviensis, G. lacustris) and invasive (pontokaspian) hosts (Chaetogammarus ischnus, Dikerogammarus haemobaphes, D. villosus) were infected by Apicomplexa. Two species of pontokaspian invaders: Chaetogammarus ischnus, Dikerogammarus villosus, and native Gammarus fossarum were infected by Microsporidia. Cucumispora dikerogammari was registered only in pontokaspian hosts. Thelohania-like microsporidia, from Dictyocoela group were registered in native (G. fossarum) and invasive hosts (D. villosus, D. haemobaphes, Ch. ischnus). 97

2 Słowa kluczowe: Microsporidia, Apicomplexa, Gammaridea, gatunki rodzime i obce, migracje Key words: Microsporidia, Apicomplexa, Gammaridea, native and invasive species, migration WSTĘP Skorupiaki obunogie (Amphipoda), a szczególnie kiełże (Gammaridea), są jednymi z najszybciej rozprzestrzeniających się gatunków inwazyjnych w Europie Środkowej i Zachodniej, gdzie wywołują drastyczne zmiany w faunie rodzimej zbiorników wodnych poddanych kolonizacji (Jażdżewski i in. 2004). W Polsce występuje 8 gatunków inwazyjnych obunogów, z których 6 (Chelicorophium curvispinum, Dikerogammarus vilosus, D. haemobaphes, Obesogammarus crassus, Chaetogammarus ischnus, Pontogammarus robustoides) jest przedstawicielami fauny pontokaspijskiej, pochodzącymi z basenu Morza Czarnego (Grabowski i in. 2007). Skorupiaki te przedostały się w latach 60. i 70. do zbiorników wodnych na obszarze byłego Związku Radzieckiego, a ponadto rozprzestrzeniały się poprzez sieć sztucznych kanałów łączących zlewiska mórz: Kaspijskiego, Czarnego, Bałtyckiego i Północnego. Uważa się, że istnieją trzy główne korytarze imigracji obcych kiełży do akwenów Europy (Bij de Vaate i in. 2002). Korytarz północny łączy basen Wołgi z Morzem Bałtyckim przez jeziora Beloje, Onega, Ładoga i rzeką Newa. Centralny korytarz biegnie przez Ukrainę, Białoruś, Polskę i Niemcy, łączy zlewiska rzek: Dniepr, Prypeć, Bug, Wisła, Odra, Elba i Ren. Korytarz zachodni łączy basen Morza Czarnego z basenem bałtyckim przez sieć kanałów, łączących rzeki Dunaj, Cisa i Ren. Istniejące korytarze spełniają funkcje arterii transportowych zarówno dla żywicieli, jak i ich pasożytów, które rozprzestrzeniają się w postaci stadiów przetrwalnikowych i rozwojowych. Rola pontokaspijskich kiełży w rozprzestrzenianiu się pasożytów na nowe tereny nie została dotychczas poznana. Interakcji pasożyt-żywiciel w procesie kolonizacji dotyczy tzw. hipoteza pathogen release (Torchin i in. 2003, Prenter i in. 2004), według której inwazja gatunków obcych jest ułatwiana w wyniku gubienia przez nie pasożytów w trakcie migracji. Organizmy takie jak kiełże, które migrują głównie wzdłuż ściśle określonych korytarzy, które stanowią rzeki oraz kanały żeglugowe, są doskonałym modelem do weryfikacji wymienionej hipotezy. Fauna pasożytów kiełży obejmuje jednokomórkowce (Microsporidia, Apicomplexa), nicienie (Nematoda), larwalne postaci kolcogłowów (Acanthocephala), przywr digenetycznych (Trematoda) oraz tasiemców (Cestoda). Mikrosporydia i gregaryny stanowią dominującą grupę pasożytów pontokaspijskich kiełży (Ovcharenko i in. 2010, 2011). Celem pracy było poznanie roli kiełży w rozprzestrzenianiu się pasożytniczych jednokomórkowców (Microsporidia, Apicomplexa) wzdłuż jednego z głównych korytarzy napływu gatunków pontokaspijskich na tereny Polski. Badania są poświęcone sprawdzeniu możliwości wymiany pasożytów pomiędzy żywicielami należącymi do odmiennych grup faunistycznych. 98

