WPŁYW LIMITOWANEGO DOSTĘPU DO SKŁADNIKÓW POKARMOWYCH NA WYDAJNOŚĆ PRODUKCJI BIOMASY MIKROGLONÓW Z RODZAJU CHLORELLA SP.

Transkrypt

1 Magdalena ROKICKA, Marcin DĘBOWSKI, Marcin ZIELIŃSKI, Karolina KUPCZYK* mikroglony, biomasa, wydajnośc produkcji WPŁYW LIMITOWANEGO DOSTĘPU DO SKŁADNIKÓW POKARMOWYCH NA WYDAJNOŚĆ PRODUKCJI BIOMASY MIKROGLONÓW Z RODZAJU CHLORELLA SP. W FOTOBIOREAKTORZE RUROWYM O ORIENTACJI PIONOWEJ Ze względu na cechy osobnicze, glony z rodzaju Chlorella sp. charakteryzują się wysokimi zdolnościami adaptacyjnymi do zmiennych warunków środowiska i warunków hodowli. Bardzo wysoki potencjał wykorzystania mikroglonów upatruje się w wykorzystaniu tego rodzaju biomasy do produkcji gazowych nośników energii. Celem pracy było określenie wydajności produkcji biomasy mikroalg z rodzaju Chlorella sp. w fotobioreaktorze rurowym o orientacji pionowej przy limitowanym dostępie do składników pokarmowych. Eksperyment przeprowadzono w dwóch częściach. W pierwszej dążono do określenia efektywności i tempa wykorzystania biogenów w dostarczonej porcji pożywki. W drugiej części system eksperymentalny eksploatowano przy ciągłym dozowaniu substancji pożywkowych. W trakcie przeprowadzonych badań stwierdzono, iż ilość wprowadzonych jednorazowo składników pokarmowych, w części pierwszej, pozwoliła na dwukrotny wzrost koncentracji biomasy glonów w eksploatowanym reaktorze. W części drugiej eksperymentu stwierdzono sukcesywny wzrost koncentracji biomasy mikroglonów w medium hodowlanym gdzie zawartość biomasy w fotobioreaktorze wzrosła ośmiokrotnie. 1. WSTĘP W ciągu ostatnich trzech dekad wykorzystanie glonów w biotechnologii gwałtownie wzrosło, stając się ważną gałęzią ogólnoświatowego przemysłu o zróżnicowanym obszarze zastosowań. Obecnie na całym świecie, co roku pozyskiwane jest około ton mokrej biomasy glonów o różnej charakterystyce i właściwościach. Produkcja * Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie, ul. Oczapowskiego 2, Olsztyn, magdalena.rokicka@uwm.edu.pl

2 542 M. ROKICKA i in. i wykorzystanie tych organizmów roślinnych może prowadzić do dostarczenia pokarmu, paszy, suplementów diety, kosmetyków, barwników, substratów energetycznych[18]. Tempo wzrostu mikroglonów wielokrotnie przewyższa tempo wzrostu lądowych i wodnych roślin naczyniowych. Interesujące wydaje się przede wszystkim wykorzystanie glonów z rodzaju Chlorella sp., które ze względu na swoje cechy osobnicze charakteryzują się wysokimi zdolnościami adaptacyjnymi do zmiennych warunków środowiska i warunków hodowli. Odpowiednie stymulowanie procesami technologicznymi w zakresie hodowli tego rodzaju mikroglonów wpływa bezpośrednio na możliwość uzyskania różnych produktów końcowych. Chlorella sp. jest organizmem kosmopolitycznym, występującym powszechnie niemal w każdym wodnym i wilgotnym środowisku, zarówno słodko- jak i słonowodnym. Duży zakres tolerancji temperaturowej powoduje ich występowanie nawet w wodach arktycznych[16]. Chlorella często występuje także we wnętrzu innych organizmów (np. pierwotniaków tj. Paramecium brusaria), w postaci zoochlorelli na zasadzie symbiotycznego współżycia z organizmem gospodarza[19]. Bardzo wysoki potencjał wykorzystania mikroglonów upatruje się w wykorzystaniu tego rodzaju biomasy do produkcji gazowych nośników energii np. w procesie wytwarzania wodoru. Dotychczas