3 MATERIAŁ I METODY BADAŃ Materiałem badań były kiełże zebrane w trakcie wyjazdu terenowego w czerwcu 2011 roku. Obszar zbioru obejmował 7 stanowisk. Były to: Bug w pobliżu miejscowości Serpelice, Zajęczniki, Brańszczyk; Zalew Zegrzyński; Narew w okolicach Nowego Dworu; Wisła w Płocku i we Włocławku (ryc. 1). Ponadto do oznaczenia Ryc. 1. Dyslokacja stanowisk w roku 2011 Fig. 1. Map of sites in 2011 pozycji taksonomicznej pasożytów wykorzystano materiał pobrany w latach podczas prac w ramach projektu Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego nr NN Na wymienionym odcinku centralnego korytarza migracyjnego analizie parazytologicznej poddano około 300 osobników kiełży przedstawicieli dwóch grup faunistycznych: atlantyckoborealnego (Gammarus fossarum, G. varsoviensis, G. lacustris) i pontokaspijskiego (Chaetogammarus ischnus, Dikerogammarus villosus), w tym w roku osobników (tab. 1). Tabela 1 Skład gatunkowy kiełży zbadanych w roku 2011 i wyniki przeprowadzonych sekcji Table 1 List of localities with systematic position of collected gammarids, and results of parasitological study Stanowiska Gatunki żywicieli, liczba zbadanych Gatunki pasożytów Serpelice N 52 o 16,92 E 23 o 03,83 Zajęczniki N 52 23,59 E 22 41,52 Gammarus fossarum (61) Dikerogammarus villosus (18) D. villosus (12) D. haemobaphes (6) Chaetogammarus ischnus (4) Cucumispora dikerogammari - Cucumispora dikerogammari Uradiophora longissima Cucumispora dikerogammari 99

4 1 2 3 Brańszczyk N 52 36,97 E 21 35,88 Zegrze N 52 27,62 E 21 03,97 Nowy Dwór Mazowiecki N 52 26,04 E 20 43,36 Płock N 52 31,93 E 19 41,28 Włocławek N 52 39,44 E 19 04,34 G. varsoviensis (9) D. vilosus (10) G. fossarum (3) D. villosus (10) G. varsoviensis (3) G. lacustris (11) D. villosus (14) D. villosus (5) Ch. ischnus (11) D. haemobaphes (14) D. villosus (15) Ch. ischnus (10) Cephaloidophora gammari Cucumispora dikerogammari, Uradiophora longissima Dictyocoela sp. Uradiophora longissima Cephaloidophora gammari Dictyocoela sp. Cephaloidophora gammari Cephaloidophora similis, Uradiophora longissima Uradiophora ramosa Cephaloidophora similis Uradiophora ramosa Dictyocoela sp. Badania parazytologiczne zostały przeprowadzone z użyciem klasycznych metod mikroskopii świetlnej i elektronowej. Po oznaczeniu pozycji systematycznej kiełże były sekcjonowane. Rozmazy tkanek, wykazujących zarażenie po utrwaleniu metanolem, barwiono odczynnikiem Giemzy według standardowej procedury (Ovcharenko 2003). Dane morfometryczne otrzymano podczas analizy preparatów, barwionych odczynnikiem Giemzy (mikrosporydia) lub w oparach 2% cieczy wodnej OsO 4 (gregaryny). Do badań ultrastruktury zarażone tkanki były utrwalane w 2,5% aldehydzie glutarowym i 2% OsO 4, a następnie zatapiane w żywicach epoksydowych, zgodnie z przyjętymi w tego typu badaniach metodami (Ovcharenko 2003). Do badań elektronowo-mikroskopowych wykorzystano mikroskop JEOL-JEM WYNIKI I DYSKUSJA U rodzimych i obcych kiełży na zbadanych stanowiskach stwierdzono pasożytnicze pierwotniaki gregaryny (Protozoa, Apicomplexa), pasożytnicze grzyby mikrosporydia (Fungi, Microsporidia) oraz larwy kolcogłowów (Animalia, Acanthocephala; Ovcharenko i in. 2010). Na podstawie materiału pozyskanego w roku 2011 wykryto na zbadanym odcinku centralnego korytarza występowanie 4 gatunków gregaryn i 3 gatunków mikrosporydiów. Średnia ekstensywność zarażenia wynosiła 13,25%, w tym mikrosporydiami 4,47% (2,32-9,52%), gregarynami 18,78% (8, ,1%) (ryc. 2, 3). Najwyższe zarażenie kiełży mikrosporydiami zanotowano w środkowym odcinku Bugu (9,52%) i w Zalewie Zegrzyńskim (7,69%). Maksymalne zarażenie gregarynami wykryto w Wiśle w okolicy Płocka (60,1%) oraz w Zalewie 100

5 Ryc. 2. Ekstensywność zarażenia kiełży gregarynami (%) na wybranych stanowiskach Fig. 2. Gregarinae prevalence (%) on selected locations Ryc. 3. Ekstensywność zarażenia kiełży mikrosporydiami (%) na wybranych stanowiskach Fig. 3. Microsporidia prevalence (%) on selected locations 101

6 Ryc. 4. Morfologia gregaryn, występujących u zbadanych kiełży. Interferencyjny kontrast (A, C, D), barwienie wg Giemzy (B, E). A, B pojedynczy gamont (A) i syzygium (B) Cephaloidophora gammari z jelita Gammarus lacustris. Jądro ulokowane w cytoplazmie deutomerita oznaczono strzałką. C syzygium Uradiophora longissima z Dikerogammarus villosus. Gamonty mają globularne epimerity i okrągłe pojedyncze jądra (oznaczono strzałkami). D syzygium i pojedynczy gamont Cephaloidophora similis z jelita Dikerogammarus villosus. E Uradiophora ramosa, trzy gamonty z pojedynczymi jądrami (oznaczono strzałkami), tworzące łańcuch. Skala: 40 µm (A-C, E), 20 µm (D) Fig. 4. Morphology of gregarines infecting investigated gammarids. Interference contrast (A, C, D), Giemza stain (B, E). A, B separate gamont (A) and syzygium (B) of Cephaloidophora gammaris from intestine of Gammarus lacustris. The nucleus is located in cytoplasm (arrowed). C syzygium Uradiophora longissima from Dikerogammarus villosus. Gamonts have globular epimerits and rounded nuclei (arrowed). D syzygium and separate gamont 102 of Cephaloidophora similis from intestine of Dikerogammarus villosus. E Uradiophora ramosa, three gamonts with separate nuclei (arrowed). Scale bars: 40 µm (A-C, E), 20 µm (D)

7 Zegrzyńskim (30,14%), co rzekomo uwarunkowane było szczegółami dynamiki mas wodnych. Pierwotniaki były reprezentowane przez gregaryny: Cephaloidophora gammari, C. similis, Uradiophora ramosa i U. longissima (ryc. 4 A-E ). Żywicielami gregaryn były gatunki rodzime (Gammarus varsoviensis, G. lacustris) oraz gatunki obce pochodzenia pontokaspijskiego (Chaetogammarus ischnus, Dikerogammarus haemobaphes, D. villosus). Gregaryny (Gregarinomorpha) to pasożytnicze jednokomórkowce, występujące u lądowych i wodnych bezkręgowców. Do chwili obecnej zostało opisanych około 250 rodzajów i 1650 gatunków gregaryn (Clopton 2004). W faunie pasożytów obunogów występujących w Polsce odnotowano przedstawicieli dwóch rodzajów: Cephaloidophora Mavrodiadi, 1908, w tym: C. gammari (Franzius, 1848), C. mucronata Codreanu-Balcescu, 1995, C. similis Codreanu- -Balcescu, 1995, Cephaloidophora spp. (4 taksony, oznaczone do rodzaju), i Uradiophora Mercier, 1912, w tym: U. ramosa Balcescu-Codreanu, 1974, U. longissima (Siebold, 1839), Uradiophora spp. (3 taksony, oznaczone do rodzaju; Ovcharenko i in. 2009b). U obunogów zostało opisanych około 60 gatunków gregaryn z rodzaju Cephaloidophora, w tym 15 gatunków zanotowano u kiełży. W roku 2011 na zbadanym odcinku centralnego korytarza przedstawiciele rodzaju Cephaloidophora zostały stwierdzone u Gammarus varsoviensis, G. lacustris, Dikerogammarus haemobaphes i D. villosus (tab. 1). Dane morfometryczne gregaryn z obu żywicieli wykazały podobieństwo do gatunków Cephaloidophora gammari (Franzius, 1848) i C. similis Codreanu-Balcescu, C. gammari, syn.: Gregarina gammari Franzius, 1848; Cephaloidophora echinogammari Poisson, 1921; Rotundula gammari Goodrich, 1949 (ryc. 4 A, B) charakteryzuje się szeroką specyficznością żywicielską. C. gammari zaraża kiełże, należące do borealnoatlantyckiej grupy faunistycznej. Pasożyt ten został opisany z jelit Gammarus pulex we Francji, a następnie był notowany w tym kraju u Echinogammarus berilloni i Gammarus olivii (= Echinogammarus olivii, Chaetogammarus olivii), w Niemczech u G. roeselii, w Rumunii u G. balcanicus montanus (= G. balcanicus), w Ameryce Północnej u G. fasciatus. W Polsce występowanie C. gammari odnotowano u G. pulex z małej przymorskiej rzeki Stradanka w okolicy Tolkmicka (Codreanu i in. 2007, Ovcharenko i inni 2007). W materiale zebranym w roku 2011 gatunek C. gammari został stwierdzony u Gammarus varsoviensis w Bugu (N 52 36,97, E 21 35,88 ) i w Zalewie Zegrzyńskim (N 52 27,62, E 21 03,97 ) oraz u Gammarus lacustris w Narwi (N 52 26,04, E 20 43,36 ). Jajowate gamonty C. gammari długości około µm występowały pojedynczo (ryc. 4A) lub w postaci syzygi (ryc. 4B). Długość epimerita stanowiła około jednej czwartej ogólnej długości ciała osobnika, szerokość epimeryta około 25 µm, a protomeryta około 30 µm. C. similis Codreanu-Balcescu, 1995 występuje w delcie Dunaju u pontokaspijskich kiełży Chaetogammarus tenellus (= Chaetogammarus ischnus) i Dikerogammarus haemobaphes (Codreanu-Balcescu 1995). W Polsce po raz pierwszy pasożyt został stwierdzony w Odrze u Dikerogammarus villosus (Ovcharenko i in. 2009a). W materiale pochodzącym ze zbiorów z roku 2011 pasożyta wykryto u Dikerogammarus haemobaphes w Wiśle w okolicach Płocka (N 52 31,93, E 19 41,28 ) oraz u D. villosus w Narwi (N 52 26,04, E 20 43,36 ). Pasożyt produkuje wydłużone 103