głównym gatunkiem badanym pod tym kątem była zielenica Chlamydomonas reinhardtii [12]. Jednak wielu badaczy zaobserwowało obecność podobnego mechanizmu u innych zielenic, także z rodzaju Chlorella, np. Chlorella fusca [21]. Mechanizm produkcji polega na enzymatycznym przełączaniu z produkcji tlenu na produkcję wodoru w procesie fotosyntezy. Ponieważ efektywność produkcji wodoru na tym szlaku jest stosunkowo niska (ok. 2-15%), konieczne wydaje się zastosowanie inżynierii genetycznej w celu zwiększania produkcji wodoru przez glony do poziomu ekonomicznie uzasadnionego (powyżej 15%). W wielu badaniach naukowych porównywano potencjał biomasy różnego pochodzenia (glonów, roślin, bakterii) pod względem możliwości wytwarzania metanu[4]. Okazało się, ze glony, zarówno morskie jak i słodkowodne charakteryzują się najwyższym potencjałem w wytwarzaniu tego składnika biogazu [20]. Celem pracy było określenie wydajności produkcji biomasy mikroalg z rodzaju Chlorella sp. w fotobioreaktorze rurowym o orientacji pionowej przy limitowanym dostępie do składników pokarmowych i porównanie do przebiegu procesu przyrostu biomasy w układzie, przy stałym uzupełnianiu komponentów pożywkowych. 2. METODYKA Badania zmierzające do określenia efektywności przyrostu biomasy glonów z rodzaju Chlorella sp. przeprowadzono w fotobioreaktorach zamkniętych w skali labora-

3 Wpływ limitowanego dostępu do składników pokarmowych na wydajność produkcji toryjnej. Stanowisko składało się reaktorów rurowych o orientacji pionowej, których objętość całkowita wynosiła 20,0 dm 3 (objętość czynna 18,0 dm 3 ) każdy (Rys.1). Fotobioreaktory oświetlane były w sposób ciągły światłem białym o natężeniu 0,07 Klux. Zawartość reaktorów była mieszana z wykorzystaniem sprężonego powietrza, które doprowadzano do dolnej części reaktora z wydajnością 100 dm 3 /h. Ten zabieg technologiczny pozwalał również na stałe doprowadzanie CO 2 do medium hodowlanego. Hodowlę prowadzono w temperaturze 20 ± 2 C. Ubytki wody powodowane parowaniem i poborem próbek do analiz uzupełniano wodą wodociągową do poziomu początkowego. Źródłem substancji pożywkowych dozowanych do fitobioreaktorów była pożywka AAP, której skład jakościowy zaprezentowano w tabeli 1. Tab. 1 Skład pożywki syntetycznej Odczynnik NH4Cl Na2HPO4 12H2O NaCl KCl CaCl2 2H2O MgSO4 7H2O NaHCO3 Na2CO3 (FeCl3 6H2O, ZnSO4) (MnSO4 H2O, CuSO4) CH4N2O Dawka 76,1 mg/l 46,2 mg/l 10,1 mg/l 4,7 mg/l 4,7 mg/l 16,7 mg/l 243,3 mg/l 162,2 mg/l <0,2 mg/l <0,2 mg/l 80 mg/l Rys. 1 Schemat foto-bioreaktora do hodowli glonów Na początku eksperymentu do eksploatowanego reaktora wprowadzono zagęszczone glony, których kompozycja taksonomiczna oparta była na monokulturze zielenic rodzaju Chlorella sp.. Skład jakościowy zastosowanego inokulum przedstawiał się następująco 93,2 % Chlorella sp., 5,7 % Scenedesmus sp., 1,1 % inne. Do układu eksperymentalnego wprowadzono taką ilość zagęszczonej biomasy, aby początkowa koncentracja mikroglonów w medium hodowlanym wynosiła 200 mg s.m./dm 3. Eksperyment przeprowadzono w dwóch częściach. W części pierwszej zmierzano do określenia efektywności oraz tempa wykorzystania biogennych substancji pożywkowych, tzn. ortofosforanów i azotu amonowego z medium hodowlanego w procesie początkowej fazy przyrostu biomasy mikroglonów. W tym celu założone ilości substancji pokarmowych wprowadzono na początku cyklu eksperymentalnego i ich stężenie w reaktorach monitorowano co 4 doby. Po stwierdzeniu, iż niezbędne dla efektywnego przyrostu biomasy glonów związki biogenne zostały wyczerpane z medium