8 prostokątne gamonty długości około 70 µm, mające spłaszczone, niepokaźne epimeryty (ryc. 4D). Szerokość epimeryta (23-25 µm) jest zbliżona do szerokości deutomeryta. Rodzaj Uradiophora Mercier, 1912 obejmuje 6 gatunków, z których 4: U. gammari Poisson, 1924, U. longissima (Siebold, 1839), U. mercieri Poisson, 1924, U. ramosa Balcescu-Codreanu, 1974 zostały opisane u kiełży (Balcescu-Codreanu 1974). Uradiophora ramosa, U. longissima oraz Uradiophora spp. (3 taksony, oznaczone do rodzaju) odnotowano w Polsce w latach u pontokaspijskich kiełży P. robustoides, D. villosus oraz północnoamerykańskiego Gammarus tigrinus (Ovcharenko i in. 2010). Uradiophora ramosa występuje w jelicie pontokaspijskiego kiełża Pontogammarus robustoides z rumuńskiego odcinka delty Dunaju (Balcescu-Codreanu 1974). W Polsce wymieniony gatunek został zarejestrowany u P. robustoides w Wiśle we Włocławku, u Dikerogammarus villosus w Odrze w pobliżu miejscowości Zdzieszowice oraz u północnoamerykańskiego Gammarus tigrinus w Zatoce Puckiej (Ovcharenko i in. 2009a). U. ramosa charakteryzuje się zdolnością do wytworzenia syzygiów, zawierających kilka osobników (ryc. 4E). Pasożyt wytwarza wydłużone gamonty o wymiarach µm. Prymity i satelity mogą różnić się morfologicznie. W materiale pochodzącym z roku 2011 U. ramosa występowała u Dikerogammarus villosus zebranych w Wiśle w pobliżu Włocławka (N 52 39,44, E 19 04,34 ) i Płocka (N 52 31,93, E 19 41,28 ). Uradiophora longissima, syn. Gregarina longissima Siebold, 1839; Didymophies longissima Franzius, 1848 pasożyt ten został opisany z kiełża Gammarus pulex we Francji. Ponadto był zarejestrowany u Orchestia littorea i Caprella aequilibra we Francji, u G. pulex i G. roeselii w Niemczech, u G. balcanicus w Rumunii i D. villosus w Polsce (Balcescu-Codreanu 1974, Codreanu-Balcescu 1995, Ovcharenko i in. 2010). Pasożyt wytwarza wydłużone gamonty długości µm z globularnymi protomerytami (ryc. 4C). W materiale z roku 2011 U. longissima występowała u Dikerogammarus villosus zebranych w Bugu (N 52 36,97, E 21 35,88 ; N 52 23,59, E 22 41,52 ), Narwi (N 52 26,04, E 20 43,36 ) i Zalewie Zegrzyńskim (N 52 27,62, E 21 03,97 ). Mikrosporydia (Fungi, Microsporidia) są wyspecjalizowanymi wewnątrzkomórkowymi pasożytami o wysokiej patogenności. Występują u szerokiego kręgu żywicieli, od pierwotniaków do człowieka. Dotychczas znanych jest ponad 1400 gatunków mikrosporydiów należących do ponad 140 rodzajów (Wilkinson i in. 2012). U słodkowodnych i morskich kiełży mikrosporydia osiedlają się głównie w tkance mięśniowej oraz w układzie rozrodczym. Na zbadanym odcinku centralnego korytarza migracyjnego zanotowano 2 taksony mikrosporydiów z dwóch rodzajów Cucumispora dikerogammari i Thelohania sp. (Ovcharenko i in. 2010). W wyniku badań parazytologicznych kiełży zebranych w latach stwierdziliśmy, iż w badanych zbiornikach wodnych występują co najmniej trzy gatunki mikrosporydiów, z których jeden (Cucumispora dikerogammari) jest pasożytem pochodzenia pontokaspijskiego, występującym u inwazyjnych kiełży z rodzaju Dikerogammarus. Cucumispora dikerogammari (Ovcharenko i in. 2009a; ryc. 5 A-G) jest szeroko rozpowszechnionym, groźnym pasożytem pontokaspijskich kiełży na terenie Europy Środkowej i Zachodniej (Ovcharenko i in. 2009a). Gatunek ten wykryto u D. villo- 104

9 Ryc. 5. Morfologia, histopatologia i ultrastruktura mikrosporydium Cucumispora dikerogammari. A Żywe spory, interferencyjny kontrast. B morfologia stadiów rozwojowych, rozmazy, barwione wg Giemzy. Meront (m) z jądrami w postaci diplokarionu, sporont (s), tetranuklearne sporogonialne plazmodium (sp) oraz spora (oznaczono strzałką). C szczegóły histopatologii, półcienki skrawek, barwiono błękitem toluidyny. Spory pasożyta są ulokowane w sarkoplazmie komórek mięśniowych (oznaczono strzałką). D meront z jądrami (n) w postaci diplokarionu. E merogonalne plasmodium (mp). F sporoblast z pogrubioną ścianką (oznaczono strzałką) i jądrami (n) tworzącymi diplokarion. G ultrastruktura spory, zawierającej jądra w postaci diplokarionu (n), polaroplast (pp) i nić biegunową, tworząca spirale w tylnej części spory (oznaczono strzałkami). Skala: 5 µm (A, B); 20 µm (C); 1 µm (D, F, G); 2 µm (F) Fig. 5. Morphology, histopathology and ultrastructure of microsporidium Cucumispora dikerogammari. A live spores, interference contrast. B morphology of developmental stages on Giemza stained smears. Meront (m) with diplokaryotic nuclei, sporont (s), sporogonal plasmodium (sp) and spore (arrowed) are visible. C semithin section of infected muscle tissue. Parasite spores are located in sarcoplasm of the muscle cells (arrowed). D meront with diplokaryotic nuclei (n). E merogonal plasmodium (mp). F sporoblast with thickened wall (arrowed) and diplokaryotic nuclei (n). G ultrastructure of mature spore with diplokariotic nuclei (n), polaroplast (pp) and polar filament, coiled in posteriori pert of the spore (double arrowed). Scale bars: 5 µm (A, B); 20 µm (C); 1 µm (D, F, 105 G); 2 µm (F)

10 sus w basenach Dunaju, Renu, Loary, Sekwany, Odry, Wisły, Bugu i Dniepru. Pasożyt wykazuje wysoki stopień zarażenia (ekstensywność, intensywność) w skolonizowanych przez D. villosus akwenach. Dotychczas nie udało się zanotować występowania C. dikerogammari u rodzimych kiełży, jednak wyniki badań eksperymentalnych w latach potwierdziły hipotezę o możliwości zarażenia atlantyckoborealnych kiełży Gammarus pulex i G. roezeli mikrosporydiami C. dikerogammari, pobranymi od pontokaspijskich Dikerogammarus villosus (Bącela-Spychalska i in. 2010). W materiale pochodzącym z roku 2011 gatunek C. dikerogammari występował u Dikerogammarus villosus zebranych z Bugu (N 52 16,92, E 23 03,83 ; N 52 23,59, E 22 41,52 ; N 52 36,97, E 21 35,88 ) i u D. ischnus (N 52 23,59, E 22 41,52 ). U rodzimych kiełży Gammarus fossarum i pontokaspijskich Chaetogammarus ischnus, Dikerogammarus villosus i D. haemobaphes odnotowano występowanie Thelohania podobnych mikrosporydiów, zaliczonych do sekwencji typu Dictyocoela (ryc. 6 A-F). Po raz pierwszy 6 sekwencji zaliczonych do grupy Dyctiocoela zostało wykrytych w roku 2004 (Terry i in. 2004) u atlantyckoborealnych żywicieli (Gammarus duebeni, G. roeseli, G. lacustris, Orchestia gamarellus, Talorchestia deshayesei) na podstawie analizy porównawczej sekwencji 16S r DNA. Do tej pory grupa obejmuje 13 sekwencji pochodzących od zarażonych atlantyckoborealnych i pontokaspijskich żywicieli (Wilkinson i in. 2011). Większość autorów uznaje Dictyocoela za odrębny rodzaj na podstawie zarejestrowanych w GenBanku sekwencji, chociaż w literaturze brakuje danych niezbędnych do pełnowartościowej taksonomicznej diagnostyki mikrosporydiów, zaliczanych do danego rodzaju. Opierając się na wynikach przeprowadzonych przez nas badań ultrastruktury, doszliśmy do wniosku o taksonomicznej odrębności tej grupy mikrosporydiów i ich morfologicznej identyczności na poziomie mikroskopii świetlnej z mikrosporydiami wcześniej opisanymi jako przedstawicielami rodzaju Thelohania (Sprague, 1977). Zbadane przez nas mikrosporydia z grupy Dictyocoela stanowią wyodrębnioną grupę, niespokrewnioną z