4 544 M. ROKICKA i in. hodowlanego, zainicjowano drugą część prac badawczych. Pierwsza część doświadczenia miała na celu określenie wpływu ograniczonych i wyczerpujących się zasobów substancji pokarmowych w środowisku na zmiany koncentracji glonów w układzie. W drugiej części system eksperymentalny namnażania biomasy mikroglonów eksploatowano przy ciągłym dozowaniu substancji pożywkowych do reaktorów, w celu zapewnienia założonych początkowych stężeń ortofosforanów i azotu amonowego w medium hodowlanym. Reżim wprowadzania związków pokarmowych do hodowli determinowany był ograniczeniem założonych stężeń azotu amonowego do poziomu 0,1 mg N-NH 4 /dm 3 i ortofosforanów do poziomu 1,0 mg P-PO 4 /dm 3. Na etapie projektowania eksperymentu założono, iż osiągnięcie powyższych wartości w medium hodowlanym będzie sygnałem do uzupełnienia biogenów w układzie technologicznym do poziomu 1,5 mg N-NH 4 /dm 3 oraz 4,5 mg P-PO 4 /dm 3. Tego rodzaju zabieg prowadzono do chwili zahamowania przyrostu biomasy glonów w monitorowanym fotobioreaktorze. Jednocześnie z fotobioreakotrem eksperymentalnym monitorowano zmiany koncentracji biomasy mikroglonów z rodzaju Chlorella sp. w układzie porównawczym, do którego po początkowym zaszczepieniu próbką mikroglonów nie dozowano źródła substancji pokarmowych. Objętość pobieranych do analiz próbek wynosiła 0,5 dm 3. Zawartość reaktorów uzupełniano następnie wodą wodociągową z komponentami pożywki syntetycznej, której skład zaprezentowano w tabeli 1. Poszczególne składniki dozowano w ilości 3,0 cm 3 /dm 3 objętości czynnej eksploatowanego reaktora. W przypadku reaktora odniesienia ubytki medium hodowlanego spowodowane poborem próbek i parowaniem uzupełniano jedynie wodą wodociągową. W trakcie badan analizowano następujące parametry: sucha masa, zawartość substancji organicznych, azot amonowy, azot azotynowy, azot azotanowy, ortofosforany. Dodatkowo prowadzono badania mikroskopowe w celu określenia składu taksonomicznego obecnej w reaktorach biomasy glonów. Identyfikację taksonomiczną fitoplanktonu prowadzoną w pierwszym, drugim i trzecim etapie badań dokonywano na podstawie preparatów nietrwałych lub półtrwałych (STARMACH 1989). Analizę jakościową i ilościową fitoplanktonu wykonywano stosując mikroskopowe powiększenia: 1,25 x 10 x 40 lub 1,25 x 10 x 100. Oznaczanymi jednostkami były komórki, cenobia, kolonie i nici lub inne formy glonów, liczone metodą kropelkową, w trzech powtórzeniach. Koncentrację suchej masy biomasy glonów oznaczano metodą wagową bezpośrednią wg PN-EN 872:2002. Analizę statystyczną uzyskanych wyników wykonano w oparciu o pakiet STATISTICA 10.0 PL. Weryfikację hipotezy dotyczącej rozkładu każdej badanej zmiennej określono na podstawie testu W Shapiro Wilka. W celu stwierdzenia istotności różnic miedzy zmiennymi przeprowadzono jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA). Sprawdzenia jednorodności wariancji w grupach dokonano z wykorzystaniem testu Levene a. W celu określenia istotności różnic między analizowanymi zmiennymi test RIR Tukeya. W testach przyjęto poziom istotności = 0,05.