rodzajem Thelohania. Za tym wnioskiem przemawiają dane ultrastrukturalne oraz molekularne (Ovcharenko i in. 2008, Wilkinson i in. 2011). W materiale pochodzącym ze zbiorów w roku 2011 Dictyocoela sp. występowała u Gammarus fossarum w Bugu (N 52 36,97, E 21 35,88 ), u G. varsoviensis w Zalewie Zegrzyńskim (N 52 27,62, E 21 03,97 ) i u Chaetogammarus ischnus i Dikerogammarus villosus w Wiśle (N 52 39,44, E 19 04,34 ; N 52 31,93, E 19 41,28 ). Wszystkie mikrosporydia miały stosunkowo prosty cykl rozwojowy, który odbywa się w cytoplazmie jednej komórki żywicielskiej. Sporoplazma pasożyta ulokowana w cytoplazmie komórki żywicielskiej przystępuje do namnażania komórek potomnych przez serię mitotycznych podziałów i tworzenie wielojądrowego wegetatywnego plasmodium (ryc. 4B, F). Po oddzieleniu nowych komórek pasożyta i otoczeniu ich dodatkową otoczką pasożyt przystępuje do drugiej fazy cyklu rozwojowego sporogonii (ryc. 5F; 6C, B, D, F), której produktem końcowym są spory (ryc. 5A, C, G; 6A, B, E). Thelohania podobne mikrosporydia produkują oktospory wewnątrz pęcherzyka sporoforowego (sporophorous vesicle), zawierającego tubularne i globularne inkluzje (ryc. 6F). Mikrosporydia nie mają własnych mitochondriów, dlatego gromadzą się obok tych organelli komórki żywicielskiej, zmieniając ich kształt i wymiary (ryc. 6F). Pasożytnictwo mikrosporydia doprowadza do destrukcji zainfekowanych komórek (ryc. 5C, 6F). 106

11 Ryc. 6. Morfologia, cytopatologia i ultrastruktura mikrosporydium Dictiocoela sp. A żywe spory, interferencyjny kontrast. B barwione wg Giemzy oktospory (oznaczone strzałką), diplokariotyczne merogonalne plasmodium (m) i sporonty (S) zawierające kilka odizolowanych jąder. C młody sporont z jądrami (n) w postaci diplokarionu. D sporogonalne plasmodium w pęcherzyku sporoforowym, produkujące sporoblasty (sb) z pojedynczymi jądrami (n). E młoda spora z pojedynczym jądrem (n) i rozwijającym aparatem ekstruzyjnym. F szczegóły cytopatologii. Sporoblasty (sb) pasożyta, mające pojedyncze jądra (n), są produkowane w pęcherzykach sporoforowych, zawierających tubularne inkluzje (oznaczono strzałką). Hipertrofowane mitochondria (mi) w cytoplazmie zarażonej komórki są kilkadziesiąt razy większe niż klasyczne (oznaczono strzałką). Stadia rozwojowe pasożyta są ulokowane w sarkoplazmie w pobliżu mionem (mn). Skala: 10 µm (A, B); 1 µm (C); 2 µm (E); 4 µm (D, F) Fig. 6. Morphology, cytopathology and ultrastructure of microsporidium Dictiocoela sp. A live spores, interference contrast. B morphology of developmental stages on Giemza stained smears with octospores (arrowed), diplokaryotic merogonal plasmodium (m) and sporonts (S). C young sporont with diplokaryotic nuclei (n). D sporogonal plasmodium within a sporophorous vesicle producing uninucleate (n) sporoblasts (sb). E immature spore with the nucleus (n) and developing extrusion apparatus. F cytopathology of infected cell. Parasite sporoblasts (sb) with separate nuclei (n) develop in sporophorous vesicles with tubular inclusions (arrowed). Hypertrophied (mi) and normal sized (arrowed) mitochondria are visible. Developmental stages of parasite are located 107 inside sarkoplasma neighboring mionems (mn). Scale bars: 10 µm (A, B); 1 µm (C); 2 µm (E); 4 µm (D, F)

12 Dotychczas dane dotyczące ultrastruktury Dictiocoela spp. obejmują kilka doniesień, w tym jedyne zdjęcie, na którym widoczne są tubularne struktury wewnątrz pęcherzyka sporoforowego oraz ultrastruktura spory D. muelleri (Terry i in. 2004). Widoczne na tym zdjęciu szczegóły ultrastruktury wykazują identyczność mikrosporydium wymienionego jako D. muelleri z gatunkiem Thelohania muelleri (Pfeiffer, 1895), szczegółowo zbadanym przez Larssona (1983). Podobnie do T. muelleri, nić biegunowa D. muelleri jest ułożona w tylnej części spory w spiralę o zwojach, identyczne są także struktury polaroplastu i otoczki spory. Na podstawie analizy porównawczej D. muelleri i D. berillonum z oktosporowymi microsporydiami od Dikerogammarus haemobaphes, Pontogammarus robustoides, Gammarus pulex i Gammarus fossarum, występującymi w Polsce, Ovcharenko i inni (2008) doszli do wniosku o możliwej identyczności Thelohania-podobnych mikrosporydiów od kiełży i przedstawicieli grupy Dictyocoela. Za tym wnioskiem przemawia także publikacja wyników kompleksowych badań przedstawicieli rodzaju Thelohania, świadczących o zbiorowym charakterze rodzaju i odrębności Thelohania-podobnych microsporydiów, pasożytujących u kiełży (Lom i in. 2001, Brown, Adamson 2006). PODSUMOWANIE I WNIOSKI 1. W wyniku badań terenowych i laboratoryjnych rodzimych i inwazyjnych kiełży, pobranych z 7 stanowisk położonych na wschodnim odcinku polskiej części centralnego korytarza migracyjnego, wykryto występowanie pasożytniczych jednokomórkowców gregaryn i mikrosporydiów. 2. Pasożytnicze pierwotniaki były reprezentowane przez gregaryny Cephaloidophora gammari, C. similis, Uradiophora ramosa, U. longissima. Żywicielami gregaryn były gatunki rodzime kiełży (Gammarus varsoviensis, G. lacustris) oraz gatunki obce pochodzenia pontokaspijskiego (Chaetogammarus ischnus, Dikerogammarus haemobaphes, D. villosus). 3. Mikrosporydia wykryto u 2 gatunków inwazyjnych kiełży (Chaetogammarus ischnus, Dikerogammarus villosus) i Gammarus fossarum reprezentanta fauny rodzimej. Cucumispora dikerogammari jest szeroko rozpowszechnionym, groźnym pasożytem pontokaspijskich kiełży na terenie Europy Środkowej i Zachodniej. Nie udało się zanotować występowania C. dikerogammari u rodzimych kiełży występujących na zbadanym odcinku korytarza migracyjnego. 4. Thelohania-podobne mikrosporydia, zaliczane do sekwencji typu Dictyocoela, występują zarówno u rodzimych, jak i inwazyjnych kiełży. Otrzymane wyniki badań pozwalają stwierdzić, iż istnieje realne zagrożenie przenoszenia i rozprzestrzeniania się mikrosporydiozy wywoływanej przez mikrosporydia z grupy Dictyocoela z rodzimych kiełży (G. fossarum) na gatunki inwazyjne (D. villosus, D. haemobaphes, Ch. ischnus). 5. Poparto tezę o identyczności Thelohania-podobnych mikrosporydiów kiełży i przedstawicieli grupy Dictyocoela. Prawdopodobnie rodzaj Thelohania jest zbiorem kilku niespokrewnionych rodzajów, o przybliżonych parametrach morfologicznych. 108

13 LITERATURA Balcescu-Codreanu D Sur une grégarine nouvelle à syzygies multiples, Uradiophora ramosa n. sp. l parasite d un amphipode pontocaspien de Roumanie. Revue Roumaine de Biologie, 19 (2): Bącela-Spychalska K., Wattier R., Rigaud T., Ovcharenko M., Konopacka A., Grabowski M., Rewicz T Invasive Gammarids as Vectors of Microparasites Dikerogammarus villosus and Cucumispora dikerogammari. W: XIVth International Colloquium on Amphipoda, Seville, Spain, September 2010, Programme & Abstracts. Universidad de Seville, Seville: 22. Bij de Vaate A., Jażdżewski K., Ketelaars H., Gollasch S., Van der Velde G Geographical patterns in range extension of macroinvertebrate Ponto-Caspian species in Europe. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 59: Brown A.M.V., Adamson M.L Phylogenetic Distance of Thelohania butleri Johnston, Vernick, and Sprague, 1978, (Microsporidia; Thelohaniidae), a Parasite of the Smooth Pink Shrimp Pandalus jordani, from its Congeners Suggests Need for Major Revision of the Genus Thelohania Henneguy, J. Eukaryot. Microbiol., 53(6): Clopton R.E Standard nomenclature and metrics of plane shapes for use in gregarine taxonomy. Comparative Parasitology, 71: Codreanu-Balcescu D Sur quelques nouvelles espèces du genre Cephaloidophora, gregarines (Protozoa, Apicomplexa) parasites des amphipodes ponto-caspiens de Roumanie. Revue Roumaine de Biologie, Serie de Biologie Animale, 40: Codreanu D., Ovcharenko