5 [mg/dm 3 ] Wpływ limitowanego dostępu do składników pokarmowych na wydajność produkcji OMÓWIENIE WYNIKÓW Pierwsza część prowadzonych badań trwała 24 dni. W tym okresie istotny wzrostu koncentracji biomasy glonów w reaktorze eksperymentalnym obserwowano do 6 doby trwania procesu. Po tym czasie zawartość fitoplanktonu wynosiła około 500 mg s.m./dm 3 i przez następne 14 dni trwania hodowli oscylowała wokół tego poziomu. Istotny, systematyczny spadek szacowanej suchej masy stwierdzono po 20 dobach od rozpoczęcia eksperymentu (Rys. 4). Zjawisko to było bezpośrednio skorelowane z wyczerpaniem się substancji pokarmowych w medium hodowlanym. Stwierdzono, iż zawartość azotu amonowego została ograniczona o 96,0% z wyjściowego poziomu 1,74 mg N-NH 4 /dm 3 do wartości 0,10 mg N-NH 4 /dm 3. Analogiczną zależność zanotowano w przypadku ortofosforanów, których stężenie w medium hodowlanym zostało ograniczono od wyjściowego poziomu 8,63 mg P-PO 4 /dm 3 do 0,48 mg P-PO 4 / dm 3 (Rys. 2). W 24 dobie trwania eksperymentu rozpoczęto realizację drugiej części badań, w której zawartość biogennych składników odżywczych była regularnie uzupełniania do założonych poziomów wyjściowych. W okresie kolejnych 36 dni obserwowano wykładniczy wzrost koncentracji glonów w fotobieraktorze. Zawartość azotu amonowego wahała się w zakresie od 2,0 mg N-NH 4 /dm 3 po wprowadzeniu pożywki ze źródła zewnętrznego do 0,1 mg N-NH 4 /dm 3 po wykorzystaniu tego biogenu na przyrost biomasy glonów. Zgodnie z założeniami metodycznymi poziom ortofosforanów utrzymywano w przedziale od 5,0 mg P-PO 4 /dm 3 a 1,0 mg P-PO 4 /dm 3 (Rys. 3) Czas [doby] N-NH4 P-PO4 Rys. 2 Zmiany zawartości N-NH 4 i P-PO 4 w medium hodowlanym w I części badań. Zatrzymanie przyrostu zawartości biomasy w eksploatowanym fotobioreaktorze nastąpiło po 60 dniach pracy. Stwierdzono, iż dłuższy czas prowadzenia eksperymen-

6 [mg s.m./dm 3 ] Stężenie [mg/dm 3 ] 546 M. ROKICKA i in. tu nie wpływał na zmiany przyrostu biomasy glonów w eksploatowanym układzie technologicznym, który ustabilizował się na poziomie 1600 mg s.m./dm 3 (Rys. 4). W czasie całego doświadczenia średni współczynnik przyrostu biomasy kształtował się na poziomie 0,25%. Najszybszy przyrost biomasy glonów w reaktorze obserwowano w okresie od 55 do 61 doby trwania eksperymentu do 105 mg/dm 3 d. W tym czasie współczynnik wzrostu wynosił 1,53%. Zmiany zawartości biomasy glonów były niewielkie i oscylowały w zakresie od 200 mg s.m./dm 3 do 370 mg s.m./dm Czas [doby] P-PO4 start N-NH4 start P-PO4 koniec N-NH4 koniec Rys. 2 Zmiany zawartości N-NH 4 i P-PO 4 w medium hodowlanym w II części badań Cześć I Cześć II faza wzrostu wykładniczego Czas [doby] reaktor zasilany pożywką reaktor odniesienia Rys. 3 Zmiany koncentracji biomasy glonów w eksploatowanym fotobioreaktorze.

7 Wpływ limitowanego dostępu do składników pokarmowych na wydajność produkcji DYSKUSJA W prezentowanych badaniach wykorzystano kulturę glonów opartą na zielenicach z rodzaju Chlorella sp. system służący do hodowli biomasy glonów opierał się na zastosowaniu fotobioreaktora rurowego o orientacji pionowej. Eriksen i in. twierdzą, że wydajność produkcji biomasy jest zależna głównie od gatunków mikroglonów [5]. Istotne znaczenie dla porównywania wyników ma również sposób hodowli glonów, rodzaj stosowanej pożywki, temperatura procesu oraz źródło i natężenie światła. Uzyskane w trakcie trwania prezentowanego eksperymentu wyniki przyrostu biomasy glonów są porównywalne z danymi opisywanymi w literaturze. W obu reaktorach dominującą grupę organizmów stanowiły glony z rodzaju Chlorell sp., z subdominującym Scenedesmus sp.. Zbieżne rezultaty uzyskali Watanable i in. oraz Hanagata i in. badając wpływ koncentracji ditlenku węgla na przyrost biomasy [19][6]. James i Al.-Khars prowadzili doświadczenia w przezroczystych pionowych fotobioreaktorach, gdzie analizowali produktywność biomasy rodzaju Chlorella sp. [7]. Zanotowana maksymalna produktywność kształtowała się w zakresie od 20 do 26 mg s.m./dm 3 d. Merchuk i in., na podstawie swoich badań stwierdzili, że fotobioreaktory kolumnowe są rozwiązaniem technologiczny o dużym potencjale wdrożeniowym[13]. 5. WNIOSKI 1. W trakcie przeprowadzonych badań stwierdzono, iż ilość wprowadzonych jednorazowo składników pokarmowych, w części pierwszej, pozwoliła na dwukrotny przyrost biomasy glonów w eksploatowanym reaktorze. Jednak tego rodzaju zabieg technologiczny nie spowodował ciągłego stabilnego wzrostu koncentracji biomasy. 2. Po 12 dobach zatrzymania stwierdzono, iż ilość suchej masy glonów w fotobioreaktorze spadała, co było skorelowane z wyczerpaniem się związków azotu i istotnym ograniczeniem stężenia związków fosforu. 3. W części drugiej eksperymentu stwierdzono sukcesywny wzrost koncentracji biomasy mikroglonów w medium hodowlanym. Zawartość biomasy w fotobioreaktorze wzrosła ośmiokrotnie. Badania zakończono, gdy ilość biomasy uzyskała wartość 1610 mg s.m./dm 3. Badania zostały zrealizowane w ramach Projektu Kluczowego nr POIG /08 pt.: "Modelowe kompleksy agroenergetyczne jako przykład kogeneracji rozproszonej opartej na lokalnych i odnawialnych źródłach energii". Projekt finansowany w ramach PO Innowacyjna Gospodarka

8 548 M. ROKICKA i in. LITERATURA [1] ANDERSEN R.,Algal Culturing Techniques l.., Esevier Academic Press, [2] BANERJEE A., SHARMA r., CHISTI Y., BANERJEE U.C., Botrycoccus braunii: a renewable Source of hydrocarbons and other chemicals. Crit. Rev. Biotechnol.; 2002, 22: [3] CHAUMONT D., Biotechnology of algal biomass production: a review of systems for outdoor mass culture, Journal of Applied Phycology 5: , [4] CHYNOWETH D.P., OWENS J.M., LEGRAND R., Renewable methane from anaerobic digestion of biomass. Renewable Energy 22, 1 8. [5] ERIKSEN N.T. i in., On-line estimation of O2 production, CO2 uptake, and growth kinetics of microalgal cultures in a gastight photobioreactor, Journal of Applied Phychology 19, [6] HANAGATA N., TAKEUCHI, T. and FUKUJU, Y.,Tolerance of microalgae to high CO2 and high temperature.,phytochemistry, [7] JAMES c., AL-KHARS A., An intensive continuous culture system using tubular photoreactors for producing microalgae. Aquaculture 87: [8] LAVENS P. SORGELOOS P. Manual on the production and use of live food for aquaculture: Laboratory of Aquaculture and Artemia Reference Center University of Ghent [9] LORENZ R.T., CYSEWSKI G.R., Commercial potential for Haematococcus microalga as a natural source of astaxantin. Trends Biotechnol.; 2003, 18, [10] MATA T., MARTINS A., CAETANO N., Microalgae for Biodiesel production and other applications: A review. Renewable and Sustainable Energy Reviews; 2010, 14(2010) [11] MELIS A., Green alga hydrogen production: progress, challenges and properties. Int. J. Hydrogen Energy; 2002, 27, [12] MELIS A., ZHANG L., FORESTIER M., GHIRARDI M.L., SEIBERT M., 2000: Sustained photobiological hydrogen gas production upon reversible inactivation of oxygen evolution in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Plant Physiol 122, [13] MERCHUK J.C., BERZIN I. Fluid flow and mass transfer in a countercurrent gas liquid inclined tubes photo-bioreactor. 62, Chemical Engineering Science, [14] MOLINA GRIMA E. FERNANDEZ A., CHISTI Y., Photobioreactors: light regime, mass transfer, and scaleup.. J. Biotechnol., [15] MOLINA GRIMA E., FERNÁNDEZ F.A.G., i in., Photobioreactors: light regime, mass transfer, and scale up. Journal of Biotechnology 70, [16] NAGASHIMA H., HAYASHI N., OHTANI S., MOMOSE H., Effects of temperature on the photosynthesis of the Antarctic green alga, Chlorella vulgaris Proc. NIPR Symp.Polar Biol. 7, Issue 1 304pp. [17] PULZ O., GROSS W., Valuable products from biotechnology of microalgae. Applied Microbiology and Biotechnology 65, [18] SPOLAORE P., JOANNIS-CASSAN C., DURAN E., ISAMBERT A., Commercial applications of microalgae. J Biosci. Bioeng. 101, [19] TANAKE Y., WATANABE T., A natural strain of Paramecium brusaria lacking symbiotic algae. Europ. J. Protistol. 38, [20] VERGARA-FERNANDEZ A., VARGAS G., ALARCON N., VELASCO A., Evaluation of marine algae as a source of biogas in a two-stage anaerobic reactor system. Biomass and Bioenergy 32, [21] WINKLER M., HEIL B., HAPPE T., 2002: Isolation and molecular characterization of the [Fe]- hydrogenase from the unicellular green alga Chlorella fusca. Biochim Biophys Acta 1576, [22] YIHE G. i in., Algae Biodiesel-A Feasibility Report, BPRO 29000, 12/7/2009

9 Wpływ limitowanego dostępu do składników pokarmowych na wydajność produkcji INFLUENCE OF LIMITED ACCESS TO NUTRIENTS FOR THE PRODUCTION BIOMASS MIKROALGAE OF THE GENUS CHLORELLA SP. IN A TUBULAR PHOTOBIOREAKTOR WITH A VERTICAL ORIENTATION Because of the characteristics subject variability, algae of the genus Chlorella sp characterized by high adaptability to changing environmental conditions and culture conditions. Very high potential for the use of microalgae is in the use of this type of biomass for the production of gas fuels. The growth rate of microalgae several times higher than the rate of growth terrestrial and aquatic plants. It seems appropriate to first of all use of algae of the genus Chlorella sp, which due to its characteristics of subject variability characterized by high adaptability to changing environmental conditions and culture conditions. Stimulating technological processes suitable for this type of microalgae culture directly affects the possibility to obtain different final products. The aim of this study was to determine the efficiency of biomass production of microalgae of the genus Chlorella sp photobioreaktor of tubular vertical orientation with limited access to nutrients. During the study it was found that the amount of nutrients once introduced in the first part, enough for to double the concentration of algal biomass in the reactor operated. However, this kind of treatment did not cause continuous technological stable increase in the concentration of biomass. After 12 days of stopping, it was found that the amount of dry algae in photobioreaktor decreased, which was correlated with the depletion of nitrogen compounds and a significant reduction of the concentration of phosphorus compounds. In the second part of the experiment had successive increase microalgae biomass concentration in the culture medium. The content of biomass in photobioreaktor increased eightfold. The study was completed, the amount of biomass obtained a value of 1610 mg sm/dm3.