M., Wita I., Grabowski M., Konopacka A On some unicellular eukaryotic microparasites of amphipod crustaceans as biomarkers related to its host geographical distribution. Anniversary Workshops From Basic Science to Therapeutic Applications, Bucharest, 5-10 June Book of Abstracts. Institute of Cellular Biology and Pathology Nicolae Simionescu, Bucharest: 25. Grabowski M., Jażdżewski K., Konopacka A Alien Crustacea in Polish waters Amphipoda. Aquatic Invasions, 2: Jażdżewski K., Konopacka A., Grabowski M Recent drastic changes in the gammarid fauna (Crustacea, Amphipoda) of the Vistula River deltaic system in Poland caused by alien invaders. Diversity and Distributions, 10: Larsson R On two microsporidia of the amphipod Rivulogammarus pulex light microscopical and ultrastructural observations on Thelohania muelleri (Pfeiffer, 1895) and Nosema rivulogammari n. sp. (Microspora, Thelohaniidae and Nosematidae). Zool. Anz., 211: Lom J., Nilsen F., Dyková I Thelohania contejeani Henneguy, 1892: dimorphic life cycle and taxonomic affinities, as indicated by ultrastructural and molecular study. Parasitology Research, 87 (10): Ovcharenko N.A New and modified methods for studying Microsporidia of aquatic animals (a reviev). Hydrobiological Journal, 39 (1): Ovcharenko M., Ironshide J., Wilkinson T Are Thelohania-like Microsporidia from Amphipods similar to Dictyocoela? W: Xth European Multicolloquium of Parasitology. Paris, August 24-28, Program & Abstract Book. Paris: 135. Ovcharenko M., Codreanu-Balcescu D., Bącela-Spychalska K., Wróblewski P New data on the distribution of unicellular parasites along central corridor of trans European migration of Ponto-Caspian gammarids (Crustacea: Amphipoda). Annual Zoological Congress of Grigore Antipa Museum. Book of abstracts. Grigore Antipa National Museum of Natural History, Bucharest: 104. Ovcharenko M., Wita I., Codreanu-Balcescu D., Grabowski M., Konopacka A Micro- 109

14 sporidia and gregarines of alien and native gammarids (Amphipoda) occurring in Poland. W: Abstracts of V European Congress of Protistology, July 23-27, 2007, St. Petersburg, Russia. Protistology, 5 (1): 61. Ovcharenko M., Bacela K., Wilkinson T., Ironsides J.E., Rigaud T., Wattier R.A. 2009a. Cucumispora dikerogammari n. gen. (Fungi: Microsporidia) infecting the invasive amphipod Dikerogammarus villosus: a potential emerging disease in European rivers. Parasitology, 137: Ovcharenko M., Codreanu-Balcescu D., Grabowski M., Konopacka A., Wita I., Czaplińska U. 2009b. Gregarines (Apicomplexa) and microsporidians (Microsporidia) of native and invasive gammarids (Amphipoda, Gammaroidea), occurring in Poland. Wiadomości Parazytologiczne, 55(7): Ovcharenko M., Rokicki J., Wita J., Codreanu-Balcescu D., Grabowski M., Konopacka A., Bącela-Spychalska K., Wróblewski P Parasites of invasive Gammarids (Amphipoda) occurring in Poland. W: Modern Problems of Aquatic Ecology. Book of abstracts 4th International Scientific Conference to commemorate Professor G.G. Winberg (11-15 October 2010). St. Petersburg: 255. Prenter J., MacNeil C., Dick J.T.A., Dunn A.M Roles of parasites in animal invasions. Trends in Ecology and Evolution, 19: Terry R.S., Smith J.E., Sharpe R.G., Rigaud T., Littlewood D.T.L., Ironside J.E., Rollinson D., Bouchon D., MacNeil C., Dick J.T.A., Dunn A.M Widespread vertical transmission and associated host sex-ratio distortion within the eukaryotic phylum Microspora. Proc. R. Soc. Lond. B, 271: Torchin M.E., Lafferty K.D., Dobson A.P., McKenzie V.J., Kuris A.M Introduced species and their missing parasites. Nature, 421: Wilkinson T.J., Rock J., Whiteley N.M., Ovcharenko M.O., Ironside J.E Genetic diversity of the feminising microsporidian parasite Dictyocoela. New insights into hostspecificity, sex and phylogeography. International Journal for Parasitology, 41: